CN102858381A

CN102858381A - 包括具有生物相容性的聚合物块和细胞的细胞构建体

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Publication number: CN102858381A
Application number: CN201180011860XA
Authority: CN
Inventors: 中村健太郎
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-03-01
Also published as: CN102858381B; US20120329157A1; KR20170005168A; JP5762399B2; KR20130005279A; EP2543397A4; WO2011108517A1; US9597432B2; KR101744040B1; EP2543397B1; JPWO2011108517A1; EP2543397A1

Abstract

本发明的一个目的是提供一种细胞三维构建体，其具有足以用于组织再生的厚度并包括在其中均匀分布的细胞。本发明提供包括具有生物相容性的聚合物块和细胞的细胞构建体，其中多个聚合物块被布置在多个细胞之间的空间内。

Description

包括具有生物相容性的聚合物块和细胞的细胞构建体

技术领域

本发明涉及包括具有生物相容性的聚合物块和细胞的细胞构建体，其中多个聚合物块以镶嵌模式布置在这样的多个细胞之间的空间内。本发明还涉及制备所述细胞构建体的方法。

背景技术

帮助陷于功能障碍或功能不全的活组织/器官再生的再生医学的实际应用目前正在进行中。再生医学是新的医疗技术，其使用3种因子(即细胞、支架和生长因子)来使活组织恢复与原有组织中相同或相似的形式或功能，所述活组织不再仅通过生物体内在具有的自然愈合能力来恢复。近年来，已经逐渐实现使用细胞的治疗。其实例包括使用自体细胞培养的表皮，使用自体软骨细胞的软骨治疗，使用充质干细胞的骨再生治疗，使用成肌细胞的心肌细胞片层(sheet)治疗，使用角膜上皮片层的角膜再生治疗，以及神经再生治疗。这些新型治疗与基于人造材料(骨修补材料或透明质酸注射)的常规替代医学不同，其帮助活组织的修复或再生并且因此产生高的疗效。实际上，产品如使用自体细胞培养的表皮或培养的软骨已经被投放市场。

然而，因为要被移植的细胞主要以薄片形式移植或以悬浮液状态移植，所以目前的技术不能提供具有足够厚度的组织。活组织原本是厚的，并且由于其厚度所以使得肌肉能够迫使心脏搏动或允许在关节软骨处的平滑运动。对于一般的使用细胞的组织再生，不能提供厚的组织被认为是主要的问题。

例如，使用细胞片层的心肌再生被认为需要细胞片层的多层构建体以再生厚的组织。Okano等最近已经使用温度应答性培养皿开发了细胞片层。该细胞片层不需要用酶如胰蛋白酶处理并且因此保持细胞-细胞结合以及黏着蛋白(非专利文献1至6)。预期这样的细胞片层制备技术可用于心肌组织的再生。因为之前的细胞片层不能形成血管网络，所以难以再生足够厚的组织(非专利文献5和7)。这是因为向中心部分的细胞的营养供应在被允许变厚的细胞片层中丧失，由此细胞死亡。Okano等也认为200μm以上的厚度不可能达到，并且正在开发细胞片层，所述细胞片层还含有引入其中的血管上皮细胞以在细胞片层中形成血管网络(非专利文献8)。然而，这不能充当实际的解决方案，原因在于存在以下问题：除了目标细胞，必须制备另一个细胞源，即血管内皮细胞；难以在细胞片层中均匀地诱导血管；并且即使可以通过这种方式提供营养物的递送路径，在该方法中，准备的营养递送路径也必须精确地连接到外部营养递送路径。

同样，对于骨再生，已经开发了包含被添加到基质中的培养的细胞的骨再生片层。

已经提出了通过将包含被培养成片状形状的充质干细胞的培养的细胞片层和包含形成片状形状的生物可降解物质的生物可降解片分层放置制备的骨再生片层(专利文献1)。此外，存在用于诱导间充质组织再生的片层，其中分化自间充质细胞的间充质组织前体细胞和胞外基质附着到多孔片上(专利文献2)。这些发明是这样的方法，其涉及将附着有培养的成骨细胞的片层放置到身体中并通过体内的膜骨化由成骨细胞形成骨皮质。然而，成骨细胞样细胞不能在分层状态中培养，并且由于此问题，具有成骨细胞层的片层不能提供细胞层的厚度超过100μm的再生片层。然后，专利文献3已经报道了可以通过培养方法的发展/优化形成厚度为200μm以上的片层，但是根据此报道，仅实现了约210μm的骨皮质组织层的形成。

如上所述，为许多组织修复提供作为厚的组成物的细胞是有难度的挑战。其主要原因是仅通过扩散到由细胞组成的三维构建体中，营养物的渗透是不足够的。已经设计了使用胶原的凝胶包埋培养作为解决该问题的一种方法(非专利文献9)。然而，包埋在凝胶中的细胞不能从根源上解决该问题，原因在于细胞从凝胶的中心部分向外部区域移动并且因此，不均匀地存在于凝胶中以致中心部分的细胞密度降低。此外，通过凝胶包埋制备的三维细胞构建体不能与另一个三维构建体结合/融合并且因此，形成的三维构建体的尺寸不能在在细胞接种时制备的尺寸之上。因此，不能采取制备小的凝胶然后将该凝胶彼此融合以制备细胞均匀分布于其中的构建体的方法。

此外，专利文献4描述了通过使用无机陶瓷小珠连接细胞来实现三维培养。然而，无机陶瓷在水保持、溶液交换、营养物扩散和缓冲能力方面较差并且实际上不能提供厚的细胞组成物。实际上，在专利文献4的实施例中，细胞结合成150至460μm的颗粒，在其上有厚的PLLA无纺布层(1cm)，该层仅增加了外观厚度。实际包含细胞的层仅是在无机陶瓷小珠的表面上的最厚为数十μm的层。即使不具有细胞的1cm PLLA无纺布被认为是构建体，它也仅仅是具有明显不均匀的细胞分布的构建体。因此，目前为止仅提供有具有在构建体中的不均匀的细胞分布的三维细胞构建体或具有非常薄的细胞层的构建体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利公布(Kokai)号2003-275294A(2003)

专利文献2：日本专利公布(Kokai)号2006-116212A(2006)

专利文献3：日本专利公布(Kokai)号2009-240766A(2009)

专利文献4：日本专利公布(Kokai)号2004-267562A(2004)

非专利文献

非专利文献1：Shimizu，T.等，Circ.Res.90，e40-48(2002)

非专利文献2：Kushida，A.等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)51，216-223(2000)

非专利文献3：Kushida，A.等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)45，355-362(1999)

非专利文献4：Shimizu，T.，Yamato，M.，Kikuchi，A.& Okano，T.，TissueEng.(组织工程)7，141-151(2001)

非专利文献5：Shimizu，T等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)60，110-117(2002)

非专利文献6：Harimoto，M.等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)62，464-470(2002)

非专利文献7：Shimizu，T.，Yamato，M.，Kikuchi，A.& Okano，T.，Biomaterials(生物材料)24，2309-2316(2003)

非专利文献8：Inflammation and Regeneration(炎症和再生)卷25No.32005，p.158-159.The 26th annual meeting of the Japanese Society ofInflammation and Regeneration(日本炎症和再生协会第26届年会)-Pursuingfusion between inflammation research and regenerative medicine(追求炎症研究和再生医学间的融合)-Mitsuo Okano

非专利文献9：Sustained growth and three-dimensional organization ofprimary mammary tumor epithelial cells embedded in collagen gel(包埋在胶原凝胶中的原发乳腺肿瘤上皮细胞的持续生长和三维组织).J Yang，JRichards，P Bowman，R Guzman，J Enami，K McCormick，S Hamamoto，DPitelka，和S Nandi.PNAS，1979年7月1日，卷76no.73401-3405

发明概述

本发明要解决的目标

本发明的一个目的是提供细胞构建体，其厚度足以用于组织再生并且包括均匀分布在其中的细胞。本发明的另一目的是提供这样的细胞构建体，其可以不使用不同于目的细胞的细胞制备。本发明的另一个目的是提供可以自发地彼此融合的三维细胞构建体。

解决目标的手段

本发明的发明人通过以镶嵌模式在三维上布置生物相容的聚合物块(即，包含具有生物相容性的聚合材料的块(mass))和细胞，成功地形成了三维细胞构建体，该三维细胞构建体允许营养物从三维细胞构建体的外部递送到三维细胞构建体的内部，具有足够的厚度，并且包含均匀分布在其中的细胞。此外，他们发现三维细胞构建体能够通过存在于其外周的细胞的作用而自发地彼此融合。已经基于这些发现完成了本发明。

