JP2007525200A - インビトロ細胞培養物を保存および／または輸送する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インビトロの二次元細胞培養物を保存および／または輸送する方法に関する。本発明による方法は、ａ）非対称支持体に固定された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度でゼラチン溶液で被覆し、ｂ）支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、およびｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送することからなる。本発明はまた、本方法に従いインビトロの二次元細胞培養物を保存および／または輸送するために用いられるキットに関し、該キットは（ｉ）非対称支持体、および（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液を含んでなる。
Description
発明の分野
本発明は、インビトロ二次元細胞培養物を保存および／または輸送する方法、並びに該培養物を保存および／または輸送するためのキットを得ることに関する。
本発明は、インビトロ二次元細胞培養物を保存および／または輸送する方法、並びに該培養物を保存および／または輸送するためのキットを得ることに関する。
背景技術
細胞培養物は、均一でもまたはそうでなくても（同時培養物）、生体内で生じるある遺伝、生化学、代謝または生理学的プロセスに有用なモデルとなりうる。それらの使用が容易であれば、動物で最終実験またはヒトで臨床試験を行う前に、多数の条件を分析しうるのである。インビトロモデルは、新たな治療標的を検証し、高性能系で種を選択し、新規分子の作用メカニズムを解明し、一般的に、生物医学、生物工学または化粧品の研究を行うための手段である。
細胞培養物は、均一でもまたはそうでなくても（同時培養物）、生体内で生じるある遺伝、生化学、代謝または生理学的プロセスに有用なモデルとなりうる。それらの使用が容易であれば、動物で最終実験またはヒトで臨床試験を行う前に、多数の条件を分析しうるのである。インビトロモデルは、新たな治療標的を検証し、高性能系で種を選択し、新規分子の作用メカニズムを解明し、一般的に、生物医学、生物工学または化粧品の研究を行うための手段である。
一般的に、細胞培養物に基づくすべてのモデルは限られた有効寿命を有している。培養細胞は様々な分化段階を経由し、それらを適切なモデルにしうる性質を維持する上で継続操作を要する。例えば、Ｃａｃｏ‐２細胞の集密培養物に基づく胃腸バリアモデルは、腸粘膜の性質の多くを再現しうる分化の状態に到達するまで２１日かかり（Le Ferrec et al.,ATLA 29:649-668,1999）、その使用のためには約３〜５日の期間が残されるにすぎない。肝細胞のモデルとして用いられるＢＣ２細胞は、それらが良いモデルになれる性質を獲得するまでに、３〜４週間の分化を要し、肝細胞と同様にそれらが実験処理に応答する上でその後の培養条件が重要となる（MJ Gomez Lechon et al.,Eur.J.Biochem.268:1448-2001）。集密化するまで増殖されたＨｕｖｅｃ臍帯細胞は、血管に相当する構造を形成するように適切な実験条件下で誘導できるため、それらは血管形成の良いモデルとなるが（Vailhe et al.,Lab.Invest.81:439-452,2001）、それにもかかわらず実験前の細胞分裂回数および用いられる刺激は適切な応答を得る上で重要である。
様々なインビトロ細胞モデルの操作および作製におけるこれらの制限は、時折使うユーザーのそれら実施を難しくさせ、一般的にそれらの最終フォーマットでのモデルのマーケティングを制限してしまう。複合モデルであって、細胞が生物の自然バリアを模造しなければならず（Rubas et al.,J.Pharma.Sci.,85:165-169,1996；Walter et al.,J.Pharma.Sci.,85:1070-1076；Irvine et al.,J.Pharma.Sci.,88:28:28-33,1999；Gaillard et al.,Eur.J.of Pharma.Sci.,12:215-222,2001）または２区画に分けたもしくは系成分の分極化に強く依存した非対称支持体で培養が行われねばならない複合モデルでは、その問題はより悪化する。