WO2010110067A1 - エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途 - Google Patents

エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2010110067A1
WO2010110067A1 PCT/JP2010/054001 JP2010054001W WO2010110067A1 WO 2010110067 A1 WO2010110067 A1 WO 2010110067A1 JP 2010054001 W JP2010054001 W JP 2010054001W WO 2010110067 A1 WO2010110067 A1 WO 2010110067A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
elastin
cross
collagen
linked product
derived
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/054001
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
佳隆 松本
高敏 四ツ柳
新一 須藤
祥史 山谷
星野　躍介
西村　和也
倫子 古賀
宏之 江成
Original Assignee
株式会社マルハニチロ食品
北海道公立大学法人札幌医科大学
国立大学法人弘前大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社マルハニチロ食品, 北海道公立大学法人札幌医科大学, 国立大学法人弘前大学 filed Critical 株式会社マルハニチロ食品
Priority to US13/259,267 priority Critical patent/US20120021063A1/en
Priority to EP10755867.8A priority patent/EP2412795B1/en
Priority to KR1020117025189A priority patent/KR101321615B1/ko
Priority to JP2011505968A priority patent/JP5060653B2/ja
Publication of WO2010110067A1 publication Critical patent/WO2010110067A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3821—Bone-forming cells, e.g. osteoblasts, osteocytes, osteoprogenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier

