JP2010029106A - 細胞輸送用担体及びそれを使用した細胞の輸送方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞輸送用担体は魚由来ゼラチン、好ましくは更にグッド緩衝液を含んだものからなり、ゲル状態を呈する当該細胞輸送用担体中に細胞を包埋し、当該担体がゲル状態を維持する温度範囲で輸送を行う。当該細胞輸送用担体及び細胞の輸送方法によれば、細胞は魚由来ゼラチンゲルに包埋されるので輸送中における細胞損傷が抑制され、また、ゼラチンを取り除いて利用できる状態にするまでの時間を短縮でき、安定輸送と高作業効率が得られる。
【選択図】なし
Description
このような問題から、細胞を常温で安定的に輸送できる方法が望まれており、そのような手段として、細胞をゼラチンゲルに包埋し、輸送中における細胞の傷害を防止して輸送する方法が多数提案されている(例えば、特許文献1、2、3など参照)。
上記の問題点を解消するため、本願発明者らは鋭意検討したところ、ゼラチン種によって細胞の保存安定性が異なることが判明した。即ち、従来、このような用途には豚や牛の皮や骨に由来するゼラチン(家畜由来ゼラチン)が使用されてきたが、家畜由来ゼラチンに代えて魚由来ゼラチンを使用すると、細胞の保存安定性を著しく高めることが可能となった。また、輸送した細胞を利用する際にはゲル化したゼラチンを完全に取り除く必要があるが、従来の家畜由来ゼラチンではその取り除く作業に時間がかかり、作業能率が悪いのみならず細胞に損傷を与えるおそれがあり、更なる向上が求められていた。魚由来ゼラチンは、ゾルーゲル転移が速やかに進行することから、作業効率が向上し、また細胞損傷も低下させ得ることが判明した。
更に、本発明者らは、輸送中における細胞の損傷の一因は輸送中における培地のpH変化(上昇)にあることを突き止めた。そこで、緩衝液により輸送中における培地のpHの上昇を抑制すると共に魚由来ゼラチンゲルに細胞を包埋すると、両者の相乗効果により細胞を安定的に輸送し得ることを見出した。
本発明の課題は、細胞を常温付近温度で安定的に輸送し、且つ輸送された細胞が使用できる状態になるまでの時間を短縮した作業効率のよい輸送用担体及びそれを使用した細胞の輸送方法を提供するものである。
また、本発明の細胞の輸送方法は、ゲル状態を呈する上記の細胞輸送用担体中に細胞を包埋し、当該担体がゲル状態を維持する温度範囲で輸送を行うことからなる。
更に、魚由来ゼラチンをグッド緩衝液と併用すると輸送中の安定性を更に高めることが可能となった。
従って、本発明の細胞輸送用担体及び細胞の輸送方法によれば、常温付近の温度で細胞の輸送を安定的に行うことができ、且つ作業効率が著しく高まり、新鮮な状態で細胞を輸送できるという格別な効果を奏する。
上記のゼラチンは、既に周知のようにコラーゲンの熱変性物であり、ゾル−ゲル転移点より高い温度ではゾル状態を呈し、当該温度より低い温度ではゲル状態を呈することが知られている。
本発明で使用されるゼラチンは魚の皮、鱗などに由来する魚由来ゼラチンである。魚由来ゼラチンの魚種としては、皮及び鱗中のコラーゲン含量が高い魚種が好ましく、例えばテラピア、タラ、サケ、イズミダイ、コイ、イトヨリなどが例示される。
また、ゼラチンのゾル−ゲル転移点は、ゼラチンの原料、製造方法などによって異なり、本発明においてはゾル−ゲル転移点が25〜37℃の範囲にあるものが好適に使用される。
更に、化学的に修飾されたゼラチン(抗プロテアーゼゼラチン)を使用してもよい。
BES: N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic
acid (pKa 7.15)
MOPS: 3-Morpholinopropanesulfonic
acid (pKa 7.20)
TES: N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic
acid (pKa 7.50)
HEPES: 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic
acid (pKa 7.55)
DIPSO: 3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic
acid (pKa 7.60)