これらの場合に、モデルの複雑さおよびその時間制限に、我々は機械的な問題を加えることができ、これは衝撃または振盪が系を無効にすることを意味している。研究者らは様々なモデル成分（支持体、培地、添加物および細胞系）にアクセスし、その後多少なりとも面倒なプロセスを用いて研究所でそれらを組み合わせねばならない。最善策として、最終研究者はすぐに使える細胞を受け取ってもよいが、制限が加わり、それらの受領後２日以内に実験を行うことが強制されることをこれは事実上意味する。そして、それらは、例えばIn Vitro Technologiesのような、マーケティング会社によるモデルの流通に大きな制限を課している。文献ＥＰ７０２０８１は三次元組織の保存および輸送方法を開示しており、これは２タイプのスポンジに固定された該三次元組織をゼラチン溶液に入れることからなり、これを冷却してゲルとし、輸送および保存を容易にしている。
したがって、一方で研究者がその使用に際して操作に余裕を持ち、他方で供給会社が国際流通上妥当なロジスティック範囲内で配送時間を考えられるように、すぐに使用できる組織化された二次元細胞培養物に基づくモデルを、それらの機能性を保ったままで供給しうる方法を提供する必要性が、現状では存在しているのである。
本発明の目的は、現状の前記必要性を解決する、インビトロの組織化された二次元細胞培養物(organized two-dimensional cell culture)を保存および輸送する方法を提供することからなる。
その主態様によれば、本発明は、インビトロの組織化された細胞培養物を保存および／または輸送する方法であって、
ａ）非対称支持体(asymmetric support)に固定された、組織化された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆し、該細胞培養物が細胞を適切な機能状態で含んでなり、
ｂ）支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、および
ｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送すること
を含んでなる方法を提供する。
ａ）非対称支持体(asymmetric support)に固定された、組織化された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆し、該細胞培養物が細胞を適切な機能状態で含んでなり、
ｂ）支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、および
ｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送すること
を含んでなる方法を提供する。
第２の態様によれば、本出願はまた、本発明の方法によるインビトロの組織化された二次元細胞培養物を保存および／または輸送するために用いられるキットであって、
（ｉ）非対称支持体、および
（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液
を含んでなる、キットを提供する。
（ｉ）非対称支持体、および
（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液
を含んでなる、キットを提供する。
その主態様によれば、本発明は、インビトロの組織化された二次元細胞培養物を保存および／または輸送する方法であって、
ａ）非対称支持体に固定された、組織化された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆し、該細胞培養物が細胞を適切な機能状態で含んでなり、
ｂ）支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、および
ｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送すること
を含んでなる方法を提供する。
ａ）非対称支持体に固定された、組織化された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆し、該細胞培養物が細胞を適切な機能状態で含んでなり、
ｂ）支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、および
ｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送すること
を含んでなる方法を提供する。
特別な態様によれば、本発明による方法は、
