JPH0823968A - 保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法 - Google Patents

保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法

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JPH0823968A
JPH0823968A JP6198071A JP19807194A JPH0823968A JP H0823968 A JPH0823968 A JP H0823968A JP 6198071 A JP6198071 A JP 6198071A JP 19807194 A JP19807194 A JP 19807194A JP H0823968 A JPH0823968 A JP H0823968A
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勝保 諸田
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、保存、輸送に適する培養皮膚の処
理方法に関する。 【構成】 昇温してゾル化したゼラチン溶液中に培養皮
膚を配置させ、然る後にこれを降温してゲル化させ、か
かるゲル化したゼラチンによって配置させた培養皮膚を
固定することを特徴とする保存、輸送に供する培養皮膚
の処理方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、保存、輸送に適する培
養皮膚の処理方法に関する。
【0002】
【従来の技術】新規に開発された医薬、化粧品等に関し
ては皮膚への刺激性、毒性等を判定するために動物によ
る各種実験が行われているが、一方では近時の動物愛護
の観点から、また、より人体に近い実験へのニーズか
ら、更には、均質な材料の安定的供給の観点から、人体
の皮膚モデルに関する研究が行われている。かかる皮膚
モデルとしては、例えば、コラーゲンスポンジに人体細
胞を播種して培養したもの、生細胞からなるもの、或
は、表皮、真皮の二層構造に培養されたもの等種々ある
が、何れも物理的強度が極めて弱く、軽い衝撃等で簡単
に破損したり剥離したりするため、特に、保存、輸送等
の面において問題があった。即ち、培養液に浸漬した状
態で取り扱う従来法にあっては、振動等による破損、或
は、培養液が容器からこぼれたりする等の問題を有し
た。また、アガロース(寒天)を用いて固定する方法も
あるが、かかるアガロースのゾル化には50℃という高
温を要するため、細胞が死滅したり、或は、ゲル強度が
強過ぎるため、培養皮膚を取り出す際に破損しやすいと
いう問題がある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる点、
特に、保存、輸送等に適し、振動、収納容器の転倒にお
いても液がこぼれたり、また、培養皮膚自体が破損した
り、或は、細胞が死滅したり、変質したりすることのな
い新規な固定方法を提供するものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、温度を
高めてゾル化したゼラチン溶液中に培養皮膚を配置さ
せ、然る後、温度を下げてかかるゼラチンをゲル化する
ことによって、前記の培養皮膚を固定化することに特徴
を有する培養皮膚の処理法に関する。
【0005】
【作用】本発明によれば、ゾル状態にあるゼラチン中に
培養皮膚を入れ、これをゲル化することによってゼリー
化したゼラチンによってその周囲を固定、保持するた
め、例えば、振動、横転、反転等してもかかる培養皮膚
がゼラチン面から移動したり剥れることがない。また、
ゼラチン自体高粘度化しているため、容器からこぼれる
こともない。従って、通常の取扱い、或は、輸送時等に
おける従来のトラブルが解消する。また、該ゼラチンの
溶媒として細胞培養液を用いることによって保存、輸送
中に必要な栄養源が確保され、細胞が死滅したり変質す
ることなく長期に安定している。また、特に、表皮と真
皮の二層構造より成る培養皮膚においては、表皮は気相
に、真皮は栄養補給層、即ち、培地に接していなけれ
ば、ふやけ、細胞の死滅というようなトラブルを生じる
が、本発明方法によればかかる問題を生ずることがな
い。
【0006】本発明に用いられるゼラチンは、豚、牛等
の動物の皮、腱、靭帯、筋膜等より抽出されるもので、
ゾル−ゲル転移点が20〜35℃の範囲にあるものであ
ればその由来を特に問わない。従って、にかわのような
ものであってもよい。かかるゼラチンの濃度は溶媒に対
し1〜20重量%、好ましくは5〜10重量%の範囲に
あることが、ゾル状態の粘度、ゲル化に要する時間、形
成されるゲルの強度等の点において望ましい。即ち、使
用濃度が高すぎるとゾル状態での粘度及び、ゲル状態で
の強度が高過ぎるため固定作業、及び、取り出しの際の
損傷等の問題があり、逆に使用濃度が低過ぎるとゲル化
に時間を要し、また、保持性に劣る問題がある。また、
これの溶媒としては、保存、輸送時等における栄養を確
保するため、例えば、細胞培養液であるDME+5%血
清培地等をそのまま用いるのが好適であるが、適宜栄養
源を添加してもよい。
【0007】一方、本発明に適用可能な培養皮膚の好例
として、例えば、コラーゲンスポンジに真皮線維芽細胞
を播種し、しかる後にこの上に表皮角化細胞を播種する
ことによって製造される毒性試験、或は、創傷治療用の
人工皮膚等に適用されるものが例示できるが、特に、こ
