JP2020526337A - 組織足場 - Google Patents

Abstract

組織足場、および組織足場を作製するための方法が提供される。組織足場は、エラスチンならびに必要に応じてフィブリンおよび／またはコラーゲンを含む。足場中のエラスチンは架橋され得る。架橋されているエラスチンは、好ましくは、可溶化エラスチンを含み、未分画のものである。本発明者らは、新規の経済的な生物学的に活性なエラスチン系材料およびそれらの製造方法を報告する。本発明は、エラスチン、例えば可溶化エラスチンを含む組成物を架橋することによる足場の形成に関する。

Description

本発明は、組織足場、例えばエラスチン系組織足場、およびこのような足場を形成するための方法に関する。

エラスチンは、結合組織、例えば皮膚、脂肪、肺、腱、靭帯、動脈または軟骨に見られる細胞外構造タンパク質である。その主な機能は、伸張または収縮後の組織の形状を保持することであり、耐荷重特性を有する（Ｂａｎｇａ，１９６６；Ｇｒａｙ，１９７３）。インビボでは、エラスチンは、（ＥＬＮ遺伝子によりコードされる）タンパク質トロポエラスチンのアセンブリおよび架橋を通じて、弾性繊維形成のプロセスにより形成される。

トロポエラスチンは、典型的には、多くのＧｌｙ、Ｖａｌ、ＡｌａおよびＰｒｏ残基（これらは、多くの場合、いくつかのアミノ酸の反復、例えばＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＶａｌおよびＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏで存在する）を有する疎水性ドメインと、多くのＬｙｓおよびＡｌａ残基（これらは、架橋において重要である）を有する疎水性ドメインとからなる。トロポエラスチンの架橋によるエラスチンの形成は、リシルオキシダーゼにより促進される。

エラスチンは、ヒトにおいて最も安定な常駐タンパク質の１つであり、７４年間の半減期を有する。その優れた構造的および生物学的特性は、組織工学用途で注目されている（Ｄａａｍｅｎら、２００７）。例えば、エラスチンは弾性を組織および臓器に提供し、弾性が最も重要である場所、例えば血管、靭帯、肺、皮膚において豊富である。しかしながら、エラスチンは非常に不溶性のタンパク質であるので、生体材料としてそれを使用することが依然として課題である（Ｌｅａｃｈら、２００５）。

この課題を克服するために、シュウ酸による加水分解後に得られる可溶性エラスチンの一形態であるα−エラスチンについて、多くの既存の戦略が開発されている。しかしながら、このプロセスは高価で時間がかかり、総収量は最小である。その結果として、足場へのその臨床応用は疑問がある。

いくつかの研究では、不溶性エラスチンを他の材料、例えばコラーゲンと混合することが報告されている（Ｒｙａｎ ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，２０１５）。しかしながら、得られる足場は、コラーゲンそれ自体と比較して弱い機械的特性および変化した生物学的反応を有する。

本発明者らは、新規の経済的な生物学的に活性なエラスチン系材料およびそれらの製造方法を報告する。

本発明は、エラスチン、例えば可溶化エラスチンを含む組成物を架橋することによる足場の形成に関する。

本発明はまた、架橋エラスチンを含む組織足場に関する。

本発明によれば、組織足場を形成するための方法であって、可溶化エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、組成物を架橋することを含む方法であって、前記組成物が、エラスチンを可溶化し得る可溶化剤と接触されたエラスチンを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを、エラスチンを可溶化することができる可溶化剤と接触させること；およびｂ）工程ａ）において形成されたエラスチン組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、架橋可溶化エラスチンを含む組織足場が提供される。

エラスチンは、天然源から抽出され得るかまたはそれに由来し得る。例えば、エラスチンは、哺乳動物供給源に由来し得る。哺乳動物供給源は、ウシ供給源、例えばウシ頸部靭帯またはヒト供給源であり得る。あるいは、エラスチンは、組換えエラスチンであり得る。

エラスチンは、鎖間架橋により、非常に不溶性のタンパク質である。しかしながら、それは可溶化され得る（Ｄａａｍｅｎ（２００７））。可溶化エラスチンは、加水分解エラスチンまたはエラスチンペプチドとも称される。