ｄ）ゼラチンを液化し、
ｅ）ゼラチンを除去し、かつ培地によってその入れ替えをし、および
ｆ）培養物をインキュベートすること
をさらに含んでなる。
ｄ）ゼラチンを液化し、
ｅ）ゼラチンを除去し、かつ培地によってその入れ替えをし、および
ｆ）培養物をインキュベートすること
をさらに含んでなる。
本発明による方法によれば、細胞培養物またはモデルの保存および／または輸送に際して、細胞の生理学的性質を維持することができ、さらに細胞モデルの本質的機械的性質が保護される。
本発明に関し、非対称支持体(asymmetric support)とは半透過性膜で物理的に分けられた２つの区画を含有する容器のことである、と理解されており、そこに培養細胞が入れられる。好ましい非対称支持体として、本発明ではトランスウェルタイプ(transwell-type)支持体を用いる。
本発明による二次元細胞培養物は、例えば、コラーゲン支持体上で集密化するまで増殖されたＨｕｖｅｃ細胞、分化Ｃａｃｏ‐２細胞の集密培養物、または線維芽細胞、腫瘍細胞、肝臓細胞、内皮細胞などのような、単層で増殖しうるいずれか他のタイプの細胞のような、組織化された培養物である。したがって、腫瘍由来腸上皮系の例としてはＣａｃｏ‐２、ＴＣ７、ＨＴ２９ Ｍ６である。腎上皮系の例としてはＭＤＣＫである。一次ヒト皮膚角化細胞の例としてはＨＥＫである。最後に、一次内皮系または培養物の例はＨＵＶＥＣ、ＨＭＥＣ‐１、ＢＢＥＣ、ＨＡＥＣおよびＢＡＥＣである。好ましくは、本発明の組織化された二次元細胞培養物は分化し、分極化し、かつ機能的に活性である。
本発明によれば、ゼラチン溶液は、溶媒として作用する同培地にゼラチンを溶解することにより調製される。溶媒としての培地の使用のおかげで、本発明による方法に従って培地保存および／または輸送された培養物は、培養物の機能性が保存されることおよび即時に使用できることを、ユーザーに保証している。好ましくは、用いられるゼラチン溶液は２．５重量％である。
本発明による方法では、例えばＡ型豚皮ゼラチンのような市販ゼラチンが用いうる。同様に、例えばＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）のような市販培地が用いうる。ゼラチン溶液を培養物へ適用する最長で７日前に、それを調製しておくことが“勧められ”、もしそうでなければ、本発明の正確な機能にとって必要な、その“保存”性の一部を失うことになる。
培地中のゼラチン溶液は、牛胎児血清（１０％ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ‐グルタミン（完全培地）で補充してもよい。
細胞培養物は下記手法により調製される。最初に、細胞を接種する前に以下の工程を含む被覆を行う：ａ）対応サイズのウェルにインサート(insert)またはトランスウェル(transwell)を入れ、２）無血清のＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）（または他の市販培地）中の各インサートのフィルター（半透過性膜）の上面にコラーゲン溶液（または細胞タイプに応じた、他の細胞外マトリックス成分）を塗布し、および３）好ましくは、細胞培養器（湿度９０％、５％ＣＯ２）で３７℃にする。インサートを用いる前に、過剰の被覆溶液が上面から吸引され、１５〜３０分間細胞培養器中に置かれ、各細胞タイプおよび各アッセイタイプ毎に決定された密度に応じた細胞が接種される。培養物は系の機能状態の範囲内で必要な時間にわたり維持され、好ましくは必要であれば４８〜７２時間毎に培地を変える。用いられるインサートまたはトランスウェルの特徴（サイズ、孔径、物質）は、本発明が適用される細胞タイプおよびアッセイにより特に決められる。培養に用いられる細胞タイプおよびアッセイタイプに応じて、何日かが経過した後、細胞系の機能状態を調べるコントロールが行われる。例えば、バリアモデルに用いられる細胞系の場合には、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）および傍細胞透過測定が用いられる。浸潤／走化性アッセイに用いられる細胞系の場合には、フィルターの下部へ移動した細胞を蛍光色素（例えば、カルセイン）で標識し、次いで蛍光法で定量することにより、走化性／浸潤能が調べられる。
