ES2880948T3 - Células listas para imprimir y dispositivos integrados - Google Patents

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ES2880948T3 ES15792516T ES15792516T ES2880948T3 ES 2880948 T3 ES2880948 T3 ES 2880948T3 ES 15792516 T ES15792516 T ES 15792516T ES 15792516 T ES15792516 T ES 15792516T ES 2880948 T3 ES2880948 T3 ES 2880948T3
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Jonathan Allen Rowley
Lye Theng Lock
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Abstract

Una composición que comprende células madre, siempre que las células no sean células madre humanas totipotentes, suspendidas en una matriz viscosa, donde las células tienen una densidad celular media de al menos un millón de células por mililitro, donde la matriz viscosa tiene una viscosidad efectiva para mantener una variación de la densidad celular inferior al 10 % durante al menos 48 horas, donde la matriz viscosa comprende un polímero biocompatible seleccionado de entre el grupo que comprende un polisacárido, un polipéptido o una glucoproteína, donde las células tienen una viabilidad celular de al menos el 70 % después de almacenarlas durante al menos 7 días a 4 °C, donde las células se forman en grupos que contienen una media de 1000-200.000 células por grupo, donde los grupos retienen la capacidad de fusionarse después de haberlos almacenado durante al menos 7 días en 4 °C.

Description

DESCRIPCIÓN
C é lu la s lis ta s para im p rim ir y d isp o s itivo s in te g ra d o s
ANTECEDENTES
La m e d ic in a re g e n e ra tiva se m u e s tra m uy p ro m e te d o ra en la c lín ica , pero el cos te y la d is p o n ib ilid a d de los m a te ria le s c e lu la re s a p a rtir de los cu a le s los in ve s tig a d o re s p ueden re a liz a r e xp e rim e n to s y e n sa yo s c lín ico s e s tán fre n a n d o el cam po. S a rt y col., 2013, B io te ch n o l P rog. 29 (1 ):143 -153 d esc rib e n la c r io co n se rva c ió n de g ru p o s de cé lu la s m adre e m b rio n a ria s de ra tón . El d o cu m e n to US 2009130756 d e sc rib e la c rio co n se rva c ió n de cé lu la s u sa nd o p a rtícu la s de m a triz de h id ro ge l b io a c tivo re ticu lad o . E x is te una g ran n eces id ad de c é lu la s p rim a ria s e s ta n d a riza d a s fa b rica d a s con a lta ca lid ad y ba jo coste , y e n tre g a d a s a in ve s tig a d o re s tra s la c io n a le s y fa b ric a n te s de d isp o s itivo s en ca n tid a d e s y fo rm a to s q ue a ce le re n el d e sa rro llo de p ro d u c to s y los e s fu e rzo s de fa b rica c ió n . T a m b ié n e x is te la n eces id ad de fo rm a to s ce lu la re s q ue te n g a n un tie m p o de co n se rva c ió n su fic ie n te para a p lica c io n e s de in g e n ie ría de te jid os , ta le s com o la b io im p re s ió n . En p a rticu la r, se n ece s ita n cé lu la s m a dre m e se n q u im a le s (C M M ) en un fo rm a to e s ta b le y listo para u sa r p ara a p lica c io n e s de in g e n ie ría de te jid o s y te ra p ia ce lu la r.
RESUMEN
En esta so lic itud , se d esc ribe n co m p o s ic io n e s , d isp o s itivo s y p ro ce d im ie n to s que p ro p o rc io n a n m a te ria le s ce lu la re s en fo rm a to s " lis to s para usar" para p ro to co lo s e xp e rim e n ta le s , te ra p é u tico s y de ing e n ie ría de te jid o s . La inve nc ión p ro p o rc io n a una co m p o s ic ió n q ue co m p re n d e cé lu la s m adre , s ie m p re q ue las cé lu la s no sean cé lu la s m adre h um a na s to tip o te n te s , su sp e n d id a s en una m a triz v isco sa , d on de las cé lu la s tie n e n una d e n s id a d c e lu la r m e d ia de al m e no s un m illón de cé lu la s p o r m ililitro , d o n d e la m a triz v isc o sa tie n e una v is c o s id a d e fe c tiva para m a n te n e r una v a r ia c ió n de la d e n s id a d c e lu la r in fe rio r al 10 % d u ra n te al m e no s 48 horas, d o n d e la m e m b ra n a v isc o sa co m p re n d e un po lím ero b io co m p a tib le s e le cc io n a d o de e n tre el g rup o que co m p re n d e un p o lisa cá rid o , un p o lip é p tid o o una g lu co p ro te ín a , d on de las cé lu la s tie n e n una v ia b ilid a d c e lu la r de al m e no s el 70 % d e sp u é s de a lm a ce n a rla s d u ra n te al m e no s 7 d ías a 4 °C, d o n d e las cé lu la s se fo rm a n en g ru p o s que co n tie n e n una m e d ia de 1000 -200.000 cé lu la s p o r g rupo , d onde los g ru p o s re tien en la ca p a c id a d de fu s io n a rse d e sp u é s de h a b e rlo s a lm a ce n a d o d u ra n te al m e no s 7 d ías en 4 °C.
Los g ru p o s p ueden c o n te n e r una m e d ia de 100 a 200.000 cé lu la s p o r g rupo , q ue inc lu ye de 1000 a 100.000 cé lu las p o r g rupo . En a lg u n o s casos, los g rup o s con tie n e n de m e d ia 1000, 5000, 10.000, 20.000, 30.000 , 40.000 , 50.000, 60.000 , 70.000 , 80.000 , 90.000 , 100.000 , 110.000 , 120.000 , 130.000 , 140.000 , 150.000 , 160.000 , 170.000 , 180.000, 190.000 o 200.000 cé lu la s p o r g rupo . C o m o e je m p lo , los g ru p o s de cé lu la s se p ue de n u sa r com o co m p o n e n te s b ás ico s para in g e n ie ría de te jid os , p o r e je m p lo , m e d ia n te im p re s ió n 3D, a s í co m o para o b je to s im p la n ta b le s fu n c io n a le s p ara a p lica c io n e s de te ra p ia ce lu la r. P o r lo tan to , un se llo d is tin tivo de los g ru p o s de cé lu la s es la cap ac id ad de que las cé lu la s in d iv id u a le s d en tro de los g rup o s m a n te n g a n su v ia b ilid a d y fu n c io n e s y, cu a n d o los g ru p o s se fu s io n a n e n tre s í en cu ltivo , p uedan fo rm a r un te jid o fun c io n a l. P o r tan to , la ca p a c id a d de los g rup o s p ara fu s io n a rse p uede d e m o s tra r una b uena v ia b ilid a d y fu n c ió n ce lu la r. P re fe rib le m e n te , los g ru p o s ta m b ié n tie n e n un ta m a ñ o y v o lu m e n s im ila res . P o r e je m p lo , en a lg u n a s re a liza c io ne s , cad a uno de los g ru p o s de cé lu la s d en tro de la co m p o s ic ió n tie n e una va r ia c ió n m e d ia de l d iá m e tro in fe rio r al 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 % , el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 %, el 20 %.
Las c o m p o s ic io n e s d e sc rita s p ueden c o m p re n d e r a d e m á s un c rio co n se rva n te y /o a g e n te b io co n se rva n te en una ca n tid a d s u fic ie n te para m a n te n e r una v ia b ilid a d c e lu la r de al m e no s el 70 %. P o r e je m p lo , las cé lu la s p ueden se r cé lu la s c o n g e la d a s con una can tida d de a g e n te c rio co n se rva n te , ta l co m o d im e tilsu lfó x id o (D M S O ), su fic ie n te para re te n e r la ca p a c id a d de los g ru p o s de c é lu la s de fu s io n a rse d e sp u é s de h a b e rlo s a lm a ce n a d o d u ra n te al m enos 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 m e se s a de -10 a -80 °C, ta l com o a -20 °C. C om o o tro e je m p lo , las c é lu la s p ueden se r cé lu la s no c o n g e la d a s con una ca n tid a d de a ge n te b io co n se rva n te , com o H yp o T h e rm o so l® , s u fic ie n te para re te n e r la ca p a c id a d de los g ru p o s de cé lu las de fu s io n a rse d e sp u é s de h a b e rlo s a lm a ce n a d o d u ra n te al m enos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 d ía s a de 0 a 25 °C, ta l com o a 4 °C.
Las cé lu las de las c o m p o s ic io n e s d e sc rita s p ueden s e r c u a lq u ie r cé lu la m a dre cap az de fo rm a r g ru p o s de cé lu la s y fu s io n a rse cu a n d o se cu ltivan ju n ta s , s ie m p re q ue las cé lu la s no sean cé lu la s m adre h u m a n a s to tip o te n te s . En a lg u n o s casos, las cé lu las son cé lu las m a dre in d ife re n c ia d a s o cé lu la s p ro g e n ito ra s con un p o ten c ia l de lina je c e lu la r que co rre sp o n d e al te jid o d e se a d o que se e stá m a n ip u la n d o g e n é tica m e n te . Las cé lu la s p ueden s e r u n ipo ten tes , o lig o p o te n te s , m u ltip o te n te s o p lu rip o te n te s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , las cé lu la s son cé lu la s m a dre adu ltas . Las cé lu la s son p re fe rib le m e n te a lo g é n ica s o a u tó lo ga s . En re a liza c io n e s p articu la re s , las cé lu la s inc lu ye n cé lu la s m a dre m e se n q u im a le s (C M M ). La co m p o s ic ió n p uede c o n te n e r un ú n ico tip o ce lu la r, ta l com o C M M . S in e m ba rg o , en a lg u n a s re a liza c io ne s , la co m p o s ic ió n con tie n e dos o m ás tip o s c e lu la re s d ife re n te s , es dec ir, cé lu la s de d os o m ás lina jes d ife re n te s . Las cé lu la s p ue de n se r cé lu la s an im a les , ta le s co m o cé lu la s hum a na s .