本发明的实施方案涉及以下方面：

[1]包括具有生物相容性的聚合物块和细胞的细胞构建体，其中多个所述聚合物块被布置在多个所述细胞之间的空间内。

[2]根据[1]所述的细胞构建体，其中所述聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

[3]根据[2]所述的细胞构建体，其中所述聚合物块的尺寸为10μm至300μm。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的细胞构建体，其中厚度或直径为400μm至3cm。

[5]根据[4]所述的细胞构建体，其中厚度或直径为720μm至1cm。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的细胞构建体，其中所述聚合物块和所述细胞之间的比率为0.0000001μg至1μg所述聚合物块/个细胞。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的细胞构建体，其通过温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物来制备。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是生物可降解材料。

[9]根据[1]至[8]中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、壳多糖或脱乙酰壳多糖。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是明胶、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、生腱蛋白、血纤蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白或RetroNectin。

[11]根据[1]至[10]中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是交联的。

[12]根据[11]所述的细胞构建体，其中所述交联是利用醛、缩合剂或酶来进行。

[13]根据[1]至[12]中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是重组明胶。

[14]根据[13]所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物在一个分子中具有两个或更多个细胞黏着信号。

[15]根据[13]所述的细胞构建体，其中所述重组明胶由下式表示：

A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

其中A表示任何氨基酸或氨基酸序列；B表示任何氨基酸或氨基酸序列；总共n个X中的每个独立地表示任何氨基酸；总共n个Y中的每个独立地表示任何氨基酸；n表示3至100的整数；m表示2至10的整数；并且总共n个Gly-X-Y中的每个可以是彼此相同的或不同的。

[16]根据[13]或[15]所述的细胞构建体，其中所述重组明胶由下式表示：

Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly

其中总共63个X中的每个独立地表示任何氨基酸；总共63个Y中的每个独立地表示任何氨基酸；并且总共63个Gly-X-Y中的每个可以是彼此相同的或不同的。

[17]根据[13]至[16]中任一项所述的细胞构建体，其中所述重组明胶具有以下任一：(1)由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列，或(2)与由SEQ IDNO：1表示的氨基酸序列具有80％或更高同源性并具有生物相容性的氨基酸序列。

[18]制备根据[1]至[17]中任一项所述的细胞构建体的方法，所述方法包括温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤。

[19]根据[18]所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤包括用新鲜培养基交换培养基。

[20]根据[19]所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤包括用分化或生长培养基来交换培养基。

[21]根据[18]至[20]中任一项所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤还包括另外加入具有生物相容性的聚合物块。

[22]通过根据[18]至[21]中任一项所述的方法制备的细胞构建体。

[23]通过将多个根据[1]至[17]中任一项所述的细胞构建体融合获得的细胞构建体。

[24]制备根据[23]所述的细胞构建体的方法，所述方法包括将多个根据[1]至[17]中任一项所述的细胞构建体进行融合的步骤。

[25]制备细胞构建体的方法，所述方法包括将多个包括多个具有生物相容性的聚合物块和多个细胞的细胞构建体进行融合的步骤，其中1个或多个聚合物块被布置在一些或所有的由所述多个细胞形成的多个空间内。

[26]根据[25]所述的制备细胞构建体的方法，其中所述聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

[27]根据[25]或[26]所述的制备细胞构建体的方法，其中在融合前细胞构建体的厚度或直径为10μm至1cm，并且在融合后细胞构建体的厚度或直径为400μm至3cm。

[28]制备细胞构建体的方法，所述方法包括进一步将第二聚合物块加入到细胞构建体并将其温育，所述细胞构建体包括多个具有生物相容性的第一聚合物块和多个细胞，其中1个或多个聚合物块被布置在一些或所有的由所述多个细胞形成的多个空间内。

[29]根据[28]所述的制备细胞构建体的方法，其中所述第一聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

[30]根据[28]或[29]所述的制备细胞构建体的方法，其中所述第二聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

[31]根据[28]至[30]中任一项所述的制备细胞构建体的方法，其中在加入所述第二聚合物块和温育后，厚度或直径为400μm至3cm。

[32]通过根据[25]至[31]中任一项所述的制备细胞构建体的方法制备的细胞构建体。

[33]根据[32]所述的细胞构建体，其被用于细胞移植、细胞培养或毒力评估。

发明效果

本发明的细胞构建体具有足以用于组织再生的厚度并且包括均匀分布在其中的细胞。本发明的细胞构建体可以在不使用不同于目的细胞的细胞情况下制备。此外，本发明的细胞构建体能够自发地彼此融合。本发明的细胞构建体可用于旨在再生遭受损伤或功能障碍的生物组织或器官的再生医学。

附图简述

[图1]图1显示使用重组明胶微块(micro-block)制备的镶嵌细胞块(mosaic cell mass)的第7天(软骨分化培养基)的立体显微镜照片。

[图2]图2显示使用天然明胶微块制备的镶嵌细胞块的第7天(软骨分化培养基)的立体显微镜照片。

[图3]图3显示含重组明胶微块的镶嵌细胞块的切片(HE染色，放大率：×5)的照片。

[图4]图4显示含重组明胶微块的镶嵌细胞块的切片(HE染色，放大率：×10)的照片。

[图5]图5显示含重组明胶微块的镶嵌细胞块的切片(HE染色，放大率：×40)的照片。

[图6]图6显示镶嵌细胞块的融合。

[图7]图7显示来自镶嵌细胞块的融合(三个镶嵌细胞块的融合)的HE染色切片(放大率：×5)的照片。

[图8]图8显示来自镶嵌细胞块的融合(三个镶嵌细胞块的融合)的HE染色切片(放大率：×10)的照片。

[图9]图9显示来自镶嵌细胞块的融合(三个镶嵌细胞块的融合)的HE染色切片(放大率：×20)的照片。

[图10]图10显示来自镶嵌细胞块的融合(三个镶嵌细胞块的融合)的HE染色切片(放大率：×5)的照片。

[图11]图11显示来自镶嵌细胞块的融合(三个镶嵌细胞块的融合)的HE染色切片(放大率：×10)的照片。

[图12]图12显示具有增加的体积的镶嵌细胞块的立体显微镜照片(随时间的变化)。

[图13]图13显示来自于具有增加的体积的镶嵌细胞块的立体显微镜照片的直径随时间的变化。

[图14]图14显示来自于具有增加的体积的镶嵌细胞块的立体显微镜照片的面积随时间的变化。

[图15]图15显示通过从具有增加的体积的镶嵌细胞块的立体显微镜照片计算确定的体积(4/3πr³)随时间的变化。

[图16]图16显示含重组明胶微块的镶嵌细胞块的切片(第7天(在生长培养基下)，放大率：×5)。

[图17]图17显示含重组明胶微块的镶嵌细胞块的切片(第7天(在生长培养基下)，放大率：×10)。

[图18]图18显示具有增加的体积的第21天的HE切片的照片(放大率：×5)(在生长培养基下加入重组明胶块)。

[图19]图19显示具有增加的体积的第21天的HE切片的照片(放大率：×40)(在生长培养基下加入重组明胶块)。

[图20]图20显示具有增加的体积的第21天的HE切片的照片(放大率：×5和×20)(在软骨分化培养基下加入重组明胶块)。

[图21]图21显示GAG的谱数据。

[图22]图22显示在镶嵌细胞块中产生的GAG的量随时间的变化。

[图23]图23显示由在镶嵌细胞块中的细胞生产/保留的ATP的量(第7天)。

[图24]图24显示使用PLGA微块制备的镶嵌细胞块的第2天(生长培养基)的立体显微镜照片。

[图25]图25显示由心肌细胞和重组明胶微块组成的镶嵌细胞块作为整体同步搏动的方式。

[图26]图26显示由表达GFP的HUVEC和重组明胶微块组成的镶嵌细胞块(50,000个细胞+0.03mg微块的镶嵌细胞块，以及300,000个细胞+0.2mg微块的镶嵌细胞块)的荧光显微镜照片和显微镜照片。