エラスチンを可溶化する一般的な方法は、それを０．２５Ｍシュウ酸により１００℃で処理するか、またはそれを８０％エタノール中１Ｍ ＫＯＨで処理することを含む。加えて、弾性繊維を分解することができるタンパク質分解酵素（多形核白血球由来のセリン型エラスターゼおよび単球／マクロファージ起源のいくつかのメタロエラスターゼを含む）もまた、可溶化エラスチンをもたらす。エラスチンの加水分解形態の例は、以下の表に示されている。

シュウ酸加水分解後に得られるエラスチンペプチドを、酢酸でｐＨ５．５に設定された１０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウムへの懸濁後にコアセルベートし、３７℃で加熱および遠心分離し得る。この結果として、２つの画分（α−エラスチン（粘性コアセルベート）およびβ−エラスチン（上清中））が形成される。

先行技術は、他の成分、例えばコラーゲンと組み合わせて不溶性エラスチンを使用することに主に焦点を当てているか、またはシュウ酸による加水分解およびβ−エラスチンからの分離後に得られるα−エラスチン可溶性成分に焦点を当てている。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、エラスチンの可溶化およびその可溶化工程の生成物の架橋が、有望で費用効果の高い組織足場を形成し得ることを見出した。このため、α−エラスチンおよびβ−エラスチンの分離または単離など、エラスチンの画分を分離または単離する必要がない。したがって、架橋された可溶化エラスチンは、粗製または未分画のものであると考えられ得る。有利なことに、本発明は、α−エラスチン画分の単離に関連する時間、不都合および費用を回避し得る。α−エラスチンおよびβ−エラスチンを分離する工程が回避され得るので、本発明はまた、総収量を改善し得る。

本発明によれば、組織足場を形成するための方法であって、未分画可溶化エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法であって、前記エラスチンが未分画のものであり、前記エラスチンが可溶化エラスチンを含む方法が提供される。前記方法は、エラスチンを、エラスチンの少なくとも一部を可溶化することができる可溶化剤と接触させ、次いで、得られた組成物を架橋することを伴い得る。

したがって、未分画エラスチンは、１つまたはそれを超えるエラスチン画分が精製、単離、分離もしくは精錬されていない粗製エラスチンであり得るか、またはエラスチンと可溶化剤との接触から生じる１つまたはそれを超える異なる形態のエラスチンであり得る。例えば、１つもしくはそれを超える可溶性エラスチン画分が単離されなくてもよいし、または可溶性エラスチン画分から不溶性エラスチン画分が分離されなくてもよい。その結果として、組成物は、異なる可溶性形態のエラスチンを含み得る。組成物は、可溶化されていないエラスチンを含み得る。したがって、組成物は、可溶性形態および不溶性形態の両方のエラスチンを含み得る。例えば、可溶化剤との接触後、エラスチンは遠心分離に供されなくてもよい。可溶化剤との接触後、エラスチンは、分画、精製、単離、分離または精錬されなくてもよい。

驚くべきことに、本発明者らは、エラスチンの分画を必要とせずに、有効なエラスチン系組織足場を形成し得ることを認識し、エラスチンの１つまたはそれを超える画分が単離され、続いて、単離された画分を使用して足場を形成する。例えば、本発明は、α−エラスチン画分の単離および利用を必要としなくてもよい。有利なことに、本発明は、エラスチンを分画するための従来の工程、例えば遠心分離および／またはコアセルベーションを必要としなくてもよい。また有利なことに、可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンの両方を含む組成物が使用され得る。これは、公知の方法よりも大きな利益を提供し得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３６９７７号は、遠心分離を伴う水溶性エラスチンの単離を必要とする。日本特許出願公開２０１４１８３８８６号は、遠心分離を伴う不溶性エラスチンの一連の酸分画を必要とする。

本発明は、例えば、リジルオキシダーゼによるトロポエラスチンの架橋によるトロポエラスチンの架橋を含む方法、またはこのような方法の生成物を包含しない。

本発明の方法は、エラスチンを可溶化する工程を含み得る。これは、エラスチンを、エラスチンの少なくとも一部を可溶化することができる可溶化剤と接触させることを伴い得る。このため、本発明は、ａ）エラスチンを可溶化して、未分画可溶化エラスチンを含む組成物を形成すること；ｂ）工程ａ）から得られた生成物を架橋することを含む方法を提供し得る。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化して、可溶化エラスチンを含む組成物を形成すること；ｂ）工程ａ）から得られた組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化剤と接触させて、可溶化エラスチンを含む組成物を形成すること；ｂ）工程ａ）から得られた組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、可溶化剤と接触されたエラスチンを架橋することを含む方法であって、前記エラスチンが分画されていない方法が提供される。