T a m b ié n se d e sc rib e una co m p o s ic ió n q ue co n tie n e m a te ria le s ce lu la re s que, d e sp u é s de l a lm a ce n a m ie n to , son a d e cu a d o s para la d isp e rs ió n , p o r e je m p lo , m e d ia n te im p re s ió n 3D. La co m p o s ic ió n d e sc rita co n tie n e cé lu las su sp e n d id a s en una m a triz v isco sa , de m o do que las cé lu la s te n g a n una d en s id a d c e lu la r m e d ia de 1 a 100 m illo ne s de cé lu la s p o r m ililitro , q ue inc lu ye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 m illo n e s de cé lu la s p o r m ililitro . A d e m á s, la m a triz v isc o sa p ue de te n e r una v isco s id a d e fe c tiva para m a n te n e r una va r ia c ió n de la d en s id a d c e lu la r en la co m p o s ic ió n in fe rio r al 5 %, el 6 %, el 7 % , el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 %, el 20 % d u ra n te al m e no s 24, 36, 48, 72 o 120 horas. En a lg u n a s re a liza c io n e s , las cé lu la s de la co m p o s ic ió n t ie n e n una v ia b ilid a d ce lu la r de al m e no s el 70 % d e sp u é s de h a b e rla s a lm a ce n a d o d u ra n te al m e no s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 d ías a de 0 a 25 °C, ta l com o a 4 °C. P o r "v ia b ilid a d " se e n tie n d e q ue las cé lu la s están v iva s y son fu n c io n a le s . Las fu n c io n e s de una cé lu la p ueden v a r ia r según el tip o de cé lu la , pero inc lu ye n la ca p a c id a d de re p lica rse , s e c re ta r c ito c ina s , s e c re ta r fa c to re s de c re c im ie n to , a d h e rirse al p lá s tico de cu ltivo de te jid os , a d h e rirse a o tras cé lu las , m ig ra r o c u a lq u ie r co m b in a c ió n de los m ism os. En a lg u n o s casos, d e te rm in a r la v ia b ilid a d im p lica la d e te cc ió n de la p re se n c ia y /o a c tiv id a d de una o m ás e n z im a s p ro d u c id a s p o r la cé lu la . C om o a n te rio rm e n te , las c é lu la s e stán p re se n te s com o g rupos. U na fo rm a im p o rta n te de e va lu a r la v ia b ilid a d de las cé lu las en un g rup o es s o m e te r a p rue b a la ca p a c id a d de los g ru p o s para fu s io n a rse . P o r lo tan to , la co m p o s ic ió n puede c o m p re n d e r a d e m á s un a g e n te b io co n se rva n te , un a ge n te c rio co n se rva n te o una co m b in a c ió n de los m ism os.
La m a triz v isc o sa usa da para su s p e n d e r las cé lu la s p uede se r c u a lq u ie r p o lím e ro b io co m p a tib le a d e cu a d o para im p re s ió n 3D y /o ing e n ie ría de te jid os . En a lg u n o s casos, el p o lím e ro es un b io p o lím ero . P o r e je m p lo , los b io p o lím e ro s a d e cu a d o s inc lu ye n p o lisa cá rid o s , p o lip é p tid o s y g lu co p ro te ín a s . E sto inc lu ye m o lé cu la s de la m a triz e x tra c e lu la r (M E C ) de o rigen n a tu ra l o s in té tico . En a lg u n a s re a liza c io n e s , el p o lím e ro b io co m p a tib le co m p re n d e a lg in a to . La v isco s id a d de l p o lím e ro b io co m p a tib le se p ue de a ju s ta r p a ra m a n te n e r la su sp e n s ió n de las cé lu las , a la ve z que ta m b ié n es p re fe rib le m e n te lo su fic ie n te m e n te flu id o para la d isp e rs ió n , p o r e je m p lo , m e d ia n te inye cc ió n a tra vé s de una a gu ja o boqu illa . En re a liza c io n e s p a rticu la re s , las cé lu la s m a n tien e n una v a r ia c ió n de d e n s id a d en la co m p o s ic ió n in fe rio r al 5 %, el 10 %, el 15 % o el 20 % d u ra n te al m e no s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 días.
T a m b ié n se d e sc rib e un k it p a ra p ro d u c ir c o m p o s ic io n e s de b io tin ta , q ue com p re nd e : una co m p o s ic ió n de la p rese n te inve nc ión , ta l com o se d e sc rib e en e sta so lic itud , q ue co m p re n d e g ru p o s de cé lu las m adre ; un p o lím e ro b io co m p a tib le y un a g e n te de re ticu lac ió n . En a lg u n o s casos, el k it co n tie n e una co m p o s ic ió n , ta l com o se d e sc rib e en e s ta so lic itud , p o r e je m p lo , q ue co m p re n d e g rup o s de cé lu la s q ue con tien en una m e d ia de 1000 a 100.000 cé lu la s p o r g rupo . El p o lím e ro b io co m p a tib le e stá en el m ism o re c ip ie n te que los g ru p o s de cé lu las . El a g e n te de re ticu lac ió n e stá en un re c ip ie n te d ife re n te al de los g ru p o s de cé lu la s y el p o lím e ro b io com p a tib le .
T a m b ié n se d e sc rib e un d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o q ue co m p re n d e una co m p o s ic ió n de m a te ria l c e lu la r d escrito en e sta so lic itud , d on de el d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o se co n fig u ra para d is p e n s a r la co m p o s ic ió n com o una un idad d isc re ta , d on de cad a un idad d is c re ta co m p re n d e una can tid a d c o n tro la d a de las cé lu las . Un e je m p lo de un d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o es un ca rtu cho , ta l com o un ca rtu ch o para su uso en un d isp o s itivo de im p re so ra tr id im e n s io n a l (3D ).
Los d e ta lle s de una o m ás re a liza c io n e s de la inve nc ión se e xp o n e n en los d ib u jo s a d ju n to s y en la d e sc rip c ió n que se p re se n ta a co n tin u a c ió n . O tras c a ra c te rís tica s , o b je tivo s y ve n ta ja s de la inve nc ión re su lta rá n e v id e n te s a p a rtir de la d e sc rip c ió n y los d ibu jos , y a p a rtir de las re iv in d ica c io n e s .
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La fig u ra 1A m u es tra una im agen de cé lu la s m adre m e se n q u im a le s (C M M ) que se a d h ie re n 2 horas d e sp u é s de la co lo ca c ió n en p lacas. La fig u ra 1B es una cu rva de c re c im ie n to para d os lo tes de C M M d e sp u é s de co lo ca rla s en p la cas y e xp a n d ir la s d u ra n te 2 pases.
La fig u ra 2 es un g rá fico de b arras que m u es tra q ue tre s lo tes de C M M q ue e xp re sa n C D 73, C D 90, C D 105 y C D 166, y son n e g a tiva s para C D 45, C D 34 y C D 14, d e sp u é s de d e s c o n g e la r y e xp a n d ir las C M M crio co n se rva d a s .
La fig u ra 3 es un g rá fico de ba rras que m u es tra los n ive les de sec re c ió n de c ito c in a s a n g io g é n ica s en tre s lo tes de C M M d e sp u é s de d e s c o n g e la r y e xp a n d ir las C M M c rio co n se rva d a s .
La fig u ra 4 m u es tra q ue las C M M se d ife re n c ia n hac ia lina jes a d ip o g é n ico s (A ) y o s te o g é n ico s (B ) d e sp u é s de d e s c o n g e la r y e xp a n d ir las C M M c rio co n se rva d a s .
La fig u ra 5 es un g rá fico de b a rras q ue m u e s tra las C M M q ue m a n tu v ie ro n su fun c ión in m u n o m o d u la d o ra d e sp u é s de d e s c o n g e la r y e xp a n d ir las C M M c rio co n se rva d a s .
Las fig u ra s 6A y 6B son im á g e n e s q ue m u es tra n la fo rm a c ió n de g ru p o s de C M M h.
La fig u ra 7 A son im á ge ne s que m u es tra n la fus ió n e sp o n tá n e a de g ru p o s de C M M que ind ica cé lu la s v iva s y m e ta b ó lica m e n te activas . La fig u ra 7B m u es tra la un ión de g ru p o s de C M M q ue ind ica c é lu la s v iva s y m e ta b ó lica m e n te activas .
La figu ra 8 es un g rá fico de b a rras q ue m u es tra q ue los g ru p o s de C M M co n tin ú a n se c re ta n d o c ito c in a s a n g io g é n ica s cu a n d o se co lo ca n en p la cas y se incu ba n en un cu ltivo a 37 °C.
La fig u ra 9 es un g rá fico de b arras q ue m u e s tra la a c tiv id a d de in d o la m in a -p irro l 2 ,3 -d io x ig e n a s a (ID O ) de los g rup o s de C M M .
La figu ra 10A es una im a ge n q ue m u es tra una ú n ica cé lu la C M M a g ru p a d a y e n ca p su la d a en a lg in a to y e x tru id a en C aC l2. La fig u ra 10B es una im a ge n q ue m u es tra g ru p o s de C M M a lta m e n te v ia b le s q ue se tiñ e ro n con C a lce ín a -A M d e sp u é s de la e n ca p su la c ió n (ve rde). La fig u ra 10C es una im agen q ue m u es tra la fu s ió n de g ru p o s de C M M en a lg in a to extru ido .
La fig u ra 11 es una se rie de im á ge ne s que m u es tra n g ru p o s de C M M h a lm a ce n a d o s d u ra n te 3 y 7 d ías a 4 °C en h ip o te rm o so l, m e d io o so lu c ió n sa lin a con H S A al 4 %, 1 d ía d e sp u é s de l cu ltivo en p laca de cu ltivo de te jid os . La fig u ra 12 es una serie de im á g e n e s q ue m u es tra n g ru p o s de C M M h a lm a ce n a d o s d u ra n te de 3 a 7 d ías a 4 °C en h ip o te rm o so l, m e d io o so lu c ió n sa lin a con H S A al 4 %, 6 d ía s d e sp u é s de l cu ltivo en p laca de cu ltivo de te jid os . La fig u ra 13 es una serie de im á g e n e s q ue m u es tra n g ru p o s de C M M h a lm a ce n a d o s d u ra n te de 3 a 7 d ías a 4 °C en h ip o te rm o so l, m e d io o so lu c ió n sa lin a con H S A al 4 %, 1 d ía d e sp u é s de l cu ltivo en p laca no a dh e ren te .
