CN109071628A - 细胞片包埋剂、含细胞片的组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种在低温下传输时能够稳定地传输细胞片，传输后，能够简便地从细胞片包埋剂回收细胞片的细胞片包埋剂、以及含细胞片的组合物及试剂盒。根据本发明，提供一种包含多肽的细胞片包埋剂，该多肽由下述式1表示，并且分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。式1：A‑[(Gly‑X‑Y)n]m‑B，式中，X及Y分别独立地表示氨基酸，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A及B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种包含分子量分布满足规定的条件的多肽的细胞片包埋剂。本发明还涉及一种包含上述细胞片包埋剂的含细胞片的组合物及试剂盒。
背景技术
近年来，实施了许多再生医疗及细胞移植治疗。尤其，研究了许多如下治疗，即，将细胞制成细胞片，仅将细胞制成片状来进行移植的治疗。与将每一个细胞以悬浮液的形式进行给药的情况相比，细胞片保持为结构物，由此使体内的存活良好且有效性得到提高。在专利文献1中，为了提供一种使用了不包含妨碍应用于临床的源自制造工序的杂质成分的细胞培养液的制造方法，记载有一种包含在不包含有效量的生长因子的细胞培养液中培养实质上无需增殖而能够形成细胞片的密度的细胞的细胞片的制造方法。
另一方面，对于不是片状的每一个细胞，研究了将成为细胞的支撑体的支架材料和细胞组合来进行移植。作为成为细胞的支撑体的支架材料，已知有基因重组明胶。在专利文献2中记载有一种基因重组明胶，其特别有用于伴有细胞附着的一些用途、例如细胞培养工作及伴有支架依赖性细胞的细胞培养的用途以及各种医疗用途。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-81829号公报
专利文献2：国际公开WO2008/103041号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
细胞片非常脆，存在传输时容易损坏的问题，成为传输到医院设施等时的问题。并且，在医院设施等中，期望在传输细胞片之后，能够简便地移植细胞片。在细胞片的移植中，期望解决上述问题。本发明欲解决的课题在于提供一种能够在低温下传输时稳定地传输细胞片，传输后，能够简便地从细胞片包埋剂回收细胞片的细胞片包埋剂。本发明欲解决的课题还在于提供一种包含上述细胞片包埋剂的含细胞片的组合物及包含上述细胞片包埋剂的试剂盒。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行深入研究的结果发现，根据包含多肽的细胞片包埋剂，能够在低温下传输时稳定地传输细胞片，而且在传输后移植细胞片时，能够在室温下简便地从细胞片包埋剂回收细胞片，该多肽具有特定的序列，且分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。本发明是基于这些见解而完成的。根据本发明，提供以下发明。
[1]一种细胞片包埋剂，其包含多肽，该多肽由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X。
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
[2]根据[1]所述的细胞片包埋剂，其中，多肽为重组明胶。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞片包埋剂，其中，多肽为由下述式2表示的多肽。
式2：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个。另外，63个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞片包埋剂，其中，多肽具有(1)序列号1中所记载的氨基酸序列、或(2)与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性且具有生物相容性的氨基酸序列。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞片包埋剂，其中，多肽具有序列号1中所记载的氨基酸序列。
[6]一种含细胞片的组合物，其包含细胞片和[1]～[5]中任一项所述的细胞片包埋剂，上述细胞片被上述细胞片包埋剂包埋。
[7]一种试剂盒，其包含细胞片和[1]～[5]中任一项所述的细胞片包埋剂。
[8]一种多肽，其用于细胞片的包埋，由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X。
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
[9]一种多肽的应用，所述多肽用于细胞片包埋剂的制造，由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X。
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
[10]一种细胞片的包埋方法，其包含用多肽包埋细胞片的工序，所述多肽由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X。
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
发明效果