Definitions

  • the present invention relates to a cross-linked product using fish-derived elastin and fish-derived collagen and uses thereof.
  • Wound dressings and artificial dermis using collagen are disclosed in Japanese Patent No. 2997823, Japanese Patent No. 3772232, Japanese Patent No. 3105308, etc., and some are actually commercially available.
  • most of the collagen used in these is collected from tissues of livestock such as cattle and pigs, but in recent years, BSE (bovine spongiform encephalopathy) has become a problem, and is derived from mammals including cow skin. There is a concern about the risk of pathogens infecting humans with collagen products using.
  • collagen is denatured into gelatin when heated in an aqueous solution or suspension.
  • Denatured collagen is easily dissolved in water and weak in strength, so that it is degraded by proteolytic enzymes in the living body and easily absorbed by the living body, making it unsuitable as a medical material that requires appropriate stability in the living body.
  • the collagen derived from fish has the disadvantage that the denaturation temperature is low and the strength of the gel is weaker than that derived from mammals.
  • the reaction In order to prevent modification, the reaction must be performed at a temperature lower than the modification temperature. However, the reaction does not proceed depending on the type of the crosslinking agent at low temperatures.
  • elastin is a major protein of elastic fibers in various tissues and organs such as ligaments and skin, and its use as a medical material for the regeneration of damaged tissues and organs of elastin is being studied.
  • Japanese Patent Publication No. 6-30616 discloses a molding composition obtained by mixing water-soluble elastin and soluble collagen in the cold.
  • International Publication No. 2002/96978 pamphlet (WO2002 / 96978) describes an elastin cross-linked body in which components such as collagen are chemically bonded when elastin is cross-linked by a cross-linking agent, and a medical device and a regenerated tissue thereof. Is disclosed.
  • Collagen and elastin are attracting attention as materials for the production of artificial dermis and medical materials for tissue regeneration, but the origin of raw materials, the handleability and mechanical strength of the resulting products, and the intended use At present, no satisfactory products are found in various requirements such as characteristics corresponding to.
  • the collagen derived from fish has the disadvantage that the denaturation temperature is low and the strength of the gel is weaker than that derived from mammals.
  • the reaction In order to prevent modification, the reaction must be performed at a temperature lower than the modification temperature. However, the reaction does not proceed depending on the type of the crosslinking agent at low temperatures.
  • Japanese Examined Patent Publication No. 6-30616 discloses a molding composition obtained by mixing water-soluble elastin and soluble collagen in the cold state and a film-like structure obtained using the same.
  • the structure obtained from this molding composition is not subjected to insolubilization treatment such as cross-linking, the form may not be maintained in water for a long time.
  • Artificial dermis is a porous body, but it is not easy to obtain a porous body for artificial dermis from the molding composition described in the publication.
  • International Publication No. 2002/96978 discloses a crosslinked body in which collagen is chemically bound when water-soluble elastin is crosslinked with a crosslinking agent and its use as a medical material.
  • a crosslinked body having a desired shape and properties. It is described that cannot be obtained.
  • a crosslinked product is obtained by this crosslinking method, it may not be able to sufficiently cope with various uses such as medical materials including artificial dermis and scaffolds for cell culture.
  • An object of the present invention is to provide a collagen / elastin cross-linked product that can sufficiently cope with various uses such as medical materials including artificial dermis and scaffolds for cell culture.
  • the cross-linked product of the present invention is obtained by cross-linking fish-derived collagen and fish-derived elastin.
  • the method for producing a cross-linked product of the present invention comprises a step of preparing a solution in which fish-derived collagen and fish-derived elastin are dissolved under conditions that do not cause colastation of the elastin, and causes coacervation of the elastin.
  • the method for producing a cross-linked product of the present invention is a method for cross-linking the above-mentioned uncrosslinked dry product. A crosslinked product is obtained.
  • the medical material of the present invention is characterized by containing the above-mentioned crosslinked product.
  • the cell culture scaffold of the present invention is characterized by containing the above-mentioned crosslinked product.
  • the cosmetic base material of the present invention is characterized by containing the above-mentioned crosslinked product.
  • a collagen / elastin cross-linked product obtained from a fish-derived raw material and sufficiently compatible with various uses such as medical materials including artificial dermis and cell culture scaffolds, and a method for producing the same, and
  • various uses such as medical materials including artificial dermis and cell culture scaffolds, and a method for producing the same
  • FIG. It is a graph which shows the fracture strength of the porous body by adding elastin to the collagen in Example 4. It is a graph which shows the fracture
  • FIG. It is the tissue image (macro image) of the 56th day implantation of the collagen / elastin porous body in the rat subcutaneous body in Example 6. It is a graph which shows transition of the area of a wound in Example 7 (the area of the wound just after an operation was made into 100%). It is a figure which shows the state of the wound of the sample group in Example 7 (14th day after an operation).
  • FIG. 10 It is a scanning electron microscope image (SEM image: 100 times) of the DNA addition collagen / elastin porous body using the crosslinking agent in Example 8.
  • 10 is a scanning electron microscope image (SEM image: 100 times) of a protamine-added collagen / elastin porous material using a crosslinking agent in Example 9.
  • FIG. It is a scanning electron microscope image (SEM image: 100 times) of the hydroxyapatite-added collagen / elastin porous material using the crosslinking agent in Example 10. It is a figure of the result of having dye
  • Example 11 It is a figure of the result of toluidine blue dyeing
  • elastin is derived from fish.
  • fish for preparing elastin include salmonid salmonids such as salmon and trout, persimmons such as tuna and bonito, periwinkles such as yellowtail, and crustaceae such as Ling Cod.
  • Elastin is preferably water-soluble elastin in order to obtain a homogeneous cross-linked product in the formation of a cross-linked product with collagen.
  • water-soluble elastin include tropoelastin, a biosynthetic precursor of elastin, ⁇ -elastin and ⁇ -elastin obtained by treating elastin with acid and alkali, and a hydrolyzate of elastin obtained by enzymatic treatment.
  • the elastin used in the present invention is preferably ⁇ -elastin, which is a polymer with a uniform molecular weight that is easy to obtain mechanical strength when a crosslinked product is prepared.
  • the molecular weight of elastin used in the present invention is not particularly limited, but a weight average molecular weight of about 10,000 to 100,000 is preferable.
  • Elastin is slower to decompose in vivo than collagen, but it has high biocompatibility like collagen and is expected to add mechanical strength and flexibility when added.
  • ⁇ -elastin is said to have biological functions such as macrophage migration activity, cell adhesion, and platelet aggregation inhibition. When ⁇ -elastin is used as a cross-linked material, these biological functions are added. It is also expected.
  • Preparation of elastin from fish can be performed by a conventional method.
  • fish-derived elastin Compared to elastin from cattle and pigs, fish-derived elastin has fewer desmosine and isodesmosine, which are one of the amino acids involved in the cross-linking structure in the elastin molecule, and the amino acid composition is also derived from mammals such as cows and pigs. With different characteristics.
  • composition (mol%) can be mentioned as an example of a composition about the amino acid of different content with respect to the elastin derived from an animal of the elastin derived from a fish which can be utilized in this invention.
  • ⁇ Glycine 35-45%
  • Alanine 10-20%
  • Valine 3-8%
  • -Isodesmosine 0.1-1.0%
  • Total non-polar amino acids are 67-77%
  • the amino acids to be analyzed are glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ileu), serine (Ser), threonine (Thr), aspartic acid.
  • Examples of fish used for collagen preparation include salmonid salmonids such as salmon and trout, perch and mackerel such as tuna and bonito, perch and horse mackerel such as yellowtail, codidae such as codfish and walleye Can do.
  • the collagen soluble (water-soluble) collagen is preferable for obtaining a homogeneous crosslinked product in the formation of a crosslinked product with elastin.
  • Preparation of collagen from fish can be performed by a conventional method.
  • telopeptide which is the main antigenic site of collagen exists at both ends of collagen. When this part is removed by enzymatic treatment, the antigenicity of collagen becomes extremely low.
  • Such collagen is called atelocollagen and is applied to medical implant materials and tissue engineering scaffold materials.
  • the soluble collagen used in the present invention is more preferably fish-derived atelocollagen.
  • the molecular weight of the collagen used in the present invention is not particularly limited, but a weight average molecular weight of about 10,000 to 300,000 is preferable.
  • the fish-derived collagen has a different amino acid composition such as proline and hydroxyproline are lower than collagen from cattle and pigs.
  • Collagen has the property of denaturation and gelatinization when the temperature rises above a certain temperature, but the denaturation temperature of fish-derived collagen is generally lower than that of cattle or pig-derived collagen.
  • composition (mol%) can be mentioned as an example of the composition about the amino acid of different content with respect to the collagen derived from the animal of the amino acid composition of the collagen derived from fish which can be utilized in this invention.
  • the amino acids to be analyzed are glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ileu), serine (Ser), threonine (Thr), aspartic acid.
  • a cross-linking agent may be used to form a cross-linked product of elastin and collagen.
  • crosslinking agent when strength stability is required for the crosslinked product, it is preferable to use a crosslinking agent. Any crosslinking agent may be used as long as it can be crosslinked.
  • carbodiimide type, azide type, fluorophosphate type, triazine type, epoxy type cross-linking agent (condensing agent) and the like can be mentioned.
  • Condensation aids may also be used, and examples thereof include N-hydroxypolycarboxylic imides, N-hydroxytriazoles, triazines, and 2-hydroxyimino-2-cyanoacetic acid ethyl ester. As these condensing agents and condensing aids, it is desirable to select those having low persistence and toxicity when used as medical materials.
  • the crosslinked product of the present invention can be produced from fish-derived elastin and fish-derived collagen by a crosslinking method using a crosslinking agent, a crosslinking method using heat, or a crosslinking method using ultraviolet rays or radiation.
  • a crosslinking method using a crosslinking agent such as artificial dermis, a scaffold for cell culture, and a cosmetic base material
  • B A step of obtaining a cross-linked product from the solution obtained in step (A) under conditions that do not cause elastin coacervation.
  • step (B) the following step (B-1) or (B-2) can be used.
  • B-1) A step of adding a cross-linking agent to the solution obtained in step (A) under the conditions that do not cause elastin coacervation to form cross-links during lyophilization to obtain a cross-linked product.
  • B-2) A step of crosslinking the dried product obtained by drying the solution obtained in step (A) under conditions that do not cause elastin coacervation.
  • drying method in the step (B-2) freeze drying, vacuum drying, air drying, drying with a dehydrating solvent, natural drying, and the like can be used. Further, after the step (B), a crosslinking treatment such as crosslinking with a crosslinking agent, crosslinking with heat, crosslinking with ultraviolet rays or radiation may be added alone or in combination.
  • a crosslinking treatment such as crosslinking with a crosslinking agent, crosslinking with heat, crosslinking with ultraviolet rays or radiation may be added alone or in combination.
  • elastin is dissolved under conditions that do not cause elastin coacervation, and a crosslinking agent is added to the solution in which elastin and collagen are dissolved in that state to form a crosslink during lyophilization.
  • a step of crosslinking a dried product obtained by drying the solution under conditions that do not cause elastin coacervation.
  • Water-soluble elastin has temperature and pH conditions that cause a phenomenon called coacervation in an aqueous solution.
  • the liquid bottom will aggregate in the form of candy, and it will not be uniformly crosslinked with other mixtures, but depending on the type of crosslinking agent and crosslinking conditions, water-soluble elastin may not be crosslinked at all. Separated from the mixture. Therefore, it is preferable that elastin coacervation does not occur in the solution for crosslinking.
  • elastin coacervation does not occur in the solution for crosslinking.
  • the conditions under which coacervation does not occur can be set depending on the type of water-soluble elastin used. Usually, temperature and pH conditions selected from a temperature in the range of 0 to 40 ° C. and a pH in the range of 1 to 12 can be employed.
  • collagen is denatured into gelatin when the temperature rises above a certain temperature.
  • Denatured collagen is easily dissolved in water and weak in strength, so that it is easily decomposed and absorbed by proteolytic enzymes in the living body, making it unsuitable as a medical material that requires appropriate stability in vivo.
  • the denaturation temperature of fish-derived collagen is said to be around 20 ° C., and it is desirable to perform solution preparation and crosslinking reaction at a temperature range lower than this.
  • Collagen is solubilized in the neutral range from acidic, but insoluble in alkaline.
  • the pH of the solution in which collagen is dissolved is preferably 1 to 7, more preferably 3 to 6.
  • the temperature is 10 ° C. or less, more preferably 0 to 5 ° C. at which elastin does not cause coacervation and collagen does not denature, and the pH is 3 to 3 at which elastin does not cause coacervation and collagen is dissolved. 6. More preferred is a pH at which the selected crosslinking agent is susceptible to reaction.
  • a solvent for dissolving elastin and collagen water, water containing an acid, alkali, surfactant, water containing a low-concentration water-soluble organic solvent, or the like can be used.
  • the mixing ratio (% by weight) of elastin and collagen is preferably in the range of 0.5% to 99.5% of elastin with respect to the weight of the crosslinked product. More preferably, it is 1 to 50%, and if it is in this range, a good porous molded body can be obtained, and a molded article that is good as a medical device including an artificial dermis, a cell culture scaffold, and a cosmetic substrate can be obtained. Obtainable.
  • crosslinking method for crosslinking a dried product containing elastin and collagen chemical crosslinking using a crosslinking agent, crosslinking by heat, crosslinking by ultraviolet rays or radiation, and the like can be used. That is, the dried product containing elastin and collagen can be crosslinked by at least one of heat, ultraviolet rays and radiation even when no crosslinking agent is added.
  • the crosslinking of the dried product can be performed in a solvent as necessary.
  • a crosslinking agent as necessary in a high concentration aqueous salt solution or in an organic solvent such as alcohols, DMSO, DMF, dioxane and the like, and a mixed solvent thereof.
  • Crosslinking can be carried out in the presence of
  • the blending ratio (% by weight) of the crosslinking agent is not particularly limited, but is preferably 1 to 50% with respect to the weight of the composition to be crosslinked.
  • a blending ratio of 1 to 30% is particularly preferable in order to obtain a good molded product as a medical device including an artificial dermis, a cell culture scaffold, and a cosmetic base material.
  • concentrations (% by weight) when elastin and collagen are cross-linked in a solution are not particularly limited. However, considering the solubility of collagen and elastin and the moldability due to the viscosity of the mixed solution, it is 0. A concentration of 5-50% is preferred. A concentration range of 1 to 10% is particularly preferable in order to obtain a good molded article as a medical device including an artificial dermis, a cell culture scaffold, and a cosmetic base material.
  • the method for molding the crosslinked collagen / elastin of the present invention is not particularly limited, but a molding die used for molding a general synthetic resin can be used.
  • a cross-linking agent is added to a solution containing elastin and collagen and poured into a mold, and this is freeze-dried to crosslink, or a solution containing elastin and collagen is poured into a mold and dried to form a dried product And the dried product is cross-linked to obtain a molded product.
  • a collagen / elastin cross-linked body such as sponge, thread, film, rod, pellet, tube or the like reflecting the template used can be molded. Further, it can be formed into a film by a solution casting method.
  • a solution containing elastin and collagen added with a crosslinking agent is spread thinly on a substrate such as a resin or metal, and then the solvent is removed and dried to obtain a crosslinked product, or a solution containing elastin and collagen is used as a resin.
  • a thin film-like collagen / elastin cross-linked product can be obtained by thinly spreading on a substrate such as the like and then cross-linking the dried product after removing the solvent.
  • fish-derived DNA and protamine can be added to the crosslinked product of the present invention.
  • DNA has a hyaluronic acid production promoting effect on normal human skin fibroblasts, and deoxyribonucleotides, which are degradation products thereof, have a proliferating activity and collagen production promoting effect on normal human skin fibroblasts.
  • DNA derived from fish DNA derived from salmonaceae can be used as DNA derived from fish.
  • the molecular weight of the DNA used in the present invention is not particularly limited, but a weight average molecular weight of about 10,000 to 10,000,000 is preferable.
  • Protamine is a protein that exists specifically in the sperm nucleus of vertebrates and has an antibacterial effect, so it is expected to prevent wound infection.
  • As protamine salmin from salmonaceae, curpain from herring family, and the like can be used.
  • the amino acid that constitutes protamine contains a large amount of arginine, and approximately 70% of salmin, a protamine derived from the salmonid family, is arginine.
  • arginine is produced in the degradation process. Arginine suppresses the expression of excess cytokines (stimulating physiologically active substances) that are released with the inflammatory reaction of tissues.
  • Arginine is a component that produces typical NO (nitrogen monoxide), and NO has a function of attacking tumor cells and cells accompanied by infection.
  • arginine plays an important role in T-lymphocyte maturation.
  • arginine is an important amino acid that has an immune response activation effect, a cell growth promoting effect, a collagen production promoting effect, and the like, and promotes healing of wounds and pressure ulcers.
  • the effects as described above can be expected by adding these fish-derived DNA and protamine to the collagen / elastin cross-linked product.