La figu ra 14 es un g rá fico de b a rras q ue m u es tra la a c tiv id a d de IDO p o r g ru p o s de C M M d e sp u é s de l a lm a ce n a m ie n to en H TS, so lu c ió n sa lin a o m e d io d u ra n te de 3 o 7 d ías a 4 °C
La figu ra 15 es un g rá fico de b arras q ue m u es tra la sec re c ió n de A ng -2 , FG F, HG F, IL -8, T IM P -1 , T IM P -2 y V E G F p or g ru p o s de C M M d e sp u é s de l a lm a c e n a m ie n to en H TS, so lu c ió n sa lina , m e d io d u ra n te de 3 o 7 d ías a 4 °C.
La fig u ra 16 es una se rie de im á ge ne s q ue m u es tra n q ue los g ru p o s de C M M c rio co n se rva d o s que m a n tien e n la ca p a c id a d de fus ió n de g rup o s y la ca p a c id a d de las cé lu la s in d iv id u a le s para u n irse al p lá s tico de cu ltivo de te jid o s (C T ) y c re ce r a p a rtir de los g rupos.
La fig u ra 17 es un g rá fico de ba rras q ue m u e s tra q ue los g ru p o s c rio co n se rva d o s m a n tien e n un fe n o tip o in m u n o m o d u la d o r inducib le .
La fig u ra 18 es un g rá fico de b a rras q ue m u e s tra la se c re c ió n de A ng -2 , FG F, HG F, IL -8, T IM P -1 , T IM P -2 y V E G F de g ru p o s de C M M c rio co n se rva d o s y no con ge lad os .
Las fig u ra s 19A a 19C son im á g e n e s que m u es tra n g ru p o s de C M M c rio co n se rva d o s que se p ud ie ro n fa b ric a r en fo rm a de a n illo (fig u ra s 19A -19B ), y la t in c ió n HE d e m u e s tra una fus ió n s a lu d a b le co n s is te n te de g ru p o s en to d a la e s tru c tu ra de l a n illo (fig u ra 19C).
La fig u ra 20 A es un d ia g ra m a de flu jo de l p ro ce so q ue ilus tra la g e n e ra c ió n de 100.000 g rup o s h echo s con 1000 cé lu la s p o r g rup o La fig u ra 20 B es un g rá fico de b arras q ue m u es tra el a h o rro de tie m p o (d ía s ) d u ra n te la e xp an s ión ce lu la r.
La fig u ra 21 A es una im a ge n que m u e s tra la p rue b a de ca p a c id a d de im p re s ió n de d ife re n te s fo rm u la c io n e s de a lg ina to .
La fig u ra 21 B es un g rá fico q ue m u es tra la co n s is te n c ia y p e g a jo s id a d de d ife re n te s fo rm u la c io n e s de a lg ina to . La fig u ra 22 es un g rá fico q ue m u e s tra la se d im e n ta c ió n y a g lu tin a c ió n de d ife re n te s fo rm u la c io n e s de a lg ina to . La fig u ra 23 es una serie de im á g e n e s q ue m u es tra n la s u p e rv ive n c ia de los g ru p o s de C M M en h id ro g e le s d e sp u é s de 7 d ías de a lm a ce n a m ie n to a 4 °C y la e xp a n s ió n de los g ru p o s tra s la co lo ca c ió n en p la cas de cu ltivo de te jid os . La fig u ra 24 A y 24 B son im á g e n e s que m u es tra n el k it de b io tin ta para la co n fig u ra c ió n de l p ro d u c to de g rup o s de C M M .
La fig u ra 25 es una im a ge n de la co n fig u ra c ió n fina l de l p ro d u c to de b io tin ta de g ru p o s de C M M , a d e cu a d a para el tra n s p o rte y a lm a c e n a m ie n to de l p ro d u c to a 4 °C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Las co m p o s ic io n e s , d isp o s itivo s y p ro ce d im ie n to s d e sc rito s se re fie ren a los ca m p o s de la m e d ic in a re ge n e ra tiva , te c n o lo g ía s b a sa d a s en cé lu la s m adre y d isp o s itivo s m éd icos , in g e n ie ría de te jid os , in ve s tig a c ió n y d e sa rro llo b io m é d ico , m a te ria s p rim a s ce lu la re s y m a te ria le s b io fu n c io n a le s d e riva d o s de cé lu la s v ivas . En p articu la r, se d esc rib e n co m p o s ic io n e s y fo rm u la c io n e s e s ta b le s de cé lu la s v iva s fu n c io n a le s q ue se e n tre g a n en fo rm a to s que p e rm ite n la in co rp o ra c ió n de e stas cé lu la s o m a te ria le s d e riva d o s de cé lu la s en p ro d u c to s b io ló g ico s y b io m é d icos .
En e sta so lic itud , se p ro p o rc io n a n fo rm u la c io n e s e s ta b le s de cé lu la s v iva s a lta m e n te fu n c io n a le s q ue perm ite n la in co rp o ra c ió n de cé lu la s en te jid o s m a n ip u la d o s g e n é tica m e n te , d isp o s itivo s m é d ico s u o tro s p ro d u c to s que re qu ie ren cé lu la s v iva s fu n c io n a le s . P o r e je m p lo , se d e sc rib e n c o m p o s ic io n e s de cé lu las para su uso en m e d ic in a re ge n e ra tiva , in g e n ie ría de te jid o s y a p lica c io n e s de b io im p re s ió n . Las fo rm u la c io n e s e s ta b le s p ro p o rc io n a d a s en e sta so lic itud m a n tien e n las cé lu la s o g ru p o s de cé lu la s en su sp e n s ió n en un e s ta d o de a lta v ia b ilid a d y fu n c io n a lid a d .
Las c o m p o s ic io n e s p ue de n c o n te n e r fo rm u la c io n e s de cé lu la s co m o cé lu la s m a dre en g rup o s h o m o g é n e o s o h e te ro g é n e o s q ue e stán lis tas para u sa r d e sp u é s de v a r io s días, se m a n a s o m e se s de a lm a ce n a m ie n to . Las fo rm u la c io n e s ce lu la re s p e rm ite n m a n te n e r la v ia b ilid a d y fu n c io n a lid a d ce lu la r. Las cé lu la s en a lg u n a s de las fo rm u la c io n e s p e rm a n e ce n en su sp e n s ió n sin s e d im e n ta r d u ra n te el a lm a ce n a m ie n to y tie n e n la ca p a c id a d de e n tre g a rla s a una u b ica c ió n e sp e c ífica m ie n tra s se m a n tie n e n la v ia b ilid a d y la fun c ión . Las fo rm u la c io n e s e s ta b le s p ueden se r e s ta b le s d u ra n te sem a na s , m e se s o años, ya sea en e s ta d o co n g e la d o (es dec ir, c r io co n se rva d o ) o no co n g e la d o (b io co n se rva d o ). P o r e s ta d o con g e la d o , se e n tie n d e q ue las fo rm u la c io n e s e s ta b le s e s tán a una te m p e ra tu ra de co n g e la c ió n o p o r d e b a jo de e lla (p o r e je m p lo , a 0 g ra d o s C e ls iu s o p o r d eb a jo de ella, y típ ic a m e n te al m enos a -20 g rad o s C e ls ius ). En a lg u n a s re a liza c io n e s , las fo rm u la c io n e s a lm a ce n a d a s en e s ta do co n g e la d o co m p re n d e n a d e m á s un a g e n te c rio co n se rva n te . P o r e s ta do no con g e la d o , se e n tie n d e q ue las fo rm u la c io n e s e s ta b le s e s tán p o r e n c im a de una te m p e ra tu ra de co n g e la c ió n (p o r e je m p lo , a 0 g ra d o s C e ls iu s o p o r e n c im a de e lla), típ ica m e n te al m e no s 2 g rad o s C e ls ius . En a lg u n a s re a liza c io n e s , el e s ta d o no co n g e la d o inc lu ye de 0 a 37 g rad o s C e ls ius , ta l com o de 4 a 24 g ra d o s C e ls ius .
El té rm in o "cé lu la ", ta l com o se usa en e sta so lic itud , se re fie re a cé lu la s ind iv idu a le s , líne as ce lu la res , cu ltivo p rim a rio o cu ltivo s d e riva d o s de d ich as cé lu las a m e no s que se ind iq ue lo con tra rio . Un "cu ltivo " se re fie re a una co m p o s ic ió n q ue co m p re n d e cé lu la s a is la d a s de l m ism o tip o o de un tip o d ife ren te .