实施本发明的实施方案

下文中，将详细描述本发明的实施方案。

本发明的细胞构建体包括具有生物相容性的聚合物块和细胞，其中多个聚合物块被布置在多个细胞之间的空间内。其一个方面的实例包括这样的细胞构建体，其包括多个具有生物相容性的聚合物块和多个细胞，其中一个或多个聚合物块被布置在一些或全部的由多个所述细胞形成的多个空间内。

根据本发明的聚合物块的形状不受特别限制并且是，例如，无定形的、球形的、颗粒状的、粉末状的、多孔的、纤维状的、纺锤状的、扁平的和片状的形状，优选是无定形的、球形的、颗粒状的、粉末状和多孔的形状，更优选无定形的形状。术语″无定形的″表示不均匀的表面形状，例如，具有表面不规则性的物质，如石头。

在本发明的细胞构建体中，多个聚合物块被布置在多个细胞之间的空间内。在本文中，″细胞之间的空间″不一定是由组成细胞产生的封闭空间，而只需要有细胞在其侧面即可。不要求所有细胞都应当在它们之间产生这样的空间。可以有这样的区域，其中细胞彼此接触。经由聚合物块的细胞之间的每个空间的距离，即，从特定细胞到所选的与该特定细胞最接近的细胞的距离，不受特别限制并且优选是聚合物块的尺寸。优选的距离也在聚合物块的优选尺寸范围内。

此外，在所述结构中，细胞在根据本发明的聚合物块的侧面。不要求细胞存在于所有聚合物块之间。可以有这样的区域，其中聚合物块彼此接触。经由细胞的聚合物块之间的距离，即，从特定聚合物块到所选的与该特定聚合物块最接近的聚合物块的距离，不受特别限制并且优选是一个所用细胞或包含细胞群体的细胞块的尺寸，例如，10μm至1000μm，优选10μm至100μm，更优选10μm至50μm。

(1)具有生物相容性的聚合物材料

(1-1)聚合物材料

在本发明中使用的具有生物相容性的聚合物不受该聚合物是否在体内降解的特别限制，只要它对生物体具有亲和性即可。其优选由生物可降解材料组成。非生物可降解材料具体地是选自由以下组成的组的至少一种材料：PTFE、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酰、不锈钢、钛、聚硅氧烷和MPC。生物可降解材料具体地是选自由以下组成的组的至少一种材料：多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、壳多糖和脱乙酰壳多糖。它们之中，多肽是尤其优选的。在本文中，这些聚合物材料可以被给予设计以增强细胞黏着性。方法如[1]“将基质表面覆盖以细胞黏着性基底(纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白)或细胞黏着序列(RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列(由氨基酸单字母编码指示))肽”，[2]“基质表面的胺化或阳离子化”，和[3]“基质表面的等离子处理或基于电晕放电的亲水处理”可以被用作具体方法。

多肽的类型不受特别限制，只要它具有生物相容性即可。多肽优选是例如，明胶、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、生腱蛋白、血纤蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白或RetroNectin，最优选明胶、胶原或缺端胶原(atelocollagen)。天然明胶或重组明胶优选作为在本发明中使用的明胶。重组明胶是更优选的。在本文中，天然明胶指由天然来源的胶原形成的明胶。以下在本说明书中将描述重组明胶。

用于本发明的具有生物相容性的聚合物的亲水性值″1/IOB″值优选为0至1.0，更优选为0至0.6，进一步优选为0至0.4。IOB是基于由AtsushiFujita提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲水性和疏水性的指标。其细节描述于例如″Pharmaceutical Bulletin(药物公报)″，卷2，2，pp.163-173(1954)，″Journal of Japanese Chemistry(日本化学杂志)″卷11，10，pp.719-725(1957)和″Fragrance Journal(香味杂志)″，卷50，pp.79-82(1981)。简言之，该方法包括假定甲烷(CH4)是所有有机化合物的来源并且所有其他化合物是甲烷衍生物，为碳原子数、取代基、改性部分、环等中的每个选择特定的数值，加入得分以确定有机值(OV)和无机值(IV)，并且将该值绘制在图表上，其中有机值在X轴上而无机值在Y轴上。有机概念图上的IOB是指有机概念图上的无机值(IV)与有机值(OV)的比率，即，″无机值(IV)/有机值(OV)″。对于有机概念图的细节，参见″Shinban YuukiGainenzu-Kiso to Ouyou-(New Edition，The Organic Conceptual Diagram，its Fundamentals and Applications in English(英文新版，有机概念图，其原理和应用))″，(Yoshio Koda等，Sankyo Publishing Co.，Ltd.，2008)″。在本说明书中，亲水性和疏水性由″1/IOB″值(IOB的倒数)指示。此符号表示″1/IOB″值越小(″1/IOB″值越接近0)，它越亲水。

用于本发明的聚合物的″1/IOB″值被设置在上述范围内，由此亲水性得到增强并且吸水性得到加强。推测所得的聚合物有效地作用于营养物的保持并且，结果，有助于细胞在本发明的三维细胞构建体(镶嵌细胞块)中的稳定性和生存力。

在用于本发明的具有生物相容性的聚合物是多肽的情况中，其由总平均亲水性(GRAVY)值指示的亲水性和疏水性的指标优选为-9.0至0.3，更优选-7.0至0.0。总平均亲水性(GRAVY)值可以通过以下文献的方法获得：“Gasteiger E.，Hoogland C.，Gattiker A.，Duvaud S.，Wilkins M.R.，Appel R.D.，Bairoch A.；Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server(在ExPASy服务器上的蛋白质鉴定和分析工具)；(In)John M.Walker(ed)：TheProteomics Protocols Handbook(蛋白质组学方案手册)，Humana Press(2005).pp.571-607”和“Gasteiger E.，Gattiker A.，Hoogland C.，Ivanyi I.，Appel R.D.，Bairoch A.：ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis(ExPASy：用于深度蛋白质知识和分析的蛋白质组学服务器).；Nucleic Acids Res.(核酸研究)31：3784-3788(2003)”。

用于本发明的聚合物的GRAVY值被设置在上述范围内，由此亲水性得到增强并且吸水性得到加强。推测所得的聚合物有效地作用于营养物的保持并且，结果，有助于细胞在本发明的三维细胞构建体(镶嵌细胞块)中的稳定性和生存力。

(1-2)交联

在本发明中使用的具有生物相容性的聚合物材料可以是交联的或可以不是交联的。那些交联的是优选的。本领域中已知的任何方法，如热交联、化学交联、使用醛(例如甲醛和戊二醛)的交联、使用缩合剂(碳二亚胺、氨腈等)的交联、酶交联、光交联、UV交联、疏水相互作用、氢键或离子相互作用可以用作交联方法。使用戊二醛的交联方法或热交联方法是优选的。

光交联的实例包括基于对包含引入其中的光反应性基团的聚合物的光照的那些，或基于在光敏剂存在下光照的那些。光反应性基团的实例包括肉桂基、香豆素基团、二硫代氨基甲酰基、呫吨染料和莰醌。

在使用酶进行交联的情况中，酶不受特别限制，只要它具有在聚合物材料之间交联的作用。可以优选使用转谷氨酰胺酶和漆酶，最优选使用转谷氨酰胺酶进行交联。可以进行使用转谷氨酰胺酶的酶交联的蛋白质的具体实例不受特别限制，只要它们是具有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基的蛋白质。转谷氨酰胺酶可以来源于哺乳动物或可以来源于微生物。其具体实例包括ACTIVA系列(由Ajinomoto Co.，Inc.生产，哺乳动物来源的转谷氨酰胺酶，作为试剂销售)，例如，来源于豚鼠肝的转谷氨酰胺酶、来源于山羊的转谷氨酰胺酶和来源于兔的转谷氨酰胺酶(由Oriental Yeast Co.，ltd.，Upstate USAInc.或Biodesign International生产)，以及来源于人的凝血因子(因子XIIIa，Haematologic Technologies，Inc.)。

聚合物材料的交联包括两个步骤：将聚合物材料溶液与交联剂混合的步骤，以及使所得的溶液进行反应的步骤。

在本发明中，用交联剂处理聚合物材料的混合温度不受特别限制，只要溶液可以被混合。该温度优选为0℃至100℃，更优选为0℃至40℃，进一步优选为0℃至30℃，进一步优选为3℃至25℃，进一步优选为3℃至15℃，进一步优选为3℃至10℃，尤其优选为3℃至7℃。

