WO2005003331A1 - Método para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro - Google Patents

Método para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro Download PDF

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WO2005003331A1
WO2005003331A1 PCT/ES2004/000140 ES2004000140W WO2005003331A1 WO 2005003331 A1 WO2005003331 A1 WO 2005003331A1 ES 2004000140 W ES2004000140 W ES 2004000140W WO 2005003331 A1 WO2005003331 A1 WO 2005003331A1
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culture
cells
support
culture medium
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PCT/ES2004/000140
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Myriam Fabre
Sonia Gonzalez Menoyo
Mariana Lopez Matas
Roser Pagan I Esquius
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Advanced In Vitro Cell Technologies S.L.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Definitions

  • the invention relates to obtaining a method for storing and transporting organized two-dimensional cell cultures in vitro, as well as obtaining a kit for storing and transporting said cultures.
  • Cell cultures homogeneous or not (co-cultures), can constitute useful models of some genetic, biochemical, metabolic or physiological processes that take place in the living organism.
  • the ease of handling allows the analysis of a large number of conditions before conducting definitive animal experiments or clinical trials in humans.
  • the "in vitro" models constitute a tool for the validation of new therapeutic targets, for the selection of series heads in high-performance systems, for the definition of the mechanism of action of new molecules and, in general, for biomedical research, biotechnological or cosmetic.
  • Huvec umbilical cord cells grown to confluence, can be induced to form structures comparable to blood vessels under appropriate experimental conditions, making them a good model of angiogenesis (Vailhe et al., Lab. Invest. 81: 439- 452, 2001). However, the number of cell divisions prior to the experiment and the stimulus used are critical to obtain an adequate response.
  • Document EP 702 081 describes a method for storing and transporting three-dimensional tissues that consists of placing said three-dimensional tissue fixed on two types of sponges in a gelatin solution, in such a way that by cooling it gels, thus facilitating its transport and storage.
  • the object of the present application is to provide a method for the storage and transport of organized two-dimensional cell cultures in vitro that meets the needs of the state of the art mentioned above.
  • Figure 1 Response in a migration assay of HUVEC endothelial cells, stimulated or not, without conditioning medium (cells that have not been maintained in the gelatin medium) and with conditioning medium (72 hours after being maintained in the gelatin medium), measured in fluorescence units.
  • the invention provides in its main aspect a method for storage and / or transportation of in vitro organized cell cultures comprising the following steps: a) coating with a gelatin solution in the culture medium at a concentration of 1 to 5% of an organized cell culture immobilized on an asymmetric support, said cell culture comprising cells in the adequate functional state, b) solidification at a temperature of 15 to 25 ° C of the gelatin added to the support, and c) storage and / or transport of the cell culture at a temperature of 15 to 25 ° C, for a period of up to 96 hours.
  • the present application also provides in a second aspect of the invention a kit for the storage and transportation of two-dimensional cell cultures organized in vitro according to the method of the invention comprising: i) an asymmetric support, and
  • the invention provides a method for the storage and / or transport of organized two-dimensional cell cultures in vitro, comprising the following steps: a) coating with a gelatin solution in the culture medium at a concentration of 1 to 5 % by weight of an organized cell culture immobilized on an asymmetric support, said cell culture comprising cells in the adequate functional state, b) solidification at a temperature of 15 to 25 ° C of the gelatin added to the support, and c) storage and / or transport of cell culture at a temperature from 15 to 25 ° C, for a period of up to 96 hours.
  • the method of the invention comprises the following additional steps: d) liquefaction of the gelatin, e) elimination of the gelatin and its replacement by a culture medium, and, f) incubation of the culture.
  • the method of the invention enables the physiological properties of cells to be maintained during storage and / or transport of the cell culture or model and, in addition, the essential mechanical properties for the cell model to be protected.
  • asymmetric support is understood as those containers that contain two compartments physically separated by a semi-permeable membrane on top of which the culture cells are placed.
  • the present invention employs the transwell type support.
  • the two-dimensional cell cultures of the invention are organized cultures such as: Huvec cells grown to confluence on a collagen support; confluent culture of differentiated Caco-2 cells; or any other type of cells capable of growing in monolayers such as fibroblasts, tumor cells, liver cells, endothelial cells, etc.
  • intestinal epithelial lines derived from tumors are Caco-2, TC7, HT29
  • the organized two-dimensional cell culture of the invention is differentiated, polarized, and functionally active.
  • the gelatin solution is prepared by dissolving gelatin in the same culture medium, which acts as a solvent. Thanks to the use of the culture medium as a solvent, it is achieved that the culture stored and / or transported according to the method of the present invention guarantees the user the preservation of the functional properties of the culture and an immediate use.
  • the gelatin solution used is 2.5% by weight.
  • any commercial gelatin can be used, such as gelatin type A of pigskin.
  • any commercial culture medium can also be used, as a medium
  • the gelatin solution in the culture medium can be supplemented with fetal bovine serum (10% FBS) and Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine (complete culture medium).