La co m p o s ic ió n d e sc rita co n tie n e cé lu la s m adre , s ie m p re q ue las cé lu la s no sea n cé lu la s m a dre to tip o te n te s hum anas. Las cé lu la s m adre p lu rip o te n te s , cé lu la s m adre adu lta s , cé lu las m a dre d e riva d a s de b la s toc is to s , cé lu la s m a dre d e riva d a s de c re s ta s g on ad a le s , cé lu las m a dre d e riva d a s de te ra to m a , cé lu la s m a dre to tip o te n te s , cé lu la s m a dre m u ltip o te n te s , cé lu la s m a dre in d e p e n d ie n te s de o n co s ta tin a (O IS C ), cé lu la s m adre e m b rio n a ria s (E S ) y cé lu las de ca rc in o m a e m b rio n a rio (C E ) son e je m p lo s de cé lu la s m adre . Las cé lu la s m adre p ueden te n e r una v a r ie d a d de p ro p ie d a d e s y ca te g o ría s d ife re n te s de e s ta s p rop ied a de s. P o r e je m p lo , en a lg u n a s fo rm as , las cé lu la s m adre son ca p a ce s de p ro life ra r d u ra n te al m e no s 10, 15, 20, 30 o m ás p ases en un e s ta do ind ife re n c ia d o . En a lg u n a s fo rm as, las cé lu la s m a dre p ue de n p ro life ra r d u ra n te m ás de un a ño sin d ife re n c ia rse . Las cé lu la s m adre ta m b ié n pueden m a n te n e r un ca r io tip o n orm a l m ie n tra s p ro life ra n y /o se d ife re n c ia n . Las cé lu la s m a dre ta m b ié n p ueden re te n e r la ca p a c id a d de d ife re n c ia rse en te jid o de l m e so de rm o , e n d o d e rm o y e c to de rm o , que inc lu ye n cé lu la s g e rm ina les , ó vu los y e sp e rm a to zo id e s . A lg u n a s cé lu la s m a dre ta m b ié n p ue de n se r cé lu la s ca p a ce s de p ro life ra r in d e fin id a m e n te in v itro en un e s ta d o in d ife re n c ia d o . A lg u n a s cé lu la s m a dre ta m b ié n p ue de n m a n te n e r un c a rio tip o n o rm a l d u ra n te un cu ltivo p ro lo ng a do . A lg u n a s cé lu las m adre p ueden m a n te n e r el p o ten c ia l de d ife re n c ia rse a d e riva d o s de las tre s cap as g e rm in a le s e m b rio n a ria s (e n d o d e rm o , m e so d e rm o y e c to d e rm o ) inc lu so d e sp u é s de un cu ltivo p ro lo ng a do . A lg u n a s cé lu la s m a dre p ue de n fo rm a r c u a lq u ie r tip o de cé lu la en el o rga n ism o . A lg u n a s cé lu la s m a dre p ueden fo rm a r cu e rp os e m b rio id e s en d e te rm in a d a s co n d ic io n e s , ta le s com o el c re c im ie n to en m e d io s q ue no m a n tien e n un c re c im ie n to in d ife re n c ia d o . A lg u n a s cé lu la s m a dre p ue de n fo rm a r q u im e ra s m e d ia n te la fu s ió n con un b la s toc is to , p o r e je m p lo .
A lg u n a s cé lu la s m a dre se p ueden d e fin ir m e d ia n te una v a r ie d a d de m a rcad o res . P o r e je m p lo , a lg u n a s cé lu la s m a dre e xp re sa n fo s fa ta sa a lca lina . A lg u n a s cé lu la s m a dre e xp re sa n S S E A -1, S S E A -3 , S s Ea -4, T R A -1 -60 y /o T R A -1 -81. A lg u n a s cé lu la s m a dre no e xp re sa n S S E A -1, S S E A -3 , S S E A -4 , T R A -1 -60 y /o T R A -1 -81. A lg u n a s cé lu la s m a dre e xp re sa n O c t 4, S ox2 y N anog . Se e n te n d e rá q ue a lg u n a s cé lu la s m a dre las e xp re sa rá n a n ive l de A R N m , y o tras ta m b ié n las e xp re sa rá n a n ive l de p ro te ína , p o r e je m p lo , en la su p e rfic ie c e lu la r o d en tro de la cé lu la .
En a lg u n o s casos, las cé lu la s son cé lu la s m adre m e se n q u im a le s (C M M ) o cé lu la s e s tro m a le s de la m é du la ósea (B M S C ). E s to s té rm in o s se usan co m o s in ó n im o s a lo la rgo de e sta so lic itud . Las C M M son de in te ré s p o rq u e se a ís lan fá c ilm e n te a p a rtir de un p e q u e ñ o a sp ira d o de m é du la ó sea u o tra s fu e n te s de cé lu la s m adre m e se n q u im a le s , y g e n e ra n fá c ilm e n te co lo n ia s d e riva d a s de una ú n ica cé lu la . Las cé lu la s de la m é du la ó se a se p ueden o b te n e r de la c re s ta ilíaca, fém u re s , tib ia s, co lu m na , cos tillas , ro d illa s u o tro s te jid o s m e se n q u im a le s . O tras fu e n te s de C M M inc lu ye n el saco v ite lin o e m b rio n a rio , p lacen ta , co rdó n u m b ilica l, piel, g rasa , te jid o s in o v ia l de las a rticu la c io n e s y san gre . La p rese nc ia de C M M en co lo n ia s de cu ltivo se p uede v e r ific a r m e d ia n te m a rca d o re s de su p e rfic ie c e lu la r e sp e c ífico s q ue se ide n tifican con a n ticu e rp o s m o no c lo n a le s . V é a n se las p a te n te s de EE. UU. n.° 5.486.359 y 7.153.500. Las co lo n ia s d e riva d a s de una ú n ica cé lu la se p ue de n e xp a n d ir a tra vé s de hasta 50 d u p lica c io n e s de p ob lac ión en 10 se m a n a s y se p ueden d ife re n c ia r en o s te o b la s to s , a d ip o c ito s , co n d ro c ito s (F rie d e n s te in y col., 1970 C e ll T issu e K inet.
3 :393 -403 ; C a s tro -M a la sp in a y col., 1980 B lood 56 :289 -301 ; B e res fo rd y col., 1992 J. C e ll Sci. 102 :341 -351 ; P rockop, 1997 S c ie n ce 276 :71 -74 ), m io c ito s (W a k ita n i y col., 1995 M u sc le N erve 18 :1417 -1426 ), a s tro c ito s , o lig o d e n d ro c ito s y n e u ro n a s (A z iz i y col., 1998 Proc. N atl. A cad . Sci. U S A 95 :3908 -3913 ); K open y col. 1999 Proc. Natl. A cad . Sci. EE. UU 96 :10711 -10716 ; C ho pp y col., 2000 N e u ro re p o rt II 300 1 -3005; W o o d b u ry y col., 2000 N e u ro sc ie n ce R es. 61 :364 -370). En ra ras o ca s io n es , las cé lu la s se p ueden d ife re n c ia r en cé lu la s de las tre s líne as g e rm ina les . P o r tan to , las C M M s irven com o p ro g e n ito re s de m ú ltip le s lina jes de cé lu la s m e se n q u im a le s q ue inc lu ye n hueso , cartílago , liga m e nto , te n d ó n , te jid o a d ip oso , m ú scu lo , te jid o ca rd íaco , estro m a , d e rm is y o tro s te jid o s con ec tivo s . V é a n se las p a te n te s de EE. UU. n.° 6.387.369 y 7.101.704. P o r e s ta s razones, las C M M se e stán so m e tie n d o a p rue b a en la a c tu a lid a d p o r su p os ib le uso en la te ra p ia c e lu la r y g en é tica de un n ú m e ro de e n fe rm e d a d e s h um a n a s (H o rw itz y col., 1999 Nat. M ed. 5 :309 -313 ; C ap lan , y col. 2000 C lin . O rtho pe d . 379 :567 -570 ).
Los p ro ce d im ie n to s para c re a r g rup o s de C M M se d esc ribe n en los d o cu m e n to s US 2012 /0219572 de P ro cko p y col. y B artosh y col., p Na S 2010 107 (31 ):13724 -13729 , que se in co rp o ra n com o re fe re n c ia en su to ta lid a d p ara esta e nseñ an za . P o r e je m p lo , las C M M se p ueden cu ltiv a r de una m a n e ra q ue fa vo re zca la c re a c ió n de g ru p o s y la fo rm a c ió n de e s fe ro id e s . P o r e je m p lo , las C M M se p ueden a is la r de la m é du la ó sea h um a na y cu ltiv a r en m edio co m p le to (D M E M ba jo en g lu co sa q ue co n tie n e 4 m M de L -g lu tam in a , P B S al 10 % y p e n ic ilin a /e s tre p to m ic in a al 1 % ) en go tas co lg a n te s o en p la cas no a d h e ren te s . Se p ue de u sa r c u a lq u ie r m e d io cap az de su s te n ta r las C M M in vitro para cu ltiv a r las C M M . Las fo rm u la c io n e s de m e d io s q ue p ue de n s u s te n ta r el c re c im ie n to de las C M M inc lu ye n , pero no se lim itan a, el m e d io de E ag le m o d ifica d o p o r D u lb ecco (D M E M ), el m e d io e se n c ia l m ín im o m o d ifica d o a lfa (a M E M ) y el m e d io 1640 de R osw e ll P a rk M e m o ria l Ins titu t (m ed io 1640 R P M I) y s im ila res . T íp ica m e n te , se a ñ a d e h asta un 20 % de sue ro fe ta l b ov ino (F B S ) o un 1-20 % de sue ro de c a b a llo al m e d io a n te r io r para su s te n ta r el c re c im ie n to de las C M M . S in em ba rg o , ta m b ié n se p uede u sa r un m e d io d e fin id o si los fa c to re s de c re c im ie n to , c ito c in a s y h o rm o n a s n e ce sa rio s para c u ltiv a r C M M se p ro p o rc io n a n en c o n c e n tra c io n e s a p ro p ia d a s en el m ed io . Los m e d io s ú tiles en los p ro ce d im ie n to s d e sc rito s p ue de n c o n te n e r uno o m ás co m p u e s to s de in te rés, q ue inc lu ye n , pero no se lim itan a, a n tib ió tico s , co m p u e s to s m ito g é n ico s o de d ife re n c ia c ió n ú tiles para el cu ltivo de C M M . Las cé lu la s se p ueden cu ltivar, p o r e je m p lo , a te m p e ra tu ra s de 27 °C a 40 °C, que inc lu ye n de 31 °C a 37 °C. El co n te n id o de d ió x id o de ca rb o n o se p uede m a n te n e r e n tre el 2 % y el 10 % y el co n te n id o de o x íg e n o se p ue de m a n te n e r e n tre el 1 % y el 22 %.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , las C M M se cu ltivan en co n d ic io n e s y d u ra n te un p e rio do de tie m p o su fic ie n te para p ro p o rc io n a r un n ú m e ro su fic ie n te de cé lu la s para un cu ltivo a d ic ion a l. A co n tin u a c ió n , las cé lu las se cu ltivan en co n d ic io n e s q ue fa vo re ce n la fo rm a c ió n de g ru p o s e s fe ro id a le s de las cé lu las . En a lg u n a s re a liza c io n e s , las cé lu las se cu ltivan en p la cas A g g re w e ll. En a lg u n a s re a liza c io ne s , las cé lu la s se cu ltivan com o g o tas co lg an tes . En a lg u na s re a liza c io n e s , cada g o ta co lg a n te de C M M q ue se cu ltiva co n tie n e de 1000 a 500.000 cé lu la s /g o ta . Las g o tas co lg a n te s de C M M se p ueden c u ltiv a r a co n tin u a c ió n d u ra n te un p e rio do de tie m p o su fic ie n te para fo rm a r g ru p o s e s fe ro id a le s de las cé lu la s m a dre m e se n q u im a le s . En g en e ra l, las g o tas de cé lu la s se cu ltivan d u ra n te un p e rio do de tie m p o de h asta 4 días.