根据本发明的细胞片包埋剂、含细胞片的组合物及试剂盒，在低温下传输时能够稳定地传输细胞片，传输后，能够简便地从细胞片包埋剂回收细胞片。
附图说明
图1表示重组明胶的分子量分布。
图2表示天然动物明胶的分子量分布。
图3表示CBE3包埋细胞片和不包含CBE3的细胞片的振荡前及振荡后的形状。
图4表示振荡前及振荡后的CBE3包埋细胞片的染色的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
＜细胞片包埋剂＞
本发明的细胞片包埋剂为包含由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X的多肽的细胞片包埋剂。
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
所谓在本说明书中所说的细胞片包埋剂，是能够对细胞片进行包埋处理的物质。所谓包埋处理，是通过浸渍等而使细胞片包埋剂与细胞片的表面的一部分或全部接触，接着用细胞片包埋剂包覆细胞片的表面的一部分或全部的处理。
[多肽]
由上述式1表示的多肽以溶液的状态(不是低温的条件)包埋细胞片，通过降低温度，进行凝胶化，成为适于传输的状态。另外，即使从细胞的保存的观点考虑，传输时也需要设为低温。并且，在本发明中，多肽满足条件X(利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上)，由此低温(4℃)下的凝胶化和室温(25℃)下的溶解变得清晰，移植细胞片时，能够在室温下简便地从细胞片包埋剂回收细胞片。
如上所述，在本发明中，利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上，但是更优选为85％以上，尤其优选为90％以上。
关于利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量，能够使用高效液相色谱法(HPLC)(Waters公司制AQUITY UPLC系统Empower2)，并使用100mmol/L磷酸缓冲剂(pH6.8)作为缓冲液来进行测量。
在上述式1中，m为2～10的整数，但是优选表示3～5的整数。
在上述式1中，n为3～100的整数，优选为15～70的整数，更优选为50～65的整数。
对于在本发明中所使用的由式1表示的多肽，只要分子量分布满足上述条件X，则可以是重组多肽、化学合成多肽或天然多肽中的任一个。
所谓化学合成多肽是指，人工合成的多肽。关于多肽的合成，可以是固相合成，也可以是液相合成，但是优选固相合成。对于本领域技术人员来说多肽的固相合成是公知的，例如可举出使用Fmoc基团(芴基-甲氧基-羰基：Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基团)来作为氨基的保护的Fmoc基团合成法、以及使用Boc基团(叔丁氧羰基：tert-Butyl Oxy Carbonyl基团)来作为氨基的保护的Boc基团合成法等。
多肽优选重组多肽。在本说明书中，将由式1表示的重组多肽称为重组明胶。关于重组明胶，在本说明书中在后面进行叙述。
在本发明中所使用的多肽的亲水性值“1/IOB”值优选为0至1.0。更优选为0至0.6，进一步优选为0至0.4。所谓IOB是指，基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲疏水性的指标，关于其详细内容，例如在“Pharmaceutical Bulletin”，vol.2，2，pp.163-173(1954)、“化学的领域”vol.11，10，pp.719-725(1957)、“FragranceJournal”，vol.50，pp.79-82(1981)等中进行了说明。简言之，将所有有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且其他化合物均视作甲烷的衍生物，对其碳原子数、取代基、转换部、环等分别设定一定的数值，并将该得分加在一起而求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，将该值绘制在将有机性值作为X轴且将无机性值作为Y轴的图上。所谓有机概念图中的IOB是指，有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容，参考“新版有机概念图-基础和应用-”(甲田善生等著，SANKYO SHUPPANCo.，Ltd，2008)。在本说明书中，由取IOB的倒数而得的“1/IOB”值表示亲疏水性。其为表示“1/IOB”值越小(接近0)，越亲水的标记。
通过将在本发明中所使用的多肽的“1/IOB”值设为上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高。
关于在本发明中所使用的多肽，由总平均亲水性(Grand average of hydropathicity：GRAVY)值表示的亲疏水性指标优选为0.3以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性(GRAVY)值能够通过《Gasteiger E.，Hoogland C.，GattikerA.，Duvaud S.，Wilkins M.R.，Appel R.D.，Bairoch A.；Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The ProteomicsProtocols Handbook，Humana Press(2005).pp.571-607》及《Gasteiger E.，Gattiker A.，Hoogland C.，Ivanyi I.，Appel R.D.，Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server forin-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).》的方法来获得。