れに限定されるものではなく単層より成るものであって
も良い。かかる培養皮膚とゼラチンゲルとの一体化に際
しては、培養に汎用される透明な蓋付きの容器に加熱し
てゾル化したゼラチンを適量入れ、次いで、培養皮膚を
その中心に位置させ、必要量のゼラチン中に埋没させた
後、ゲル化温度まで冷却して固定させても、容器の中心
に培養皮膚を位置させ、これに必要量のゾル化したゼラ
チンを注ぎ込み、その後ゲル化温度まで冷却して固定さ
せても何れでも良い。しかる後は、極端な低温、例え
ば、培養皮膚の細胞が剥れないよう10℃以上、また、
逆にゾル化して保持力が低下したり、細胞が死滅するこ
とのないよう37℃以下の温度を維持して管理する。ま
た、これの使用に際しては、ゲル化したゼラチンから直
接培養皮膚を取り出してもよいが、損傷等を防止する意
味において温度を高めてゼラチンをゾル化し、低粘度の
状態で取り出すのが好ましい。この際ゼラチンが付着し
ているような場合には生理食塩水等で洗浄するのが望ま
しい。
【0008】
【実施例】以下、本発明について実施例を挙げて説明す
る。 1.皮膚モデルのゼラチンへの固定 (1)皮膚モデルの調整 24ウエル培養プレートの底面に架橋し、凍結乾燥した
ポアサイズ90μm、厚さ3mmのTypeIコラーゲ
ンから成るスポンジを敷き、ヒト線維芽細胞をKGM+
10%血清培地に懸濁し、1平方センチ当り100万c
ellsの濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着する
まで37℃で1晩培養した。次いで、このスポンジ上に
ポアサイズ15μm、厚さ40μmのTypeIコラー
ゲンから成る架橋、凍結乾燥され、シート状にプレスさ
れたスポンジシートを敷き、ヒト角化細胞をKGM+1
0%血清培地に懸濁し、1平方センチ当り80万cel
lsの濃度で播種し、37℃で1晩培養して表皮層と真
皮層の二層構造からなる皮膚モデルを作成した。 (2)ゼラチン溶液の調整 溶媒としてのDME+5%血清培地100mlを37℃
に保ち、これにEOG滅菌したウシ骨由来のゼラチン粉
末10gを加え、攪拌、溶解して10%ゼラチンゾル溶
液を調整した。かかる液は水のようにさらさらした低粘
度のゾルであった。 (3)ゲルへの封入 (1)で調整した皮膚モデルを6ウエルプレートの中心
に置き、このまわりに(2)で調整したゼラチンゾルを
3ml加えた。この液量では皮膚モデル表面の表皮層は
気相、即ち、空気に接し、真皮層はゼラチン液中に保た
れていた。これを室温(約20℃)で放置したところ約
30分後にはゲル化し、ゼリー状の高粘度のゼラチンに
よってかかる皮膚モデルは固定された。 2.保存、輸送の確認試験 前記のように固定した培養皮膚モデルが保存、輸送に耐
え得るかどうかを確認するため37℃で培養を続けた皮
膚モデルをコントロールとし、ゲル封入後1,3,5日
間室温(20℃)で放置した本発明モデルの細胞数をニ
ュートラルレッド法で計測した。その結果、1日後9
7.7%、3日後101.8%、5日後102.0%
(但し、37℃のモデルを100としたとき)の値を得
た。これは、この間に細胞の状態が常に正常に維持され
たことを示したものである。また、同時に5日後のモデ
ルの組織切片を作成し、観察したところ大きな構造の変
化がなかったことが確認できた。更に、取り扱い上、ゼ
ラチンゲルで固定された培養皮膚はそのままの状態を維
持し、剥離したり損傷することがなかった。
【0009】
【発明の効果】本発明は、上記のように20〜35℃の
温度範囲においてゲルとゾルに可逆的に変化するゼラチ
ンの性質を利用し、高粘度のゲル状態にあるゼラチンに
よって培養皮膚を固定、保持するため、輸送、取り扱い
時にこれが損傷したり、変質する等のトラブルを生じな
い。また、細胞培養液を溶媒として用いたり、適宜の栄
養源をこれに加えることによって細胞の成育状態を維持
できること、更に、ゾル、ゲル化の温度が細胞が死滅し
たり、損傷するほどの高温、低温を要しないこと等極め
て適しており、出荷時までの保存、或は、輸送、更に
は、そのための作業性等において優れた効果を発揮する
ものである。また、予め無底のセル等の容器に皮膚培養
を行えば、ゼラチン溶液への移し替えにおいてこれをそ
のまま移設したり、容器をそのまま固定してゼラチンを
注ぎ込むこともでき、作業が容易であるばかりか、これ
に伴う損傷等も防止できる。更に、前記したように該ゼ
ラチン自体細胞培養液を溶媒として、十分培地となり得
ることから当初よりこれを培地として皮膚培養を行え
ば、一旦培養された培養皮膚をこれに移し替える必要が
なく、その作業がより合理的であると共に、移し替えに
伴う損傷等の懸念が更に解消されるものである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 昇温してゾル化したゼラチン溶液中に培
    養皮膚を配置させ、然る後にこれを降温してゲル化さ
    せ、かかるゲル化したゼラチンによって配置させた培養
    皮膚を固定することを特徴とする保存、輸送に供する培
    養皮膚の処理方法。
  2. 【請求項2】 ゼラチンの溶媒として細胞培養液を用い
    ることを特徴とする請求項1記載の処理方法。
  3. 【請求項3】 培養皮膚が表皮と真皮の二層構造より成
    り、かかる表皮部分が気相に接し、真皮部分がゲル化し
    たゼラチン層に接するよう配置されたことを特徴とする
    請求項1、及び、請求項2記載の処理方法。
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