Las cé lu la s p ue de n d e riv a r de un s e r h u m a n o o de o tro a n im a l. P o r e je m p lo , las cé lu la s p ue de n p ro c e d e r de un ratón, cob aya , rata, g an ad o , cab a llo s , ce rdos, o ve jas o cab ra s . En a lg u n a s re a liza c io ne s , las cé lu la s se o rig in a n a p a rtir de p rim a te s no h um anos . En a lg u n o s casos, las cé lu las son a u tó lo g a s o a lo g én ica s .
En a lg u n o s casos, las cé lu las se o b tie n e n de un cu ltivo ce lu la r, lo q ue im p lica la d u p lica c ió n de la p ob lac ión (p ase s de cé lu las ). En e s to s casos, las cé lu la s son p re fe rib le m e n te de una p ob la c ió n que se d u p lica m e no s o igua l a 50, que inc lu ye una p ob lac ión que se d u p lica e n tre 4 y 50, e n tre 10 y 30. P o r lo tan to , las cé lu la s p ueden s e r del n ú m e ro de pase 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.
H ay va r io s b io m a te ria le s q ue se p ueden u sa r en in g e n ie ría de te jid o s y e n tre g a de cé lu las , y la m a yo ría de e stos m a te ria le s se co n s id e ra n "h id ro g e le s " o g e les q ue con tie n e n agua. Los re q u is ito s para e s to s m a te ria le s son 1) b io co m p a tib ilid a d : las cé lu la s se d eben p o d e r co m b in a r con los m a te ria les , a m enudo , en to d o el m a te ria l, y p e rm a n e ce r v ia b le s y fu n c io n a le s , y 2) en la m a yo ría de los casos, los h id ro g e le s ta m b ié n d eben fa c ilita r la m ig rac ión , p ro life ra c ió n y d ife re n c ia c ió n de los cé lu la s in co rp o ra d a s y e n d ó g e n a s . E x is ten lim ita c io n e s a d ic io n a le s para m a n te n e r la "ca p a c id a d de im p re s ió n " de los h id ro ge le s , a la ve z que se m a n tien e n los re q u is ito s in ic ia les de b io co m p a tib ilid a d y m ig ra c ió n /fu n c ió n . E s to s se e xp lica n en la re v is ió n de M a lda , J y col., A dv. M ate r. 2013 , 25, 5011 -5028. A d e m á s, se d esc rib e n m u ch a s fu e n te s co m e rc ia le s de h id ro g e le s q ue se p ue de n u sa r para la b io im p re s ió n en M u rp h y SV, S karda l A, A ta la A. 2013. E va lu a tio n o f h yd ro g e ls fo r b io -p rin ting a p p lica tio n s . J B iom ed M a te r R es P art A 2013 : 101 A :272 -284, que inc lu ye el c o lá g e n o tip o I, co lá g e n o /fib rin a , fib rina , h id ro ge l E x trace l™ , E x tra ce l™ UV, á c id o h ia lu ró n ico su s titu id o con tira m in a (T S -N a H y), C o rge l™ , m e tilce lu lo sa -h ia lu ro n a n o (M C -H A ), qu itosa no , q u ito sa n o /co lá g e n o , a lg in a to , a lg in a to /g e la tin a y d ia c rila to de p o lie tile n g lico l (P E G D A ).
Los m a te ria le s co m u n e s u sa do s en la in g e n ie ría de te jid o s y la b io im p re s ió n son a lg in a tos , co lá ge no s , fib rinas, f ib r in ó g e n o s , p o lie tile n g lico le s (P E G ), agar, a ga ro sa , qu itosa no , h ia lu ron a no , m e ta c rila m id a , g e la tin as , p lu ró n ico s, m a trige l, m e tilce lu lo sa y P E G -D A (d iac rila to ). A m e nu do , e s to s m a te ria le s no se usan s im p le m e n te so los, s ino que, a m enudo , se m e zc la n para c o m b in a r p ro p ie d a d e s (p o r e je m p lo , p ro p ie d a d e s g e lif ica n te s de los a lg in a to s o P E G -D A con la ca p a c id a d de a d h e s ió n ce lu la r de los co lá g e n o s /fib r in a s ) para h a c e r n ue va s co m p o s ic io n e s . A d e m á s, se p ueden d is e ñ a r n ue vo s h id ro g e le s d esde cero para te n e r en cue n ta e s ta s p ro p ie d a d e s (G u ve n d ire n y B urd ick, C u rre n t O p in io n in B io te ch n o lo g y 2013 , 24 :841 -846 ).
Los h id ro g e le s para su uso en las co m p o s ic io n e s y p ro ce d im ie n to s d e sc rito s son c o m p a tib le s con la d is p e n s a c ió n /im p re s ió n de las cé lu la s y, al m ism o tie m p o , tie n e n la ca p a c id a d de m a n te n e r las cé lu la s v ia b le s y fu n c io n a le s d u ra n te v a r io s d ía s /s e m a n a s /m e s e s d u ra n te el p roce so de b io co n se rva c ió n .
Las c o m p o s ic io n e s p ro p o rc io n a d a s en e sta so lic itu d co m p re n d e n cé lu la s q ue m a n tien e n una a lta v ia b ilid a d y fu n c io n a lid a d d e sp u é s de un a lm a ce n a m ie n to p ro lo ng a do . P o r v ia b ilid a d se e n tie n d e que, d e sp u é s de la co n se rva c ió n o el a lm a ce n a m ie n to , las cé lu la s están v iva s y son ca p a ce s de re a liza r las m ism a s fu n c io n e s c e lu la re s q ue a n tes del a lm a ce n a m ie n to . En a lg u n o s casos, una a lta v ia b ilid a d s ig n ifica q ue al m e no s el 70 %, el 71 %, el 72 %, el 73 %, el 74 %, el 75 %, el 76 %, el 77 %, el 78 %, el 79 %, el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 % , el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % de la p ob la c ió n c e lu la r in ic ia l es cap az de sob re v iv ir, c re ce r y fu n c io n a r d e sp u é s de la co n se rva c ió n o el a lm a ce n a m ie n to .
La v ia b ilid a d c e lu la r se p uede d e te rm in a r u sa nd o p ro ce d im ie n to s co n o c id o s en la té cn ica . Un e n sa yo de v ia b ilid a d es un e n sa yo p ara d e te rm in a r la ca p a c id a d de ó rga n os , cé lu la s o te jid o s para m a n te n e r o re c u p e ra r la v ia b ilid a d . La v ia b ilid a d se p uede d is tin g u ir de los e s ta d o s de to d o o n ada de v id a y m u erte m e d ia n te el uso de un índ ice cu a n tifica b le e n tre 0 y 1 (o el 0 y el 100 % ) (P e gg DE (1989 ). "V ia b ility a ssa ys fo r p rese rved ce lls , tissu e s , and o rga n s". C ryo b io lo g y 26(3 ): 212 -231 ). P o r e je m p lo , e xa m in a r la re lac ió n e n tre p o tas io y sod io en las cé lu la s p ue de s e rv ir com o índ ice de v ia b ilid a d . Si las cé lu la s no tie n e n p o tas io in tra ce lu la r a lto y sod io in tra ce lu la r bajo , e n ton ces , es p os ib le que la m e m b ra n a c e lu la r no e sté in tacta , y /o (2 ) es p os ib le que la b om b a de sod io y p o tas io no e sté fu n c io n a n d o bien. P or tan to , m u ch os e n sa yo s q ue m iden la in te g rida d de la m e m b ra n a c e lu la r se usan co m o m e d id a s cu a n tita tiva s de v ia b ilid a d . E s to s p ueden s e r azu l tr ip a n o , yo d u ro de p rop id io (YP), que son tin te s q ue p ueden p e n e tra r en las m e m b ra n a s c e lu la re s con fu g a s y se han a u to m a tiza d o en cá m a ra s de re cu e n to d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te . O tros tip o s de e n sa yo s m iden la ta s a m e ta b ó lica g en e ra l de las p o b la c io n e s ce lu la res , ta le s co m o la m e d ic ió n de A T P to ta l, e n sa yo s b a sa d o s en fo rm a zá n (M T T /X T T ) y e n sa yo s b a sa d o s en azu l de A lo m a r o b a sa d o s en re sazu rina . Sin e m ba rg o , las m e d id a s cu a n tita tiva s de la fu n c ió n fis io ló g ica no ind ican si es p os ib le la re pa ra c ió n y re cu p e ra c ió n del daño. Un e n sa yo de la ca p a c id a d de una cé lu la para a d h e rirse a una sup e rfic ie , p ro p a g a rse y, con el t ie m p o , m ig ra r y d iv id irse p ue de se r m ás ind ica tivo de q ue una cé lu la e s tá v iva , pero p ue de lle va r m u ch o m ás tie m p o y p uede se r m e no s cu a n tita tivo . D icho esto , to d a s e s ta s p ru e b a s se p ue de n u sa r com o e n sa yo s de v ia b ilid a d p ara e va lu a r el éxito de las té cn ica s de c rio co n se rva c ió n , la to x ic id a d de las s u s ta n c ia s o la e fe c tiv id a d de las su s ta n c ia s para m itig a r los e fe c to s de s u s ta n c ia s tóx icas .