对于使聚合物材料和交联剂进行反应的步骤，温度可以升高。反应温度不受特别限制，只要交联进行。考虑到聚合物材料的变性或降解，该温度基本为-100℃至200℃，更优选为0℃至60℃，更优选为0℃至40℃，进一步优选为3℃至25℃，进一步优选为3℃至15℃，进一步优选为3℃至10℃，尤其优选为3℃至7℃。

即使不使用交联剂，也可以进行聚合物材料的交联。交联方法的具体实例包括但不限于热交联方法。

不使用交联剂的交联方法的反应温度不受特别限制，只要可以进行交联。该温度优选为-100℃至500℃，更优选为0℃至300℃，进一步优选为50℃至300℃，进一步优选为100℃至250℃，进一步优选为120℃至200℃。

(1-3)重组明胶

在本发明中重组明胶是指多肽或蛋白样物质，其通过基因重组技术制备并具有类似于明胶的氨基酸序列。对于可以用于本发明的重组明胶，它优选具有重复的由表征胶原的Gly-X-Y (X和Y各自独立地表示任何氨基酸)表示的序列(多个Gly-X-Y序列可以是相同的或彼此不同的)。优选地，在分子中包含细胞黏着信号的两个或多个序列。具有来源于胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶可以被用作在本发明中使用的重组明胶。例如，可以使用在EP1014176、US6992172、WO2004/85473和WO2008/103041中描述的那些，尽管重组明胶不限于它们。在本发明中使用的优选的重组明胶是具有以下方面的重组明胶：

用于本发明的重组明胶具有基于天然明胶的原有性能的极好的生物相容性，由于是非天然来源的所以不用担心BSE等，并且还具有极好的非感染性。此外，因为与天然明胶相比用于本发明的重组明胶是均质的并且其序列是确定的，所以根据交联或以下所述的那些，它可以被精确设计以在强度或降解性方面具有小的变化。

重组明胶的分子量优选为2KDa至100KDa，更优选为2.5KDa至95KDa，进一步优选为5KDa至90KDa，最优选为10KDa至90KDa。

重组明胶具有由表征胶原的Gly-X-Y表示的序列的重复。在本文中，多个Gly-X-Y序列可以是相同的或彼此不同的。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，而X和Y各自表示任何氨基酸(优选地，除甘氨酸外的任何氨基酸)。与其他蛋白质相比，表征胶原的GXY序列在明胶/胶原的氨基酸组成和序列中是非常特殊的部分结构。在该部分中，甘氨酸占全部的约1/3并且以三个氨基酸中有一个的比率出现在氨基酸序列中。甘氨酸是最简单的氨基酸。其在分子链上的位置较少受限制，并且甘氨酸对在凝胶化期间螺旋结构的再生贡献很大。优选的是，亚氨基酸(脯氨酸或羟基脯氨酸)应当大量地包括在由X和Y表示的氨基酸中，并占所有氨基酸的10％至45％。优选的是，序列中优选80％以上，更优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸应当是GXY重复结构。

在通常的明胶中，关于极性氨基酸，带电荷的那些和不带电荷的那些以1∶1的比率存在。在本文中，极性氨基酸专门指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和精氨酸。其中，极性不带电荷的氨基酸指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。极性氨基酸与组成用于本发明的重组明胶的所有氨基酸的比率为10至40％，优选20至30％。此外，优选的是，不带电荷的氨基酸与极性氨基酸的比率应当为5％至小于20％，优选小于10％。进一步优选的是，选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸的任何一个氨基酸，优选两个以上的氨基酸不应当包含在序列中。

通常，多肽中充当细胞黏着信号的最小氨基酸序列是已知的(例如，″Medicina Philosophica″，卷9，No.7(1990)，p.527，Nagai Shoten Co.，Ltd.)。优选的是，用于本发明的重组明胶在分子中应当具有两个以上的这些细胞黏着信号。根据可以与之黏着的多类细胞，具体序列优选RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列，更优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列和HAV序列，尤其优选RGD序列(由氨基酸单字母编码指示)。在RGD序列中，ERGD序列是优选的。由细胞生产的基质的量可以通过使用具有细胞黏着信号的重组明胶来改善。在例如使用充质干细胞作为细胞的软骨分化的情况中，糖胺聚糖(GAG)的生产可以得到改善。

对于RGD序列在用于本发明的重组明胶中的布置，优选的是，RGD序列之间的氨基酸的数目应当为0至100，优选25至60，并且不应当是均匀确定的。

从细胞黏着/生长的角度，此最小氨基酸序列的含量优选为每个蛋白分子3至50个序列，更优选每个蛋白分子4至30个序列，尤其优选每个蛋白分子5至20个序列，最优选每个蛋白分子12个序列。

在用于本发明的重组明胶中，RGD基序与氨基酸总数的比率优选为至少0.4％。在重组明胶包括350个以上的氨基酸的情况中，优选的是，每一段350个氨基酸应当包括至少一个RGD基序。RGD基序与氨基酸总数的比率更优选为至少0.6％，进一步优选为至少0.8％，进一步优选为至少1.0％，进一步优选至少1.2％，最优选至少1.5％。RGD基序在重组明胶中的数目优选为每250个氨基酸至少4个，更优选6个，进一步优选8个，进一步优选12至16个。0.4％的RGD基序比率对应于每250个氨基酸至少一个RGD序列。因为RGD基序的数目是整数，所以由251个氨基酸组成的明胶必须包含至少两个RGD序列以满足0.4％的特征。优选地，本发明的重组明胶包含至少两个RGD序列/250个氨基酸，更优选至少三个RGD序列/250个氨基酸，进一步优选至少四个RGD序列/250个氨基酸。在另一方面中，本发明的重组明胶包括至少4个RGD基序，优选6个，更优选8个，进一步优选12至16个RGD基序。

此外，重组明胶可以被部分水解。

优选的是，用于本发明的重组明胶应当具有由A[(Gly-X-Y)n]mB表示的重复结构。m优选为2至10，更优选为3至5。n优选为3至100，更优选为15至70，最优选为50至65。

优选的是，多个天然存在的胶原序列单元应当与重复单元结合。在本文中，天然存在的胶原可以是任何天然存在的胶原并且优选为I型、II型、III型、IV型和V型胶原，更优选为I型、II型和III型胶原。在另一个实施方案中，胶原的来源优选是人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选人。

用于本发明的重组明胶的等电点优选为5至10，更优选为6至10，进一步优选为7至9.5。

优选地，重组明胶不被去氨基化。

优选地，重组明胶不具有端肽。

优选地，重组明胶是基本纯的胶原材料，其由编码天然胶原的核酸制备。

用于本发明的重组明胶尤其优选是具有以下任一的重组明胶：

(1)由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列；或

(2)与由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列具有80％以上(更优选90％以上，最优选95％以上)的同源性并且具有生物相容性的氨基酸序列。

用于本发明的重组明胶可以通过本领域技术人员已知的基因重组技术制备并且可以根据在例如EP1014176A2、US6992172、WO2004-85473或WO2008/103041中描述的方法制备。具体地，获得编码预定的重组明胶的氨基酸序列的基因，并且将其结合到表达载体中从而制备重组表达载体，然后将该重组表达载体引入到合适的宿主中以制备转化体。将获得的转化体在合适的培养基中培养，由此制备重组明胶。由此，制备的重组明胶可以从培养物中收集从而制备用于本发明的重组明胶。

(1-4)具有生物相容性的聚合物块

在本发明中，使用包含上述具有生物相容性的聚合物材料的块(block)(块(mass))。聚合物块的制备方法不受特别限制。例如，可以使用粉碎机(New Power Mill，etc.)将包含聚合物的固体物质粉碎，然后通过筛子筛分以获得具有所需大小的块。

每个聚合物块的尺寸优选为1μm至700μm，更优选10μm至700μm，进一步优选10μm至300μm，进一步优选20μm至150μm，尤其优选25μm至106μm。此外，聚合物块可以是等于或长于700μm的长线状形式(其厚度在上述尺寸范围内)，并且可以是片层或凝胶形式(具有在上述尺寸范围内的厚度)。通过采用此优选范围，细胞可以更均匀地存在于构建体中。