  • the cell culture can be prepared in the following way: first, before planting the cells, perform a coating that involves: 1) placing the inserts or transwells on top of the wells of the corresponding size; 2) apply a solution of collagen (or other cell-type dependent extracellular matrix component) in DMEM culture medium (1g / L glucose) without serum (or other) on the upper face of the filters (semipermeable membranes) of each insert. commercial medium); and 3) preferably leave at 37 ° C in the cell culture oven (90% humidity, 5% C0 2 ). Before using the insert, the excess coating solution is aspirated from the apical side, left for approximately 15 to 30 minutes in the culture oven, and the cells corresponding to the density determined for each cell type and for each type of test.
  • the characteristics of the inserts or transwells used are specifically determined by the cell type and the assay to which the present invention can be applied. Depending on the type of cell used in the culture and the type of assay, after a number of days elapsed, controls are carried out to determine the functional status of the cellular system. For example, in the case of cellular systems that are used as barrier models, TEER (TransEpithelial Electrical Resistance) and paracellular permeability can be used.
  • TEER TransEpithelial Electrical Resistance
  • paracellular permeability can be used.
  • a determination of the migration / invasion capacity is made by labeling with a fluorochrome (eg, calcein) of cells that have migrated to the lower part of the filter and subsequent quantification by fluorimetry.
  • a fluorochrome eg, calcein
  • the cell culture is coated with a gelatin solution in the culture medium at a concentration of 1 to 5%.
  • the gelatin will be applied at the precise moment in which it has been verified that the cellular system has just reached the adequate functional state, so that the already functional cellular system is immobilized, but the user is left a time frame for do your trials upon receiving the system.
  • the elapsed cultivation time is called "life time”.
  • the life times of cell cultures depend not only on the cell types of the culture (fibroblasts, tumor lines, etc.) but also on their functional application (assay barrier pass, adhesion test, migration test, invasion test). Their determination is a matter of experimental practice.
  • the lifespan will be between 30 minutes and 1 hour after the cells are seeded.
  • the time will be between 1 and 24 hours.
  • the life time will be 13 days after seeding the cells, after which time they are already functional as a barrier and the gelatin is applied, leaving the user until day 25 of culture to carry out the barrier passage test.
  • suitable functional state is understood to be the state that viable cells of the culture present when they are capable of performing the function assigned to them in the assay.
  • the plate is incubated with solid gelatin inside a cell incubator until the gelatin is completely liquefied, preferably at 37 ° C, 90% humidity and 5% C0 2 for 3 to 4 hours until the gelatin is completely liquefied. It is then removed from both compartments by aspiration and the culture is washed with a balanced culture medium at 37 ° C. Subsequently, the specific culture medium is applied to the cells in question and the The latter are preferably incubated at 37 ° C in 90% humidity / 5% C0 2 until use.
  • the present application provides in a second aspect of the invention a kit for the storage and transport of two-dimensional cell cultures organized in vitro according to the method of the invention, comprising: i) an asymmetric support, and ii) a gelatin solution in the culture medium at a concentration of 1 to 5%.
  • the kit of the present invention uses a transwell type support as an asymmetric support.
  • Example 1 Method for storing and transporting the C Caaccoo model - 22 d dee b baarrrreerraa i inntteessttiinnaall i inn v viittrroo.
  • Pig skin gelatin type A is used, dissolved in DMEM culture medium (1g / L glucose) at 50 ° C and directly at the use concentration.
  • the inserts 12 hours before seeding the cells, the inserts (6.5mm diameter transwells) are placed on top of the wells of the corresponding size, and it is applied on the upper face of the polycarbonate filters (semipermeable membranes of 0.4 ⁇ m pore diameter) of each insert a rat tail type I collagen solution (20 ⁇ g / ml) in DMEM culture medium (1g / L glucose) without serum, and left at 37 ° C in the culture oven cell phones (90% humidity, 5% C0 2 ). Before use, the excess coating solution is aspirated from the apical face, left for 15 to 30 minutes in the culture oven, and the Caco-2 cells are seeded at a density of 5 X 10 5 cells / cm 2 . The culture is maintained for 13 days, with medium changes every 48-72 hours, putting 300 ⁇ l of complete culture medium in the apical compartment and 900 ⁇ l in the basal.
  • the barrier status (polarization) controls of the Caco-2 monolayer were performed using TEER (TransEpithelial Electrical Resistance) and paracellular permeability. These controls make it possible to determine the functional state of the cellular system as a barrier before coating it with gelatin.
  • TEER TransEpithelial Electrical Resistance
  • the plate is incubated with solid gelatin inside a cell incubator at 37 ° C, 90% humidity and 5% C0 2 for 3 to 4 hours until the complete gelatin liquefaction . It is then removed from both compartments by aspiration and the culture is washed with complete culture medium balanced at 37 ° C. Subsequently, the specific culture medium for Caco-2 cells is applied and the cells are incubated at 37 ° C in 90% humidity / 5% C0 2 until use (minimum 24 hours; maximum 9 days later), changing the medium every 48 -72 hours.