本発明によれば、細胞培養物は培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆される。一般的に、既に機能性の細胞系は固定されており、その系を入手する際ユーザーはアッセイを行う上で時間制限を有しているため、細胞系が適切な機能状態にちょうど達したことがチェックされた正にその瞬間、ゼラチンは適用される。経過した培養時間は“寿命”と称される。即時に使用できる細胞系への本発明の適用について、以下に述べる。細胞培養物の寿命、即ちゼラチンが適用された培養物の寿命は、培養細胞タイプ（線維芽細胞、腫瘍系など）のみならず、その機能面の用途（バリア透過アッセイ、付着アッセイ、走化性アッセイ、浸潤アッセイ）にも依存する。その決定は実験実施上の問題である。そのため、トランスウェルタイプ支持体に接種された線維芽細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の場合には、これらの細胞が走化性アッセイで機能的に活性な条件下、寿命は細胞を接種した後３０分〜１時間である。浸潤アッセイの場合、寿命は１〜２４時間である。対照的に、トランスウェルに接種されたＣａｃｏ‐２細胞の場合には、細胞を接種し、それらがバリアとして既に機能性になり、ゼラチンが適用されてから、寿命は１３日間であり、２５日目の増殖までユーザーはバリア透過試験を行える。
本発明に関し、適切な機能状態とは、各アッセイにおいて定められた機能を行うことが可能なときに、生細胞培養物が存在している状態である、と理解される。
ゼラチンを培養物へ適用するためには、まず、ゼラチン溶液を完全に液化させ、培地温度、通常では３７℃に平衡化させることが必要である。次いで、培地を各インサートの２区画から除去し、各インサートの２区画において培養物が培地で洗浄される。次いで、２．５％液体ゼラチンを上部区画および下部区画に塗布し、フローフード(flow hood)中室温（２０〜２５）℃で２〜３時間かけて固化させる。ゼラチンが固化したら、プレートがパラフィルムで密封され、それらが用いられる（最長４日後）までそれらは室温で保たれる。
固定培養物の使用を必要とする場合、ゼラチンの完全液化まで、好ましくは３７℃、湿度９０％および４％ＣＯ２で３〜４時間かけてゼラチンを完全に液化するまで、セルインキュベーター内で固体ゼラチン状態でプレートをインキュベートする。次いで、培養物を両区画から吸引によって取得し、培養物は３７℃で平衡化培地により洗浄される。次いで、問題の細胞用の特定培地を適用し、その使用まで、それらを好ましくは３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２でインキュベートする。
第二の態様によれば、本発明は、本発明による方法に従いインビトロの組織化された二次元細胞培養物を保存および／または輸送するためのキットを提供し、該キットは、
（ｉ）非対称支持体、および
（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液
を含んでなる。
具体的態様によれば、本発明によるキットは非対称支持体としてトランスウェルタイプ支持体を用いる。
下記例は本発明を説明するためにある。
（ｉ）非対称支持体、および
（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液
を含んでなる。
具体的態様によれば、本発明によるキットは非対称支持体としてトランスウェルタイプ支持体を用いる。
下記例は本発明を説明するためにある。
例１：インビトロＣａｃｏ‐２腸バリアモデルを保存および／または輸送する方法
１‐ゼラチン調製
使用濃度（溶解しうる最大濃度：１０％）で直接的に、５０℃でＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）に溶解された、Ａ型豚皮ゼラチンを用いる。本例では、粉末ゼラチン２．５ｇを秤量し、ＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）１００ｍＬで溶解させる。０．２２μｍ孔フィルター濾過で直ちに（“加熱”しながら）滅菌する。次いで、それを牛胎児血清（１０％ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ‐グルタミン（完全培地）で補充する。最後に、それをその使用まで４℃で保存する。
１‐ゼラチン調製