  • These components are blended so that the desired physical properties, characteristics or functionality can be imparted to the crosslinked product.
  • the blending amount is not particularly limited, but 0.5% to 50%, preferably 1 to 20% of DNA and / or protamine is added with respect to the total weight of collagen and elastin.
  • powdered or granular calcium phosphate can be added to the cross-linked product of the present invention in addition to fish-derived elastin and collagen.
  • This crosslinked product can be applied as a bone regeneration inducer or regeneration promoter, or as a bone filling material for the purpose of inducing or promoting bone formation in a bone defect portion, but is not limited to these uses. Absent.
  • the amount of calcium phosphate is blended so that the desired physical properties, characteristics or functionality can be imparted to the crosslinked product.
  • the blending amount is not particularly limited, but 0.5% to 50%, preferably 1 to 20% of calcium phosphate is added to the total weight of collagen and elastin.
  • hydroxyapatite HA
  • tricalcium phosphate ⁇ -TCP
  • ⁇ -TCP calcium hydrogen phosphate dihydrate
  • DCPD calcium hydrogen phosphate dihydrate
  • OCP octacalcium phosphate
  • TeCP tetracalcium phosphate
  • CAP Carbonate apatite
  • the present invention it is possible to obtain a crosslinked product composed of a homogeneous complex that is insoluble in water, and even when a porous material is used, a porous structure suitable as a scaffold for artificial dermis or cell culture is used as the crosslinked material. Obtainable. Furthermore, since elastin and collagen used for the production of the crosslinked product according to the present invention are not a conventional mammal-derived material in which infectious diseases such as BSE (bovine spongiform encephalopathy) are concerned, but a natural material derived from fish. Therefore, a safer crosslinked product can be provided.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the cross-linked product according to the present invention is more suitable as a medical material because it has improved in vivo stability and mechanical strength than collagen alone, and has in vivo degradability by adding elastin. It had physical properties.
  • the porous body made of the cross-linked product according to the present invention is homogeneous and has a porous structure suitable as a scaffold for artificial dermis or cell culture. Therefore, when used as an artificial dermis, it has excellent skin fibroblast invasion properties, good granulation formation, suppresses wound contraction, and is rapidly absorbed into the body after wound healing. When the skin is damaged by wounds, pressure ulcers, etc., it is applied to the damaged surface and can be used for dermal component deficient sites. Therefore, according to the present invention, an artificial dermis that effectively promotes wound healing can be provided.
  • the porous body composed of the crosslinked product according to the present invention has uniform pores therein and has biocompatibility and a property of gradually degrading in vivo, growth factors (b-FGF, BMP, etc.) ) And antibiotics, and can be used as a material for a delivery system (DDS) that can be delivered and supplied to a necessary location such as an affected area.
  • DDS delivery system
  • it can also be used in various ways as a scaffold for regenerative medicine (scaffold) as a medical material such as a transplant material.
  • the cross-linked product according to the present invention can be used as a bone regeneration base material, but can also contain a bone formation factor and a growth factor.
  • a bone formation factor for example, bone morphogenetic protein (BMP), recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP) as bone morphogenetic factors, fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), epithelium Growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), neurotrophic factor (NGF) and the like.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • rhBMP recombinant human bone morphogenetic protein
  • FGF fibroblast growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • EGF epithelium Growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • NGF neuro
  • the crosslinked product according to the present invention can be used as a cartilage regeneration base material for medical use and cell culture scaffolding.
  • a cartilage regeneration base material for medical use and cell culture scaffolding.
  • a collagen / elastin porous body is homogeneous and has a suitable porous structure excellent in cell invasion, so that a cartilage-like tissue can be maintained. Since cartilage regeneration is rapidly absorbed by the living body, it is applied to the damaged surface of cartilage and can effectively regenerate cartilage-like tissue. Therefore, according to the present invention, a cartilage regeneration base material that effectively promotes cartilage regeneration can be provided.
  • the cross-linked product according to the present invention may contain a cartilage differentiation inducing factor and a growth factor that can be used as a cartilage regeneration base material for medical use and cell culture scaffolds.
  • cartilage differentiation inducing factors include transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), bone morphogenetic protein (BMP), recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP), Sox gene group (Sox9, Sox5 or Sox6) and the like. And at least one of these can be used.
  • the cross-linked collagen / elastin of the present invention can be used as a cosmetic base material.
  • a cosmetic base material it can be used for cosmetic face masks, wet sheets and the like.
  • a porous body when used, it can be impregnated with a lot of lotion and cosmetic liquid, and the functionality of collagen and elastin can also be expected.
  • a face mask for makeup When used as a face mask for makeup, a sheet-like porous body having a thickness of about 1 to 5 mm that matches the shape of the face or has a shape that partially covers the face can be used.
  • Example 1 Cytotoxicity test of fish-derived atelocollagen and water-soluble elastin
  • samples atelocollagen derived from salmon skin and water-soluble elastin derived from salmon heart were used.
  • As the evaluation cells normal human skin fibroblasts, which are the main body in the skin matrix, were used. Cytotoxicity tests were performed with the WST-1 assay.
  • the WST-1 assay utilizes the fact that formazan (Formazan) produced by degradation of WST-1 by the action of mitochondria in cells is colorimetrically determined (measurement wavelength: 450 nm), and its absorbance correlates with the number of living cells. This is a well-known method for measuring the number of living cells. The obtained results are shown in FIGS. All samples were confirmed to have a high cell viability at a concentration of 0.1 to 10 ⁇ g / mL and show no cytotoxicity.
  • Example 2 (Example of preparation of fish-derived collagen / elastin porous material using a crosslinking agent)
  • a porous body was prepared using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, which were the same as those used in Example 1. That is, it was weighed in a test tube so that the compounding ratio (weight ratio) of scab-derived atelocollagen and cocoon heart-derived water-soluble elastin was 8/2. Deionized water was added to the mixed collagen / elastin powder and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a collagen / elastin mixed solution having a concentration of 5%.
  • EDC crosslinking agent: 1-Ethyl-3- (3-dimetylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • aqueous solution was added to the prepared collagen / elastin mixed solution under refrigeration (3 ° C.) and mixed (collagen and EDC was added to 20% (w / w) based on the total weight of elastin).
  • a collagen / elastin mixed solution to which EDC was added was poured into a mold having a desired shape and freeze-dried to obtain a collagen / elastin porous body.
  • the obtained collagen / elastin porous material was washed with ion exchange water. After washing, the collagen / elastin porous material in a water-containing state was freeze-dried to obtain a collagen / elastin porous material.
  • the pore size was 50 to 100 ⁇ m and the pore diameters were uniform (FIG. 3). reference).
  • Example 3 (Example of preparation of fish-derived collagen / elastin porous material using thermal crosslinking) A porous body was prepared using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, which were the same as those used in Example 1. That is, the test tube was weighed so that the compounding ratio (weight ratio) of scab-derived atelocollagen and shark heart-derived water-soluble elastin was 7: 3 collagen / elastin. Deionized water was added to the mixed collagen / elastin powder and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a collagen / elastin mixed solution having a concentration of 10%.
  • the mixed solution was poured into a mold having a desired shape and freeze-dried to obtain a freeze-dried product.
  • the freeze-dried product was thermally crosslinked at 150 ° C. for 24 hours under reduced pressure to obtain a collagen / elastin porous material.
  • the obtained porous body was put in water, it retained its shape for over a week.
  • SEM scanning electron microscope
  • Example 4 Change in physical properties of porous body by adding elastin to collagen Using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, a cross-linking method similar to that in Example 2 was used. A porous body in which 20% (w / w) elastin is added to collagen and a porous body in which 40% (w / w) elastin is added to collagen have the same size and shape (diameter 12 mm, thickness 6 mm). Columnar) (the total concentration of collagen and elastin was 5%). These porous bodies were left in water for 24 hours to obtain a swollen gel.
  • the mechanical strength of this gel was measured by REOMETER (manufacturing and sales: Sun Science Co., Ltd.).
  • the breaking distance which is a value indicating the breaking strength of the gel and the flexibility of the gel, was increased as compared to the case of collagen alone (elastin content 0%) (see FIGS. 5 and 6).
  • the strength was weak and the fracture distance could not be measured.
  • Example 5 Evaluation as a scaffold (cell culture scaffold) of fish-derived collagen / elastin porous material
  • a fish-derived collagen / elastin porous material (diameter 11 mm ⁇ thickness 3 mm) prepared in the same manner as in Example 2 was used.
  • WFB a fibroblast immortalized strain of WKA rat
  • normal human skin fibroblasts were used as cells for evaluation.
  • the collagen / elastin porous material was sterilized with ethylene oxide gas, and the degassed porous material was placed in a 12-well culture plate. Next, 1 mL of the cell-containing culture solution (cell concentration 5 ⁇ 10 5 cells / mL) is soaked in each sponge, and then 1 mL of the culture solution is poured.
  • the culture solution is exchanged every 3 or 4 days and cultured. did.
  • Cell survival confirmation and histological evaluation were carried out 14 and 28 days after culture.
  • a variation of the WST-1 assay was used to confirm cell survival. That is, the cells adhered to the culture plate were removed, and the porous material was transferred to a new culture plate in order to measure only the cells engrafted in the porous material. 2-3 mL of WST-1 solution-culture solution (1:10) was poured onto a new culture plate, allowed to react for 4 hours, and absorbance was measured with a plate reader. Histological evaluation was performed by fixing a collagen / elastin porous material in formalin, embedding it in a paraffin block, and slicing it with hematoxylin-eosin.
  • Example 6 Embedding test of fish-derived collagen / elastin porous material in vivo (rat subcutaneous)
  • a fish-derived collagen / elastin porous material (diameter 11 mm ⁇ thickness 5 mm) prepared in the same manner as in Example 2 was used.
  • Wister rats (4 weeks old, around 200 g, female) were anesthetized with ether, and the hair on the back was shaved off with a clipper. About 1 cm of incision was made in the back skin with a scissors, a pocket having a diameter of about 1 cm was created under the skin (under the fleshy membrane), a porous body sterilized with ethylene oxide gas was embedded, and sutured closed with nylon thread.
  • the rats were killed by plan and biopsy was performed on the portion where the porous body was embedded.
  • the tissue was fixed in formalin and then used as a paraffin specimen. This was stained with hematoxylin-eosin to evaluate biocompatibility.
  • Example 7 Transplantation test of fish-derived collagen / elastin porous material to rat skin defect wound
  • a fish-derived collagen / elastin porous body (diameter 20 mm ⁇ thickness 5 mm) was prepared in the same manner as in Example 2, and this was used as a transplant material in the sample group.
  • Terdermis collagen monolayer type, manufactured by Terumo
  • a commercially available artificial dermis using collagen was used as a transplant material for the control group.
  • Example 8 (Preparation example of DNA-added collagen / elastin porous material using a crosslinking agent)
  • a porous body was prepared using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, which were the same as those used in Example 1. That is, the test tube was weighed so that the blending ratio (weight ratio) of salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin was 8: 2.
  • Deionized water was added to the mixed collagen / elastin powder and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a collagen / elastin mixed solution having a concentration of 5%.
  • Deionized water was added to salmon eggplant-derived DNA and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a DNA solution having a concentration of 5%.
  • the DNA-added collagen / elastin mixed solution to which EDC was added was poured into a mold having a desired shape and freeze-dried to obtain a DNA-added collagen / elastin porous body.
  • the obtained DNA-added collagen / elastin porous material was washed with ion-exchanged water. After washing, the water-containing DNA-added collagen / elastin porous material was freeze-dried to obtain a DNA-added collagen / elastin porous material.
  • Example 9 (Preparation example of protamine-added collagen / elastin porous material using a cross-linking agent)
  • a porous body was prepared using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, which were the same as those used in Example 1. That is, the test tube was weighed so that the blending ratio (weight ratio) of salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin was 8: 2.
  • Deionized water was added to the mixed collagen / elastin powder and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a collagen / elastin mixed solution having a concentration of 5%.
  • Deionized water was added to protamine derived from salmon roe and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a 5% concentration protamine solution.
  • Protamine added collagen / elastin with 5% concentration of protamine solution added to the 5% concentration collagen / elastin mixed solution so that the weight ratio is 8: 2 and stirred under refrigeration (3 ° C.). A mixture was obtained.
  • an EDC crosslinking agent: 1-Ethyl-3- (3-dimetylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • aqueous solution was added and mixed (collagen, elastin and protamine).
  • EDC was added to 20% (w / w) based on the total weight).
  • the protamine-added collagen / elastin mixed solution to which EDC was added was poured into a mold having a target shape and freeze-dried to obtain a protamine-added collagen / elastin porous body.
  • the obtained protamine-added collagen / elastin porous material was washed with ion-exchanged water. After washing, the hydrous protamine-added collagen / elastin porous material was freeze-dried to obtain a protamine-added collagen / elastin porous material.
  • the pore size was about 100 ⁇ m and the pore diameters were uniform (see FIG. 11).
  • Example 10 (Preparation example of hydroxyapatite-added collagen / elastin porous material using a crosslinking agent)
  • a porous body was prepared using salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin, which were the same as those used in Example 1. That is, the test tube was weighed so that the blending ratio (weight ratio) of salmon skin-derived atelocollagen and salmon heart-derived water-soluble elastin was 8: 2.
  • Deionized water was added to the mixed collagen / elastin powder and stirred under refrigeration (3 ° C.) to obtain a collagen / elastin mixed solution having a concentration of 5%.
  • HA was added to the prepared collagen / elastin mixed solution so that the weight ratio of the total weight of collagen and elastin to hydroxyapatite (hereinafter referred to as HA) was 8: 2, and kneaded under refrigeration (3 ° C.).
  • an EDC crosslinking agent: 1-Ethyl-3- (3-dimetylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • aqueous solution was added and mixed (total weight of collagen and elastin) The EDC was added so as to be 20% (w / w)).
  • the HA-added collagen / elastin mixed solution to which EDC was added was poured into a mold having a desired shape and freeze-dried to obtain a HA-added collagen / elastin porous body.
  • the obtained HA-added collagen / elastin porous material was washed with ion-exchanged water. After washing, the HA-added collagen / elastin porous material in a water-containing state was freeze-dried to obtain an HA-added collagen / elastin porous material.
  • the structure of the obtained HA-added collagen / elastin porous body was observed with a scanning electron microscope (manufactured by JEOL, JSM-6380LV, hereinafter referred to as SEM). As a result, the pore size was about 100 ⁇ m (see FIG. 12).
  • Example 11 (Use of collagen / elastin porous material in the field of cartilage regeneration) A fish-derived collagen / elastin porous material (diameter 11 mm ⁇ thickness 5 mm) prepared in the same manner as in Example 2 was used. A collagen / elastin porous material degassed in the culture solution was placed in a 10 cm culture dish. Next, the cultured chondrocytes were recovered from the culture flask, the number of cells was counted, and 5 ⁇ 10 6 cells were resuspended in 500 ⁇ L of a culture solution to obtain a cell culture solution. This cell culture solution was soaked into the collagen / elastin porous material, and the culture was started in an incubator.
  • Example 12 Preparation of film-like fish-derived collagen / elastin complex
  • EDC crosslinking agent: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • aqueous solution was added to the prepared collagen / elastin mixed solution and mixed (based on the total weight of collagen and elastin).
  • EDC was added so as to be 0.5% (w / w)).
  • This mixed solution to which EDC was added was applied onto a polypropylene sheet, and this was left standing in a desiccator containing a desiccant, and dried and solidified (the above operation was performed at 5 ° C. or lower). After drying and solidifying, the film-like collagen / elastin complex was heat-treated at 180 ° C. for 1 hour under reduced pressure.
  • Example 13 (Used as a cosmetic base material for collagen / elastin complex) The left forearm of the subjects (four men in their 20s to 30s) was thoroughly washed with soap, washed with water, and then their hands were wiped dry. After 30 minutes of washing, marks were made at the places where the probe of the measuring instrument was applied to three places inside the left forearm. The viscoelasticity of the marked part was measured with a cutaneous viscoelasticity measuring device, cutometer MPA580 (Courage + Khazaka, measurement mode 1) (before application: 0:00). After the 0:00 measurement, a sheet-like collagen / elastin porous material in which commercial lotion was sufficiently soaked was attached to one of the three marks of each subject, and left for 15 minutes.
  • a cutaneous viscoelasticity measuring device cutometer MPA580 (Courage + Khazaka, measurement mode 1) (before application: 0:00). After the 0:00 measurement, a sheet-like collagen / elastin porous material in which commercial lotion was sufficiently soaked was attached
  • a sheet-like collagen / elastin porous material was prepared in the same manner as in Example 2. After 15 minutes, the collagen / elastin porous material containing skin lotion (abbreviated as CES + skin lotion application) was peeled off, and at the same time, lotion was applied to another marked area. Similarly, a non-application portion, a lotion application portion, and a CES + lotion application portion were created for all four subjects. Two hours after application, the skin viscoelasticity of the marked part was measured in the same manner as described above.