  • Table 1 Stability of the functional barrier state of the Caco-2 cellular system stored in 2.5% room temperature gelatin, evaluated by TEER measurement (values in ohm x cm 2 ).
  • Caco-2 up to 4 days at room temperature without affecting its functional barrier status; and 2) once the gelatin has been removed, maintain its functional state for up to 9 days afterwards to carry out barrier passage tests.
  • Example 2 Characteristics of the cultures and determination of the life times of the culture before applying the gelatin.
  • Table II indicates some of the cell types that can be cultivated in transwells that form monolayers and that are capable of being storable and transportable in gelatin in its barrier state and, therefore, cultures to which the present method of transport.
  • Caco-2, TC7, HT29 M6 tumor-derived intestinal epithelial lines
  • - MDCK kidney epithelial line
  • HEK primary human skin keratinocytes
  • HUVEC HMEC-1
  • BBEC BBEC
  • HAEC HAEC
  • BAEC primary lines or cultures of endothelial cells.
  • Table II Recommended cell densities for seeding in inserts and culture times for obtaining in vitro barrier systems.
  • the cultivation times indicated in Table II refer to the optimal time interval for obtaining a polarized monolayer, beyond which it loses its optimal functional properties as a cell barrier.
  • Gelatin is applied to the culture at the moment when it reaches the adequate functional state.
  • gelatin is preferably applied on day 13 (approximate minimum time at which cells begin to form a functional polarized monolayer or barrier). They can be kept in gelatin until approximately day 17 at room temperature and used until approximately day 25, without losing their functional barrier properties.
  • the life time will be between 30 minutes and 1 hour after seeding the cells. .
  • the time will be between 1 and 24 hours.
  • Example 3 Method for storing and transporting systems cells for "ready to use” migration / invasion assays.
  • Pig skin gelatin type A is used, dissolved in the corresponding culture medium of the cell type to be used (for example, DMEM
  • the inserts In case of coating, 12 hours before sowing the cells, the inserts (Fluoroblock system of 3 or 8 ⁇ m diameter) are placed on top of the wells of corresponding size, it is applied on the upper and lower face of the filters of each insert a solution of the corresponding matrix (collagen, fibronectin, vitronectin etc.) diluted in PBS, and left at 37 ° C in the cell culture oven (90% humidity, 5% C0 2 ). Before use, excess coating solution is aspirated from the apical side, left for 15 to 30 minutes in the culture oven, and the cells are seeded at a density that depends on the cell type (between 5 x
  • the gelatin solution is placed in a culture bath at 37 ° C until its complete liquefaction and equilibrates at the temperature of the culture (37 ° C).
  • the culture medium is then removed from the apical compartment of each insert and washed with culture medium (without serum in this case).
  • the plate is incubated with solid gelatin inside a cell incubator at 37 ° C, 90% humidity and 5% CO 2 for 3 to 4 hours until the complete liquefaction of the gelatin. It is then removed from both compartments by aspiration and the culture is washed with serum-free culture medium equilibrated at 37 ° C. At this time the culture is ready for the migration / invasion test.
  • the response of HUVEC cells that have not been maintained in conditioning medium is compared with the response of HUVEC cells maintained for 72 hours with conditioning medium.
  • the cells have been stimulated (control +) with complete EBM medium (with growth factors and 10% fetal bovine serum).
  • Unstimulated cells have been maintained with EBM without supplement in the basal part.
  • the cells kept in gelatin are capable of responding to a migratory stimulus (+ control in the figure).
  • This result indicates that the gelatin storage method described in this invention allows: 1) to immobilize the HUVEC system for up to 3 days at room temperature without affecting its functional state; and 2) once the gelatin is removed, a migration test can be performed.

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Abstract

El método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25°C de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de hasta 96 horas. La presente invención también proporciona un kit para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro según el método de la invención que comprende: i) un soporte asimétrico, y ii) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.

Description

MÉTODO PARA EL ALMACENAMIENTO Y/O TRANSPORTE DE CULTIVOS CELULARES IN VITRO.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con la obtención de un método para el almacenamiento y de transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro, así como con la obtención de un kit para el almacenamiento y transporte de dichos cultivos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los cultivos celulares, homogéneos o no (cocultivos), pueden constituir modelos útiles de algunos procesos genéticos, bioquímicos, metabólicos o fisiológicos que tienen lugar en el organismo vivo. La facilidad de su manipulación permite el análisis de gran número de condiciones antes de realizar los experimentos definitivos en animales o los ensayos clínicos en seres humanos. Los modelos "in vitro" constituyen una herramienta para la validación de nuevas dianas terapéuticas, para la selección de cabezas de serie en sistemas de alto rendimiento, para la definición del mecanismo de acción de nuevas moléculas y, en general, para la investigación biomédica, biotecnológica o cosmética.