(2)细胞

可以根据本发明的细胞构建体的目的来合适地选择用于本发明的细胞。其类型不受特别限制。此外，根据细胞构建体的使用目的，所用的细胞可以是一种类型的，或者可以使用多个类型的组合。此外，所用的细胞优选动物细胞，更优选来源于脊椎动物的细胞，尤其优选来源于人的细胞。来源于脊椎动物的细胞(尤其，来源于人的细胞)的类型可以是以下中任一：多能细胞、体干细胞、前体细胞和成熟细胞。例如，例如，ES细胞、GS细胞或iPS细胞可以用作多能细胞。例如，充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、来源于骨髓的细胞、心肌干细胞、来源于脂肪的干细胞或神经干细胞可以用作体干细胞。例如，来源于皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾、肝、胰、脾、口腔、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或头发的细胞可以用作前体细胞和成熟细胞。例如，ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、骨原细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、心脏成肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、来源于骨髓的细胞或造血干细胞可以用作来源于人的细胞。此外，细胞的来源可以是自体细胞和异体细胞中任一。当组合使用多种类型的细胞时，这样的组合的实例是血管细胞和其他细胞的组合。血管细胞的实例包括血管内皮细胞、血管内皮前体细胞和造血干细胞。组合使用血管细胞和其他细胞，可以将血管引入至本发明的细胞构建体中，并且营养物、氧气和其他物质可以得到供应。

(3)细胞构建体

在本发明中，使用上述具有生物相容性的聚合物块和细胞，在三维上将多个聚合物块以镶嵌的模式布置在多个细胞之间的空间内。这使得能够从三维细胞构建体的外部向其内部递送营养物，并且它导致具有足够厚度的三维细胞构建体的形成。同时，三维细胞构建体能够通过存在于其外周的细胞的作用而自发地彼此融合。

可以通过下述方法将本发明的细胞构建体的厚度或直径调整至所需水平。下限优选215μm，400μm是更优选的，并且730μm是最优选的。厚度或直径的上限不受特别限制。通常，上限优选3cm，更优选2cm，并且更优选1cm。细胞构建体的厚度或直径优选为400μm至3cm，更优选500μm至2cm，并且进一步优选720μm至1cm。在实例中，首先制备720μm以上的细胞构建体(图3)，然后通过融合制备813-μm厚的细胞构建体(图10)。本发明的细胞构建体的特征在于包含聚合物块的区域和包含细胞的区域以镶嵌模式布置。本文使用的术语″细胞构建体的厚度或直径″如下定义。当在细胞构建体中选择给定点A时，在通过点A的直线之中，将细胞构建体分开以使从细胞构建体的外部到点A的距离最小的线段的长度被指定为″线段A″。选择在细胞构建体中使线段A的长度最大化的点A，并将线段A的长度指定为″细胞构建体的厚度或直径″。

本发明的细胞构建体能够具有足够的厚度并且包括均匀分布在其中的细胞。因此，这样的细胞构建体可以优选用于细胞移植、细胞培养、毒力评估或其他目的。当本发明的细胞构建体用于这样的目的时，优选地，根据本发明的细胞构建体的厚度或直径可以在上述范围内。

此外，在使用本发明的细胞构建体在制备本发明的细胞构建体的方法(下述)中作为融合前的细胞构建体或作为加入第二聚合物块前的细胞构建体的情况中，细胞构建体的厚度或直径的范围优选为10μm至1cm，更优选10μm至2000μm，进一步优选15μm至1500μm，最优选20μm至1300μm。

在本发明的细胞构建体中，细胞和聚合物块之间的比率不受特别限制并且聚合物块/细胞的比率优选为0.0000001μg至1.0μg，更优选为0.000001μg至0.1μg，进一步优选为0.00001μg至0.01μg，最优选为0.00002μg至0.006μg。通过采用上述范围，细胞可以更均匀地存在。此外，通过采用上述范围作为下限，细胞可以在用于上述应用期间发挥作用。通过采用上述范围作为上限，任选存在于聚合物块中的组分可以被供应到细胞。在本文中，聚合物块中的组分的实例包括但不特别限于包含在下述培养基中的组分。

(4)制备细胞构建体的方法

本发明的细胞构建体可以通过以交替的方式放置由具有生物相容性的聚合物材料和细胞组成的块(mass)(块(block))来制备。制备方法不受特别限制并且优选的方法包括形成聚合物块并且之后将细胞接种于其中。具体地，本发明的细胞构建体可以通过温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物来制备。例如，细胞和事先制备的具有生物相容性的聚合物块以镶嵌的模式布置在容器中或布置在保持在容器中的液体中。该布置的方式优选为使用自然聚集、自由下落、离心或搅拌以促进或控制由细胞和生物相容性基质组成的镶嵌模式的顺序形成。

所用的容器优选是由低细胞黏着性材料或非细胞黏着性材料制成的容器，更优选由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二酯制成的容器。优选地，容器应当具有平的、U形的或V形的底部。

通过上述方法获得的镶嵌模式的细胞构建体可以通过例如以下方法被制成具有所需尺寸的细胞构建体：

(1)分别地将制备的镶嵌模式的细胞块彼此融合，或

(2)在分化培养基或生长培养基下增加其体积。

用于此融合或体积增加的方法不受特别限制。

例如，在温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤中，用分化培养基或生长培养基代替培养基，由此可以增加细胞构建体的体积。优选地，在温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤中，可以向其中加入额外的具有生物相容性的聚合物块，以制备具有所需尺寸的其中均匀存在细胞的细胞构建体。

包括分别使制备的镶嵌模式的细胞块彼此融合的方法具体是用于制备细胞构建体的方法，所述方法包括融合多个细胞构建体(包括多个具有生物相容性的聚合物块和多个细胞，其中1个或多个聚合物块被布置在一些或全部的由多个细胞形成的多个空间内)的步骤。

根据用于制备本发明的细胞构建体的方法的″具有生物相容性的聚合物块(类型、尺寸等)″、″细胞″、″细胞之间的空间″、″获得的细胞构建体(尺寸等)″、″细胞和聚合物块之间的比率″等的优选范围类似于与上述本发明的细胞构建体相关的优选范围。

此外，每个细胞构建体在融合前的厚度或直径优选为10μm至1cm，而融合后的厚度或直径优选为400μm至3cm。在本文中，每个细胞构建体在融合前的厚度或直径更优选为10μm至2000μm，进一步优选为15μm至1500μm，最优选为20μm至1300μm，而融合后的厚度或直径更优选为500μm至2cm，进一步优选为720μm至1cm。

上述通过向其中加入额外的具有生物相容性的聚合物块来制备具有所需大小的细胞构建体的方法具体是这样的制备细胞构建体的方法，所述方法包括向细胞构建体(包括多个具有生物相容性的第一聚合物块和多个细胞，其中一个或多个聚合物块被布置在一些或全部的由所述多个细胞形成的多个空间内)另外加入第二聚合物块并将其温育的步骤。在本文中，″具有生物相容性的聚合物块(类型、尺寸等)″、″细胞″、″细胞之间的空间″、″获得的细胞构建体(尺寸等)″、″细胞和聚合物块之间的比率″等的优选范围类似于与上述本发明的细胞构建体相关的优选范围。

在本文中，优选的是，要被融合的细胞构建体应当以0至50μm，更优选0至20μm，进一步优选0至5μm的间隔放置。在细胞构建体的融合中，细胞或由细胞生产的基质被认为通过细胞生长/扩散而起黏合剂的作用，以致连接细胞构建体。可以通过采用上述范围来促进细胞构建体之间的黏着。

根据本发明的每个第一聚合物块的尺寸优选为1μm至700μm，更优选为10μm至700μm，进一步优选为10μm至300μm，进一步优选为20μm至150μm，尤其优选为25μm至106μm。此外，根据本发明的每个第二聚合物块的尺寸同样优选为1μm至700μm，更优选为10μm至700μm，进一步优选为10μm至300μm，进一步优选为20μm至150μm，尤其优选为25μm至106μm。

通过用于制备本发明的细胞构建体的方法获得的细胞构建体的厚度或直径的范围优选为400μm至3cm，更优选为500μm至2cm，进一步优选为720μm至1cm。

对于进一步向细胞构建体中加入第二聚合物块以及将它们温育，优选的是，添加第二聚合物块的速度应当根据所用细胞的生长速率合适地进行选择。具体地，如果以快的速度加入第二聚合物块，则细胞向细胞构建体的外部区域移动从而降低均匀的细胞分布。如果以慢的速度加入它们，则形成具有高比率细胞的位点从而降低均匀的细胞分布。因此，考虑所用细胞的生长速率来选择速度。

通过用于制备本发明的细胞构建体的方法制备的细胞构建体可以具有所需的构型和尺寸，以及足够的厚度。因为细胞可以均匀地分布于其中，所以同样，该细胞构建体可以优选用于细胞移植、细胞培养、毒力评估或其他用途。