En los e s tu d io s d escritos , se usó un e n sa yo de in te g rida d de m e m b ra n a PI a u to m a tiza d o (N u c le o C o u n te r N C 100 de C h e m o m e te ch Inc) com o un e n sa yo L ive /D e ad , y se u tilizó azu l de A lo m a r para m e d ir el m e ta b o lism o c e lu la r de los g rupos. T a m b ié n se u sa ron p ru e b a s fu n c io n a le s q ue m u e s tra n q ue las cé lu la s d e n tro de los g rup o s aún se pueden a d h e rir al p lá s tico de l cu ltivo c e lu la r y c re ce r a p a rtir de l g rup o y, cu a n d o los g ru p o s se m a n tien e n en su p e rfic ie s no a dh es ivas , las cé lu la s en el b o rde de l g rup o se un irán con o tros g rup o s, c re a n d o una fus ió n de g ru p o s en e s tru c tu ra s ú n icas y m ás g ran d es . Es la su p o s ic ió n g e n e ra l de que m u ch a s de las fu n c io n e s ce lu la res , ta le s com o la secre c ión de c ito c ina s , la d ife re n c ia c ió n y la fu n c ió n in m u n o m o d u la d o ra de las C M M h, se m a n tien e n si las cé lu las aún son ca p a ce s de a d h e rirse y e x te n d e rse en p la cas de cu ltivo , o si los g ru p o s de cé lu la s se fu s io n a n (q ue es el e q u iva le n te 3D a a d h e rirse y p rop a ga rse ).
S e p ue de m a n te n e r una a lta v ia b ilid a d de las cé lu las (p o r e je m p lo , C M M ) en las c o m p o s ic io n e s com o re su lta d o de las so lu c io n e s a cu o sa s en las q ue se a lm a ce n a n las cé lu las . Las so lu c io n e s a cu o sa s p ue de n co m p re n d e r, p o r e jem p lo , su s ta n c ia s q u ím ica s y n u trie n te s q ue re du cen la a p o p to s is c e lu la r y la m u erte ce lu la r.
P o r lo tan to , en a lg u n a s re a liza c io n e s , las c o m p o s ic io n e s con tien en un a g e n te c rio co n se rva n te . Los e je m p lo s no lim ita n te s de a g e n te s c r io co n se rva n te s inc lu ye n d im e tilsu lfó x id o (D M S O ), g lice ro l, p o liv in ilp irro lid in a , p o lie tile ng lico l, a lb ú m ina , d ex tran o , saca rosa , e tile ng lico l, i-e ritrito l, D -rib ito l, D -m a n ito l, D -so rb ito l, i-inos ito l, D -lac to sa , c lo ru ro de co lina , a m in o á c id o s , m e tano l, a ce tam id a , m o n o a ce ta to de g lice ro l, sa le s in o rg á n ica s o c u a lq u ie r co m b in a c ió n de los m ism os. En a lg u n o s casos, el c r io co n se rva n te co n tie n e m e d io s de co n g e la c ió n C ry o S to r® C S2, C S 5 o C S 10 (B io L ife S o lu tion s , Inc) y D M S O al 5 %. En a lg u n o s casos, el c rio co n se rva n te co n tie n e e n tre un 1 % y un 15 % de D M S O , ta l com o de un 2 % a un 7 ,5 %, inc luso , un 5 % de D M SO .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la co m p o s ic ió n ce lu la r d e sc rita co m p re n d e un a g e n te b io co n se rva n te que e lim in a los ra d ica le s libres, p ro p o rc io n a a m o rtig u a c ió n de l pH, p ro p o rc io n a so p o rte o n có tico /o sm ó tico , co n tie n e su s tra to s e ne rg é ticos , tie n e c o n c e n tra c io n e s ión icas q ue e qu ilib ra n el e s ta d o in tra ce lu la r a ba jas te m p e ra tu ra s , o cu a lq u ie r co m b in a c ió n de los m ism os. P o r e je m p lo , en a lg u n a s re a liza c io ne s , la fo rm u la c ió n de b io co n se rva c ió n co m p re n d e H yp o T h e rm o so l® (B io L ife S o lu tion s , Inc.), ta l com o H yp o T h e rm o so l® F R S . Los c o m p o n e n te s de H yp o T h e rm o so l® F R S inc lu ye n T ro lo x (á c ido 6 -h id ro x i-2 ,5 ,7 ,8 -te tra m e tilc ro m a n -2 -c a rb o x ílic o ), Na+, K+, C a 2+, M g2+, C l-, H2P O 4', H C O 3 ', H E P E S , lac to b io na to , saca rosa , m an ito l, g lucosa , d e x tra n o -40 , a d e n o s in a y g lu ta tión , con un pH de 7 ,6 y una o sm o la lid a d de 360. P o r lo tan to , en a lg u n a s re a liza c io n e s , la co m p o s ic ió n c e lu la r d e sc rita co m p re n d e un 2 -10 % de D M S O e H yp o T h e rm o so l® o H yp o T h e rm o so l® F R S .
Las c o m p o s ic io n e s p ro p o rc io n a d a s en e sta so lic itud co m p re n d e n cé lu la s en g ra n d e s v o lú m e n e s y a ltas c o n c e n tra c io n e s de cé lu las . En a lg u n a s re a liza c io ne s , las c o m p o s ic io n e s c e lu la re s d e sc rita s co n tie n e n al m enos 10 m illo ne s de cé lu la s a una co n ce n tra c ió n de al m e no s 1 m illón cé lu las /m l. P o r e je m p lo , en a lg u n a s re a liza c io n e s , la co m p o s ic ió n co m p re n d e al m e no s 10 m illo ne s, 100 m illo ne s, 1 m il m illo ne s, 10 m il m illo ne s o 50 m il m illo ne s de cé lu las a una co n ce n tra c ió n de al m e no s 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 m illo n e s de cé lu las /m l.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , las cé lu la s d e sc rita s e stán p re se n te s com o g ru p o s m u ltice lu la re s que a c tú an com o "m ic ro te jid o s ", y se p ueden u sa r co m o co m p o n e n te s b á s ico s para te jid o s 3D de o rden s u p e rio r cu a n d o se im prim en, o fo rm a to s e s ta b le s p ara cé lu las tra sp la n ta d a s en a p lica c io n e s de te ra p ia ce lu la r. P o r lo tan to , e s to s g ru p o s tien en p re fe rib le m e n te un ta m a ñ o y fo rm a u n ifo rm es , a u n q u e los g ru p o s m u ltice lu la re s de ta m a ñ o y fo rm a h e te ro g é n e o s p ueden s e r su fic ie n te s en m u ch a s a p lica c io n e s . Los g ru p o s ta m b ié n se d isp e rsa n p re fe rib le m e n te d en tro de la co m p o s ic ió n c e lu la r de m a ne ra un ifo rm e para p ro p o rc io n a r un n ú m e ro co n s ta n te de cé lu las cu a n d o se d isp en san , e x tru ye n o im prim en.
El ta m a ñ o y la d e n s id a d de los g ru p o s se p ueden s e le cc io n a r en fu n c ió n de l uso p rev is to . En a lg u n a s re a liza c io ne s , las cé lu la s e stán p re se n te s en g ru p o s q ue co n tie n e n al m e no s 1000, 2000 , 3000, 4000 , 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000 , 30.000 , 40.000 , 50.000 , 60.000 , 70.000 , 80.000 , 90.000 ,100.000 , 150.000 o 200.000 cé lu la s p o r g rupo . Los g ru p o s p re fe rib le m e n te tie n e n una v a r ia c ió n de d iá m e tro in fe rio r al 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 15 % o el 20 % d en tro de cada com p os ic ión .
Las cé lu la s d e sc rita s se su sp e n d e n en una so lu c ió n v is c o sa (es dec ir, m a te ria l de e x tru s ió n ) q ue m a n tie n e las cé lu las en su sp e n s ió n para m e jo ra r la d is trib u c ió n un ifo rm e d en tro de la com p o s ic ió n , a la v e z q ue ta m b ié n m a n tie n e la ido n e id ad de la co m p o s ic ió n para la ex tru s ión , p o r e je m p lo , para b io im p re s ió n . P o r "d is tr ib u c ió n u n ifo rm e " se e n tie n d e q ue las cé lu la s tie n e n una va r ia c ió n de d en s id a d in fe rio r al 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 15 % o el 20 % d e n tro de cada com p o s ic ió n . P o r e je m p lo , la so lu c ió n v isc o sa p uede s e r un h id ro ge l, com o los d e sc rito s a n te rio rm e n te . P o r lo tan to , la v isco s id a d es p re fe rib le m e n te lo su fic ie n te m e n te a lta para m a n te n e r una d is trib uc ió n u n ifo rm e a la v e z q ue es lo s u fic ie n te m e n te ba ja para s e r a d e cu a d a para la e x tru s ió n m e d ia n te una b io im p re so ra .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , las c o m p o s ic io n e s d e sc rita s (b io tin ta s ) se ca ra c te r iza n p o r te n e r una v isco s id a d de e n tre 500 y 1.000.000 cen tipo ise s , e n tre 750 y 1.000.000 cen tipo ise s ; e n tre 1000 y 1 ,000 ,000 ce n tipo ise s ; e n tre 1000 y 400.000 cen tipo ise s ; e n tre 2000 y 100.000 ce n tipo ise s ; e n tre 3000 y 50.000 cen tipo ise s ; e n tre 4000 y 25.000 cen tipo ise s ; e n tre 5000 y 20.000 ce n tip o ise s ; o e n tre 6000 y 15.000 cen tipo ise s . La v isco s id a d se p uede m e d ir m e d ia n te p ro ce d im ie n to s h a b itu a le s con un v isco s ím e tro .
En a lg u n o s casos, el m a te ria l de e x tru s ió n ta m b ié n es un b io m a te ria l a d e cu a d o p ara la in g e n ie ría de te jid o s , ta l com o co lá ge no , h ia lu ron a to , fib rina , a lg in a to , a ga ro sa , q u ito sa n o y c o m b in a c io n e s de los m ism os. En o tras re a liza c io ne s , los h id ro g e le s a d e cu a d o s son p o lím e ro s s in té ticos . En re a liza c io n e s a d ic ion a le s , los h id ro g e le s a d e cu a d o s inc luyen los d e riva d o s de á c id o p o lia c rílico y d e riva d o s del m ism o, ó x ido de po lie tile no , p o lie tile n g lico l y co p o lím e ro s de los m ism os, a lco ho l po liv in ílico , p o lifo s fa ce n o y co m b in a c io n e s de los m ism os.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , un co m p u e s to de e x tru s ió n co m p re n d e un fo to in ic ia d o r, que es una m o lé cu la que, tra s la a bso rc ió n de luz a una lon g itu d de o nd a e sp ec ífica , p ro d u ce e sp e c ie s re a c tiva s ca p a ce s de c a ta liz a r re a cc io n e s de p o lim e riza c ió n o p o lico n d e n sa c ió n . E s ta s re a cc io n e s ta m b ié n se d e n o m in a n fo to p o lim e riza c ió n o cu ra d o p o r rad iac ión . Los fo to in ic ia d o re s son típ ic a m e n te ce to n a s q ue co n tie n e n ta n to g rup o s a ro m á tico s com o carbo n ilo .