En general, todos los modelos basados en cultivos celulares tienen una vida útil limitada. Así, las células en cultivo pasan por diferentes fases de diferenciación, y requieren de manipulación continua para mantener las propiedades que las hacen un modelo adecuado. Por ejemplo, el modelo de barrera gastrointestinal basado en el cultivo confluyente de células Caco-2 requiere 21 días para alcanzar el estado de diferenciación que permite reproducir muchas de las propiedades de la mucosa intestinal (Le Ferrec et al., ATLA 29:649-668, 1999), y su utilidad se prolonga sólo durante una ventana de unos 3 a 5 días. Las células BC2, utilizadas como modelo de célula hepática, requieren entre tres y cuatro semanas de diferenciación antes de adquirir las propiedades que las hacen un buen modelo, y las condiciones de cultivo posteriores son clave para que respondan a los tratamientos experimentales de forma parecida al hepatocito (MJ Gómez-
Lechón, et al., Eur.J. Biochem.268:1448, 2001). Las células de cordón umbilical Huvec, crecidas hasta confluencia, pueden ser inducidas a formar estructuras comparables a los vasos sanguíneos en condiciones experimentales adecuadas, por lo que constituyen un buen modelo de angiogénesis (Vailhe et al., Lab. Invest. 81 :439-452, 2001). Sin embargo, el número de divisiones celulares previo al experimento y el estímulo utilizado son críticos para obtener una respuesta adecuada.
Estas limitaciones en la manipulación y generación de los diferentes modelos celulares "in vitro" los hacen de difícil implementación para los usuarios ocasionales, y en general limitan la comercialización de los modelos en su formato final. El problema se agudiza en modelos complejos, en los que las células deben imitar a las barreras naturales del organismo (Rubas et al., J. Pharma. Sci., 85:165-169, 1996; Walter et al., J. Pharma. Sci., 85:1070-1076; Irvine et al., J. Pharma. Sci., 88:28-33, 1999; Gaillard et al., Eur. J. of Pharma. Sci., 12:215-222, 2001 ); o los cultivos deben realizarse sobre soportes asimétricos, separando dos compartimientos o con una fuerte dependencia en la polarización de los componentes del sistema. En estos casos, a la complejidad del modelo y a sus limitaciones temporales se añaden problemas de tipo mecánico, que hacen que los golpes o las sacudidas puedan invalidar el sistema. Los investigadores pueden acceder a los diferentes componentes del modelo (soporte, medio y aditivos de cultivo y líneas celulares), y posteriormente deben combinarlos en el laboratorio utilizando procesos más o menos laboriosos. En el mejor de los casos el investigador final puede recibir las células ya listas para su uso, pero con limitaciones que prácticamente obligan a realizar los experimentos dentro de los dos días posteriores a la recepción, e imponen serias restricciones en la distribución del modelo por parte de la compañía que lo comercializa, como por ejemplo In Vitro Technologies. El documento EP 702 081 describe un método para el almacenamiento y transporte de tejidos tridimensionales que consiste en situar dicho tejido tridimensional fijado sobre dos tipos de esponjas en una solución de gelatina, de tal forma que por enfriamiento ésta se gelifica, facilitando así su transporte y almacenamiento.
Existe por tanto en el estado de la técnica la necesidad de disponer de un método para poder suministrar modelos basados en cultivos celulares bidimensionales organizados a punto para ser utilizados y con sus propiedades funcionales intactas de forma que, por un lado, el investigador disponga de margen de maniobra para su utilización y, por otro, la compañía suministradora pueda plantear tiempos de entrega dentro de los márgenes logísticos razonables de la distribución internacional.
El objeto de la presente solicitud consiste en proporcionar un método para el almacenamiento y el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro que resuelva las necesidades del estado de la técnica mencionadas anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 - Respuesta en un ensayo de migración de células endoteliales HUVEC, estimuladas o no, sin medio de condicionamiento (células que no han sido mantenidas en el medio con gelatina) y con medio de condicionamiento (72 horas después de haber sido mantenidas en el medio con gelatina), medida en unidades de fluorescencia.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona en su aspecto principal un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares organizados in vitro que comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25°C de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de hasta 96 horas.
La presente solicitud también proporciona en un segundo aspecto de la invención un kit para el almacenamiento y el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro según el método de la invención que comprende: i) un soporte asimétrico, y
¡i) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.
DESCRICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona en su aspecto principal un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro que comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% en peso de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25°C de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de hasta 96 horas.
En una realización particular, el método de la invención comprende las siguientes etapas adicionales: d) licuación de la gelatina, e) eliminación de la gelatina y sustitución de la misma por un medio de cultivo, y, f) incubación del cultivo.
El método de la invención hace posible que durante el almacenamiento y/o transporte del cultivo o modelo celular se mantengan las propiedades fisiológicas de las células y, además, que se protejan las propiedades mecánicas esenciales para el modelo celular.
