ES2329793T3 - Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. - Google Patents
Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2329793T3 ES2329793T3 ES04724028T ES04724028T ES2329793T3 ES 2329793 T3 ES2329793 T3 ES 2329793T3 ES 04724028 T ES04724028 T ES 04724028T ES 04724028 T ES04724028 T ES 04724028T ES 2329793 T3 ES2329793 T3 ES 2329793T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- culture
- gelatin
- cells
- cell
- support
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 51
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 51
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000008274 jelly Substances 0.000 claims description 23
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 13
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 11
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 10
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000532370 Atla Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000709400 Ruba Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
El método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25°C de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25°C, durante un periodo de hasta 96 horas. La presente invención también proporciona un kit para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro según el método de la invención que comprende: i) un soporte asimétrico, y ii) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.
Description
Método para el almacenamiento y/o transporte de
cultivos celulares in vitro.
La invención se relaciona con la obtención de un
método para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares
bidimensionales in vitro, así como con la obtención de un kit
para almacenar y/o transportar dichos cultivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos celulares, homogéneos o no
(cocultivos), pueden constituir modelos útiles de algunos procesos
genéticos, bioquímicos, metabólicos o fisiológicos que tienen lugar
en el organismo vivo. La facilidad de su manipulación permite el
análisis de gran número de condiciones antes de realizar los
experimentos definitivos en animales o los ensayos clínicos en
seres humanos. Los modelos "in vitro" constituyen una
herramienta para la validación de nuevas dianas terapéuticas, para
la selección de cabezas de serie en sistemas de alto rendimiento,
para la definición del mecanismo de acción de nuevas moléculas y, en
general, para la investigación biomédica, biotecnológica o
cosmética.
cosmética.
En general, todos los modelos basados en
cultivos celulares tienen una vida útil limitada. Así, las células
en cultivo pasan por diferentes fases de diferenciación, y requieren
de manipulación continua para mantener las propiedades que las
hacen un modelo adecuado. Por ejemplo, el modelo de barrera
gastrointestinal basado en el cultivo confluyente de células
Caco-2 requiere 21 días para alcanzar el estado de
diferenciación que permite reproducir muchas de las propiedades de
la mucosa intestinal (Le Ferrec et al., ATLA
29:649-668, 1999), y su utilidad se prolonga sólo
durante una ventana de unos 3 a 5 días. Las células BC2, utilizadas
como modelo de célula hepática, requieren entre tres y cuatro
semanas de diferenciación antes de adquirir las propiedades que las
hacen un buen modelo, y las condiciones de cultivo posteriores son
clave para que respondan a los tratamientos experimentales de forma
parecida al hepatocito (MJ Gómez-Lechón, et
al., Eur. J. Biochem.268:1448, 2001). Las células de cordón
umbilical Huvec, crecidas hasta confluencia, pueden ser inducidas a
formar estructuras comparables a los vasos sanguíneos en
condiciones experimentales adecuadas, por lo que constituyen un buen
modelo de angiogénesis (Vailhe et al., Lab. Invest.
81:439-452, 2001). Sin embargo, el número de
divisiones celulares previo al experimento y el estímulo utilizado
son críticos para obtener una respuesta adecuada.
Estas limitaciones en la manipulación y
generación de los diferentes modelos celulares "in
vitro" los hacen de difícil implementación para los usuarios
ocasionales, y en general limitan la comercialización de los modelos
en su formato final. El problema se agudiza en modelos complejos,
en los que las células deben imitar a las barreras naturales del
organismo (Rubas et al., J. Pharma. Sci.,
85:165-169, 1996; Walter et al., J. Pharma.
Sci., 85:1070-1076; Irvine et al., J. Pharma.
Sci., 88:28-33, 1999; Gaillard et al., Eur.