使用濃度（溶解しうる最大濃度：１０％）で直接的に、５０℃でＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）に溶解された、Ａ型豚皮ゼラチンを用いる。本例では、粉末ゼラチン２．５ｇを秤量し、ＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）１００ｍＬで溶解させる。０．２２μｍ孔フィルター濾過で直ちに（“加熱”しながら）滅菌する。次いで、それを牛胎児血清（１０％ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ‐グルタミン（完全培地）で補充する。最後に、それをその使用まで４℃で保存する。
２‐分極Ｃａｃｏ‐２培養物の調製
被覆：細胞を接種する１２時間前、インサート（６．５ｍｍ径トランスウェル）を対応サイズのウェルへ入れ、各インサートのポリカーボネートフィルター（０．４μｍ孔径半透膜）の上面に無血清のＩ型ラット尾コラーゲン溶液（１ｇ／Ｌグルコース）を塗布し、それを細胞培養器（湿度９０％、５％ＣＯ２）中で３７℃にする。その使用前に、過剰の被覆溶液を上面から吸引し、それを培養器に１５〜３０分間入れ、Ｃａｃｏ‐２細胞を５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で接種する。培養物を１３日間維持し、４８〜７２時間毎に培地を変え、上部区画に完全培地３００μＬおよび下部区画に９００μＬを入れる。１３日目に、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）および傍細胞透過測定により、Ｃａｃｏ‐２単層のバリア状態コントロール（分極化）を行う。これらのコントロールから、ゼラチンで被覆前に、バリアとしての細胞系の機能状態を調べられる。
３‐ゼラチン適用
完全に液化し、培養温度（３７℃）で平衡化するまで、それを３７℃で培養浴に入れる。次いで、培地を各インサートの２区画から除去し、培養物を各インサートの２区画において培地で洗浄する。次いで、２．５％液体ゼラチン３００μＬを上部区画におよび９００μＬを下部区画に適用し、それをフローフード中室温（２０〜２５）℃で２〜３時間かけて固化させる。ゼラチンが固化したら、プレートをパラフィルムで密封し、それらが用いられる（最長４日後）までそれらを室温で保つ。
被覆：細胞を接種する１２時間前、インサート（６．５ｍｍ径トランスウェル）を対応サイズのウェルへ入れ、各インサートのポリカーボネートフィルター（０．４μｍ孔径半透膜）の上面に無血清のＩ型ラット尾コラーゲン溶液（１ｇ／Ｌグルコース）を塗布し、それを細胞培養器（湿度９０％、５％ＣＯ２）中で３７℃にする。その使用前に、過剰の被覆溶液を上面から吸引し、それを培養器に１５〜３０分間入れ、Ｃａｃｏ‐２細胞を５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で接種する。培養物を１３日間維持し、４８〜７２時間毎に培地を変え、上部区画に完全培地３００μＬおよび下部区画に９００μＬを入れる。１３日目に、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）および傍細胞透過測定により、Ｃａｃｏ‐２単層のバリア状態コントロール（分極化）を行う。これらのコントロールから、ゼラチンで被覆前に、バリアとしての細胞系の機能状態を調べられる。
３‐ゼラチン適用
完全に液化し、培養温度（３７℃）で平衡化するまで、それを３７℃で培養浴に入れる。次いで、培地を各インサートの２区画から除去し、培養物を各インサートの２区画において培地で洗浄する。次いで、２．５％液体ゼラチン３００μＬを上部区画におよび９００μＬを下部区画に適用し、それをフローフード中室温（２０〜２５）℃で２〜３時間かけて固化させる。ゼラチンが固化したら、プレートをパラフィルムで密封し、それらが用いられる（最長４日後）までそれらを室温で保つ。
４‐ゼラチン除去
固定培養物の使用を必要とするときには、好ましくは３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２で３〜４時間かけてゼラチンが完全に液化するまで、セルインキュベーター内で固体ゼラチン状態でプレートをインキュベートする。次いで、それを両区画から吸引により除去し、培養物を３７℃で平衡化培地により洗浄する。次いで、Ｃａｃｏ‐２細胞用の特定培地を適用し、その使用（最短２４時間；最長９日後）まで、細胞を好ましくは３７℃、湿度９０％／５％ＣＯ２でインキュベートし、４８〜７２時間毎に培地を変える。