En el contexto de la presente invención se entiende por soporte asimétrico aquellos recipientes que contienen dos compartimentos físicamente separados por una membrana semipermeable encima de la cual se sitúan las células del cultivo. Como soporte asimétrico preferido la presente invención emplea el soporte tipo transwell. Los cultivos celulares bidimensionales de la invención son cultivos organizados como por ejemplo: células Huvec crecidas a confluencia sobre un soporte de colágeno; cultivo confluyente de células Caco-2 diferenciadas; o cualquier otro tipo de células capaz de crecer en monocapas tales como fibroblastos, células tumorales, hepáticas, endoteliales, etc. Así, ejemplos de líneas epiteliales intestinales derivadas de tumores son Caco-2, TC7, HT29
M6; un ejemplo de línea de epitelio de riñon es MDCK; un ejemplo de keratinocitos humanos primarios de piel es HEK; finalmente ejemplos de líneas o cultivos primarios endoteliales son HUVEC, HMEC-1 , BBEC, HAEC y BAEC. Preferentemente, el cultivo celular bidimensional organizado de la invención está diferenciado, polarizado y es funcionalmente activo. Según la presente invención, la solución de gelatina se prepara disolviendo gelatina en el mismo medio de cultivo, que actúa como disolvente. Gracias al empleo del medio de cultivo como disolvente se consigue que el cultivo almacenado y/o transportado según el método de la presente invención garantice al usuario la preservación de las propiedades funcionales del cultivo y una utilización inmediata. Preferiblemente la solución de gelatina empleada es del 2.5% en peso.
En el método de la invención se puede emplear cualquier gelatina comercial, como por ejemplo gelatina tipo A de piel de cerdo. Similarmente, también se puede emplear cualquier medio de cultivo comercial, como un medio
DMEM (1 g/L glucosa). Es "aconsejable" preparar la solución de gelatina con un máximo de 7 días antes de aplicarla al cultivo, ya que de lo contrario ésta pierde parte de sus propiedades de "conservación", las cuales son necesarias para el buen funcionamiento de la presente invención.
La solución de gelatina en el medio de cultivo puede ser suplementada con suero bovino fetal (FBS 10%) y Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de cultivo completo).
El cultivo celular puede prepararse del siguiente modo: realizar primeramente, antes de sembrar las células, un coating que implica: 1 ) colocar los insertos o transwells encima de los pocilios de tamaño correspondiente; 2) aplicar sobre la cara superior de los filtros (membranas semipermeables) de cada inserto una solución de colágeno (u otro componente de matriz extracelular, dependiente del tipo celular) en medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) sin suero (u otro medio comercial); y 3) dejar preferiblemente a 37°C en la estufa para cultivos celulares (90% humedad, 5% C02). Antes de la utilización del inserto, se aspira el exceso de solución de coating de la cara apical, se deja aproximadamente de 15 a 30 minutos en la estufa para cultivos, y se siembran las células correspondientes a la densidad determinada para cada tipo celular y para cada tipo de ensayo. Se mantiene el cultivo durante el tiempo necesario al alcance del estado funcional del sistema, con cambios de medio preferiblemente cada 48-72 horas si necesario. Las características de los insertos o transwells utilizados (tamaño, diámetro de poros, material) vienen determinadas de manera específica por el tipo celular y el ensayo al cual se puede aplicar la presente invención. En función del tipo de célula empleada en el cultivo y del tipo de ensayo, tras un número de días transcurridos, se realizan controles para determinar el estado funcional del sistema celular. Por ejemplo, en el caso de los sistemas celulares que se utilizan como modelos de barreras, se pueden emplear medida de TEER (Resistencia Eléctrica TransEpitelial) y permeabilidad paracelular. En el caso de los sistemas celulares que se utilizan para ensayos de migración/invasión, se realiza una determinación de la capacidad de migración/invasión mediante mareaje con un fluorocromo (por ejemplo, calceina) de las células que hayan migrado a la parte inferior del filtro y posterior cuantificación por fluorimetría.
Según la presente invención, el cultivo celular se recubre con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración de 1 a 5%. De forma general, se aplicará la gelatina en el preciso momento en que se haya comprobado que el sistema celular acaba de alcanzar el estado funcional adecuado, de manera que se inmoviliza el sistema celular ya funcional, pero se deja al usuario un margen de tiempo para hacer sus ensayos al recibir el sistema. Al tiempo de cultivo transcurrido se denomina "tiempo de vida". De aquí la aplicación de la presente invención a sistemas celulares "ready-to- use". Los tiempos de vida de los cultivos celulares, es decir el tiempo de vida del cultivo en que se aplica la gelatina, dependen no sólo de los tipos celulares del cultivo (fibroblastos, líneas tumorales, etc.) sino también de su aplicación funcional (ensayo de paso de barrera, ensayo de adhesión, ensayo de migración, ensayo de invasión). Su determinación es una cuestión de práctica experimental. Así, en el caso específico de los fibroblastos y células HUVEC sembradas en soportes tipo transwell y en condiciones bajo las cuales estas células estén funcionalmente activas para un ensayo de migración, el tiempo de vida será entre 30 minutos y 1 hora después de sembrar las células. En el caso de un ensayo de invasión, el tiempo será entre 1 y 24 horas. En cambio, en el caso de las células Caco-2 sembradas en transwells, el tiempo de vida será 13 días después de sembrar las células, tiempo a partir del cual ya son funcionales como barrera y se aplica la gelatina, dejando al usuario hasta el día 25 de cultivo para realizar el ensayo de paso de barrera.
