JPH0823968A - 保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法 - Google Patents
保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法Info
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Abstract
理方法に関する。 【構成】 昇温してゾル化したゼラチン溶液中に培養皮
膚を配置させ、然る後にこれを降温してゲル化させ、か
かるゲル化したゼラチンによって配置させた培養皮膚を
固定することを特徴とする保存、輸送に供する培養皮膚
の処理方法。
Description
養皮膚の処理方法に関する。
ては皮膚への刺激性、毒性等を判定するために動物によ
る各種実験が行われているが、一方では近時の動物愛護
の観点から、また、より人体に近い実験へのニーズか
ら、更には、均質な材料の安定的供給の観点から、人体
の皮膚モデルに関する研究が行われている。かかる皮膚
モデルとしては、例えば、コラーゲンスポンジに人体細
胞を播種して培養したもの、生細胞からなるもの、或
は、表皮、真皮の二層構造に培養されたもの等種々ある
が、何れも物理的強度が極めて弱く、軽い衝撃等で簡単
に破損したり剥離したりするため、特に、保存、輸送等
の面において問題があった。即ち、培養液に浸漬した状
態で取り扱う従来法にあっては、振動等による破損、或
は、培養液が容器からこぼれたりする等の問題を有し
た。また、アガロース(寒天)を用いて固定する方法も
あるが、かかるアガロースのゾル化には50℃という高
温を要するため、細胞が死滅したり、或は、ゲル強度が
強過ぎるため、培養皮膚を取り出す際に破損しやすいと
いう問題がある。
特に、保存、輸送等に適し、振動、収納容器の転倒にお
いても液がこぼれたり、また、培養皮膚自体が破損した
り、或は、細胞が死滅したり、変質したりすることのな
い新規な固定方法を提供するものである。
高めてゾル化したゼラチン溶液中に培養皮膚を配置さ
せ、然る後、温度を下げてかかるゼラチンをゲル化する
ことによって、前記の培養皮膚を固定化することに特徴
を有する培養皮膚の処理法に関する。
培養皮膚を入れ、これをゲル化することによってゼリー
化したゼラチンによってその周囲を固定、保持するた
め、例えば、振動、横転、反転等してもかかる培養皮膚
がゼラチン面から移動したり剥れることがない。また、
ゼラチン自体高粘度化しているため、容器からこぼれる
こともない。従って、通常の取扱い、或は、輸送時等に
おける従来のトラブルが解消する。また、該ゼラチンの
溶媒として細胞培養液を用いることによって保存、輸送
中に必要な栄養源が確保され、細胞が死滅したり変質す
ることなく長期に安定している。また、特に、表皮と真
皮の二層構造より成る培養皮膚においては、表皮は気相
に、真皮は栄養補給層、即ち、培地に接していなけれ
ば、ふやけ、細胞の死滅というようなトラブルを生じる
が、本発明方法によればかかる問題を生ずることがな
い。
の動物の皮、腱、靭帯、筋膜等より抽出されるもので、
ゾル−ゲル転移点が20〜35℃の範囲にあるものであ
ればその由来を特に問わない。従って、にかわのような
ものであってもよい。かかるゼラチンの濃度は溶媒に対
し1〜20重量%、好ましくは5〜10重量%の範囲に
あることが、ゾル状態の粘度、ゲル化に要する時間、形
成されるゲルの強度等の点において望ましい。即ち、使
用濃度が高すぎるとゾル状態での粘度及び、ゲル状態で
の強度が高過ぎるため固定作業、及び、取り出しの際の
損傷等の問題があり、逆に使用濃度が低過ぎるとゲル化
に時間を要し、また、保持性に劣る問題がある。また、
これの溶媒としては、保存、輸送時等における栄養を確
保するため、例えば、細胞培養液であるDME+5%血
清培地等をそのまま用いるのが好適であるが、適宜栄養
源を添加してもよい。
として、例えば、コラーゲンスポンジに真皮線維芽細胞
を播種し、しかる後にこの上に表皮角化細胞を播種する
ことによって製造される毒性試験、或は、創傷治療用の
人工皮膚等に適用されるものが例示できるが、特に、こ
れに限定されるものではなく単層より成るものであって
も良い。かかる培養皮膚とゼラチンゲルとの一体化に際
しては、培養に汎用される透明な蓋付きの容器に加熱し
てゾル化したゼラチンを適量入れ、次いで、培養皮膚を
その中心に位置させ、必要量のゼラチン中に埋没させた
後、ゲル化温度まで冷却して固定させても、容器の中心
に培養皮膚を位置させ、これに必要量のゾル化したゼラ
チンを注ぎ込み、その後ゲル化温度まで冷却して固定さ
せても何れでも良い。しかる後は、極端な低温、例え
ば、培養皮膚の細胞が剥れないよう10℃以上、また、
逆にゾル化して保持力が低下したり、細胞が死滅するこ
とのないよう37℃以下の温度を維持して管理する。ま
た、これの使用に際しては、ゲル化したゼラチンから直
接培養皮膚を取り出してもよいが、損傷等を防止する意
味において温度を高めてゼラチンをゾル化し、低粘度の