固定培養物の使用を必要とするときには、好ましくは３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２で３〜４時間かけてゼラチンが完全に液化するまで、セルインキュベーター内で固体ゼラチン状態でプレートをインキュベートする。次いで、それを両区画から吸引により除去し、培養物を３７℃で平衡化培地により洗浄する。次いで、Ｃａｃｏ‐２細胞用の特定培地を適用し、その使用（最短２４時間；最長９日後）まで、細胞を好ましくは３７℃、湿度９０％／５％ＣＯ２でインキュベートし、４８〜７２時間毎に培地を変える。
表１で示されるように、ゼラチン中で５および７日間の固定後に得られたＴＥＥＲ値には、それを適用する前に得られたコントロール値と比較して、有意の低下が観察される。この結果は、本発明で開示されたゼラチン中の保存方法が：１）機能バリア状態に影響を与えることなく、室温にて４日以内はＣａｃｏ‐２系を固定すること、および２）ゼラチンが除去されたら、バリア透過アッセイを行うために機能状態とした後９日以内は維持しうることを示している。
例２：ゼラチン適用前における培養物の特徴付けおよび培養物寿命の測定
表IIは、単層を形成するトランスウェルタイプ支持体で培養でき、ゼラチン中バリア状態で保存および輸送しうる、一部の細胞タイプ、ひいては本輸送方法が適用しうる培養物のいくつかを示している。
‐Ｃａｃｏ‐２、ＴＣ７、ＨＴ２９ Ｍ６：腫瘍由来の腸上皮系
‐ＭＤＣＫ：腎上皮系
‐ＨＥＫ：一次ヒト皮膚角化細胞
‐ＨＵＶＥＣ、ＨＭＥＣ‐１、ＢＢＥＣ、ＨＡＥＣ、ＢＡＥＣ：一次内皮細胞培養物または系
表IIは、単層を形成するトランスウェルタイプ支持体で培養でき、ゼラチン中バリア状態で保存および輸送しうる、一部の細胞タイプ、ひいては本輸送方法が適用しうる培養物のいくつかを示している。
‐Ｃａｃｏ‐２、ＴＣ７、ＨＴ２９ Ｍ６：腫瘍由来の腸上皮系
‐ＭＤＣＫ：腎上皮系
‐ＨＥＫ：一次ヒト皮膚角化細胞
‐ＨＵＶＥＣ、ＨＭＥＣ‐１、ＢＢＥＣ、ＨＡＥＣ、ＢＡＥＣ：一次内皮細胞培養物または系
表IIで示される培養時間は、分極単層を得る上で最良の時間間隔に関し、それを超えると、それは細胞バリアとして最良の機能性を失ってしまう。
機能バリア状態を保存して、アッセイを行う時間をユーザーに残せる、これら細胞系の寿命（ゼラチンが適用される培養物のモーメント）の測定が、ＴＥＥＲおよび傍細胞透過測定を用いて実験的に行われた。
適切な機能状態に達した時点で、ゼラチンを培養物に適用する。Ｃａｃｏ‐２細胞バリア透過試験の場合は、ゼラチンを好ましくは１３日目（細胞が機能性分極単層またはバリアを形成し始めるほぼ最短の時間）に適用する。それらは室温で約１７日目までゼラチン中で保存でき、それらの機能バリア性を失うことなく、約２５日目まで用いられる。
各種細胞タイプ（線維芽細胞、腫瘍系）の寿命、または表IIで記載されているが、バリア透過アッセイ（付着アッセイ、走化性アッセイ、浸潤アッセイ）の異なる機能面で規定されるものは、異なるゼラチン適用時間を示す。トランスウェルタイプ支持体に接種された線維芽細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の場合には、これらの細胞が走化性アッセイで機能的に活性な条件下において、寿命は細胞の接種後３０分〜１時間である。浸潤アッセイの場合、寿命は１〜２４時間である。
例３：走化性／浸潤アッセイ用に即時に使用できる細胞系を保存および輸送する方法
１‐ゼラチン調製
使用濃度（溶解しうる最大濃度：１０％）で直接的に、用いられる細胞タイプに対応した培地（例えば、線維芽細胞の場合ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）またはＨＵＶＥＣ内皮細胞の場合ＥＢＭ培地）に５０℃で溶解した、Ａ型豚皮ゼラチンを用いる。本例では、粉末ゼラチン２．５ｇを秤量し、それをＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）１００ｍＬで溶解させる。保存および輸送中の細胞生存率を高めるために、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳをコンディショニング培地へ加える。それを０．２２μｍ孔フィルター濾過で直ちに（“加熱”しながら）滅菌する。次いで、それを牛胎児血清（細胞タイプに応じたパーセンテージ）およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ‐グルタミン（完全培地）で補充する。最後に、それをその使用まで４℃で保存する。
１‐ゼラチン調製