En el contexto de la presente invención se entiende por estado funcional adecuado, el estado que presentan las células viables del cultivo cuando son capaces de realizar la función que tienen asignada en el ensayo.
Para efectuar la aplicación de la gelatina sobre el cultivo en primer lugar es necesario licuar completamente la solución de gelatina, y equilibrarla a la temperatura del cultivo, en general 37°C. A continuación, se retira el medio de cultivo de los 2 compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio de cultivo en los 2 compartimentos de cada inserto. Posteriormente se aplica gelatina 2,5% líquida en el compartimiento apical y en el compartimiento basal, y se deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo y a temperatura ambiente (20-25°C). Una vez ha solidificado la gelatina, se sellan las placas con parafilm y se mantienen a temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4 días después).
En el momento en que se quiera utilizar el cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro de un incubador de células hasta la completa licuación de la gelatina, preferiblemente a 37°C, 90% humedad y 5% C02 durante 3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración y se lava el cultivo con medio de cultivo equilibrado a 37°C. Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para las células en cuestión y se incuban estas últimas preferiblemente a 37°C en 90% humedad / 5% C02 hasta su uso.
La presente solicitud proporciona en un segundo aspecto de la invención un kit para el almacenamiento y el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro según el método de la invención que comprende: i) un soporte asimétrico, y ii) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.
En una realización particular, el kit de la presente invención emplea como soporte asimétrico un soporte tipo transwell.
Los ejemplos que se describen a continuación sirven para ilustrar la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Método para el almacenamiento y transporte del modelo C Caaccoo--22 d dee b baarrrreerraa i inntteessttiinnaall i inn v viittrroo.
1 - Preparación de la gelatina
Se utiliza gelatina tipo A de piel de cerdo, disuelta en medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) a 50°C y directamente a la concentración de uso
(máxima concentración que se puede disolver: 10%). En el presente caso, se pesan 2,5g de gelatina en polvo y se disuelve con 100 mi de medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa). Se esteriliza en seguida (en "caliente") mediante filtración por filtros de 0,22μm de poro. A continuación se suplementa con suero bovino fetal (FBS 10%) y Penicilina/Streptomicina/L-
Glutamina (medio de cultivo completo). Finalmente se guarda a 4°C hasta su utilización.
2- Preparación del cultivo Caco-2 polarizado.
Coating: 12 horas antes de sembrar las células, se colocan los insertos (transwells de 6,5mm de diámetro) encima de los pocilios de tamaño correspondiente, y se aplica sobre la cara superior de los filtros de policarbonato (membranas semipermeables de 0,4μm de diámetro de poro) de cada inserto una solución de colágeno tipo I de cola de rata (20 μg/ml) en medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) sin suero, y se deja a 37°C en la estufa para cultivos celulares (90% humedad, 5% C02). Antes de su utilización, se aspira el exceso de solución de coating de la cara apical, se deja de 15 a 30 minutos en la estufa para cultivos, y se siembran las células Caco-2 a una densidad de 5 X 105 células/cm2. Se mantiene el cultivo durante 13 días, con cambios de medio cada 48-72 horas, poniendo 300μl de medio de cultivo completo en el compartimento apical y 900μl en el basal.
Al día 13, se realizan los controles de estado de barrera (polarización) de la monocapa Caco-2 mediante medida de TEER (Resistencia Eléctrica TransEpitelial) y permeabilidad paracelular. Estos controles permiten determinar el estado funcional del sistema celular como barrera antes de recubrir con gelatina.
3- Aplicación de la gelatina
Se pone en un baño de cultivo a 37°C hasta su completa licuación y se equilibra a la temperatura del cultivo (37°C). A continuación, se retira el medio de cultivo de los 2 compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio de cultivo completo en los 2 compartimentos de cada inserto. Posteriormente se aplica 300μl de gelatina 2,5% líquida en el compartimiento apical y 900μl en el compartimiento basal, y se deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo y a temperatura ambiente (20-25°C). Una vez ha solidificado la gelatina, se sellan las placas con parafilm y se mantienen a temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4 días después).
4- Eliminación de la gelatina
En el momento en que se quiera utilizar el cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro de un incubador de células a 37°C, 90% humedad y 5% C02 durante 3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración y se lava el cultivo con medio de cultivo completo equilibrado a 37°C. Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para células Caco-2 y se incuban las células a 37°C en 90% humedad / 5% C02 hasta su uso (mínimo 24 horas; máximo 9 días después), cambiando el medio cada 48-72 horas.