Abstract

人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を提供すること。 魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を得る。

Description

エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途
　本発明は、魚類由来のエラスチン及び魚類由来のコラーゲンを用いた架橋物及びその用途に関する。
　コラーゲンを用いた創傷被覆材や人工真皮は、特許２９９７８２３号明細書、特許３７７２２３２号明細書、特許３１０５３０８号明細書等に開示され、実際に市販されているものもある。しかしこれらに用いられているコラーゲンは、そのほとんどが牛、豚などの家畜の組織より採取されているが、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）問題が顕在化し、牛皮を含む哺乳動物由来の原料を用いたコラーゲン製品により、人間に対し病原体が感染する危険性が懸念されている。
　こうした背景の中、生体親和性が高く、細胞侵入性が良好で、創収縮抑制がおこらず、真皮様組織形成後は速やかに生体分解性を示す、牛や豚などの哺乳動物由来以外の素材を用いた人工真皮の開発が望まれていた。魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途が開示されている（特開２００５－９５３３１号公報）。
　ところでコラーゲンは水溶液あるいは懸濁液中で熱を掛けると変性してゼラチンとなる。変性したコラーゲンは水に溶けやすく強度が弱いため、生体内のタンパク質分解酵素によって分解され、生体に吸収されやすくなり、生体内で適度な安定性が求められる医療用材料としては不向きとなる。更に、魚類由来のコラーゲンは哺乳動物由来のものと比べると変性温度が低く、ゲルの強度が弱い欠点があった。変性を防ぐため変性温度以下で反応させなければならないが、低温下では架橋剤の種類によっては反応が進まない欠点があった。
　一方、エラスチンは、靭帯や皮膚など種々の組織や器官における弾性線維の主要蛋白質であり、エラスチンの損傷組織や器官の再生のための医療用材料としての用途が検討されている。
　特公平６－３０６１６号公報には水溶性エラスチンと可溶性コラーゲンを冷時混合してなる成型用組成物が開示されている。また、国際公開第２００２／９６９７８号パンフレット（ＷＯ２００２／９６９７８）には、エラスチンを架橋剤により架橋させる際にコラーゲンなどの成分を化学的に結合させたエラスチン架橋体、並びにその医療用器具及び再生組織が開示されている。
特許２９９７８２３号明細書 特許３７７２２３２号明細書 特許３１０５３０８号明細書 特開２００５－９５３３１号公報 特公平６－３０６１６号公報 国際公開第２００２／９６９７８号パンフレット
　コラーゲン及びエラスチンは、人工真皮製造用の材料や組織再生のための医療用材料としての用途が注目されているが、原材料の由来、得られた製品の取り扱い性や機械的強度、目的とする用途に対応した特性などの種々の要件において満足できるものが見当たらないのが現状である。
　例えば、牛や豚以外に由来するものとしての魚類由来のコラーゲンおよび魚類由来の水溶性エラスチンを用いた創傷被覆材や人工真皮を開示する先行技術文献は現状では見あたらない。また魚類由来のコラーゲンは哺乳動物由来のものと比べると変性温度が低く、ゲルの強度が弱い欠点があった。変性を防ぐため変性温度以下で反応させなければならないが、低温下では架橋剤の種類によっては反応が進まない欠点があった。
　特公平６－３０６１６号公報には水溶性エラスチンと可溶性コラーゲンを冷時混合してなる成型用組成物及びそれを用いて得られた膜状構造体が開示されている。しかし、この成型用組成物から得られる構造体は架橋等の不溶化処理がされていないことから、長時間水中で形態を保持することができない場合がある。また人工真皮は多孔体であるが、同公報に記載される成型用組成物から人工真皮用の多孔体を得ることは容易ではない。
　国際公開第２００２／９６９７８号パンフレットには、水溶性エラスチンを架橋剤で架橋する際にコラーゲンを化学的に結合した架橋体およびその医療用材料としての用途が開示されている。しかしながら、国際公開第２００２／９６９７８号パンフレットに記載される架橋方法では、架橋剤や架橋条件によって鋳型に流し込むことが困難であったり、反応速度の制御が難しく、目的とする形状や性状の架橋体が得られないことが記載されている。更に、この架橋方法によって架橋体が得られた場合でも人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応できない場合がある。
　本発明の目的は、人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を提供することにある。
　本発明の架橋物は、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより得られることを特徴とするものである。
　本発明の架橋物の製造方法は、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程、もしくは該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液を乾燥して得られる乾燥物を架橋させる工程を有することを特徴とする。本発明の架橋物の製造方法は、上述の未架橋の乾燥物を架橋する方法として、架橋剤を用いた架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋、これら単独もしくは組合せにより、水に不溶な架橋物を得ることを特徴とする。
　本発明の医療用材料は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。また、本発明の細胞培養足場材は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。また、本発明の化粧品基材は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。
　本発明によれば、魚類由来の原料から得られ、人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物及びその製造方法、並びに、このコラーゲン／エラスチン架橋物を利用して得られる医療用材料、細胞培養足場材および化粧品基材としての用途を提供することができる。
実施例１における魚類由来アテロコラーゲンの細胞毒性試験の結果を示すグラフである（マイトマイシンＣ（細胞毒性物質、販売:協和発酵キリン株式会社））。 実施例１における魚類由来水溶性エラスチンの細胞毒性試験の結果を示すグラフである（マイトマイシンＣ（細胞毒性物質、販売:協和発酵キリン株式会社））。 実施例２における架橋剤を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：２００倍）である。 実施例３における熱架橋を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：２００倍）である。 実施例４におけるコラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の破断強度を示すグラフである。 実施例４におけるコラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の破断距離を示すグラフである。 実施例６におけるコラーゲン／エラスチン多孔体のラット皮下への埋め込み５６日目の組織像（マクロ像）である。 実施例７における創の面積の推移（術直後の創の面積を１００％とした）を示すグラフである。 実施例７におけるサンプル群（術後１４日目）の創の状態を示す図である。 実施例８における架橋剤を用いたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。 実施例９における架橋剤を用いたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。 実施例１０における架橋剤を用いたヒドロキシアパタイト添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。 実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をアルシアンブルー染色した結果の図である。 実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をトルイジンブルー染色した結果の図である。 実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色した結果の図である。 実施例１２におけるフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体（含水状態）の写真画像である。 実施例１３における皮膚粘弾性の測定結果のグラフである。（n　＝　４、ＣＥＳ＋化粧水塗布部との比較、ｔ　検定、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５） 実施例１４におけるフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体（含水状態）の写真画像である。
　本発明においては、エラスチンとして魚類由来のものを用いる。エラスチン調製用の魚類として、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目サバ科、ブリ等のスズキ目アジ科、Ｌｉｎｇ　Ｃｏｄ等のカサゴ目アイナメ科などを挙げることができる。エラスチンとしては、コラーゲンとの架橋物の形成において、均質な架橋物を得る上では、水溶性エラスチンが好ましい。水溶性エラスチンとしてはエラスチンの生合成前駆体であるトロポエラスチン、エラスチンを酸およびアルカリ処理することで得られるα－エラスチン、κ－エラスチン、および酵素処理して得られるエラスチンの加水分解物がある。本発明で用いるエラスチンとしては、架橋物を調製した際に機械的強度が得られやすい分子量の揃った高分子であるα－エラスチンが望ましい。
　また本発明で用いるエラスチンの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万～１０万程度が好ましい。
　エラスチンはコラーゲンと比較すると生体内での分解は遅いが、コラーゲンと同様に生体親和性が高く、添加することで機械的強度や柔軟性が付加されることが期待される。またα－エラスチンはマクロファージ遊走活性、細胞接着、血小板凝集阻害等の生物学的機能を有するとされており、α－エラスチンを架橋物の素材として用いた場合、これらの生物学的機能が付加されることも期待される。
　魚類からのエラスチンの調製は、常法により行うことができる。
　魚類由来のエラスチンは、牛や豚からのエラスチンに比べて、エラスチン分子内の架橋構造に関与するアミノ酸の一種であるデスモシン、イソデスモシンが少ないほか、アミノ酸組成もウシやブタ等の哺乳動物由来とは異なる特徴を有する。
　本発明において利用できる魚類由来エラスチンの動物由来のエラスチンに対して異なる含有量のアミノ酸についての組成の一例として、以下の組成（ｍｏｌ％）を挙げることができる。
・グリシン：３５～４５％
・アラニン：１０～２０％
・バリン：３～８％
・イソデスモシン：０．１～１．０％
・デスモシンが０．１～１．０％
・非極性アミノ酸の合計が６７～７７％
　なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ileu）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシリジン（Hylys）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、ヒドロキシプロリン（Hypro）、イソデスモシン（Iso-Des）及びデスモシン（Des）である。上記のグリシン、アラニン、バリン、イソデスモシン、デスモシン以外のアミノ酸の含有率（ｍｏｌ％）の一例を以下にあげる。
・ロイシン：３．４～４．５
・イソロイシン：０．９～１．９
・セリン：３．１～３．４
・トレオニン：３．１～６．５
・アスパラギン酸：１．６～２．９
・グルタミン酸：３．２～４．３
・リシン：０．７～１．５
・アルギニン：１．６～２．６
・ヒスチジン：０．２～０．８
・ヒドロキシリジン：０
・システイン：０～０．２
・メチオニン：０．４～０．７
・チロシン：３．４～４．４
・フェニルアラニン：１．１～３．１
・プロリン：８．６～１０．１
・ヒドロキシプロリン：０．５～０．９
　一方、コラーゲンとしても魚類由来のものを用いる。コラーゲン調製用の魚類として、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目・サバ科、ブリ等のスズキ目・アジ科、マダラ、スケトウダラ等のタラ目タラ科などを挙げることができる。コラーゲンとしては、エラスチンとの架橋物の形成において、均質な架橋物を得る上では、可溶性（水溶性）コラーゲンが好ましい。魚類からのコラーゲンの調製は、常法により行うことができる。ところでコラーゲンの両端には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。この部分を酵素処理で取り外すと、コラーゲンの抗原性が極端に低くなる。このようなコラーゲンをアテロコラーゲンと呼び、医療用のインプラント材料や組織工学用の足場材料に応用されている。本発明に用いる可溶性コラーゲンとしては、魚類由来のアテロコラーゲンがより好ましい。
　また本発明で用いるコラーゲンの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万～３０万程度が好ましい。
　魚類由来のコラーゲンは、牛や豚からのコラーゲンに比べて、プロリンやヒドロキシプロリンが低いなどアミノ酸組成がことなる。またコラーゲンはある温度以上となると変性しゼラチン化する性質があるが、魚類由来のコラーゲンの変性温度は牛や豚由来のコラーゲンと比較すると一般的に低い。
　本発明において利用できる魚類由来コラーゲンのアミノ酸組成の動物由来のコラーゲンに対して異なる含有量のアミノ酸についての組成の一例として、以下の組成（ｍｏｌ％）を挙げることができる。
・グリシン：３４～４０％
・プロリン：５．０～１１．０％
・ヒドロキシプロリン：４．０～８．０％
・ヒスチジン：０．８～２．０％
　なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ileu）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパアラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシリジン（Hylys）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）及びヒドロキシプロリン（Hypro）である。
　上記のグリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン以外のアミノ酸の含有率（mol%）の一例を以下にあげる。
・アラニン：１０．５～１５．０
・バリン：１．１～２．２
・ロイシン：１．５～２．３
・イソロイシン：０．５～１．１
・セリン：３．５～６．３
・トレオニン：２．１～３．６
・アスパアラギン酸：４．３～５．３
・グルタミン酸：７．４～９．５
・リシン：２．４～２．９
・アルギニン：４．９～５．５
・ヒドロキシリジン：０．５～０．８
・システイン：０～０．２
・メチオニン：０．３～１．７
・トリプトファン：０
・チロシン：０．２～０．３
・フェニルアラニン：１．１～１．４
　エラスチンとコラーゲンの架橋物の形成には、架橋剤を用いてもよい。特に、架橋物に強度安定性が求められる場合には、架橋剤を用いておくことが好ましい。架橋剤としては、これらを架橋できるものであればよい。例えば、カルボジイミド系、アジド系、フルオロホスフェート系、トリアジン系、エポキシ系の架橋剤（縮合剤）などを挙げることができる。また縮合助剤を用いてもよく、N-ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、N-ヒドロキシトリアゾール類、トリアジン類、及び２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸エチルエステル等が挙げられる。これらの縮合剤および縮合助剤としては、医療用材料として用いる場合は残留性や毒性が低いものを選択することが望ましい。
　本発明の架橋物は、魚類由来のエラスチンと魚類由来のコラーゲンを、架橋剤を用いた架橋法、熱による架橋法、紫外線もしくは放射線による架橋法により製造することができる。人工真皮などの医療用材料、細胞培養用の足場材および化粧品基材としての特性を得る上では、以下の工程を有する製造方法により架橋物を製造することが好ましい。
（Ａ）魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンをエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた溶液からエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で架橋物を得る工程。
　工程（Ｂ）としては、以下の工程（Ｂ－１）または（Ｂ－２）を用いることができる。