使用濃度（溶解しうる最大濃度：１０％）で直接的に、用いられる細胞タイプに対応した培地（例えば、線維芽細胞の場合ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）またはＨＵＶＥＣ内皮細胞の場合ＥＢＭ培地）に５０℃で溶解した、Ａ型豚皮ゼラチンを用いる。本例では、粉末ゼラチン２．５ｇを秤量し、それをＤＭＥＭ培地（１ｇ／Ｌグルコース）１００ｍＬで溶解させる。保存および輸送中の細胞生存率を高めるために、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳをコンディショニング培地へ加える。それを０．２２μｍ孔フィルター濾過で直ちに（“加熱”しながら）滅菌する。次いで、それを牛胎児血清（細胞タイプに応じたパーセンテージ）およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ‐グルタミン（完全培地）で補充する。最後に、それをその使用まで４℃で保存する。
２‐非対称支持体における細胞培養物の調製
被覆に際して、細胞を接種する１２時間前、インサート（３または８μｍ径のFluoroblock系）を対応サイズのウェルへ入れ、ＰＢＳで希釈された対応マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン）の溶液を各インサートの繊維の上面および下面へ入れ、それを細胞培養器（湿度９０％、５％ＣＯ２）中で３７℃にする。その使用前に、過剰の被覆溶液を上面から吸引し、それを培養器に１５〜３０分間入れ、細胞を培養タイプに応じた密度（５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２）で接種する。非対称支持体をマトリックスで被覆しないならば、細胞をフィルターに直接接種する。このタイプのアッセイでは、細胞接種および付着時間（３０分〜１時間）中に、Fluoroblock系の下部区画に培地を入れる必要はない。対応試験を接種細胞の一部で行い、室温でそれらを維持するために残部へゼラチンを適用する。これらのコントロールから細胞系の機能状態を調べられる。
被覆に際して、細胞を接種する１２時間前、インサート（３または８μｍ径のFluoroblock系）を対応サイズのウェルへ入れ、ＰＢＳで希釈された対応マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン）の溶液を各インサートの繊維の上面および下面へ入れ、それを細胞培養器（湿度９０％、５％ＣＯ２）中で３７℃にする。その使用前に、過剰の被覆溶液を上面から吸引し、それを培養器に１５〜３０分間入れ、細胞を培養タイプに応じた密度（５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２）で接種する。非対称支持体をマトリックスで被覆しないならば、細胞をフィルターに直接接種する。このタイプのアッセイでは、細胞接種および付着時間（３０分〜１時間）中に、Fluoroblock系の下部区画に培地を入れる必要はない。対応試験を接種細胞の一部で行い、室温でそれらを維持するために残部へゼラチンを適用する。これらのコントロールから細胞系の機能状態を調べられる。
３‐ゼラチン適用
ゼラチン溶液を完全に液化し、培養温度（３７℃）で平衡化するまで、３７℃で培養浴に入れる。次いで、培地を各インサートの上部区画から除去し、それを（本例では無血清）培地で洗浄する。次いで、２．５％液体ゼラチン３００μＬを上部区画に適用し、それをフローフード中で２〜３時間かけて固化させる。次いで、７００μＬを下部区画に適用し、フローフード中で固化したら、それを室温（２０〜２５）℃で保存する。ゼラチンが固化したら、プレートをパラフィルムで密封し、それらが用いられる（最長４日後）まで室温で保つ。
ゼラチン溶液を完全に液化し、培養温度（３７℃）で平衡化するまで、３７℃で培養浴に入れる。次いで、培地を各インサートの上部区画から除去し、それを（本例では無血清）培地で洗浄する。次いで、２．５％液体ゼラチン３００μＬを上部区画に適用し、それをフローフード中で２〜３時間かけて固化させる。次いで、７００μＬを下部区画に適用し、フローフード中で固化したら、それを室温（２０〜２５）℃で保存する。ゼラチンが固化したら、プレートをパラフィルムで密封し、それらが用いられる（最長４日後）まで室温で保つ。
４‐ゼラチン除去
固定培養物の使用が必要なときは、ゼラチンを完全に液化するまで、セルインキュベーター内３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２で３〜４時間かけて、固体ゼラチン状態でプレートをインキュベートする。次いで、それを両区画から吸引により除去し、培養物を３７℃で平衡化した無血清培地で洗浄する。この時点で、走化性／浸潤アッセイを行うための培地を調製する。