00 o en o en en
Tabla 1: Estabilidad del estado funcional de barrera del sistema celular Caco-2 almacenado en gelatina 2,5% temperatura ambiente, evaluado mediante medida de TEER (valores en ohm x cm2).
TIEMPO INMOVILIZACIÓN EN GELATINA 1DIA 3 DÍAS 4 DÍAS . 5DJAS 7 DÍAS ANTES 3637,81 ±93,34 3027,97 ±154,55 4949,01 ±140,90 4855,51 ±5,5 4855,51 ±5,5
TIEMPO 3 DÍAS 3451,89 ±541,30 3117,73+ 13,10 3528,51 ±198,45 1743,17± 63,29 882,97 +563,3
DESPUÉS 5 DÍAS 3434,53 ±5,81 3143,03± 178,6 ND ND ND
GELATINA 9 DÍAS 4110,15 ±503,74 3318,15± 267,4 ND ND ND
(ND: No Determinado)
re Tal y como se presenta en la Tabla I, solo se observa una disminución significativa en los valores de TEER obtenidos después de 5 y 7 días de inmovilización en gelatina comparando con los valores controles obtenidos antes de aplicarla. Este resultado indica que el método de almacenamiento en gelatina descrito en esta invención permite: 1) inmovilizar el sistema
Caco-2 hasta 4 días a temperatura ambiente sin afectar su estado funcional de barrera; y 2) una vez quitada la gelatina, mantener hasta 9 días después su estado funcional para realizar ensayos de paso de barrera.
Ejemplo 2: Características de los cultivos y determinación de los tiempos de vida del cultivo antes de aplicar la gelatina.
En la Tabla II se indican algunos de los tipos celulares cultivables en soportes tipo transwells que forman monocapas y que son susceptibles de ser almacenables y transportables en gelatina en su estado de barrera y, por tanto, cultivos a los cuales es aplicable el presente método de transporte.
Caco-2, TC7, HT29 M6: líneas epiteliales intestinales derivadas de tumores, - MDCK: línea de epitelio de riñon, HEK: keratinocitos humanos primarios de piel, HUVEC, HMEC-1 , BBEC, HAEC, BAEC: líneas o cultivos primarios de células endoteliales.
00 ι o en o en en
Tabla II: Densidades celulares recomendadas para la siembra en insertos y tiempos de cultivo para la obtención de sistemas de barreras in vitro.
Figure imgf000016_0001
(ND: No Determinado)
Los tiempos de cultivo indicados en la Tabla II se refieren al intervalo de tiempo óptimo de obtención de una monocapa polarizada, más allá del cual pierde sus propiedades funcionales óptimas como barrera celular.
La determinación de los tiempos de vida (momento del cultivo en que se aplica la gelatina) de estos sistemas celulares, que permitan a la vez preservar su estado funcional de barrera y dejar tiempo al usuario para realizar el ensayo, se ha efectuado de modo experimental mediante medida de TEER y permeabilidad paracelular.
La gelatina se aplica al cultivo en el momento en que éste alcanza el estado funcional adecuado. En el caso del ensayo de paso de barrera de células Caco-2, la gelatina se aplica preferiblemente a día 13 (tiempo mínimo aproximado en el cual las células empiezan a formar una monocapa polarizada funcional o barrera). Se pueden mantener en gelatina hasta aproximadamente el día 17 a temperatura ambiente y utilizarse hasta aproximadamente día 25, sin perder sus propiedades funcionales de barrera.
Los tiempos de vida bien de otros tipos celulares (fibroblastos, líneas tumorales), o bien de estos mismos descritos en la Tabla II pero definidos para otras aplicaciones funcionales diferentes del ensayo de paso de barrera (ensayo de adhesión, ensayo de migración, ensayo de invasión), representan diferentes tiempos de aplicación de la gelatina. Así, en el caso específico de los fibroblastos y células HUVEC sembradas en soportes tipo transwell y en condiciones bajo las cuales estas células estén funcionalmente activas para un ensayo de migración, el tiempo de vida será entre 30 minutos y 1 hora después de sembrar las células. En el caso de un ensayo de invasión el tiempo será entre 1 y 24 horas.
Ejemplo 3: Método para el almacenamiento y transporte de sistemas celulares para los ensayos de migración/invasión "ready to use".
1- Preparación de la gelatina
Se utiliza gelatina tipo A de piel de cerdo, disuelta en el medio de cultivo correspondiente del tipo celular que va a ser usado (por ejemplo, DMEM
(1g/L glucosa) en el caso de los fibroblastos o medio EBM en el caso de las células endoteliales HUVEC) a 50°C y directamente a la concentración de uso (máxima concentración que se puede disolver: 10%). En el presente caso, se pesan 2,5g de gelatina en polvo y se disuelve con 100 mi de medio de cultivo. Para aumentar la supervivencia celular durante el almacenamiento y transporte, se añade HEPES 25mM al medio de condicionamiento. Se esteriliza en seguida (en "caliente") mediante filtración por filtros de 0,22μm de poro. A continuación, se suplementa con suero bovino fetal (porcentaje en función del tipo celular) y Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de cultivo completo).