通过将在本发明中所使用的多肽的GRAVY值设为上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高。
[重组明胶]
在本发明中所使用的多肽优选重组明胶。
作为重组明胶，例如能够使用EP1014176、美国专利6992172号、国际公开WO2004/85473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但是并不限定于这些。作为在本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下方式的重组明胶。
从天然明胶原有的性能来看，重组明胶的生物相容性优异，并且由于不是源自天然的，因此不用担心牛海绵状脑病(BSE)等，从而非感染性优异。
重组明胶的分子量并无特别限定，但是优选为2000以上且100000以下(2kDa(千道尔顿)以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
优选重组明胶具有由胶原蛋白的特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意的氨基酸(优选除甘氨酸以外的任意的氨基酸)。所谓由胶原蛋白的特征性Gly-X-Y表示的序列是指，明胶·胶原蛋白的氨基酸组成及序列中的、与其他蛋白质相比非常特异的部分结构。在该部分中，甘氨酸占整体的约3分之1，且在氨基酸序列中以每3中有1个的方式重复。甘氨酸是最简单的氨基酸，且对分子链的配置的限制也较少，对凝胶化时的螺旋结构的再生贡献较大。优选由X及Y表示的氨基酸大量包含亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，且占整体的10％～45％。优选为重组明胶的序列的80％以上、进一步优选为95％以上、最优选为99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
关于一般的明胶，极性氨基酸中带电荷的氨基酸与不带电荷的氨基酸以1:1存在。在此，所谓极性氨基酸，具体而言，是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中，所谓极性不带电荷的氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。在本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，上述极性氨基酸中的不带电荷的氨基酸的比例优选为5％以上且小于20％，更优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个(优选为2个以上)氨基酸。
通常，在多肽中，已知有作为细胞粘接信号发挥作用的最小氨基酸序列(例如，Nagai co.，Ltd出版发行“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。关于在本发明中所使用的重组明胶，可以在一分子中具有2个以上的这些细胞粘接信号。作为具体的序列，从所粘接的细胞的种类较多的方面考虑，优选由氨基酸单字母标记表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选RGD序列。在RGD序列中，优选ERGD序列。
作为在本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数量在0～100之间(优选在25～60之间)不均匀。
关于该最小氨基酸序列的含量，在蛋白质1分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
在本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。在重组明胶包含350个以上的氨基酸的情况下，优选350个氨基酸的每一段(stretch)至少包含1个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，更加进一步优选至少为1.0％，尤其优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。关于重组肽内的RGD基序的数量，每250个氨基酸，优选至少为4个、更优选为6个、进一步优选为8个、尤其优选为12个以上且16个以下。0.4％的RGD基序的比例对应于每250个氨基酸至少为1个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶必须至少包含2个RGD序列。关于本发明的重组明胶，优选每250个氨基酸至少包含2个RGD序列，更优选每250个氨基酸至少包含3个RGD序列，进一步优选每250个氨基酸至少包含4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，至少包含4个RGD基序，优选包含6个RGD基序，更优选包含8个RGD基序，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以被局部水解。
更优选在本发明中所使用的多肽由下述式2表示。