固定培養物の使用が必要なときは、ゼラチンを完全に液化するまで、セルインキュベーター内３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２で３〜４時間かけて、固体ゼラチン状態でプレートをインキュベートする。次いで、それを両区画から吸引により除去し、培養物を３７℃で平衡化した無血清培地で洗浄する。この時点で、走化性／浸潤アッセイを行うための培地を調製する。
走化性アッセイ（２４ｈ走化性）では、コンディショニング培地中で保持されなかった（無コンディショニング培地）ＨＵＶＥＣ細胞の応答を、コンディショニング培地で７２時間保たれたＨＵＶＥＣ細胞の応答と比較する。両ケースとも、細胞を完全ＥＢＭ培地（成長因子および１０％牛胎児血清含有）で刺激した（コントロール＋）。無刺激細胞（コントロール−）は下部での補充なしにＥＢＭで維持した。
図１で示されるように、ゼラチン中で維持された細胞は走化性刺激に応答しうる（図中コントロール＋）。この結果は、本発明で開示されたゼラチン中の保存方法が：１）その機能状態に影響を与えることなく、室温で３日までＨＵＶＥＣ系を固定できること、および２）ゼラチンが除去されると、走化性試験が行えることを示している。
Claims (13)
- インビトロの組織化された二次元細胞培養物を保存および／または輸送する方法であって、
ａ）非対称支持体に固定された、組織化された細胞培養物を培地中１〜５％の濃度のゼラチン溶液で被覆し、前記細胞培養物が細胞を適切な機能状態で含んでなり、
ｂ）前記支持体へ加えられたゼラチンを１５〜２５℃の温度で固化させ、および
ｃ）１５〜２５℃の温度で９６時間以内の期間で細胞培養物を保存および／または輸送すること
を含んでなる、方法。 - ａ）前記ゼラチンを液化し、
ｂ）該ゼラチンを除去し、かつ培地によってその入れ替えをし、および
ｃ）培養物をインキュベートすること
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。 - 前記組織化された二次元細胞培養物が、分化し、分極化し、かつ機能的に活性であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、コラーゲン支持体上で集密化するまで増殖したＨｕｖｅｃ細胞および分化Ｃａｃｏ‐２細胞、または線維芽細胞、腫瘍細胞、肝臓細胞、内皮細胞などのような、単層で増殖しうるいずれか他のタイプの細胞から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
- ２．５％ゼラチン溶液が用いられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゼラチンを、１５〜２５℃の温度で３０分〜１２時間かけて固化させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 非対称支持体がトランスウェルタイプ支持体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゼラチンの液化を、３５〜４０℃で１〜４時間かけて行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゼラチンの液化を３７℃で行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 前記後続の培養物のインキュベートを、３５〜４０℃で１時間〜８日間にわたり行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記後続の培養物のインキュベートを３７℃で行うことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
- 請求項１〜１１のいずれか一項のインビトロの組織化された二次元細胞培養物を保存および／または輸送するためのキットであって、
（ｉ）非対称支持体、および
（ii）培地中濃度１〜５％のゼラチン溶液
を含んでなる、キット。 - 前記非対称支持体がトランスウェルタイプ支持体であることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
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