J. of Pharma. Sci., 12:215-222, 2001); o los
cultivos deben realizarse sobre soportes asimétricos, separando dos
compartimientos o con una fuerte dependencia en la polarización de
los componentes del sistema. En estos casos, a la complejidad del
modelo y a sus limitaciones temporales se añaden problemas de tipo
mecánico, que hacen que los golpes o las sacudidas puedan invalidar
el sistema. Los investigadores pueden acceder a los diferentes
componentes del modelo (soporte, medio y aditivos de cultivo y
líneas celulares), y posteriormente deben combinarlos en el
laboratorio utilizando procesos más o menos laboriosos. En el mejor
de los casos el investigador final puede recibir las células ya
listas para su uso, pero con limitaciones que prácticamente obligan
a realizar los experimentos dentro de los dos días posteriores a la
recepción, e imponen serias restricciones en la distribución del
modelo por parte de la compañía que lo comercializa, como por
ejemplo In Vitro Technologies. El documento EP 702 081
describe un método para el almacenamiento y transporte de tejidos
tridimensionales que consiste en situar dicho tejido tridimensional
fijado sobre dos tipos de esponjas en una solución de gelatina, de
tal forma que por enfriamiento ésta se gelifica, facilitando así su
transporte y
almacenamiento.
almacenamiento.
Existe por tanto en el estado de la técnica la
necesidad de disponer de un método para poder suministrar modelos
basados en cultivos celulares bidimensionales organizados a punto
para ser utilizados y con sus propiedades funcionales intactas de
forma que, por un lado, el investigador disponga de margen de
maniobra para su utilización y, por otro, la compañía
suministradora pueda plantear tiempos de entrega dentro de los
márgenes logísticos razonables de la distribución
internacional.
El objeto de la presente solicitud consiste en
proporcionar un método para el almacenamiento y el transporte de
cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro que
resuelva las necesidades del estado de la técnica mencionadas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 - Respuesta en un ensayo de migración
de células endoteliales HUVEC, estimuladas o no, sin medio de
condicionamiento (células que no han sido mantenidas en el medio con
gelatina) y con medio de condicionamiento (72 horas después de
haber sido mantenidas en el medio con gelatina), medida en unidades
de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona en su aspecto principal
un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos
celulares organizados in vitro, bidimensionales,
funcionalmente activos, polarizados y diferenciados que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado bidimensional, funcionalmente activo, polarizado y diferenciado que está inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
La presente solicitud también proporciona en un
segundo aspecto de la invención un cultivo celular organizado
bidimensional que está diferenciado, polarizado y funcionalmente
activo, caracterizado porque se encuentra inmovilizado en un
soporte asimétrico y recubierto con una solución de gelatina en el
medio de cultivo a una concentración del 1 a 5%, comprendiendo
dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona en su aspecto principal
un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos
celulares bidimensionales organizados in vitro diferenciados,
polarizados y funcionalmente activos que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% en peso de un cultivo celular organizado bidimensional, funcionalmente activo, polarizado y diferenciado que está inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
En una realización particular, el método de la
invención comprende las siguientes etapas adicionales:
- d)
- licuación de la gelatina,
- e)
- eliminación de la gelatina y sustitución de la misma por un medio de cultivo, y,
- f)
- incubación del cultivo.
El método de la invención hace posible que
durante el almacenamiento y/o transporte del cultivo o modelo
celular se mantengan las propiedades fisiológicas de las células
y, además, que se protejan las propiedades mecánicas esenciales
para el modelo celular.
En el contexto de la presente invención se
entiende por soporte asimétrico aquellos recipientes que contienen
dos compartimentos físicamente separados por una membrana
semipermeable encima de la cual se sitúan las células del cultivo.
Como soporte asimétrico preferido la presente invención emplea el
soporte tipo transwell.
Los cultivos celulares bidimensionales
funcionalmente activos, polarizados y diferenciados de la invención
son por ejemplo: células Huvec crecidas a confluencia sobre un
soporte de colágeno; cultivo confluyente de células
Caco-2 diferenciadas; o cualquier otro tipo de
células capaz de crecer en monocapas tales como células tumorales,
hepáticas, endoteliales, etc. Así, ejemplos de líneas epiteliales
intestinales derivadas de tumores son Caco-2, TC7,
HT29 M6; un ejemplo de línea de epitelio de riñón es MDCK; un
ejemplo de keratinocitos humanos primarios de piel es HEK;
finalmente ejemplos de líneas o cultivos primarios endoteliales son
HUVEC, HMEC-1, BBEC, HAEC y
BAEC.
BAEC.