式2：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个。另外，63个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
优选在重复单元上键合多个天然存在的胶原蛋白的序列单元。在此所说的天然存在的胶原蛋白，只要是天然存在的，则可以是任一个，但是优选I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一形态，上述胶原蛋白的来源优选人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选人。
在本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测量，如等电点电泳法(参考Maxey,C.R.(1976)；Phitogr.Gelatin 2，Editor Cox，P.J.Academic，London，Engl.)中所记载那样，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶不被去胺基化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶通过编码氨基酸序列的核酸来制备且实质上为纯多肽。
重组明胶尤其优选具有：
(1)序列编号1中所记载的氨基酸序列；或
(2)与序列编号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(优选为90％以上，更优选为95％以上，尤其优选为98％以上)的序列同源性，且具有生物相容性的氨基酸序列。
另外，所谓生物相容性是指，与生物接触时，不会引起如长期且慢性炎症反应等显著的不良反应。
重组明胶最优选具有序列编号1中所记载的氨基酸序列。
本发明中的序列同源性是指由下述式计算出的值。
％序列同源性＝[(相同残基数)/(对齐长度)]×100
2个氨基酸序列中的序列同源性能够通过本领域技术人员公知的任意的方法来确定，能够使用BLAST((基本局部比对搜索工具：Basic Local Alignment Search Tool))程序(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)等来确定。
重组明胶可以由在序列编号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或者加成1个或者数个氨基酸而得的氨基酸序列组成，并且具备具有生物相容性的氨基酸序列。
“缺失、取代或者加成1个或者数个氨基酸而得的氨基酸序列”中的“1个或者数个”是指，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。
重组明胶能够通过本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如能够按照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取编码规定的重组明胶的氨基酸序列的基因，并将其整合到表达载体，制作重组表达载体，将其导入到适当的宿主并制作转化体。通过在适当的培养基中培养所获得的转化体来产生重组明胶，因此能够通过回收由培养物产生的重组明胶来制备在本发明中所使用的重组明胶。
[细胞片包埋剂的形态]
本发明的细胞片包埋剂的形态并无特别限定，只要包含由式1表示，且分子量分布满足条件X的多肽，则能够设为任意的形态。例如，可以是溶液(水溶液等)、悬浮液、粉末或凝胶等中的任一种。在为粉末或凝胶等的情况下使用时能够溶解于水等溶剂中而使用。
本发明的细胞片包埋剂中的上述多肽的含量并无特别限定，但是通常为0.1质量％至100质量％，优选为0.5质量％至100质量％。
关于应用本发明的细胞片包埋剂的细胞片，在本说明书中在后面进行叙述。
＜含细胞片的组合物＞
本发明还涉及一种包含细胞片和本发明的细胞片包埋剂，且上述细胞片被上述细胞片包埋剂包埋的含细胞片的组合物。
[细胞片]
所谓本发明中的细胞片是指，将细胞作为主要成分的片材。关于细胞片，细胞彼此连结而成为片状，只要是片状，则其结构并无特别限定，可以是单层细胞片、由双层以上的细胞形成的片材、或由经三维培养的细胞形成的片材中的任一种。
细胞彼此可以直接和/或隔着介入物质而彼此连结。作为介入物质，只要是至少能够将细胞彼此机械连结的物质，则并无特别限定，但是例如可举出细胞外基质等。介入物质优选源自细胞的物质、尤其源自构成细胞片的细胞的物质。细胞至少可机械连结，但是还可以功能性连结、例如化学连结、电连结。
在本发明中的细胞片中包含能够形成细胞片的任意的细胞。作为细胞的例子，并无特别限定，可包含心肌细胞、成肌细胞(例如，骨骼肌成肌细胞)、成纤维细胞、滑膜细胞、上皮细胞、及内皮细胞等。在上述中也优选心肌细胞及骨骼肌成肌细胞。作为细胞，能够使用源自能够利用细胞片进行治疗的任意的生物的细胞。生物并无特别限定，例如可举出人、非人类的灵长类(猴子等)、狗、猫、猪、马、山羊、绵羊、大鼠、小鼠及仓鼠等。并且，所使用的细胞可以只有1种，但是还能够使用2种以上的细胞。
细胞片能够通过公知的细胞片的制造方法或遵照该方法的方法来制造。例如，在培养皿中培养细胞，并在细胞成为片状之后，从培养皿回收片材即可。如上所述，细胞片的制造方法并无特别限定，但是作为一例，能通通过日本特开2010-81829号公报中所记载的方法来制造细胞片。
典型地，细胞片可通过将细胞接种于培养液中的工序及培养细胞并形成细胞片的工序来制造。
细胞的培养能够在本技术领域中通常进行的条件下进行。例如，作为典型的培养条件，可举出在37℃、5％CO2下的培养。
[含细胞片的组合物的制造]