（Ｂ－１）エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で、工程（Ａ）で得られた溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程。
（Ｂ－２）工程（Ａ）で得られた溶液をエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で乾燥させて得た乾燥物を架橋させる工程。
　工程（Ｂ－２）における乾燥方法としては、凍結乾燥、真空乾燥、送風乾燥、脱水溶剤による乾燥、自然乾燥などが利用できる。また工程（Ｂ）の後に、更に架橋剤による架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋など、これら単独もしくは組合せた架橋処理を加えてもよい。
　従ってこの製造方法は、エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で、エラスチンを溶解し、その状態でエラスチン及びコラーゲンが溶解した溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程、もしくはこの溶液をエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で乾燥して得られる乾燥物を架橋させる工程に特徴を有する。水溶性エラスチンには水溶液中でコアセルベーションという現象を起こす温度やｐＨの条件が存在する。コアセルベーションが生じると、液底に水あめ状に凝集していまい、他の混合物とは均一に架橋しないばかりか、架橋剤の種類や架橋条件によっては、水溶性エラスチンは全く架橋せず、他の混合物と分離してしまう。従って、架橋用の溶液中においてエラスチンのコアセルベーションが生じないようにしておくことが好ましい。エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下でコラーゲン及び架橋剤と反応させることにより、エラスチンと、コラーゲン及び架橋剤との均一な反応が進行し、均質な架橋物を得ることができる。架橋物を多孔体として得る場合においても、より均質な空孔分布を有する多孔体が形成可能となる。エラスチンのコアセルベーションが生じた状態で架橋を行うと、架橋物中にエラスチンが偏在した部分が生じ、更に、架橋構造が架橋物全体に十分に形成できない場合が生じる。
　コアセルベーションが生じない条件は、用いる水溶性エラスチンの種類によって設定可能である。通常、０～４０℃の範囲の温度、及び１～１２の範囲のｐＨから選択した温度及びｐＨ条件が採用可能である。
　一方、コラーゲンはある温度以上になると変性してゼラチンとなる。変性したコラーゲンは水に溶けやすく強度が弱いため、生体内のタンパク質分解酵素によって分解吸収されやすくなり、生体内で適度な安定性が求められる医療用材料としては不向きとなる。上記理由より変性温度以下で溶液の調製および架橋反応を行う必要がある。一般的に魚類由来のコラーゲンの変性温度は２０℃前後と言われており、これより低い温度帯で溶液の調製および架橋反応を行うことが望ましい。またコラーゲンは酸性より中性域では可溶化しているが、アルカリ性では不溶化する性質を有する。これらのことからコラーゲンを含む組成物を均一な条件で架橋させるためには、コラーゲンが溶解している溶液のｐＨは、１～７、さらに好ましくは３～６が望ましい。
　従ってエラスチンとコラーゲンの均質な溶液を得るためには、両者が溶解している状態であることが必要である。すなわち、温度はエラスチンがコアセルベーションを起こさず、かつコラーゲンが変性しない１０度以下、さらに好ましくは０～５℃、ｐＨはエラスチンがコアセルベーションを起こさず、かつコラーゲンが溶解している３～６、さらに好ましくは選択した架橋剤が反応しやすいｐＨが好ましい。
　エラスチンとコラーゲンとを溶解させる場合の溶媒としては、水、もしくは酸、アルカリ、界面活性剤を含む水、低濃度の水溶性有機溶媒を含む水などを用いることができる。
　エラスチンとコラーゲンの混合割合（重量％）としては、架橋物重量に対してエラスチンが０．５％～９９．５％の範囲であることが好ましい。さらに好ましくは１～５０％であり、この範囲であれば良好な多孔質な成型体を得ることができ、人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得ることができる。
　エラスチン及びコラーゲンを含む乾燥物を架橋する場合の架橋方法としては、架橋剤を用いた化学架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋などを用いることができる。すなわち、エラスチン及びコラーゲンを含む乾燥物は架橋剤を添加しない場合においても、熱、紫外線及び放射線の少なくとも１つによって架橋させることができる。
　また、乾燥物の架橋は、必要に応じて溶媒中で行うことができる。例えば、乾燥物が溶媒中に溶解しないように、高濃度の塩類水溶液中、もしくはアルコール類、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジオキサン等などの有機溶媒中、及びこれらの混合溶媒中で、必要に応じて架橋剤の存在下で架橋を行うことができる。
　架橋剤の配合割合（重量％）としては、特に限定されるものではないが、架橋させる組成物重量に対し１～５０％が好ましい。人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得るためには１～３０％の配合割合が特に好ましい。
　溶液中でエラスチンとコラーゲンとを架橋させる場合のこれらの濃度（重量％）としては、特に限定されるものではないが、コラーゲンおよびエラスチンの溶解性、混合液の粘性による成型性を考慮すると０．５～５０％濃度が好ましい。人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得るためには１～１０％の濃度範囲が特に好ましい。
　本発明のコラーゲン／エラスチン架橋体の成型方法は特に限定されるものではないが、一般的な合成樹脂の成型に用いられる成型用の型を用いることができる。例えば、エラスチンおよびコラーゲンを含む溶液に架橋剤を加えて型に流し込み、これを凍結乾燥することで架橋させる、もしくはエラスチンおよびコラーゲンを含む溶液を型に流し込み、これを乾燥して成型された乾燥物を得て、該乾燥物を架橋することで成形物を得る。このような方法で、使用した鋳型を反映したスポンジ状、糸状、膜状、棒状、ペレット状、チューブ状などのコラーゲン／エラスチン架橋体を成型することが出来る。また、溶液キャスト法により膜状に成型することができる。例えば、エラスチンおよびコラーゲンを含む溶液に架橋剤を加えたものを樹脂や金属などの基板上に薄く広げた後、溶媒を除去乾燥させることで架橋体を得る、もしくはエラスチンおよびコラーゲンを含む溶液を樹脂等の基板上に薄く広げた後、溶媒を除去乾燥したものを架橋することでフィルム状のコラーゲン／エラスチン架橋体を得ることが出来る。
　本発明の架橋物には、エラスチン及びコラーゲンの他に、魚類由来のＤＮＡやプロタミンを添加することができる。
　ＤＮＡにはヒト皮膚正常線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進効果を有し、またこれらの分解物であるデオキシリボヌクレオチド類はヒト皮膚正常線維芽細胞の増殖活性やコラーゲン産生促進効果を有する。魚類由来のＤＮＡとしては、サケ科の由来のＤＮＡなどを用いることができる。また本発明で用いるＤＮＡの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万～１０００万程度が好ましい。
　プロタミンは脊椎動物の精子核に特異的に存在するタンパク質で抗菌効果を有することから、創傷の感染予防作用が期待される。プロタミンとしては、サケ科由来のサルミン、ニシン科由来のクルペインなどを用いることができる。
　プロタミンを構成するアミノ酸にはアルギニンが多く含まれており、サケ科由来のプロタミンであるサルミンではおおよそ７０％はアルギニンであるが、コラーゲン／エラスチン多孔体にプロタミンを含有させた場合、これらの生体内での分解過程でアルギニンが生じる。アルギニンは組織の炎症反応に伴って放出される過剰なサイトカイン（刺激を与える生理活性物質）の発現を抑制する。また、アルギニンは代表的なＮＯ（一酸化窒素）を産生する成分で、ＮＯは腫瘍細胞や感染を伴った細胞に攻撃を加える働きを持っている。さらに、アルギニンは、Ｔ－リンパ球の成熟にとっても重要な役割を果たす。このように、アルギニンは免疫反応の活性化、細胞増殖促進効果、コラーゲン生成促進効果などを有し、創傷や褥瘡の治癒を促進する重要なアミノ酸である。
　従ってこれら魚類由来のＤＮＡやプロタミンをコラーゲン／エラスチン架橋物に添加することで上述のような効果が期待できる。これらの成分の配合量は目的とする物性や、特性あるいは機能性を架橋物に付与できるように配合する。配合量は特に限定されるわけではないが、コラーゲンとエラスチンの合計重量に対し０．５％～５０％、好ましくは１～２０％のＤＮＡおよびまたはプロタミンを添加する。
　さらに本発明の架橋物には、魚類由来のエラスチン及びコラーゲンの他に、粉末状または顆粒状のリン酸カルシウムを添加することができる。この架橋物は、骨再生誘導剤もしくは再生促進剤、あるいは骨欠損部における骨形成の誘導もしくは促進を目的とした骨補填材としての応用が可能であるが、これらの用途に限定されるものではない。
　リン酸カルシウムの配合量は目的とする物性や、特性あるいは機能性を架橋物に付与できるように配合する。配合量は特に限定されるわけではないが、コラーゲンとエラスチンの合計重量に対し０．５％～５０％、好ましくは１～２０％のリン酸カルシウムを添加する。
　リン酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（α―ＴＣＰ，β―ＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴｅＣＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
　本発明によれば、水不溶性である均質な複合体よりなる架橋物を得ることができ、多孔体とした場合でも、人工真皮や細胞培養用の足場材として好適な多孔質構造を架橋物に得ることができる。更に、本発明にかかる架橋物の製造に用いるエラスチン及びコラーゲンは、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）などの感染症が懸念される従来の哺乳動物由来の素材ではなく、魚類由来の天然素材であるため、より安全性の高い架橋物を提供することができる。
　本発明にかかる架橋物は、エラスチンを添加したことで、コラーゲン単体より生体内での安定性と機械強度が向上し、且つ生体内での分解性も有しており、医療用材料として好適な物性を有していた。
　本発明にかかる架橋物からなる多孔体は、均質であり、かつ、人工真皮や細胞培養用の足場材として好適な多孔質構造を有している。従って、人工真皮として用いた場合に、皮膚線維芽細胞の侵入性に優れ、肉芽形成が良好であり創収縮を抑制し、創傷治癒後は速やかに生体に吸収性されることから、創傷、熱創、褥瘡等により皮膚が損傷を受けた際に、損傷面に適用され、真皮成分の欠損部位に使用できる。従って、本発明によれば、効果的に創傷治癒を促進する人工真皮を提供することができる。
　さらには本発明にかかる架橋物からなる多孔体は、内部に均一な細孔が存在し、生体適合性および生体内で徐々に分解する性質を有することから、成長因子（ｂ－ＦＧＦ、ＢＭＰなど）や抗生物質などの薬物を保持し、患部など必要な箇所に送達し、供給することのできる送達システム（ＤＤＳ）用の素材としても利用することができる。また、人工真皮にとどまらず、再生医療用の足場材（スキャフォールド材）として、移植材料等の医療用材料として多岐に利用することも可能である。
　本発明にかかる架橋物は、骨再生基材としての利用が可能であるが、骨形成因子及び成長因子を含ませることも出来る。例えば、骨形成因子としては骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）を、成長因子としては線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
　本発明にかかる架橋物は、医療用および細胞培養足場剤用の軟骨再生基材としての利用が可能である。例えばコラーゲン／エラスチン多孔体は均質であり、かつ、細胞の侵入性に優れた好適な多孔質構造を有していることから、軟骨様組織を維持することができる。軟骨再生後は速やかに生体に吸収性されることから、軟骨の損傷面に適用され、効果的に軟骨様組織を再生できる。従って、本発明によれば、効果的に軟骨再生を促進する軟骨再生基材を提供することができる。
　本発明にかかる架橋物は、医療用および細胞培養足場剤用の軟骨再生基材としての利用が可能である軟骨分化誘導因子及び成長因子を含ませることも出来る。例えば、軟骨分化誘導因子としては、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）、Ｓｏｘ遺伝子群（Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ５あるいはＳｏｘ６）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
　本発明のコラーゲン/エラスチン架橋体は化粧品基材として用いることができる。化粧品基材としては、化粧用フェイスマスクやウエットシートなどに用いることができる。特に多孔体とした場合は、多くの化粧水や美容液を含浸させることができ、コラーゲン、エラスチンの機能性も期待できる。化粧用フェイスマスクとして用いる場合、厚さ1～5mm程度のシート状多孔体で、顔の形状に合わせたものや一部を覆う形状のものが利用できる。
　次に実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について、詳細に記載するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において特に規定がない限りは「％」は重量基準である。
　〔実施例１〕
（魚類由来のアテロコラーゲン及び水溶性エラスチンの細胞毒性試験）
　試料としてサケ皮由来のアテロコラーゲン、サケ心臓由来の水溶性エラスチンを用いた。評価細胞は皮膚マトリックス内の主体をなすヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。細胞毒性試験は、ＷＳＴ-１アッセイにて実施した。ＷＳＴ-１アッセイは、細胞内のミトコンドリアの働きによりＷＳＴ－１が分解されて生成するホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）を比色定量（測定波長４５０ｎｍ）し、その吸光度が生細胞数と相関することを利用して生細胞数を測定する当業者において周知の方法である。得られた結果を図１及び図２に示す。いずれのサンプルも０．１～１０μｇ/ｍＬの濃度において細胞生存率が高く、細胞毒性を示さないことが確認された。
　〔実施例２〕
（架橋剤を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液に冷蔵下（３℃）でＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide　hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したコラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたコラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のコラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。
　得られたコラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ－６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは５０～１００μｍであり、孔径は揃っていた（図３参照）。
　〔実施例３〕
（熱架橋を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝７：３となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度１０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。該混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、凍結乾燥物を得た。該凍結乾燥物を減圧下で１５０度、２４時間熱架橋を行い、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られた多孔体を水中に入れたところ1週間以上形状を保持していた。得られたコラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ-６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは５０～１００μｍであり、孔径は揃っていた（図４参照）。
　〔実施例４〕コラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の物性変化
　サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて、実施例２と同様の架橋方法で、コラーゲン１００％の多孔体、コラーゲンに対し２０％（ｗ/ｗ）のエラスチンを添加した多孔体、コラーゲンに対し４０％（ｗ/ｗ）のエラスチンを添加した多孔体をそれぞれ同一の大きさ及び形状（直径１２ｍｍ厚さ６ｍｍの円柱状）となるように調製した（コラーゲンとエラスチンの合計濃度は５％とした）。これらの多孔体を水中に２４時間放置して、膨潤状態のゲルとした。このゲルの機械的強度をＲＥＯＭＥＴＥＲ（製造販売：（株）サン科学）で測定した。その結果、エラスチンを添加することでコラーゲン単体（エラスチン含有率０％）の場合より、ゲルの破断強度、およびゲルの柔軟性を示す値である破断距離が長くなった（図５、図６参照）。また比較対照として哺乳動物由来のコラーゲンを使用した市販されている人工真皮を上記と同じ分析条件で測定したところ、強度が弱く破断距離は測定できなかった。
　〔実施例５〕
（魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体のスキャホールド（細胞培養足場材）としての評価）
　実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径１１ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を用いた。評価用の細胞として、ＷＦＢ（ＷＫＡラットの線維芽細胞不死化株）、ヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。コラーゲン／エラスチン多孔体をエチレンオキサイドガス滅菌し、脱気処置した多孔体を１２穴培養プレートに置いた。次に細胞含培養液（細胞濃度５×１０５個／ｍＬ）を１ｍＬずつ各スポンジに染み込ませたのち、１ｍＬの培養液を注ぎ、これを３、４日ごとに培養液を交換して培養した。細胞の生存確認と組織学的評価を培養後１４，２８日目に実施した。細胞の生存確認はＷＳＴ－１アッセイの変法を用いた。すなわち培養プレートに接着した細胞を除去し、多孔体に生着した細胞のみを測定するため、多孔体を新しい培養プレートに移した。２～３ｍＬのＷＳＴ－１液－培養液（１：１０）を新しい培養プレートに注ぎ、そのまま４時間反応させて、吸光度をプレートリーダーで測定した。組織学的評価はコラーゲン／エラスチン多孔体をホルマリン固定し、これをパラフィンブロックに包埋し、薄切後にヘマトキシリン－エオジン染色して実施した。
　ＷＳＴ－１アッセイ変法による結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１に示すとおり、両細胞ともブランク（無細胞）と比較した場合、吸光度が明らかに存在し、更にまた１４日目と比較し２８日目では吸光度が増大していることから、多孔体内で生存し、且つ増殖していることが示唆された。培養組織を染色して顕微鏡下に観察した結果、ヒト皮膚正常線維芽細胞，ＷＦＢいずれの細胞も細胞同士が接着し、多孔体に付着している事が認められた。これらのことから魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体は細胞培養足場材として使用できることが明らかとなった。
　〔実施例６〕
（魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の生体内（ラット皮下）への埋め込み試験）
　実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径１１ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を用いた。Ｗｉｓｔｅｒ系ラット(４週齢、２００ｇ前後、メス)にエーテルで麻酔をかけ、背部の毛をバリカンで剃り落とした。剪刀にて背部皮膚を約１ｃｍ切開し、皮下（肉様膜下）に直径約１ｃｍのポケットを作成後、エチレンオキサイドガス滅菌した多孔体を埋入し、ナイロン糸で縫合閉創した。手術日より３、７、１４、２１、２８、５６日目にラットを計画屠殺し、多孔体を埋入した部分を生検した。組織をホルマリン固定した後、パラフィン標本とした。これをヘマトキシリン-エオジン染色して、生体適合性を評価した。
　多孔体埋め込み後の組織を観察した結果、移植早期には多孔体周囲に炎症細胞浸潤、毛細血管、線維芽細胞・内皮細胞のいわゆる肉芽組織が散見され、その後次第に肉芽組織が増生し、新しい膠原繊維（コラーゲン等）が産生され、５６日目にはほぼ完全に瘢痕化した。一方、多孔体は周囲から破壊・吸収され、５６日目には完全に吸収された（図７参照）。これは、以前に報告されているコラーゲン使用人工真皮であるペルナック(販売元；ジョンソン＆ジョンソン、製造元；グンゼ)の動物実験の結果とほぼ同等であった。
　〔実施例７〕
（ラット皮膚欠損創への魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の移植試験）
　実施例２と同じ方法で魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径２０ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を調製し、サンプル群はこれを移植材料とした。コントロール群には市販されているコラーゲン使用人工真皮であるテルダーミス（コラーゲン単層タイプ、テルモ製）を移植材料として用いた。Ｗｉｓｔｅｒ系ラットにエーテルで麻酔をかけ、背部に直径１５ｍｍほどの皮膚欠損創を作成し、欠損創に移植材料を置き、ドレッシング保護材で欠損創と移植材料を完全に覆い、ドレッシング保護材と皮膚断端をナイロン糸で縫合した。移植材料と下床を密着させるためガーゼで軽く圧迫し、さらに伸縮性バンドで圧迫固定した。移植材料なしのＯＰＥＮ　ＷＯＵＮＤ群、移植材料として魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体を用いたサンプル群、移植材料としてテルダーミスを用いたコントロール群の３群を作成し、同様の処置を各群５匹行った。
　試験結果の試料埋入に伴う死亡および感染等の所見は各群ともに確認されなかった。創面の肉眼的所見では、サンプル群は術後より創面が急速に収縮することはなく、７日目では大部分は肉芽化したＯＰＥＮ　ＷＯＵＮＤ群の創面は、術後より急速に収縮し始め、１４日目にはほぼ治癒した。経時的な創面の大きさの比較検討の結果、ＯＰＥＮ　ＷＯＵＮＤ群の創面は術後の早期から急速に収縮し始めるのに対し、サンプル群およびコントロール群では創収縮は比較的緩徐に生じることが認められた（図８、９参照）。創面（治癒面）の組織学的検討の結果、術後７日目のサンプル群では、周囲組織より炎症細胞浸潤、線維芽細胞および血管内皮細胞などが観察された。術後１４日目では下床組織は肉芽・瘢痕組織であり、その上部の皮膚断端より再生上皮が伸展していた。潰瘍底部は細胞成分・毛細血管に富み、深層部位は細胞成分が減少し瘢痕が成熟しつつあった。本結果は市販の人工真皮であるテルダーミスと同様の結果であった。
　〔実施例８〕
（架橋剤を用いたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来ＤＮＡに脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のＤＮＡ溶液を得た。
　先に調製した濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、濃度５％のＤＮＡ溶液を重量比が８：２となるように添加し、冷蔵下（３℃）攪拌してＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液を得た。このＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide　hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲン、エラスチンおよびＤＮＡの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、ＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、ＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。
　得られたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ－６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であり、孔径は揃っていた（図１０参照）。
　〔実施例９〕
（架橋剤を用いたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来プロタミンに脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のプロタミン溶液を得た。先に調製した濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、濃度５％のプロタミン溶液を重量比が８：２となるように添加し、冷蔵下（３℃）攪拌してプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合液を得た。このプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide　hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲン、エラスチンおよびプロタミンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、プロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、プロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。
　得られたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ－６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であり、孔径は揃っていた（図１１参照）。
　〔実施例１０〕
（架橋剤を用いたヒドロキシアパタイト添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、コラーゲンとエラスチンの合計重量とヒドロキシアパタイト（以下、ＨＡ）の重量比が８：２となるようにＨＡを加え、冷蔵下（３℃）で錬和した。このＨＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide　hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したＨＡ添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、ＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、ＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。
　得られたＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ－６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であった（図１２参照）。
　〔実施例１１〕
（コラーゲン/エラスチン多孔体の軟骨再生分野での利用）
　実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（直径１１ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を用いた。培養液中で脱気処置したコラーゲン／エラスチン多孔体を１０ｃｍ培養皿に設置した。次に培養した軟骨細胞を培養フラスコから回収して細胞数を数え、５×１０６個を５００μＬの培養液中に再懸濁し、細胞培養液とした。この細胞培養液をコラーゲン／エラスチン多孔体に染み込ませ、インキュベーター内で培養を開始した。さらに１２時間後に培養液１０ｍＬを培養皿に注いだ。３日または４日に一度培養液を交換した。培養後１８日目に組織を回収し、これをホルマリン固定した後、パラフィンブロックに包埋・薄切し、組織切片を作成した。組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色、アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、ＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色を行った。
　アルシアンブルー染色（図１３）とトルイジンブルー染色（図１４）により細胞周囲の基質が濃染されたことから、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸などの酸性ムコ多糖類が多く含まれる軟骨基質であると考えられた。またトルイジンブルー染色では、軟骨細胞に特徴的なメタクロマジーが観察された。さらに軟骨基質に特徴的に含まれるＩＩ型コラーゲンを染色するＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色でも濃染されており、細胞周辺に軟骨器質が産生されていることが確認された（図１５）。以上の結果から、コラーゲン/エラスチン多孔体は軟骨細胞培養基材（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）や軟骨再生基材となることが示唆された。
　〔実施例１２〕
（フィルム状の魚類由来コラーゲン／エラスチン複合体の調製）
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８：２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度２０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液にＥＤＣ（架橋剤：１‐Ethyl‐3‐(3-dimethylaminopropyl)‐carbodiimide　hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが０．５％（w／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したこの混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥・固化させた（以上の操作を５℃以下で行った）。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を減圧下で、１８０℃で１時間加熱処理を行った。
　得られたフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を水に浸漬させたところ、一週間以上形状を保持していた（図１６）。
　〔実施例１３〕
（コラーゲン/エラスチン複合体の化粧品基材として利用）
　被験者（２０代～３０代の男性４名）の左前腕を石鹸でよく洗浄し、水洗したのち手を拭き乾かした。洗浄３０分後、左前腕内側３箇所に測定器のプローブを当てる場所に印をつけた。印をつけた部位の粘弾性を皮膚粘弾性測定装置　キュートメーター　ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ+Ｋｈａｚａｋａ社、測定モード１）で測定した（塗布前：０時）。０時測定後、各被験者の３箇所の印のうち、１箇所に市販化粧水を十分に染み込ませたシート状のコラーゲン／エラスチン多孔体を貼り付け、１５分間放置した。なおシート状のコラーゲン／エラスチン多孔体は実施例２と同様に調製した。１５分後、化粧水を含ませたコラーゲン／エラスチン多孔体（ＣＥＳ＋化粧水塗布と略）を剥がすと同時に、印をつけた別の１箇所に化粧水を塗布した。同様にして全４名の被験者に対し、塗布なし部、化粧水塗布部、ＣＥＳ＋化粧水塗布部を作成した。塗布２時間後、印をつけた部位の皮膚粘弾性を上述と同様に測定した。
　各部の塗布前後の皮膚粘弾性値（Ｒ７値）の差を比較したところ、ＣＥＳ＋化粧水塗布部では、塗布なし部と比較して有意に皮膚粘弾性が上昇した（図１７）。またＣＥＳ＋化粧水塗布部の肉眼的所見では異常は認められなかった。以上のようにコラーゲン/エラスチン多孔体は化粧品の効果を高めたことから、化粧品基材として使用可能であった。
　〔実施例１４〕
（フィルム状の魚類由来コラーゲン／エラスチン複合体の調製（２））
　実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８：２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度２０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液とした。この混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥させた（以上の操作を５℃以下で行った）。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を減圧下で、１８０℃で１時間、加熱処理を行い、フィルム状のコラーゲン／エラスチンの架橋物を調製した。
　得られたフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を水に浸漬させたところ、水中で1週間以上形状を保持していた（図１８）。