Según la presente invención, la solución de
gelatina se prepara disolviendo gelatina en el mismo medio de
cultivo, que actúa como disolvente. Gracias al empleo del medio de
cultivo como disolvente se consigue que el cultivo almacenado y/o
transportado según el método de la presente invención garantice al
usuario la preservación de las propiedades funcionales del cultivo
y una utilización inmediata. Preferiblemente la solución de gelatina
empleada es del 2.5% en peso.
En el método de la invención se puede emplear
cualquier gelatina comercial, como por ejemplo gelatina tipo A de
piel de cerdo. Similarmente, también se puede emplear cualquier
medio de cultivo comercial, como un medio DMEM (1 g/L glucosa). Es
"aconsejable" preparar la solución de gelatina con un máximo de
7 días antes de aplicarla al cultivo, ya que de lo contrario ésta
pierde parte de sus propiedades de "conservación", las cuales
son necesarias para el buen funcionamiento de la presente
invención.
La solución de gelatina en el medio de cultivo
puede ser suplementada con suero bovino fetal (FBS 10%) y
Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de
cultivo completo).
El cultivo celular puede prepararse del
siguiente modo: realizar primeramente, antes de sembrar las células,
un coating que implica: 1) colocar los insertos o
transwells encima de los pocillos de tamaño correspondiente;
2) aplicar sobre la cara superior de los filtros (membranas
semipermeables) de cada inserto una solución de colágeno (u otro
componente de matriz extracelular, dependiente del tipo celular) en
medio de cultivo DMEM (1 g/L glucosa) sin suero (u otro medio
comercial); y 3) dejar preferiblemente a 37ºC en la estufa para
cultivos celulares (90% humedad, 5% CO_{2}). Antes de la
utilización del inserto, se aspira el exceso de solución de
coating de la cara apical, se deja aproximadamente de 15 a 30
minutos en la estufa para cultivos, y se siembran las células
correspondientes a la densidad determinada para cada tipo celular y
para cada tipo de ensayo. Se mantiene el cultivo durante el tiempo
necesario al alcance del estado funcional del sistema, con cambios
de medio preferiblemente cada 48-72 horas si
necesario. Las características de los insertos o transwells
utilizados (tamaño, diámetro de poros, material) vienen determinadas
de manera específica por el tipo celular y el ensayo al cual se
puede aplicar la presente invención. En función del tipo de célula
empleada en el cultivo y del tipo de ensayo, tras un número de días
transcurridos, se realizan controles para determinar el estado
funcional del sistema celular. Por ejemplo, en el caso de los
sistemas celulares que se utilizan como modelos de barreras, se
pueden emplear medida de TEER (Resistencia Eléctrica TransEpitelial)
y permeabilidad paracelular. En el caso de los sistemas celulares
que se utilizan para ensayos de migración/invasión, se realiza una
determinación de la capacidad de migración/invasión mediante
marcaje con un fluorocromo (por ejemplo, calceina) de las células
que hayan migrado a la parte inferior del filtro y posterior
cuantificación por
fluorimetría.
fluorimetría.
Según la presente invención, el cultivo celular
se recubre con una solución de gelatina en el medio de cultivo a
una concentración de 1 a 5%. De forma general, se aplicará la
gelatina en el preciso momento en que se haya comprobado que el
sistema celular acaba de alcanzar el estado funcional adecuado, de
manera que se inmoviliza el sistema celular ya funcional, pero se
deja al usuario un margen de tiempo para hacer sus ensayos al
recibir el sistema. Al tiempo de cultivo transcurrido se denomina
"tiempo de vida". De aquí la aplicación de la presente
invención a sistemas celulares
"ready-to-use". Los
tiempos de vida de los cultivos celulares, es decir el tiempo de
vida del cultivo en que se aplica la gelatina, dependen no sólo de
los tipos celulares del cultivo (líneas tumorales, etc.) sino
también de su aplicación funcional (ensayo de paso de barrera,
ensayo de adhesión, ensayo de migración, ensayo de invasión). Su
determinación es una cuestión de práctica experimental. Así, en el
caso específico de las células HUVEC sembradas en soportes tipo
transwell y en condiciones bajo las cuales estas células
estén funcionalmente activas para un ensayo de migración, el tiempo
de vida será entre 30 minutos y 1 hora después de sembrar las
células. En el caso de un ensayo de invasión, el tiempo será entre
1 y 24 horas. En cambio, en el caso de las células
Caco-2 sembradas en transwells, el tiempo de
vida será 13 días después de sembrar las células, tiempo a partir
del cual ya son funcionales como barrera y se aplica la gelatina,
dejando al usuario hasta el día 25 de cultivo para realizar el
ensayo de paso de
barrera.
barrera.