用本发明的细胞片包埋剂包埋上述细胞片，由此能够制造含细胞片的组合物。包埋的方法并无特别限定，但是能够通过如下方式来使溶液进行凝胶化：在包含细胞片的容器中，添加本发明的包埋剂(优选溶液)，并在低温(例如，2～12℃)下进行冷却。根据上述，能够制造细胞片被细胞片包埋剂包埋的含细胞片的组合物。
＜试剂盒＞
根据本发明，还提供一种包含上述细胞片和本发明的细胞片包埋剂的试剂盒。关于细胞片及细胞片包埋剂的详细内容、优选的方式，在本说明书中如上所述。在试剂盒中还可以包含用于进行包埋处理的容器及使用说明书等。
通过以下的实施例，对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明并不受实施例的限定。
实施例
(1)重组明胶
准备了以下CBE3来作为重组明胶(国际公开WO2008/103041号公报中所记载)。
CBE3：
分子量：51.6kD
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸数量：571个
RGD序列：12个
亚氨基酸含量：33％
几乎100％的氨基酸是GXY的重复结构。在CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列编号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列编号3相同。其中末尾的X修正为“P”)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
(2)重组明胶的分子量分布的测量
关于在上述(1)中所记载的重组明胶CBE3(实施例1)，使用凝胶渗透色谱法(GPC)实施了分子量分布的测量。关于分子量分布的测量，使用HPLC(Waters公司制AQUITY UPLC系统Empower2)，并使用了100mmol/L磷酸缓冲剂(pH6.8)作为缓冲液。使用它们来测量了重组明胶的分子量分布的相对性。
将其结果示于图1中。存在2个CBE3的分子量峰。关于该2个峰，根据面积比计算所有峰中的占有率的结果，第一个峰为92.1％，第二个峰为7.9％。由此发现，CBE3具有占据92％的分子量峰来作为占有率较高的峰。
(3)天然动物明胶的分子量分布的测量
作为比较，关于天然动物明胶(比较例1)，与上述(2)同样地使用GPC实施了分子量分布的测量。将结果示于图2中。存在2个天然动物明胶的分子量峰。关于该2个峰，根据面积比计算所有峰中的占有率的结果，第一个峰为47.6％，第二个峰为52.4％。由此发现，天然动物明胶具有52％的分子量峰来作为占有率较高的峰。
(4)包埋剂性能试验(凝胶化速度)
为了用作传输细胞片时的包埋剂，低温下的凝胶化速度快，相反地，作为可逆反应的在常温下迅速恢复成液体的性能变得重要。因此，以1质量％浓度，测试了低温下的凝胶化速度、常温下的恢复成液体的速度。
其结果观察到如下现象：在实施例1的CBE3中，通过转移至4℃而迅速进行凝胶化，液的流动性迅速下降，若将完全凝胶化的试样转移至25℃的室温环境下，则快速恢复成液体。
具体而言，在CBE3中，通过转移至4℃而从40分钟后开始凝胶化并在50分钟之后成为几乎稳定的凝胶。并且，该凝胶具有强度，且为即使用手按压也不会压坏的凝胶。若将该凝胶恢复25℃的室温，则用40分钟恢复成完全的液体。
另一方面，关于比较例1的天然动物明胶，通过转移至4℃而引起凝胶化，但是与使用CBE3时相比，其速度缓慢且迟缓。并且，对将完全凝胶化的试样转移至25℃的室温环境，再次恢复成液体的速度进行测试的结果，与实施例1的CBE3相比，比较例1的天然动物明胶恢复成液体的速度迟缓。
具体而言，在天然动物明胶中，通过转移至4℃而从60分钟之后开始凝胶化，但是即使在90分钟之后也只是松软的凝胶状。此后也不会转变成具有强度的凝胶，并保持为若用手按压则容易压坏的程度的松软的凝胶状。在将凝胶状恢复到25℃的室温的情况下，天然动物明胶恢复成完全的液体需要70分钟。
(5)CBE3包埋细胞片的制作
将人类骨骼成肌细胞6.0×107个悬浮于包含20％(v/v)人血清的DMEM/F12培养基10mL，并接种于10cm dish温度响应性培养皿(UpCell(注册商标)：CellSeed Inc.)。在37℃、5％CO2下培养一夜并进行细胞片化，在室温下进行了剥离。在室温下将包含1质量％CBE3的HBSS+(Thermo Fisher Scientific公司制)10mL添加到温度响应性培养皿，以2～8℃冷却1小时并进行凝胶化，从而制作了CBE3包埋细胞片。HBSS是Hanks’Balanced Saltsolution的简称。
(6)振动评价
(6-1)
将在上述(5)中所制作的CBE3包埋细胞片装载于台式摇床(NR-3，TIETECH Co.，Ltd.制)，将转速设定为100rpm(每分钟转速：rotation per minute)并以2～8℃振荡了2天。作为对照，在10cmdish温度响应性培养皿制备的细胞片中添加不包含CBE3的HBSS+，并以相同的方式进行了振荡。振荡后，将CBE3包埋细胞片静放在室温，熔融凝胶并回收了细胞片。将振荡前及振荡后的形状示于图3中。
在添加不包含CBE3的HBSS+的情况下，振荡后的细胞片会损坏，相对于此，在使用包含1质量％CBE3的HBSS+包埋细胞片的情况下，即使在振荡后，细胞片也不会损坏。
(6-2)
用10质量％中性缓冲福尔马林，将在添加刚制成薄片之后的细胞片及包含1质量％CBE3的HBSS+并振荡之后回收的细胞片固定一夜，并进行了石蜡包埋。对于包埋样品切成薄片并脱去石蜡之后，用卡拉兹(Carrazzi)的苏木素和曙红进行了染色。将结果示于图4中。