Claims (30)

  1. 　魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより得られることを特徴とする架橋物。
  2. 　前記魚類が、サケ科、サバ科、アジ科、タラ科またはアイナメ科に属する魚類である請求項１に記載の架橋物。
  3. 　ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１または２に記載の架橋物。
  4. 　魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
    　該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
    　得られた架橋物を乾燥させる工程と、
    を有する製造方法により得られるものである請求項１または２に記載の架橋物。
  5. 前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項４に記載の架橋物。
  6. 　魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
    　該溶液から乾燥物を得る工程と、
    　該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
    を有する製造方法により得られるものである請求項１または２に記載の架橋物。
  7. 　前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項６に記載の架橋物。
  8. 　前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項４乃至７のいずれかに記載の架橋物。
  9. 　前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項４乃至８のいずれかに記載の架橋物。
  10. 　リン酸カルシウムを更に含む請求項４乃至９のいずれかに記載の架橋物。
  11. 　前記架橋物が多孔体として得られる請求項１乃至１０のいずれかに記載の架橋物。
  12. 　前記架橋物がフィルム（膜）として得られる請求項１乃至１０のいずれかに記載の架橋物。
  13. 　魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
    　該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
    　得られた架橋物を乾燥させる工程と、
    を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
  14. 　前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１３に記載の架橋物の製造方法。
  15. 　魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
    　該溶液から乾燥物を得る工程と、
    　該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
    を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
  16. 　前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項１５に記載の架橋物の製造方法。
  17. 　前記架橋物が多孔体として得られる請求項１３乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
  18. 　前記架橋物がフィルム（膜）として得られる請求項１３乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
  19. 　前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項１３乃至１８のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
  20. 　前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１３乃至１９のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
  21. 　リン酸カルシウムを更に含む請求項１３乃至２０のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
  22. 　請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
  23. 　人工真皮である請求項２２に記載の医療用材料。
  24. 　軟骨再生基材である請求項２２に記載の医療用材料。
  25. 　骨再生基材である請求項２２に記載の医療用材料。
  26. 　骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項２５に記載の医療用材料。
  27. 　請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
  28. 　軟骨細胞の培養に適した請求項２７に記載の細胞培養足場材。
  29. 　骨細胞の培養に適した請求項２７に記載の細胞培養足場材。
  30. 　請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
PCT/JP2010/054001 2009-03-27 2010-03-10 エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途 WO2010110067A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/259,267 US20120021063A1 (en) 2009-03-27 2010-03-10 Crosslinked material comprising elastin and collagen, and use thereof
EP10755867.8A EP2412795B1 (en) 2009-03-27 2010-03-10 Crosslinked material comprising elastin and collagen, and use thereof
KR1020117025189A KR101321615B1 (ko) 2009-03-27 2010-03-10 엘라스틴 및 콜라겐을 사용한 가교물 및 그 용도
JP2011505968A JP5060653B2 (ja) 2009-03-27 2010-03-10 エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-079898 2009-03-27
JP2009079898 2009-03-27
JP2009-260000 2009-11-13
JP2009260000 2009-11-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010110067A1 true WO2010110067A1 (ja) 2010-09-30