En el contexto de la presente invención se
entiende por estado funcional adecuado, el estado que
presentan las células viables del cultivo cuando son capaces de
realizar la función que tienen asignada en el ensayo.
Para efectuar la aplicación de la gelatina sobre
el cultivo en primer lugar es necesario licuar completamente la
solución de gelatina, y equilibrarla a la temperatura del cultivo,
en general 37ºC. A continuación, se retira el medio de cultivo de
los 2 compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio
de cultivo en los 2 compartimentos de cada inserto. Posteriormente
se aplica gelatina 2,5% líquida en el compartimiento apical y en el
compartimiento basal, y se deja solidificar entre 2 y 3 horas en la
campana de flujo y a temperatura ambiente
(20-25ºC). Una vez ha solidificado la gelatina, se
sellan las placas con parafilm y se mantienen a temperatura
ambiente hasta su utilización (máximo 4 días después).
En el momento en que se quiera utilizar el
cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro
de un incubador de células hasta la completa licuación de la
gelatina, preferiblemente a 37ºC, 90% humedad y 5% CO_{2} durante
3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A
continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración
y se lava el cultivo con medio de cultivo equilibrado a 37ºC.
Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para las
células en cuestión y se incuban estas últimas preferiblemente a
37ºC en 90% humedad/5% CO_{2} hasta su uso.
Los ejemplos que se describen a continuación
sirven para ilustrar la invención.
\newpage
Ejemplos
Ejemplo
1
Se utiliza gelatina tipo A de piel de cerdo,
disuelta en medio de cultivo DMEM (1 g/L glucosa) a 50ºC y
directamente a la concentración de uso (máxima concentración que se
puede disolver: 10%). En el presente caso, se pesan 2,5 g de
gelatina en polvo y se disuelve con 100 ml de medio de cultivo DMEM
(1 g/L glucosa). Se esteriliza en seguida (en "caliente")
mediante filtración por filtros de 0,22 \mum de poro. A
continuación se suplementa con suero bovino fetal (FBS 10%) y
Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de
cultivo completo). Finalmente se guarda a 4ºC hasta su
utilización.
Coating: 12 horas antes de sembrar las
células, se colocan los insertos (transwells de 6,5 mm de
diámetro) encima de los pocillos de tamaño correspondiente, y se
aplica sobre la cara superior de los filtros de policarbonato
(membranas semipermeables de 0,4 \mum de diámetro de poro) de cada
inserto una solución de colágeno tipo I de cola de rata (20
\mug/ml) en medio de cultivo DMEM (1 g/L glucosa) sin suero, y se
deja a 37ºC en la estufa para cultivos celulares (90% humedad, 5%
CO_{2}). Antes de su utilización, se aspira el exceso de solución
de coating de la cara apical, se deja de 15 a 30 minutos en la
estufa para cultivos, y se siembran las células
Caco-2 a una densidad de 5 X 10^{5}
células/cm^{2}. Se mantiene el cultivo durante 13 días, con
cambios de medio cada 48-72 horas, poniendo 300
\mul de medio de cultivo completo en el compartimento apical y
900 \mul en el basal. Al día 13, se realizan los controles de
estado de barrera (polarización) de la monocapa
Caco-2 mediante medida de TEER (Resistencia
Eléctrica TransEpitelial) y permeabilidad paracelular. Estos
controles permiten determinar el estado funcional del sistema
celular como barrera antes de recubrir con gelatina.
Se pone en un baño de cultivo a 37ºC hasta su
completa licuación y se equilibra a la temperatura del cultivo
(37ºC). A continuación, se retira el medio de cultivo de los 2
compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio de
cultivo completo en los 2 compartimentos de cada inserto.