Finalmente se guarda a 4°C hasta su utilización.
2- Preparación del cultivo celular en el soporte asimétrico.
En caso de recubrimiento, 12 horas antes de sembrar las células, se colocan los insertos (sistema Fluoroblock de 3 o 8 μm de diámetro) encima de los pocilios de tamaño correspondiente, se aplica sobre la cara superior e inferior de los filtros de cada inserto una solución de la matriz correspondiente (colágeno, fibronectina, vitronectina etc.) diluida en PBS, y se deja a 37°C en la estufa para cultivos celulares (90% humedad, 5% C02). Antes de su utilización, se aspira el exceso de solución de recubrimiento de la cara apical, se deja de 15 a 30 minutos en la estufa para cultivos, y se siembran las células a una densidad que depende del tipo celular (entre 5 x
104 y 1 x 105 células/cm2). Si el soporte asimétrico no se recubre con matriz, las células se siembran directamente sobre el filtro. En este tipo de ensayo, durante el período de siembra y adhesión de las células (entre 30 minutos y
1 hora), no es necesario poner medio en el compartimiento basal del sistema Fluoroblock. Se realiza el ensayo correspondiente con una parte de las células sembradas, mientras que al resto se les aplica la gelatina para su mantenimiento a temperatura ambiente. Estos controles permiten determinar el estado funcional del sistema celular.
3- Aplicación de la gelatina
La solución de gelatina se pone en un baño de cultivo a 37°C hasta su completa licuación y se equilibra a la temperatura del cultivo (37°C). A continuación, se retira el medio de cultivo del compartimiento apical de cada inserto y se lava con medio de cultivo (sin suero en este caso).
Posteriormente se aplica 300μl de gelatina 2,5% líquida en el compartimiento apical y se deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo. A continuación se añaden 700μl en el compartimiento basal, y una vez solidificada en la campana de flujo, se guarda a temperatura ambiente (20-25°C). Una vez ha solidificado la gelatina, se sellan las placas con parafilm y se mantienen a temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4 días después).
4- Eliminación de la gelatina En el momento en que se quiera utilizar el cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro de un incubador de células a 37°C, 90% humedad y 5% CO2 durante 3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A continuación se elimina de ambos compartimientos mediante aspiración y se lava el cultivo con medio de cultivo sin suero equilibrado a 37°C. En este momento el cultivo está preparado para la realización del ensayo de migración/invasión.
En el ensayo de migración (24 h de migración) se compara la respuesta de células HUVEC que no han sido mantenidas en medio de condicionamiento (sin medio de condicionamiento) con la respuesta de células HUVEC mantenidas durante 72 horas con medio de condicionamiento. En ambos casos las células han sido estimuladas (control +) con medio EBM completo (con factores de crecimiento y el 10% de suero bovino fetal). Las células no estimuladas (control -) se han mantenido con EBM sin suplemento en la parte basal.
Tal y como se presenta en la Figura 1 , las células mantenidas en gelatina son capaces de responder a un estímulo migratorio (control + en la figura). Este resultado indica que el método de almacenamiento en gelatina descrito en esta invención permite: 1) inmovilizar el sistema HUVEC hasta 3 días a temperatura ambiente sin afectar su estado funcional; y 2) una vez quitada la gelatina, se puede realizar un ensayo de migración.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para el almacenamiento y el transporte in vitro de cultivos celulares bidimensionales organizados que comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25°C de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de hasta 96 horas.
2. Método según la reivindicación 1 que comprende las etapas adicionales: a) licuación de la gelatina, b) eliminación de la gelatina y sustitución de la misma por un medio de cultivo, y c) incubación del cultivo.
3. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el cultivo celular bidimensional organizado está diferenciado, polarizado y es funcionalmente activo.
4. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque el cultivo celular está seleccionado de entre: células Huvec crecidas a confluencia sobre un soporte de colágeno y células Caco-2 diferenciadas, o cualquier otro tipo de células capaz de crecer en monocapas tales como fibroblastos, células tumorales, hepáticas, endoteliales, etc.
5. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la solución de gelatina empleada es del 2.5%
6. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la gelatina se solidifica a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de 30 minutos a 12 horas.
7. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el soporte asimétrico es un soporte tipo transwell.
8. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa entre 35 y 40°C durante un periodo de 1 a 4 horas.
9. Método según la reivindicación 8 caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa a 37°C.
10. Método según las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se efectúa entre 35 y 40°C durante un periodo de 1 hora a 8 días.
11. Método según la reivindicación 10 caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se efectúa a 37°C.
12. Kit para el almacenamiento y/o el transporte in viro de cultivos celulares bidimensionales organizados según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que comprende: i) un soporte asimétrico, y ii) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.
13. Kit según la reivindicación 12 caracterizado porque el soporte asimétrico es un soporte tipo transweil.
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