Family

ID=42780760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/054001 WO2010110067A1 (ja) 2009-03-27 2010-03-10 エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20120021063A1 (ja)
EP (1) EP2412795B1 (ja)
JP (1) JP5060653B2 (ja)
KR (1) KR101321615B1 (ja)
TW (1) TWI433694B (ja)
WO (1) WO2010110067A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011108517A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 富士フイルム株式会社 生体親和性を有する高分子ブロックと細胞からなる細胞構造体
JP2013150648A (ja) * 2012-01-24 2013-08-08 Hoya Corp 人工軟骨の製造方法
WO2015045044A1 (ja) * 2013-09-25 2015-04-02 マルハニチロ株式会社 骨形成用の医療用または歯科用材料
JP2018058789A (ja) * 2016-10-05 2018-04-12 マルハニチロ株式会社 抗菌性及び創傷治癒促進性を有する創傷治癒剤
JP2020526337A (ja) * 2017-07-14 2020-08-31 ラフト エンタープライジズ リミテッド 組織足場

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2004753T3 (da) * 2006-03-13 2010-05-25 Becker & Co Naturinwerk Kollagenpulver og en kollagenbaseret termoplastisk sammensætning til fremstilling af formartikler
KR102398811B1 (ko) * 2012-12-10 2022-05-16 앨러간 파마슈티컬스 인터내셔널 리미티드 확장 가능한 3-차원 탄성 구조물 제조
EP3019187A4 (en) * 2013-07-08 2017-03-15 International Dehydrated Foods, Inc. Compositions prepared from poultry and methods of their use
EP3034103A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-22 Geistlich Pharma AG Collagen Sponge
WO2017205740A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Integra Lifesciences Corporation Process for preparing tissue regeneration matrix
KR102114300B1 (ko) * 2018-04-16 2020-05-22 전남대학교 산학협력단 최소 침습 골연골 재생용 자기 구동 마이크로지지체
CN114146232B (zh) * 2022-02-10 2022-04-19 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 一种抗菌异构多孔膜及其制备方法
CN115747197B (zh) * 2023-01-06 2023-04-21 中国肉类食品综合研究中心 可食用3d打印生物墨水及制备方法和在培育肉中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630616A (ja) 1992-07-18 1994-02-08 Iseki & Co Ltd 田植機の苗供給装置
JP2997823B2 (ja) 1991-08-21 2000-01-11 グンゼ株式会社 コラーゲンスポンジの製造方法
JP3105308B2 (ja) 1991-10-09 2000-10-30 テルモ株式会社 人工皮膚およびその製造法
WO2002096978A1 (fr) 2001-05-30 2002-12-05 Keiichi Miyamoto Elastine reticulee et son procede de production
JP2005095331A (ja) 2003-09-24 2005-04-14 Ihara Suisan Kk 魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途
JP3772232B2 (ja) 1996-09-09 2006-05-10 グンゼ株式会社 組織含有人工真皮及びその製造法
WO2007126411A2 (en) * 2005-07-28 2007-11-08 Carnegie Mellon University Biocompatible polymers and methods of use

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2608321B2 (ja) * 1988-12-20 1997-05-07 三省製薬株式会社 安定なエラスチン加水分解物水溶液
IT1251701B (it) * 1991-10-16 1995-05-19 Angra Srl Soluzione di collagene marino con elastina e relativo metodo di estrazione.
US20030039695A1 (en) * 2001-08-10 2003-02-27 Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemische Industrie Collagen carrier of therapeutic genetic material, and method
FR2801313A1 (fr) * 1999-05-19 2001-05-25 Coletica Produit collagenique contenant du collagene d'origine marine a faible odeur et de preference a proprietes mecaniques ameliorees, ainsi que son utilisation sous forme de compositions ou de produits cosmetiques ou pharmaceutiques
DE10157182A1 (de) * 2001-11-22 2003-06-05 Matricel Gmbh Verfahren zur Behandlung von Materialien biologischen Ursprungs und Elastin-Produkt
JP4680771B2 (ja) * 2003-05-26 2011-05-11 Ｈｏｙａ株式会社 リン酸カルシウム含有複合多孔体及びその製造方法
US8529939B2 (en) * 2003-12-08 2013-09-10 Gel-Del Technologies, Inc. Mucoadhesive drug delivery devices and methods of making and using thereof
JP4078431B2 (ja) * 2004-10-29 2008-04-23 国立大学法人九州工業大学 水溶性エラスチンとその製造方法及びそれを含む食品と医薬

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2997823B2 (ja) 1991-08-21 2000-01-11 グンゼ株式会社 コラーゲンスポンジの製造方法
JP3105308B2 (ja) 1991-10-09 2000-10-30 テルモ株式会社 人工皮膚およびその製造法
JPH0630616A (ja) 1992-07-18 1994-02-08 Iseki & Co Ltd 田植機の苗供給装置
JP3772232B2 (ja) 1996-09-09 2006-05-10 グンゼ株式会社 組織含有人工真皮及びその製造法
WO2002096978A1 (fr) 2001-05-30 2002-12-05 Keiichi Miyamoto Elastine reticulee et son procede de production
JP2005095331A (ja) 2003-09-24 2005-04-14 Ihara Suisan Kk 魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途
WO2007126411A2 (en) * 2005-07-28 2007-11-08 Carnegie Mellon University Biocompatible polymers and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AYAKO HONMURA ET AL.: "Synergistic effect of collagen peptide and elastin peptide derived from salmon on promoting hyaluronic acid production and cell growth of normal human dermal fibroblast cells (SF-TY)", BULLETIN OF THE JAPANESE SOCIETY OF SCIENTIFIC FISHERIES, vol. 75, no. 1, 15 January 2009 (2009-01-15), pages 86 - 88, XP008154599 *
MOTOHIKO TADA ET AL.: "Sake Yurai Elestin Collagen Peptide no Hifu ni Taisuru Koka", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, 5 March 2008 (2008-03-05), pages 281, XP008162677 *
TAKATOSHI YOTSUYANAGI ET AL.: "Sake Yurai Collagen /Elastin Takotai no Tokusei to Igakuteki Oyo", INOBESHON JAPAN 2009 KOSHIKI GAIDO BUKKU, 16 September 2009 (2009-09-16), pages 47, XP008154679 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011108517A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 富士フイルム株式会社 生体親和性を有する高分子ブロックと細胞からなる細胞構造体
US9597432B2 (en) 2010-03-01 2017-03-21 Fujifilm Corporation Cell construct comprising polymer blocks having biocompatibility and cells
JP2013150648A (ja) * 2012-01-24 2013-08-08 Hoya Corp 人工軟骨の製造方法
WO2015045044A1 (ja) * 2013-09-25 2015-04-02 マルハニチロ株式会社 骨形成用の医療用または歯科用材料
US10166313B2 (en) 2013-09-25 2019-01-01 Maruha Nichiro Corporation Medical or dental material for osteogenesis
JP2018058789A (ja) * 2016-10-05 2018-04-12 マルハニチロ株式会社 抗菌性及び創傷治癒促進性を有する創傷治癒剤
WO2018066580A1 (ja) * 2016-10-05 2018-04-12 マルハニチロ株式会社 抗菌性及び創傷治癒促進性を有する創傷治癒剤
JP2020526337A (ja) * 2017-07-14 2020-08-31 ラフト エンタープライジズ リミテッド 組織足場

Also Published As

Publication number Publication date
EP2412795B1 (en) 2016-12-28
EP2412795A1 (en) 2012-02-01
JP5060653B2 (ja) 2012-10-31
KR101321615B1 (ko) 2013-10-23
EP2412795A4 (en) 2014-04-09
KR20110139300A (ko) 2011-12-28
JPWO2010110067A1 (ja) 2012-09-27
US20120021063A1 (en) 2012-01-26
TW201036653A (en) 2010-10-16
TWI433694B (zh) 2014-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5060653B2 (ja) エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途
Rajabi et al. Keratinous materials: Structures and functions in biomedical applications
Gaspar-Pintiliescu et al. Natural composite dressings based on collagen, gelatin and plant bioactive compounds for wound healing: A review
Han et al. Mussel-inspired cryogels for promoting wound regeneration through photobiostimulation, modulating inflammatory responses and suppressing bacterial invasion
JP2834155B2 (ja) コラーゲンフレーク体
Powell et al. EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability
Ruszczak Effect of collagen matrices on dermal wound healing
US9636362B2 (en) Pullulan regenerative matrix
Konop et al. The role of allogenic keratin‐derived dressing in wound healing in a mouse model
WO2011087743A2 (en) Decellularized adipose cell growth scaffold
Kim et al. Fabrication of duck’s feet collagen–silk hybrid biomaterial for tissue engineering
JP2018522824A (ja) 胎盤由来マトリックス並びにその調製方法及び使用
Arasteh et al. Efficient wound healing using a synthetic nanofibrous bilayer skin substitute in murine model
Kim et al. Wound healing properties of a 3-D scaffold comprising soluble silkworm gland hydrolysate and human collagen
CN112870453A (zh) 一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶以及制备方法和应用
JPH1147258A (ja) ゼラチンとコラーゲンとを含有する医用基材
EP1888099B1 (en) Hydratable keratin compositions
Sah et al. Eggshell membrane protein modified silk fibroin-poly vinyl alcohol scaffold for bone tissue engineering: in vitro and in vivo study
JP5839814B2 (ja) Ｄａｎｃｅタンパク質含有徐放基材及び該徐放基材の製造方法
Kirubanandan et al. Regeneration of soft tissue using porous bovine collagen scaffold
Gomase et al. Polymeric Gel Scaffolds and Biomimetic Environments for Wound Healing
JP5935181B2 (ja) 創傷治癒用の生体材料およびその調製
Amirthalingam et al. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications
Muthusamy et al. Collagen-based strategies in wound healing and skin tissue engineering
Chen et al. Enzymatic functionalization of decellularized tilapia skin scaffolds with enhanced skin regeneration

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10755867

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011505968

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13259267

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117025189

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010755867

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010755867

Country of ref document: EP