Posteriormente se aplica 300 \mul de gelatina 2,5% líquida en el
compartimiento apical y 900 \mul en el compartimiento basal, y se
deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo y a
temperatura ambiente (20-25ºC). Una vez ha
solidificado la gelatina, se sellan las placas con parafilm y se
mantienen a temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4 días
después).
En el momento en que se quiera utilizar el
cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro
de un incubador de células a 37ºC, 90% humedad y 5% CO_{2} durante
3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A
continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración
y se lava el cultivo con medio de cultivo completo equilibrado a
37ºC. Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para
células Caco-2 y se incuban las células a 37ºC en
90% humedad/5% CO_{2} hasta su uso (mínimo 24 horas; máximo 9
días después), cambiando el medio cada 48-72
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se presenta en la Tabla I, solo se
observa una disminución significativa en los valores de TEER
obtenidos después de 5 y 7 días de inmovilización en gelatina
comparando con los valores controles obtenidos antes de aplicarla.
Este resultado indica que el método de almacenamiento en gelatina
descrito en esta invención permite: 1) inmovilizar el sistema
Caco-2 hasta 4 días a temperatura ambiente sin
afectar su estado funcional de barrera; y 2) una vez quitada la
gelatina, mantener hasta 9 días después su estado funcional para
realizar ensayos de paso de barrera.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En la Tabla II se indican algunos de los tipos
celulares cultivables en soportes tipo transwells que forman
monocapas y que son susceptibles de ser almacenables y
transportables en gelatina en su estado de barrera y, por tanto,
cultivos a los cuales es aplicable el presente método de
transporte.
- -
- Caco-2, TC7, HT29 M6: líneas epiteliales intestinales derivadas de tumores,
- -
- MDCK: línea de epitelio de riñón,
- -
- HEK: keratinocitos humanos primarios de piel,
- -
- HUVEC, HMEC-1, BBEC, HAEC, BAEC: líneas o cultivos primarios de células endoteliales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los tiempos de cultivo indicados en la Tabla II
se refieren al intervalo de tiempo óptimo de obtención de una
monocapa polarizada, más allá del cual pierde sus propiedades
funcionales óptimas como barrera celular.
La determinación de los tiempos de vida (momento
del cultivo en que se aplica la gelatina) de estos sistemas
celulares, que permitan a la vez preservar su estado funcional de
barrera y dejar tiempo al usuario para realizar el ensayo, se ha
efectuado de modo experimental mediante medida de TEER y
permeabilidad paracelular.
La gelatina se aplica al cultivo en el momento
en que éste alcanza el estado funcional adecuado. En el caso del
ensayo de paso de barrera de células Caco-2, la
gelatina se aplica preferiblemente a día 13 (tiempo mínimo
aproximado en el cual las células empiezan a formar una monocapa
polarizada funcional o barrera). Se pueden mantener en gelatina
hasta aproximadamente el día 17 a temperatura ambiente y utilizarse
hasta aproximadamente día 25, sin perder sus propiedades
funcionales de barrera.
Los tiempos de vida bien de otros tipos
celulares (fibroblastos, líneas tumorales), o bien de estos mismos
descritos en la Tabla II pero definidos para otras aplicaciones
funcionales diferentes del ensayo de paso de barrera (ensayo de
adhesión, ensayo de migración, ensayo de invasión), representan
diferentes tiempos de aplicación de la gelatina. Así, en el caso
específico de los fibroblastos y células HUVEC sembradas en
soportes tipo transwell y en condiciones bajo las cuales
estas células estén funcionalmente activas para un ensayo de
migración, el tiempo de vida será entre 30 minutos y 1 hora después
de sembrar las células. En el caso de un ensayo de invasión el
tiempo será entre 1 y 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utiliza gelatina tipo A de piel de cerdo,
disuelta en el medio de cultivo correspondiente del tipo celular
que va a ser usado (por ejemplo, DMEM (1 g/L glucosa) en el caso de
los fibroblastos o medio EBM en el caso de las células endoteliales
HUVEC) a 50ºC y directamente a la concentración de uso (máxima
concentración que se puede disolver: 10%). En el presente caso, se
pesan 2,5 g de gelatina en polvo y se disuelve con 100 ml de medio
de cultivo. Para aumentar la supervivencia celular durante el
almacenamiento y transporte, se añade HEPES 25 mM al medio de
condicionamiento. Se esteriliza en seguida (en "caliente")
mediante filtración por filtros de 0,22 \mum de poro. A
continuación, se suplementa con suero bovino fetal (porcentaje en
función del tipo celular) y
Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de
cultivo completo). Finalmente se guarda a 4ºC hasta su
utilización.