En a lg u n a s re a liza c io ne s , los co m p u e s to s de e x tru s ió n b a sa d o s en h id ro g e le s son g e le s te rm o rre ve rs ib le s (ta m b ié n co n o c id o s com o g e les o te rm o g e le s s e n s ib le s al ca lo r). En a lg u n a s re a liza c io n e s , un h id ro ge l te rm o rre ve rs ib le a d e cu a d o no es líqu ido a te m p e ra tu ra am b ie n te . Los p o lím e ro s co m p u e s to s de p o lio x ip ro p ile n o y p o lio x ie tile n o fo rm an g e le s te rm o rre ve rs ib le s cu a n d o se in co rp o ra n a so lu c io n e s acu osa s. E s to s p o lím e ro s tie n e n la ca p a c id a d de c a m b ia r de l e s ta d o líqu ido al e s ta do en ge l a te m p e ra tu ra s q ue se p ue de n m a n te n e r en un a p a ra to de b io im p re so ra . La tra n s ic ió n de fase de e s ta do líqu ido a e s ta d o en gel d e p e n d e de la co n ce n tra c ió n del p o lím e ro y de los in g re d ie n te s de la so lu c ió n .
Las fo rm u la c io n e s de cé lu la s e s ta b le s se p ue de n a lm acen ar, p o r e je m p lo , en una b o te lla tra d ic io n a l con ta p ó n de ro sca o m e m b ra n a de gom a, o d en tro de un d isp o s itivo de s is te m a ce rra do e sté ril q ue se p ue de sa c a r del a lm a ce n a m ie n to co n g e la d o o no co n g e la d o e in te g ra rse con un d isp o s itivo de d isp e n sa c ió n . El d isp o s itivo de d isp e n sa c ió n p ue de ser, p o r e je m p lo , una b io im p re so ra o un d isp o s itivo de inye cc ió n a u to m a tiza d o o a u to m a tiza d o o m anua l. O p c io n a lm e n te , la b io im p re so ra p uede s e r una b io im p re so ra tr id im e n s io n a l (3D ). El d isp o s itivo de d isp e n sa c ió n p ue de lle va r las cé lu la s v iva s a u b ica c io n e s e sp e c ífica s a la v e z que m a n tie n e la e s te rilid a d y la ca lid ad de las cé lu las . P o r lo tan to , en a lg u n a s re a liza c io n e s , las c o m p o s ic io n e s de cé lu la s d e sc rita s e stán co n te n id a s d en tro de un ca rtu ch o de b io tin ta o je r in g a b io m é d ica e sté ril o a sé p tica .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la p ob la c ió n de cé lu la s h o m o g é n e a s d e sc rita s y una so lu c ió n v isc o sa co m p re n d e n una b io tin ta para su uso en b io im p re s ió n . T a l com o se usa en esta so lic itud , "b io tin ta " s ig n ifica una co m p o s ic ió n líqu ida , se m isó lid a o só lid a q ue co m p re n d e una p lu ra lida d de cé lu las . En a lg u n a s re a liza c io n e s , la b io tin ta co m p re n d e s u sp e n s io n e s ce lu la res , g ru p o s de cé lu las , g e le s q ue co m p re n d e n cé lu las , cu e rp o s m u ltice lu la re s o te jid o s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , la b io tin ta co m p re n d e a d ic io n a lm e n te m a te ria l de soporte . En a lg u n a s re a liza c io ne s , la b io tin ta co m p re n d e a d ic io n a lm e n te m a te ria le s no c e lu la re s q ue p ro p o rc io n a n p ro p ie d a d e s b io m e cá n ica s e sp e c ífica s que p e rm ite n la b io im p re s ió n .
T a l com o se usa en e sta so lic itud , "b io im p re s ió n " s ig n ifica u tiliz a r la d e p o s ic ió n tr id im e n s io n a l y p rec isa de cé lu la s (p o r e je m p lo , s o lu c io n e s ce lu la res , g e le s que co n tie n e n cé lu las , s u sp e n s io n e s ce lu la res , c o n c e n tra c io n e s ce lu la res , g rup o s m u ltice lu la re s , cu e rp o s m u ltice lu la re s , e tc .) m e d ia n te una m e to d o lo g ía q ue sea co m p a tib le con un d isp o s itivo de c re a c ió n de p ro to tip o s tr id im e n s io n a l a u to m a tiza d o , a s is tid o p o r o rd e n a d o r (p o r e je m p lo , una b io im p re so ra ).
T a l com o se usa en e sta so lic itud , "ca rtu ch o " s ig n ifica c u a lq u ie r o b je to q ue sea cap az de re c ib ir (y a lb e rg a r) una b io tin ta o un m a te ria l de sop orte .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , el re c ip ie n te o ca rtu ch o tie n e p u e rtos o tu b o s e s té rile s q ue p e rm ite n que las cé lu la s y los b io m a te ria le s se e xp u lse n del re c ip ie n te o ca rtu ch o a la v e z que se m a n tien e n las co n d ic io n e s a sé p tica s cu a n d o sea necesa rio .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , una b io im p re so ra d isp e n sa b io tin ta de l ca rtu ch o en un pa tró n e sp e c ífico y en p os ic io n e s e sp e c ífica s seg ún lo ind iq ue un so ftw a re de d ise ño a s is tid o p o r o rd e n a d o r para fo rm a r una co n s tru cc ió n ce lu la r, te jid o u ó rg a n o e sp ec ífico . P ara fa b r ic a r c o n s tru cc io n e s de te jid o com p le ja s , la b io im p re so ra d ep o s ita la b io tin ta a ve lo c id a d e s p rec isas y en ca n tid a d e s u n ifo rm es . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o co m p re n d e un o rific io de d isp e n sa c ió n . En v a r ia s o tras re a liza c io n e s , un ca rtu ch o co m p re n d e 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o m ás o rific io s de d isp e n sa c ió n . En una re a liza c ió n a d ic ion a l, los b o rd e s de un o rific io de d isp e n sa c ió n son lisos o su s ta n c ia lm e n te lisos.
M u ch os tip o s de ca rtu ch o s son a d e cu a d o s para su uso con b io im p re so ra s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es co m p a tib le con la b io im p re s ió n q ue im p lica la e x tru s ió n de una b io tin ta só lid a o se m isó lid a o un m a te ria l de so p o rte a tra vé s de uno o m ás o rific io s de d isp e n sa c ió n . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es c o m p a tib le con la b io im p re s ió n q ue im p lica d is p e n s a r una so lu c ió n c e lu la r líqu ida o sem isó lida , su sp e n s ió n c e lu la r o c o n ce n tra c ió n c e lu la r a tra vé s de uno o m á s o rific io s de d isp e n sa c ió n . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es co m p a tib le con la b io im p re s ió n no con tinu a . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es co m p a tib le con b io im p re s ió n co n tin u a y /o su s ta n c ia lm e n te con tinua .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es un tu b o c a p ila r o una m ic ro p ip e ta . En a lg u n a s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o es una je r in g a o una agu ja . M u ch os d iá m e tro s in te rn os son a d e cu a d o s para ca rtu ch o s su s ta n c ia lm e n te re d o n d o s o c ilín d rico s . En v a r ia s re a liza c io ne s , los d iá m e tro s in te rn o s a d e cu a d o s inc lu ye n , a m o do de e je m p lo s no lim itan tes , 1, 10, 50, 100, 200 , 300, 400, 500, 600 , 700, 800, 900, 1000 o m ás |jm , q ue inc lu ye n in c re m e n to s en los m ism os. En o tras v a r ia s re a liza c io n e s , los d iá m e tro s in te rn os a d e cu a d o s inc luyen , a m o do de e je m p lo s no lim itan tes , 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o m ás m m , q ue inc lu ye n in c re m e n to s en los m ism os. En a lg u na s re a liza c io n e s , un ca rtu ch o tie n e un d iá m e tro in te rn o de 1 j m a 1000 jm . En una re a liza c ió n p articu la r, un ca rtu ch o tie n e un d iá m e tro in te rn o de 500 jm . En o tra re a liza c ió n p a rticu la r, un ca rtu ch o tie n e un d iá m e tro in te rn o de 250 jm . M u ch os v o lú m e n e s in te rn os son a d e cu a d o s para los ca rtu ch o s d e sc rito s en e sta so lic itud . En v a r ia s re a liza c io n e s , los vo lú m e n e s in te rn o s a d e cu a d o s inc luyen , a m o do de e je m p lo s no lim itan tes , 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 , 300, 400, 500, 600 , 700, 800, 900, 1000 o m ás ml, que inc lu ye n in c re m e n to s en los m ism os. En o tras v a r ia s rea liza c io ne s , los v o lú m e n e s in te rn os a d e cu a d o s inc luyen , a m o do de e je m p lo s no lim itan tes , 1 ,2 , 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 199, 300, 400 , 500 o m ás ml, que inc lu ye n in c re m e n to s en los m ism os.
En a lg u n a s re a liza c io ne s , un ca rtu ch o es co m p a tib le con la im p re s ió n p o r cho rro de tin ta de b io tin ta y /o m a te ria l de so p o rte en una su p e rfic ie 2D o 3D re cep to ra , ta l com o la d e sc rita en la pa ten te de EE. UU. n.° 7.051.654. En re a liza c io n e s a d ic io n a le s , un ca rtu ch o inc lu ye o rific io s de d isp e n sa c ió n en fo rm a de b o q u illa s o a g u ja s co n tro la d a s p o r v o lta je ba jo el con tro l de l có d ig o in fo rm á tico d e sc rito en e sta so lic itud .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , se m arca un ca rtu ch o para in d ica r la co m p o s ic ió n de su con ten ido . En re a liza c io n e s a d ic ion a le s , se m arca un ca rtu ch o p ara in d ica r la co m p o s ic ió n de una b io tin ta co n te n id a en el m ism o. En a lg u na s re a liza c io n e s , la su p e rfic ie de l ca rtu ch o es a co lor. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la su p e rfic ie e x te rio r del ca rtu ch o está teñ ida , p in tada , m a rcad a con un b o líg ra fo , m a rca d a con un a d h e s ivo o una co m b in a c ió n de los m ism os.