下文中，将参考实施例来更具体地描述本发明。然而，不意欲将本发明限于实施例。

实施例

实施例1：重组明胶

作为重组明胶制备下述CBE3(描述于WO2008-103041中)。

CBE3

分子量：51.6kD

结构：GAP[(GXY)63]3G

氨基酸的数目：571

RGD序列的数目：12

亚氨基酸含量：33％

基本上100％的氨基酸是GXY重复结构。CBE3的氨基酸序列不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。

等电点：9.34，GRAVY值：-0.682，1/IOB值：0.323

氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO：1)(除了末端部的X变为了″P″以外，与WO2008/103041中的SEQ ID NO：3相同)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGP I GPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

实施例2：制备重组明胶微块

使用重组明胶CBE3制备作为基质块的无定形微块。将1000mg重组明胶溶解在9448μL超纯水中。在加入152μL 1N HCl后，将400μL 25％戊二醛以1.0％的终浓度加入其中，并在50℃反应3小时以制备交联的明胶凝胶。将此交联的明胶凝胶浸入1L 0.2M甘氨酸溶液中并在40℃振荡2小时。然后，将交联的明胶凝胶在5L超纯水中振荡洗涤1小时，并将该超纯水用新鲜的超纯水替换，接着再次洗涤1小时。重复该步骤以完成总计6次洗涤操作。将经如此洗涤的交联的明胶凝胶在-80℃冷冻达5小时，然后在冻干机(EYELA，FDU-1000)中冻干。使用New Power Mill(OsakaChemical Co.，Ltd.，New Power Mill PM-2005)将获得的冻干产物粉碎。以最大的转数进行粉碎达总计5分钟(1分钟×5轮)。通过不锈钢筛将获得的颗粒筛分以获得25至53μm和53至106μm的重组明胶微块。

实施例3：制备天然明胶微块

使用天然明胶(Nippi，Inc.，Nippi明胶/高级明胶APAT)制备作为基质块的无定形微块。将1000mg天然明胶溶解在9448μL超纯水中。在加入152μL 1N HCl后，以1.0％的终浓度向其中加入400μL 25％戊二醛并在50℃反应3小时以制备交联的明胶凝胶。将该交联的明胶凝胶浸入1L 0.2M甘氨酸溶液中并在40℃振荡2小时。然后，将交联的明胶凝胶在5L超纯水中振荡洗涤1小时，并将该超纯水用新鲜的超纯水替换，接着再次洗涤1小时。重复该步骤以完成总计6次洗涤操作。将经如此洗涤的交联的明胶凝胶在-80℃冷冻达5小时，然后在冻干机(EYELA，FDU-1000)中冻干。使用New Power Mill(Osaka Chemical Co.，Ltd.，New Power MillPM-2005)将获得的冻干的产物粉碎。以最大的转数进行粉碎达总计5分钟(1分钟×5轮)。通过不锈钢筛将获得的颗粒筛分以获得25至53μm和53至106μm的天然明胶微块。

实施例4：使用重组明胶微块制备镶嵌细胞块

利用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整到500000个细胞/mL。在加入实施例2中制备的重组明胶微块至1.0mg/mL后，将100μL混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，U形底部)并静置18小时，以制备直径约为1mm、由重组明胶微块和hMSC细胞组成的球形镶嵌细胞块(0.002μg聚合物块/细胞)。然后，用软骨分化培养基(TakaraBio Inc.；hMSC Differentiation BulletKit(TM)，Chondrogenic，TGF-β3)(200μL)来替代培养基。在第7天，形成直径(＝厚度)为1.54mm的球形镶嵌细胞块(图1)。在本文中，该镶嵌细胞块被制备成球形，原因在于其是在U形平板中制备的。在第3、7、10、14、17和21天进行培养基替换。

实施例5：使用天然明胶微块制备镶嵌细胞块

利用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整到500000个细胞/mL。在加入实施例3中制备的天然明胶微块至1.0mg/mL后，将100μL混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板并静置18小时，以制备直径约为1mm、由天然明胶微块和hMSC细胞组成的球形镶嵌细胞块(0.002μg聚合物块/细胞)。然后，用软骨分化培养基(Takara Bio Inc.；hMSC DifferentiationBulletKit(TM)，Chondrogenic，TGF-β3)(200μL)来替代培养基。在第7天，形成直径(＝厚度)为1.34mm的球形镶嵌细胞块(图2)。在本文中，该镶嵌细胞块被制备成球形，原因在于其是在U形平板中制备的。

利用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整到500000个细胞/mL。通过将条件变为终浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL来制备在实施例3中制备的天然明胶微块，将100μL每种混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板并静置18小时以成功地制备直径稍小于1mm的球形镶嵌细胞块(0.00001、0.0002、0.0004、0.002和0.004μg聚合物块/细胞)。

实施例6：样品分析

制备在实施例4中使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块的组织切片。在从实施例4中制备的培养基中的镶嵌细胞块去除培养基后，通过加入200μL PBS洗涤所得的镶嵌细胞块，并将此PBS除去。将洗涤步骤重复两次。然后，将经洗涤的镶嵌细胞块浸入10％福尔马林中，并进行福尔马林固定达2天。然后，将所得的细胞块包埋在石蜡中以制备组织切片。将切片用HE(苏木精-伊红)染色，并且分析细胞和明胶微块的状态。结果显示在图3、4和5中。可以由此确认：制备了其中明胶微块和细胞以镶嵌模式布置的三维构建体；并且细胞以正常状态存在于镶嵌细胞块中。此外，从此横截面切片，显示可以制备厚度为至少720μm以上的镶嵌细胞块。

实施例7：镶嵌细胞块的融合

检测在实施例4中制备的镶嵌细胞块是否可以融合，即，所布置的镶嵌细胞块是否能够通过自然融合形成较大的三维构建体。将在实施例4中制备的第6天的两个、三个或四个镶嵌细胞块布置在Sumilon CelltightX96U平板中并培养5天。结果，显示位于每个镶嵌细胞块外周上的细胞使所述镶嵌细胞块彼此结合，由此镶嵌细胞块自然融合。图6显示利用立体显微镜拍摄的照片。关于在融合起始日(称作第6天)的镶嵌细胞块，镶嵌细胞块仅仅彼此邻近放置。与此对比，在从融合起始日起的第5天(称作第11天)，新的层在镶嵌细胞块之间形成，表明了镶嵌细胞块融合的方式。同样，图7、8、9、10和11显示制备融合的镶嵌细胞块的组织切片以及用HE染色其横截面(使用10％福尔马林进行固定，并且使用石蜡包埋进行包埋)的结果。从图中清楚可见，通过细胞和由细胞产生的胞外基质在镶嵌细胞块之间形成融合层，从而使镶嵌细胞块彼此融合和结合。由此显示，本发明中制备的镶嵌细胞块能够自然融合并且能够通过该融合形成较大的构建体。因此证明，使用本发明实现了具有厚度的细胞片层的制备和更立体的三维构建体的制备。

实施例8：在生长培养基下使用重组明胶微块制备镶嵌细胞块

利用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整到500000个细胞/mL。在加入实施例2中制备的重组明胶微块至1.0mg/mL后，将100μL混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板并静置18小时，以制备直径约为1mm的球形镶嵌细胞块(0.002μg聚合物块/细胞)。然后，培养基的体积增加至200μL，并且培养镶嵌细胞块，每3天替换培养基。在第7天，形成直径(＝厚度)为1.34mm的球形镶嵌细胞块(在本文中，由于其在U形平板中制备，所以该镶嵌细胞块被制备成球形)。第7天的镶嵌细胞块的切片照片显示在图16和17中。如从图中清楚可见，在此横截面切片上，甚至是厚度较小的位点的厚度也达到至少624μm以上。

实施例9：镶嵌细胞块体积的增加(在生长培养基下)

将0.1mg在实施例2中制备的重组明胶微块悬浮在生长培养基(TakaraBio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))中，并将其在培养基替换期间加入到在实施例8中制备的第三天(第3天)的镶嵌细胞块中。随后，在第7、10、14、17和21天在培养基替换时加入0.1mg的重组明胶微块。