En caso de recubrimiento, 12 horas antes de
sembrar las células, se colocan los insertos (sistema
Fluoroblock de 3 o 8 \mum de diámetro) encima de los
pocillos de tamaño correspondiente, se aplica sobre la cara superior
e inferior de los filtros de cada inserto una solución de la matriz
correspondiente (colágeno, fibronectina, vitronectina etc.) diluida
en PBS, y se deja a 37ºC en la estufa para cultivos celulares (90%
humedad, 5% CO_{2}). Antes de su utilización, se aspira el exceso
de solución de recubrimiento de la cara apical, se deja de 15 a 30
minutos en la estufa para cultivos, y se siembran las células a una
densidad que depende del tipo celular (entre 5 x 10^{4} y 1 x
10^{5} células/cm^{2}). Si el soporte asimétrico no se recubre
con matriz, las células se siembran directamente sobre el filtro. En
este tipo de ensayo, durante el período de siembra y adhesión de
las células (entre 30 minutos y 1 hora), no es necesario poner medio
en el compartimiento basal del sistema Fluoroblock. Se
realiza el ensayo correspondiente con una parte de las células
sembradas, mientras que al resto se les aplica la gelatina para su
mantenimiento a temperatura ambiente. Estos controles permiten
determinar el estado funcional del sistema celular.
La solución de gelatina se pone en un baño de
cultivo a 37ºC hasta su completa licuación y se equilibra a la
temperatura del cultivo (37ºC). A continuación, se retira el medio
de cultivo del compartimiento apical de cada inserto y se lava con
medio de cultivo (sin suero en este caso). Posteriormente se aplica
300 \mul de gelatina 2,5% líquida en el compartimiento apical y
se deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo. A
continuación se añaden 700 \mul en el compartimiento basal, y una
vez solidificada en la campana de flujo, se guarda a temperatura
ambiente (20-25ºC). Una vez ha solidificado la
gelatina, se sellan las placas con parafilm y se mantienen a
temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4 días
después).
En el momento en que se quiera utilizar el
cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro
de un incubador de células a 37ºC, 90% humedad y 5% CO_{2} durante
3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A
continuación se elimina de ambos compartimientos mediante aspiración
y se lava el cultivo con medio de cultivo sin suero equilibrado a
37ºC. En este momento el cultivo está preparado para la realización
del ensayo de migración/invasión.
En el ensayo de migración (24 h de migración) se
compara la respuesta de células HUVEC que no han sido mantenidas en
medio de condicionamiento (sin medio de condicionamiento) con la
respuesta de células HUVEC mantenidas durante 72 horas con medio de
condicionamiento. En ambos casos las células han sido estimuladas
(control +) con medio EBM completo (con factores de crecimiento y
el 10% de suero bovino fetal). Las células no estimuladas (control
-) se han mantenido con EBM sin suplemento en la parte basal.
Tal y como se presenta en la Figura 1, las
células mantenidas en gelatina son capaces de responder a un
estímulo migratorio (control + en la figura). Este resultado indica
que el método de almacenamiento en gelatina descrito en esta
invención permite: 1) inmovilizar el sistema HUVEC hasta 3 días a
temperatura ambiente sin afectar su estado funcional; y 2) una vez
quitada la gelatina, se puede realizar un ensayo de migración.
Claims (11)
1. Método para el almacenamiento y/o transporte
in vitro de cultivos celulares bidimensionales organizados,
funcionalmente activos, polarizados y diferenciados que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado bidimensional, funcionalmente activo, polarizado y diferenciado que está inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
2. Método según la reivindicación 1 que
comprende las etapas adicionales:
- a)
- licuación de la gelatina,
- b)
- eliminación de la gelatina y sustitución de la misma por un medio de cultivo, y
- c)
- incubación del cultivo.