TAPSO: 2-Hydroxy-N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid (pKa 7.70)
POPSO: Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic
acid),dehydrate (pKa 7.85)
HEPPSO: 2-Hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic
acid,monohydrate (pKa 7.90)
EPPS: 3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic
acid (pKa 8.00)
が例示され、好ましくはHEPES又はMOPSが使用される。
当該担体におけるゼラチンの含量としては、所望するゲルの強度により適宜選択することができ、水などに溶解した状態で通常は3〜15%程度(W/V%、以下特に明示のない限り、%はW/V%を示す)、好ましくは5〜10%程度に調整される。3%未満ではゲル強度が不足するおそれがあり、15%を超えるとゲル強度が過大となりゾル状態に戻す際に時間がかかり、その間に細胞を損傷するおそれがある。
細胞培養培地、細胞の栄養源などは、細胞種、輸送期間などに応じて適宜の量を使用することができる。
より具体的には、輸送される細胞が浮遊細胞の場合には、本発明の輸送用担体に水を加え、更に必要に応じて細胞培養培地及び栄養源を添加し、ゾル−ゲル転移点以上に加温してゾル状態とした後、細胞を加えて分散させる。次いで、当該細胞を含むゾルを適当な輸送用容器に充填し、密封した後、ゾル−ゲル転移点以下に冷却してゲル状態とする。これにより、細胞は、本発明の輸送用担体のゲルに包埋された状態で容器に収納されることになる。
また、輸送される細胞が接着細胞の場合には、適当な輸送用容器内に細胞を予め付着させておく。一方で、本発明の輸送用担体に水を加え、更に必要に応じて細胞培養培地及び栄養源を添加し、ゾル−ゲル転移点以上に加温してゾル状態とし、そのゾルを当該容器に充填し、密封した後、ゾル−ゲル転移点以下に冷却してゲル状態とする。これにより、細胞は、本発明の輸送用担体のゲルに包埋された状態で容器に収納されることになる。
輸送された容器は、ゾル−ゲル転移点以上に加温してゲル状態をゾル状態として流動性を持たせた後、細胞を分離し、必要に応じて洗浄することにより、細胞の輸送が完了する。
通常のDMEM培地 (Sigma D5796, 10%血清添加)へ魚由来ゼラチン(商品名イクオス、新田ゼラチン社製、魚の鱗・皮由来ゼラチン)を8重量%になるように添加した培地に、DT40細胞(ニワトリB細胞株)をおき、5日間の室温放置後の細胞数を調べた。
この際、比較のために、魚由来ゼラチンに代えて豚由来ゼラチンを添加した培地を使用した以外は同じ条件での比較実験をした。
実施例1の培地の中にある細胞を取り出すため、ゲル化している状態の細胞含有培地をゾル化するに際して、ゾル化して細胞を取り出せるまでの時間を比較した。その結果を表2に示す。表2に示されるように、取り出して使用できるまでの時間が55%まで短縮されることが判明した。
実施例1で用いた培地にHEPESを終濃度25mMになるように加えた条件下で、細胞の安定性を測定した。その結果を表3に示す。表3に示されるように、HEPESを共存させることで細胞生存率は100%を越すことができ、細胞の保存状態が改良されていることが判明した。
なお、実施例1〜3では、魚由来ゼラチンとしてイクオスを使用して実験を行なったが、その他の魚由来ゼラチン(例えばサケ由来ゼラチン)についても同様の効果が得られる。
Claims (5)
- 魚由来ゼラチンからなる細胞輸送用担体。
- グッド緩衝液を含む請求項1記載の細胞輸送用担体。
- グッド緩衝液が、HEPES緩衝液又はMOPS緩衝液である請求項1又は2記載の細胞輸送用担体。
- 細胞培養培地を含有する請求項1〜3の何れかに記載の細胞輸送用担体。
- ゲル状態を呈する請求項1〜4の何れかに記載の細胞輸送用担体中に細胞を包埋し、当該担体がゲル状態を維持する温度範囲で輸送を行うことを特徴とする細胞の輸送方法。
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