在立体显微镜下在对该镶嵌细胞块的观察中的直径(作为两个不同直径的平均值计算)、拍照的镶嵌细胞块的面积、以及计算的体积(从以上确定的直径根据4/3πr³计算而来)中的每一个随时间的变化显示在图12、13、14和15中。结果，在第21天最终形成平均直径(＝厚度)为3.41mm的球形镶嵌细胞块。由此证明可以制备尺寸达至少3.41mm的镶嵌细胞块。还证明可以通过依靠该方法继续增加体积来增加尺寸。

此时的组织切片(HE染色)显示在图18和19中。如从图中清楚可见，细胞和重组明胶微块以镶嵌模式布置。此外，因为作为样品，镶嵌细胞块的尺寸约为3mm并且小，所以极难正确地产生通过球的中心的横截面。因此，虽然球的最深的部分没有在切片中获得，但是即使是在样品中收集到该切片的部分也显示具有至少1.17mm的厚度。

如在图12、13和14中所示，在第7、10、14、17和21天培养基替换期间不加入重组明胶微块培养的情况下，在镶嵌细胞块中直径不改变。在不加入重组明胶微块培养的镶嵌细胞块中，仅由细胞和细胞产生的胞外基质组成的层状结构由增殖的细胞在镶嵌细胞块的最外层形成。结果，形成这样的状态，其中营养的扩散被细胞和所产生的胞外基质的层封锁，从而防止细胞进一步增殖(尺寸增大(sized up))。这就是直径不变的原因。另一方面，当在培养基替换时不断地加入重组明胶微块时，这些重组明胶微块总是与增殖的细胞一起以镶嵌模式配合，由此由细胞和重组明胶微块组成的镶嵌结构可以继续得以维持，即使是在细胞增殖后。结果，由重组明胶微块提供的营养供应通路始终得到保证，并且不产生由细胞和所生成的胞外基质无意形成的外层。可以对所得的镶嵌细胞块进行尺寸增大。

实施例10：镶嵌细胞块的体积的增加(在软骨分化培养基下)

将0.1mg在实施例2中制备的重组明胶微块(0.1mg)悬浮在软骨分化培养基(Takara Bio Inc.；hMSC Differentiation BulletKit(TM)，Chondrogenic，TGF-β3)中，并在培养基替换期间将其加入到在实施例4中制备的第三天(第3天)的镶嵌细胞块。随后，在第7、10、14、17和21天在培养基替换时加入0.1mg的重组明胶微块。

在立体显微镜下在对该镶嵌细胞块的观察中的直径(作为两个不同直径的平均值计算)、拍照的镶嵌细胞块的面积、以及计算的体积(根据4/3πr³从以上确定的直径计算而来)中的每一个随时间的变化显示在图12、13、14和15中。结果，在第21天最终形成平均直径(＝厚度)为2.05mm的球形镶嵌细胞块。由此证明可以制备尺寸达至少2.05mm的镶嵌细胞块。还证明可以通过依靠该方法继续增加体积来增加尺寸。

此时的组织切片(HE染色)显示在图20和21中。如从图中清楚可见，细胞和重组明胶微块以镶嵌模式布置。此外，因为作为样品，镶嵌细胞块的尺寸约为2mm并且小，所以极难正确地产生通过球的中心的横截面。因此，虽然球的最深的部分没有在切片中获得，但是即使是在样品中收集到该切片的部分也显示具有至少897μm的厚度。

如在图12、13和14中所示，在第7、10、14、17和21天培养基替换期间不加入重组明胶微块培养的情况下，在镶嵌细胞块中直径不改变。在不加入重组明胶微块培养的镶嵌细胞块中，仅由细胞和细胞产生的胞外基质组成的层状结构由增殖的细胞在镶嵌细胞块的最外层形成。结果，形成这样的状态，其中营养的扩散被细胞和所产生的胞外基质的层封锁，从而防止细胞进一步增殖(尺寸增大)。这就是直径不变的原因。另一方面，当在培养基替换时不断地加入重组明胶微块时，这些重组明胶微块总是与增殖的细胞一起以镶嵌模式配合，由此由细胞和明胶微块组成的镶嵌结构可以继续得以维持，即使是在细胞增殖后。结果，由重组明胶微块提供的营养供应通路始终得到保证，并且不产生由细胞和所生成的胞外基质无意形成的外层。可以对所得的镶嵌细胞块进行尺寸增大。

实施例11：确定在镶嵌细胞块中制备的GAG的量(随时间的变化)

对于在实施例4和5中制备的镶嵌细胞块(hMSC细胞+重组明胶以及hMSC细胞+天然明胶)以及仅使用细胞制备的细胞块(不使用明胶块，通过与在实施例4中相同的方法制备)，确定每个镶嵌细胞块中的糖胺聚糖的量。通过使用二甲基亚甲基蓝染料的方法进行测量(Farndale等，Improvedquantitation and sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethyleneblue(通过使用二甲基亚甲基蓝的改善的定量和硫酸化的糖胺聚糖).Biochimica et Biophysica Acta(生物化学和生物物理学学报)883(1986)173-177)，并且使用Sulfated GAG Quantification Kit(硫酸化GAG定量试剂盒)(Seikagaku Biobusiness Corp.)作为试剂。测量在530nm处的吸光度以进行量化。如在图21中所示，确认通过该方法看到在525-530nm处的特征吸收峰。

确定GAG的量随时间的过去的结果显示在图22的图表中。结果，在不使用明胶微块的情况下制备的细胞块中产生的糖胺聚糖(GAG)的量低，而在使用天然明胶微块制备的镶嵌细胞块以及使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块中产生的GAG的量极其高。由此可以确认：在实施例4和5中制备的镶嵌细胞块中，软骨分化得到促进；并且制备的镶嵌细胞块具有细胞的功能(具有产生GAG的能力)。此外，产生的GAG的量在使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块中比在使用天然明胶微块制备的镶嵌细胞块中显著更高。这证明，与天然明胶微块产生的那些相比，使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块能够维持更高的细胞活性以及基质生成活性，并且显示使用重组明胶能够实现的基质生成量是使用天然明胶所不可能实现的。

实施例12：镶嵌细胞块的ATP定量

确定在每个镶嵌细胞块中由细胞产生/保留的ATP(腺苷三磷酸)的量。已知ATP是一般生物体的能量源。可以通过确定合成/保留的ATP的量来了解细胞的活性代谢状态和活性状态。在测量中使用CellTiter-Glo(Promega Corp.)。为进行比较，对于在实施例4和5中制备的镶嵌细胞块(hMSC细胞+重组明胶以及hMSC细胞+天然明胶)以及仅使用细胞制备的细胞块(不使用明胶块，通过与在实施例4中相同的方法制备)，使用CellTiter-Glo来确定在每个镶嵌细胞块中的ATP的量，上述细胞块都是第7天的。

结果显示在图23中。因此清楚的是，产生/保留的ATP的量在使用明胶微块制备的镶嵌细胞块中比在仅使用细胞制备的细胞块中显著更高(p＜0.01)。这表明，微块以镶嵌模式配合，由此由微块提供进入镶嵌细胞块的营养供应通路，并且与在仅由细胞组成的块中相比，细胞的高活性代谢状态得到更好的维持。进一步证明，产生/保留的ATP的量在使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块中比在使用天然明胶微块制备的镶嵌细胞块中显著更高。由此证明，与天然明胶微块产生的那些相比，使用重组明胶微块制备的镶嵌细胞块展示更高的细胞存活并且在此镶嵌细胞块中的细胞是活的。据显示，使用重组明胶能够实现的细胞存活的改善是使用天然明胶所不可能实现的。

实施例13：制备PLGA微块

将0.3g PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，PLGA7520)溶解在二氯甲烷(3mL)中。将PLGA溶液在干燥机(EYELA，FDU-1000)中真空干燥以获得PLGA的干燥产物。将PLGA的干燥产物利用New Power Mill(Osaka Chemical Co.，Ltd.，New Power MillPM-2005)粉碎。以最大转数进行粉碎(10秒×20轮)。通过不锈钢筛将获得的颗粒筛分从而获得25至53μm和53至106μm的PLGA微块。

PLGA：″1/IOB″值：0.0552

实施例14：使用PLGA制备镶嵌细胞块

使用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整至500000个细胞/mL。在加入在实施例13中制备的PLGA微块(通过改变条件使终浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL来制备)后，将100μL每种混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板并静置18小时，以制备直径略小于1mm的球形镶嵌细胞块(0.0002、0.0004、0.002和0.004μg的聚合物块/细胞)。然后，将培养基的体积增加至200μL，并且培养每种镶嵌细胞块，每3天替换培养基。在本文中，由于在U形平板中制备，所以该镶嵌细胞块被制备成球形。第2天的PLGA镶嵌细胞块的立体显微镜照片显示在图24中。