3. Método según la reivindicación 2
caracterizado porque el cultivo celular está seleccionado de
entre: células Huvec crecidas a confluencia sobre un soporte de
colágeno y células Caco-2 diferenciadas, o cualquier
otro tipo de células capaz de crecer en monocapas tales como
células tumorales, hepáticas y endoteliales.
4. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la solución de gelatina empleada es del
2.5%
5. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la gelatina se solidifica a una
temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de 30 minutos a 12
horas.
6. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque el soporte asimétrico es un soporte tipo
transwell.
7. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa
entre 35 y 40ºC durante un periodo de 1 a 4 horas.
8. Método según la reivindicación 7
caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa a
37ºC.
9. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se
efectúa entre 35 y 40ºC durante un periodo de 1 hora a 8 días.
10. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se
efectúa a 37ºC.
11. Un cultivo celular organizado bidimensional
que está diferenciado, polarizado y funcionalmente activo,
caracterizado porque se encuentra inmovilizado en un soporte
asimétrico y recubierto con una solución de gelatina en el medio de
cultivo a una concentración del 1 a 5%, comprendiendo dicho cultivo
celular células en el estado funcional adecuado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301526 | 2003-07-01 | ||
| ES200301526A ES2222093A1 (es) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2329793T3 true ES2329793T3 (es) | 2009-12-01 |
Family
ID=33560931
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200301526A Pending ES2222093A1 (es) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. |
| ES04724028T Expired - Lifetime ES2329793T3 (es) | 2003-07-01 | 2004-03-29 | Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200301526A Pending ES2222093A1 (es) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8900842B2 (es) |
| EP (1) | EP1650292B1 (es) |
| JP (2) | JP5460946B2 (es) |
| CA (1) | CA2530318C (es) |
| DE (1) | DE602004022052D1 (es) |
| ES (2) | ES2222093A1 (es) |
| WO (1) | WO2005003331A1 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2233175B1 (es) * | 2003-04-10 | 2006-02-01 | Industras Samar't, S.A. | Disposicion de troquelado de placas o letreros embutiendo por rehundido. |
| CA2627121C (en) | 2005-10-24 | 2013-11-12 | Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemische Industrie | Method and device for synovial cell-charged collagen membrane or gel |
| JP5237714B2 (ja) * | 2008-07-29 | 2013-07-17 | ＢｉｏＲＯＩＳ株式会社 | 細胞輸送用担体及びそれを使用した細胞の輸送方法 |
| ES2343721B1 (es) | 2008-12-19 | 2011-06-06 | Histocell, S.L. | Sistema de transporte de celulas. |
| DE102009022354B4 (de) * | 2009-05-15 | 2015-05-07 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Bioreaktorsystem |
| US20230105072A1 (en) | 2020-02-14 | 2023-04-06 | Readycell, S.L. | System for storing and transporting cell lines |
| LU102338B1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-21 | Luxembourg Inst Science & Tech List | Medium for in vitro transportation and storage of cells |
| WO2022144883A2 (en) * | 2020-12-28 | 2022-07-07 | 1E Therapeutics, Ltd. | P21 mrna targeting dnazymes |
| WO2022144882A2 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-07 | 1E Therapeutics, Ltd. | P21 mrna target areas for silencing |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH089966A (ja) * | 1994-06-30 | 1996-01-16 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 動物細胞の輸送方法 |
| JP2858087B2 (ja) * | 1994-09-19 | 1999-02-17 | グンゼ株式会社 | 組織培養用基材及び組織培養法 |
| DE19735460A1 (de) * | 1997-08-16 | 1999-02-18 | Rolf Prof Dr Med Zander | Spül- oder Lagerungsflüssigkeit für Blutzellen |
| IL141438A0 (en) * | 2000-02-23 | 2002-03-10 | Pfizer Prod Inc | Method of increasing the bioavailability and tissue penetration of azithromycin |
| KR100675252B1 (ko) * | 2000-03-08 | 2007-02-08 | 한국생명공학연구원 | 신규 7,8-디히드로-잔테논-8-카르복실산 유도체 및 이를생산하는 신규 미생물 |