状態で取り出すのが好ましい。この際ゼラチンが付着し
ているような場合には生理食塩水等で洗浄するのが望ま
しい。
る。 1.皮膚モデルのゼラチンへの固定 (1)皮膚モデルの調整 24ウエル培養プレートの底面に架橋し、凍結乾燥した
ポアサイズ90μm、厚さ3mmのTypeIコラーゲ
ンから成るスポンジを敷き、ヒト線維芽細胞をKGM+
10%血清培地に懸濁し、1平方センチ当り100万c
ellsの濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着する
まで37℃で1晩培養した。次いで、このスポンジ上に
ポアサイズ15μm、厚さ40μmのTypeIコラー
ゲンから成る架橋、凍結乾燥され、シート状にプレスさ
れたスポンジシートを敷き、ヒト角化細胞をKGM+1
0%血清培地に懸濁し、1平方センチ当り80万cel
lsの濃度で播種し、37℃で1晩培養して表皮層と真
皮層の二層構造からなる皮膚モデルを作成した。 (2)ゼラチン溶液の調整 溶媒としてのDME+5%血清培地100mlを37℃
に保ち、これにEOG滅菌したウシ骨由来のゼラチン粉
末10gを加え、攪拌、溶解して10%ゼラチンゾル溶
液を調整した。かかる液は水のようにさらさらした低粘
度のゾルであった。 (3)ゲルへの封入 (1)で調整した皮膚モデルを6ウエルプレートの中心
に置き、このまわりに(2)で調整したゼラチンゾルを
3ml加えた。この液量では皮膚モデル表面の表皮層は
気相、即ち、空気に接し、真皮層はゼラチン液中に保た
れていた。これを室温(約20℃)で放置したところ約
30分後にはゲル化し、ゼリー状の高粘度のゼラチンに
よってかかる皮膚モデルは固定された。 2.保存、輸送の確認試験 前記のように固定した培養皮膚モデルが保存、輸送に耐
え得るかどうかを確認するため37℃で培養を続けた皮
膚モデルをコントロールとし、ゲル封入後1,3,5日
間室温(20℃)で放置した本発明モデルの細胞数をニ
ュートラルレッド法で計測した。その結果、1日後9
7.7%、3日後101.8%、5日後102.0%
(但し、37℃のモデルを100としたとき)の値を得
た。これは、この間に細胞の状態が常に正常に維持され
たことを示したものである。また、同時に5日後のモデ
ルの組織切片を作成し、観察したところ大きな構造の変
化がなかったことが確認できた。更に、取り扱い上、ゼ
ラチンゲルで固定された培養皮膚はそのままの状態を維
持し、剥離したり損傷することがなかった。
温度範囲においてゲルとゾルに可逆的に変化するゼラチ
ンの性質を利用し、高粘度のゲル状態にあるゼラチンに
よって培養皮膚を固定、保持するため、輸送、取り扱い
時にこれが損傷したり、変質する等のトラブルを生じな
い。また、細胞培養液を溶媒として用いたり、適宜の栄
養源をこれに加えることによって細胞の成育状態を維持
できること、更に、ゾル、ゲル化の温度が細胞が死滅し
たり、損傷するほどの高温、低温を要しないこと等極め
て適しており、出荷時までの保存、或は、輸送、更に
は、そのための作業性等において優れた効果を発揮する
ものである。また、予め無底のセル等の容器に皮膚培養
を行えば、ゼラチン溶液への移し替えにおいてこれをそ
のまま移設したり、容器をそのまま固定してゼラチンを
注ぎ込むこともでき、作業が容易であるばかりか、これ
に伴う損傷等も防止できる。更に、前記したように該ゼ
ラチン自体細胞培養液を溶媒として、十分培地となり得
ることから当初よりこれを培地として皮膚培養を行え
ば、一旦培養された培養皮膚をこれに移し替える必要が
なく、その作業がより合理的であると共に、移し替えに
伴う損傷等の懸念が更に解消されるものである。
Claims (3)
- 【請求項1】 昇温してゾル化したゼラチン溶液中に培
養皮膚を配置させ、然る後にこれを降温してゲル化さ
せ、かかるゲル化したゼラチンによって配置させた培養
皮膚を固定することを特徴とする保存、輸送に供する培
養皮膚の処理方法。 - 【請求項2】 ゼラチンの溶媒として細胞培養液を用い
ることを特徴とする請求項1記載の処理方法。 - 【請求項3】 培養皮膚が表皮と真皮の二層構造より成
り、かかる表皮部分が気相に接し、真皮部分がゲル化し
たゼラチン層に接するよう配置されたことを特徴とする
請求項1、及び、請求項2記載の処理方法。
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JP6198071A JP2928727B2 (ja) | 1994-07-18 | 1994-07-18 | 保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法 |
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-
1994
- 1994-07-18 JP JP6198071A patent/JP2928727B2/ja not_active Expired - Lifetime
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