实施例15：制备琼脂糖微块

将超纯水(100mL)加入到5g琼脂糖粉末，并通过使用微波炉加热来溶解粉末。使所获得的5％的琼脂糖溶液回到室温以获得固体物质。将该固体物质在-80℃冷冻5小时然后在冻干机(EYELA，FDU-1000)中冻干以获得琼脂糖的冻干产物。使用New Power Mill(Osaka Chemical Co.，Ltd.，New Power Mill PM-2005)将琼脂糖的冻干产物粉碎。以最大转数进行粉碎(10秒×20轮)。通过不锈钢筛将获得的颗粒筛分从而获得25至53μm和53至106μm的琼脂糖微块。

IOB值：3.18

实施例16：使用琼脂糖制备镶嵌细胞块

使用生长培养基(Takara Bio Inc.；MSCGM-CD(TM)BulletKit(TM))将来源于人骨髓的充质干细胞(hMSC)调整至500,000个细胞/mL。在加入在实施例15中制备的琼脂糖微块(通过改变条件使终浓度为0.1mg/mL和1.0mg/mL来制备)后，将100μL每种混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板并静置18小时，以制备直径略小于1mm的球形镶嵌细胞块(0.0002和0.002μg的聚合物块/细胞)。然后，将培养基的体积增加至200μL，并且培养每种镶嵌细胞块，每3天替换培养基。在本文中，由于在U形平板中制备，所以该镶嵌细胞块被制备成球形。

实施例17：使用心肌细胞制备镶嵌细胞块

使用用于心肌细胞的培养基(Primary Cell Co.，Ltd；用于心肌细胞的CMCM培养基)将新生SD大鼠心肌细胞(rCMC)调整至500000个细胞/mL。在加入在实施例2中制备的重组明胶微块至0.5、1.0或3.0mg/mL后，将100μL每种混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板(Sumitomo BakeliteCo.，Ltd.，U形底部)并静置18小时，以制备直径约为1至2mm、由重组明胶微块和rCMC细胞组成的镶嵌细胞块(0.001、0.002和0.006μg的聚合物块/个细胞)。在第3、7、10、14、17和21天进行培养基替换。

在第1天和第3天的阶段，已经能够确认rCMC镶嵌细胞块作为整个构建体同步搏动(图25)。因为在说明书中难以显示运动的图像，所以图25是通过在0.2秒后从运动的图像捕获相同位点的静止图像而获得的图像。如从用三角标记的位点清楚可见，在两张图像中整个构建体移动。

这可以显示，甚至使用心肌细胞也能够形成本发明的三维细胞构建体(镶嵌细胞块)，并且还证明：获得了作为细胞构建体的包含心肌细胞的镶嵌细胞块，其作为整个构建体同步搏动。

实施例18：使用表达GFP的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)制备镶嵌细胞块

使用用于内皮细胞的培养基(Kurabo Industries Ltd.；培养基200S，LSGS，抗菌剂GA溶液)将表达GFP的人脐静脉内皮细胞(GFP-HUVEC；Angio-Proteomie)调整至500000个细胞/mL。在加入在实施例2中制备的重组明胶微块至0.3、1.0或3.0mg/mL后，将100μL每种混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，U形底部)(0.0006、0.002和0.006μg聚合物块/个细胞)。同样地，也将细胞调整至1,500,000个细胞/mL，并且在加入在实施例2中制备的重组明胶微块至1.0mg/mL后，将100μL或200μL混合物接种到Sumilon Celltight X96U平板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，U形底部)并制备。将它们全部分别静置18小时，以制备直径约为1至2mm、由重组明胶微块和GFP-HUVEC细胞组成的镶嵌细胞块。在第3、7、10、14、17和21天进行培养基替换。

图26显示50000个细胞+0.03mg微块的镶嵌细胞块和300000个细胞+0.2mg微块的镶嵌细胞块的显微镜照片和荧光显微镜照片。因为GFP-HUVEC细胞发射GFP荧光，所以容易通过荧光显微镜来了解在镶嵌细胞块中的分布。由此显示，甚至使用血管内皮细胞也能够制备本发明的三维细胞构建体(镶嵌细胞块)。

还证明，可以使用各种细胞(如充质干细胞、心肌细胞和血管内皮细胞)来形成本发明的细胞构建体(镶嵌细胞块)。同时显示，可以使用各种聚合物块(如重组明胶块、动物明胶块、PLGA块和琼脂糖块)来形成本发明的细胞构建体(镶嵌细胞块)。这证明可以使用各种细胞种类和各种聚合物块种类来形成本发明的三维细胞构建体(镶嵌细胞块)。

Claims

1.细胞构建体，其包括具有生物相容性的聚合物块和细胞，其中多个所述聚合物块被布置在多个所述细胞之间的空间内。

2.根据权利要求1所述的细胞构建体，其中所述聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

3.根据权利要求2所述的细胞构建体，其中所述聚合物块的尺寸为10μm至300μm。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞构建体，其中厚度或直径为400μm至3cm。

5.根据权利要求4所述的细胞构建体，其中厚度或直径为720μm至1cm。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞构建体，其中所述聚合物块和所述细胞之间的比率为0.0000001μg至1μg所述聚合物块/个细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞构建体，其通过温育所述具有生物相容性的聚合物块和包含所述细胞的培养液的混合物来制备。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是生物可降解材料。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、壳多糖或脱乙酰壳多糖。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是明胶、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、生腱蛋白、血纤蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白或RetroNectin。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是交联的。

12.根据权利要求11所述的细胞构建体，其中所述交联是使用醛、缩合剂或酶来进行。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物是重组明胶。

14.根据权利要求13所述的细胞构建体，其中所述具有生物相容性的聚合物在一个分子中具有两个或更多个细胞黏着信号。

15.根据权利要求13所述的细胞构建体，其中所述重组明胶由下式表示：

A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

16.根据权利要求13或15所述的细胞构建体，其中所述重组明胶由下式表示：

Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly

17.根据权利要求13至16中任一项所述的细胞构建体，其中所述重组明胶具有以下任一：

(1)由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列，或

(2)与由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列具有80％或更高同源性并具有生物相容性的氨基酸序列。

18.制备根据权利要求1至17中任一项所述的细胞构建体的方法，所述方法包括温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤包括用新鲜培养基交换培养基。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤包括用分化或生长培养基来交换培养基。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述温育具有生物相容性的聚合物块和包含细胞的培养液的混合物的步骤还包括另外加入具有生物相容性的聚合物块。

22.通过根据权利要求18至21中任一项所述的方法制备的细胞构建体。

23.通过将多个根据权利要求1至17中任一项所述的细胞构建体融合获得的细胞构建体。

24.一种制备根据权利要求23所述的细胞构建体的方法，所述方法包括将多个根据权利要求1至17中任一项所述的细胞构建体进行融合的步骤。

25.一种制备细胞构建体的方法，所述方法包括将多个细胞构建体融合的步骤，所述细胞构建体包括多个具有生物相容性的聚合物块和多个细胞，其中1个或多个聚合物块被布置在一些或所有的由所述多个细胞形成的多个空间内。

26.根据权利要求25所述的制备细胞构建体的方法，其中所述聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

27.根据权利要求25或26所述的制备细胞构建体的方法，其中在融合前细胞构建体的厚度或直径为10μm至1cm，并且在融合后细胞构建体的厚度或直径为400μm至3cm。

28.一种制备细胞构建体的方法，所述方法包括进一步将第二聚合物块加入到细胞构建体并将其温育，所述细胞构建体包括多个具有生物相容性的第一聚合物块和多个细胞，其中1个或多个聚合物块被布置在一些或所有的由所述多个细胞形成的多个空间内。

29.根据权利要求28所述的制备细胞构建体的方法，其中所述第一聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

30.根据权利要求28或29所述的制备细胞构建体的方法，其中所述第二聚合物块的尺寸为1μm至700μm。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的制备细胞构建体的方法，其中在加入所述第二聚合物块和温育后，厚度或直径为400μm至3cm。

32.通过根据权利要求25至31中任一项所述的制备细胞构建体的方法制备的细胞构建体。

33.根据权利要求32所述的细胞构建体，其用于细胞移植、细胞培养或毒力评估。