| GB0031065D0 (en) * | 2000-12-20 | 2001-01-31 | Univ Cardiff | Preservation of cells |
| CA2440480A1 (en) * | 2001-03-15 | 2002-09-26 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Method of using pyruvate and/or its derivatives for the treatment of cytokine-mediated inflammatory conditions |
-
2003
- 2003-07-01 ES ES200301526A patent/ES2222093A1/es active Pending
-
2004
- 2004-03-29 JP JP2006518239A patent/JP5460946B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 US US10/563,033 patent/US8900842B2/en active Active
- 2004-03-29 EP EP04724028A patent/EP1650292B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 WO PCT/ES2004/000140 patent/WO2005003331A1/es active Application Filing
- 2004-03-29 ES ES04724028T patent/ES2329793T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 CA CA2530318A patent/CA2530318C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 DE DE602004022052T patent/DE602004022052D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-02-04 JP JP2011022733A patent/JP2011120600A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090239282A1 (en) | 2009-09-24 |
| EP1650292A1 (en) | 2006-04-26 |
| JP2011120600A (ja) | 2011-06-23 |
| JP2007525200A (ja) | 2007-09-06 |
| DE602004022052D1 (de) | 2009-08-27 |
| JP5460946B2 (ja) | 2014-04-02 |
| ES2222093A1 (es) | 2005-01-16 |
| WO2005003331A1 (es) | 2005-01-13 |
| CA2530318C (en) | 2012-08-21 |
| CA2530318A1 (en) | 2005-01-13 |
| EP1650292B1 (en) | 2009-07-15 |
| US8900842B2 (en) | 2014-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gruber et al. | Three-dimensional culture of human disc cells within agarose or a collagen sponge: assessment of proteoglycan production | |
| ES2763331T3 (es) | Expansión de células madre en biorreactores de fibra hueca | |
| EP2639293B1 (en) | Cell culture chamber, method for producing same, tissue model using cell culture chamber, and method for producing same | |
| ES2398805T3 (es) | Sistema de transporte celular | |
| JP2011120600A (ja) | インビトロ細胞培養物を保存および／または輸送する方法 | |
| Daum et al. | Isolation, cultivation, and application of human alveolar epithelial cells | |
| KR102373335B1 (ko) | 3ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도 | |
| BRPI1008297B1 (pt) | Método para a criopreservação de células, estruturas celulares artificiais oumontagens de tecidos complexos tridimensionais | |
| KR20170093250A (ko) | 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 | |
| JPWO2005014774A1 (ja) | 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法 | |
| BR112013030567B1 (pt) | dispositivos de túbulo proximal bioartificial e método in vitro para gerar um dispositivo de túbulo proximal bioartificial por diferenciação de uma ou mais células precursoras em células renais | |
| US7501231B2 (en) | Methods and compositions for cryopreservation of dissociated primary animal cells | |
| Lesman et al. | Cell tri-culture for cardiac vascularization | |
| BRPI0618988A2 (pt) | criopreservação de hepatócitos | |
| KR100564813B1 (ko) | 세포의 보존방법 | |
| Kinasiewicz et al. | Three-dimensional culture of hepatocytes on spongy polyethersulfone membrane developed for cell transplantation | |
| Moulin | Three-dimensional model of hypertrophic scar using a tissue-engineering approach | |
| CN102614547B (zh) | 一种快速构建复层细胞的方法 | |
| Maselli et al. | Porcine organotypic epicardial slice protocol: A tool for the study of epicardium in cardiovascular research | |
| JPWO2018183199A5 (es) | ||
| Kakehi et al. | Repeated and long-term cryopreservation of primary bovine myogenic cells to maintain quality in biomimetic cultured meat | |
| Schwarzkopf et al. | Autospecies and Post–Myocardial Infarction Sera Enhance the Viability, Proliferation, and Maturation of 3D Cardiac Cell Culture | |
| Amorim et al. | 32 Tips and Tricks | |
| Malik et al. | Organ, Histotypic and Organotypic Culture, and Tissue Engineering | |
| Lyu et al. | 3D co-culture of macrophages and fibroblasts in a sessile drop chip for unveiling the role of macrophages in skin wound-healing |