添加包含1质量％CBE3的HBSS+来包埋细胞片时，振荡后的细胞片的内部细胞与制作时同样地存活着，从而确认到是能够充分地发挥其性能的细胞片。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 细胞片包埋剂、含细胞片的组合物及试剂盒
<130> 16F02134
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571
<212> PRT
<213> Recombinant
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
1 5 10 15
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro
85 90 95
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Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala
165 170 175
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Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly
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Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp
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225 230 235 240
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245 250 255
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly
290 295 300
Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
340 345 350
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro
370 375 380
Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro
405 410 415
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Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
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Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
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Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
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Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
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Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
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Ile Lys Val Ala Val
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Glu Arg Gly Asp
1
Claims (7)
1.一种细胞片包埋剂，其包含多肽，该多肽由下述式1表示，并且分子量分布满足下述条件X，
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，
条件X：利用凝胶渗透色谱法的分子量分布测量中的最大分子量峰面积为所有分子量峰的总面积的80％以上。
2.根据权利要求1所述的细胞片包埋剂，其中，
多肽为重组明胶。
3.根据权利要求1或2所述的细胞片包埋剂，其中，
多肽为由下述式2表示的多肽，
式2：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，另外，63个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞片包埋剂，其中，
多肽具有(1)序列号1中所记载的氨基酸序列、或(2)与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性且具有生物相容性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞片包埋剂，其中，
多肽具有序列号1中所记载的氨基酸序列。
6.一种含细胞片的组合物，其包含细胞片和权利要求1～5中任一项所述的细胞片包埋剂，所述细胞片被所述细胞片包埋剂包埋。
7.一种试剂盒，其包含细胞片和权利要求1～5中任一项所述的细胞片包埋剂。
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