En a lg u n o s casos, el ca rtu ch o es un s is te m a de c o le c to r de un so lo uso, ta l com o el q ue se d e sc rib e en la p a ten te de EE. UU. n.° 6.712.963 , que se d e sc rib e en esta so lic itud para la e n se ñ a n za de u n id a d e s de c o le c to r de un so lo uso. En pocas pa labras , los tu b o s d e se ch a b le s y los re c ip ie n te s de pared fle x ib le se p ueden m o n ta r m e d ia n te co n e c to re s a sé p ticos . E s to s co le c to re s p ue de n in te ra c tu a r con al m e no s una vá lv u la de p inza co n tro la d a a d is ta n c ia que se a co p la so lo a la su p e rfic ie e x te rio r del tu b o de co le cto r. D ich os s is te m a s de c o le c to r y vá lv u la de p inza se p ue de n u sa r ju n to con un tip o de b om b a peris tá ltica , que, ju n to con la vá lv u la de p inza q ue se hace fu n c io n a r a d is ta nc ia , la p ue de h ace r fu n c io n a r un c o n tro la d o r q ue p ro p o rc io n a una e n tre g a a u to m a tiza d a y p rec isa de flu id o b io te cn o ló g ico en un e n to rno a sé p tico a la ve z que e v ita o reduce los p ro ce d im ie n to s de lim p ie za y co m p ro b a c ió n de ca lidad .
El ca rtu ch o d e sc rito se co n fig u ra p re fe rib le m e n te para lle n a rse a sé p tica m e n te con b io tin ta y, a con tin u a c ió n , p ro te g e r la b io tin ta de la e xp o s ic ió n al e n to rn o p ara e v ita r la co n ta m in a c ió n . P o r lo tan to , el ca rtu ch o p re fe rib le m e n te tie n e un se llo que m a n tie n e el s is te m a ce rra d o d e sp u é s de llena rlo . P re fe rib le m e n te , el ca rtu ch o ta m b ié n d e b e ría p od e r m a n te n e r las cé lu la s en la b io tin ta a una te m p e ra tu ra e sp e c ífica . P o r e je m p lo , el ca rtu ch o se p uede a is la r.
El ca rtu ch o d e sc rito ta m b ié n se co n fig u ra p re fe rib le m e n te p ara e xp u ls a r la b io tin ta de su in te rio r. P o r e je m p lo , la b io tina se p ue de e xp u ls a r p o r p res ión de a ire , p res ión h id rá u lica , p is to n e s a to rn illa d o s o s im ila res . D ado q ue la e xp u ls ió n p uede c re a r p re s io n e s s ig n ifica tiva s , el ca rtu ch o se fo rm a p re fe rib le m e n te a p a rtir de un m a te ria l ríg ido .
El ca rtu ch o tie n e al m enos un o rific io para e xp u ls a r/d is p e rs a r la b io tin ta . S in e m ba rg o , m ú ltip le s o rific io s pueden a ce le ra r la im p re s ió n . En a lg u n o s casos, la im p re so ra 3D se co n fig u ra con d os o m ás ca rtu ch o s para d isp e n sa r d os o m ás t ip o s de cé lu las . S in e m ba rg o , en a lg u n o s casos, un ú n ico ca rtu ch o co n tie n e dos o m ás c o m p a rtim e n to s y dos o m ás o rific io s para d is p e n s a r dos tip o s de cé lu la s al m ism o tie m p o . De fo rm a a lte rn a tiva , se p ueden co m b in a r 2 o m ás tip o s de cé lu la s en g ru p o s de cé lu las q ue se su sp e n d e n en el b io p o lím ero , o se p ue de n m e zc la r 2 t ip o s de cé lu la s en una re lac ió n o p tim iza d a d e n tro de la m ism a m a triz de h id ro ge l y e x tru ir la s al m ism o tiem p o .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , el ca rtu ch o co n tie n e una com p o s ic ió n , ta l com o se d e sc rib e en e s ta so lic itud , q ue co n tie n e cé lu la s su sp e n d id a s en una m a triz v isco sa , de m o do que las cé lu las sean v ia b le s y estén lis tas para im p rim ir una vez q ue se re tiren de l a lm a ce n a m ie n to (p o r e je m p lo , c o n g e la d a s o no co n g e la d a s ). En a lg u n o s casos, e sto s ig n ifica que la m a triz v is c o sa es lo su fic ie n te m e n te v isc o sa para m a n te n e r las cé lu la s d isp e rsa s de fo rm a u n ifo rm e en la co m p o s ic ió n , es dec ir, no d e p o s ita d a s en el fo n d o del ca rtucho .
T a m b ié n se d e sc rib e un k it para p ro d u c ir c o m p o s ic io n e s de b io tin ta , que co m p re n d e una co m p o s ic ió n de la invenc ión , ta l co m o se d e sc rib e en e sta so lic itud , q ue co m p re n d e g ru p o s de cé lu la s m adre , un p o lím e ro b io co m p a tib le y un a g e n te de re ticu lac ió n . El k it ta m b ié n p ue de c o n te n e r un p o lím e ro b io co m p a tib le no re ticu lad o , ta l com o a lg in a to . El p o lím e ro b io co m p a tib le está en el m ism o re c ip ie n te que los g ru p o s de cé lu las . El k it con tie n e un a ge n te de re ticu lac ió n , ta l com o su lfa to de ca lc io . E s te a g e n te e stá en un re c ip ie n te d is tin to al de los g ru p o s de cé lu la s y el po lím ero b io co m p a tib le . El k it p uede c o n te n e r a d e m á s un m e d io p ara m e zc la r los in g re d ie n te s del kit, ta l com o una je rin g a .

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. U na co m p o s ic ió n q ue co m p re n d e cé lu la s m adre , s ie m p re que las cé lu la s no sean cé lu la s m a dre h um a n a s to tip o te n te s , su sp e n d id a s en una m a triz v isco sa , d on de las cé lu la s tie n e n una d e n s id a d c e lu la r m e d ia de al m e no s un m illón de cé lu la s p o r m ililitro , d o n d e la m a triz v isc o sa tie n e una v is c o s id a d e fe c tiva para m a n te n e r una v a r ia c ió n de la d e n s id a d c e lu la r in fe rio r al 10 % d u ra n te al m e no s 48 horas, d o n d e la m a triz v isc o sa co m p re n d e un po lím ero b io co m p a tib le s e le cc io n a d o de e n tre el g rup o que co m p re n d e un p o lisa cá rid o , un p o lip é p tid o o una g lu co p ro te ín a , d on de las cé lu la s tie n e n una v ia b ilid a d c e lu la r de al m e no s el 70 % d e sp u é s de a lm a ce n a rla s d u ra n te al m e no s 7 d ías a 4 °C,
d on de las cé lu las se fo rm a n en g ru p o s q ue co n tie n e n una m e d ia de 1000-200.000 cé lu la s p o r g rupo , d o n d e los g rup o s re tien en la ca p a c id a d de fu s io n a rse d e sp u é s de h a b e rlo s a lm a ce n a d o d u ra n te al m e no s 7 d ías en 4 °C.
2. La co m p o s ic ió n de la re iv in d ica c ió n 1, d o n d e los g rup o s tie n e n una v a r ia c ió n de d iá m e tro m e d ia in fe rio r al 10 % d en tro de la com p os ic ión .
3. La co m p o s ic ió n de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 o 2, d o n d e la co m p o s ic ió n co m p re n d e un a ge n te b io co n se rva n te , un a g e n te c rio co n se rva n te o una co m b in a c ió n de los m ism os.
4. La co m p o s ic ió n de la re iv in d ica c ió n 3, d o n d e el a ge n te c rio co n se rva n te co m p re n d e d im e tilsu lfó x id o (D M S O ).
5. La co m p o s ic ió n de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, d o n d e la m a triz v isc o sa co m p re n d e un b io p o lím ero .
6. La co m p o s ic ió n de la re iv in d ica c ió n 5, d o n d e el b io p o lím e ro es un p o lisacá rido , un p o lip é p tid o o una g lu co p ro te ín a .
7. La co m p o s ic ió n de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-3 o 5 o 6 , d on de el p o lím e ro b io co m p a tib le co m p re n d e un po lisacá rido .
8. El p ro ce d im ie n to de la re iv in d ica c ió n 7, d o n d e el p o lisa cá r id o es a lg ina to .
9. La co m p o s ic ió n de la re iv in d ica c ió n 6 , d o n d e el b io p o lím e ro es una m o lé cu la de la m a triz e x tra c e lu la r d e riva d a de fo rm a n a tu ra l o s in té tica .
10. La co m p o s ic ió n de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 9, d on de las cé lu la s co m p re n d e n cé lu las m adre m e se n q u im a le s .
11. La co m p o s ic ió n de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 10, d on de las cé lu la s co m p re n d e n a d e m á s cé lu las e nd o te lia les .
12. Un k it que com p re nd e :
a) una co m p o s ic ió n de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3; y
b) un a g e n te de re ticu lac ió n .
13. Un d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o q ue co m p re n d e la co m p o s ic ió n de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 8, d on de el d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o se co n fig u ra para d is p e n s a r la co m p o s ic ió n co m o una u n idad d iscre ta , d on de cada u n id ad d isc re ta co m p re n d e c a n tid a d e s co n tro la d a s de las cé lu las , d onde , p re fe rib le m e n te , el d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o es un ca rtucho .
14. El d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o según la re iv in d ica c ió n 13, d on de el d isp o s itivo de s is te m a ce rra d o se co n fig u ra p ara su uso en un d isp o s itivo de im p re so ra tr id im e n s io n a l (3D ).
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