本発明によれば、エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法であって、前記エラスチンが、未分画のものであってかつ可溶化エラスチンを含む、方法が提供される。

本発明によれば、架橋未分画可溶化エラスチンを含む組織足場が提供される。

本発明によれば、架橋エラスチンを含む組織足場であって、架橋エラスチンを含む前記組成物が、可溶化エラスチンを含むエラスチンを含む製剤を架橋することにより形成されたものであり、前記エラスチンが分画されていない組織足場が提供される。

本発明によれば、架橋エラスチンを含む組織足場であって、前記エラスチンが可溶化剤と接触されており、分画されていない組織足場が提供される。

足場は、１〜２０％（ｗ／ｖ）エラスチン、例えば５〜１５％（ｗ／ｖ）エラスチン、例えば約１０％（ｗ／ｖ）エラスチンを含む溶液から調製され得る。

好ましくは、エラスチンは、酸、最も好ましくはシュウ酸との接触により可溶化されるかまたは可溶化されている。

本発明によれば、エラスチンを可溶化する方法であって、エラスチンを、エラスチンの少なくとも一部を可溶化することができる可溶化剤と接触させることを含む方法が提供される。可溶化剤は、好ましくは酸、より好ましくはシュウ酸である。

本発明によれば、エラスチンを可溶化する方法であって、エラスチンを酸、好ましくはシュウ酸と接触させることを含む方法が提供される。

特に好ましい実施形態では、エラスチンは、１００℃未満の温度、好ましくは５０℃未満またはそれに等しい温度、より好ましくは１５〜３０℃の温度、例えば室温で可溶化される。

酸、好ましくはシュウ酸は、１Ｍ未満、好ましくは０．７５Ｍ未満、より好ましくは０．５Ｍまたは０．５Ｍ未満であり得る。酸は、少なくとも０．２５Ｍであり得る。例えば、酸は、０．２Ｍ〜１Ｍ、例えば０．２５Ｍ〜０．７５Ｍであり得る。

本明細書に記載されるエラスチンを可溶化する方法は、シュウ酸を使用する確立されたエラスチン可溶化方法とは対照的である。シュウ酸を使用する従来のエラスチン可溶化方法は、１００℃で行われる（例えば、Ｄａａｍｅｎら、（２００７）を参照のこと）。しかしながら、本発明者らは、本発明の足場を形成するための有効な可溶化が１００℃未満の温度で起こり得ることを見出した。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、１００℃未満の温度におけるシュウ酸による処理が、α−およびβ−エラスチンを含む混合物の形成をもたらし得ると仮定した。この場合、本発明の方法は、α−およびβ−エラスチンの架橋を含み得、本発明の足場は、架橋α−およびβ−エラスチンを含み得る。有利なことに、本発明者らは、α−エラスチン画分を単離するなど、可溶化画分を分離する必要がないこと、および可溶化エラスチンの粗混合物または未分画混合物を使用して、有効な足場を形成し得ることを認識した。

未分画可溶化エラスチンなどの可溶化エラスチンを含む組成物は、可溶化されていないいくつかのエラスチンを含み得ると認識される。したがって、組成物は、不溶性エラスチンおよび可溶性エラスチンの混合物を含み得る。

したがって、本発明は、可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法を提供し得る。したがって、本発明は、架橋エラスチンを含む組織足場であって、前記エラスチンが可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンを含む組織足場を提供し得る。

驚くべきことに、本発明者らは、有効な組織足場を取得するために、架橋すべきエラスチンの完全な可溶化が不要であり得ることを認識した。

本発明によれば、不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法が提供される。

本発明によれば、架橋不溶性エラスチンを含む組織足場が提供される。

可溶化または酸との接触は、好ましくは、少なくとも３０秒間、より好ましくは少なくとも１分間行われる。例えば、可溶化または酸との接触は、約１〜３分間行われ得る。可溶化または酸との接触は、最大５分間行われ得る。これは、シュウ酸による従来のエラスチン処理（これは、典型的には約１時間行われる）とは対照的である（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３６７７７号を参照のこと）。

本発明によれば、エラスチンを酸、好ましくはシュウ酸と接触させることを含む方法が提供される。好ましくは、酸との接触は、１００℃未満の温度、最も好ましくは５０℃未満またはそれに等しい温度、より好ましくは１５〜３０℃の温度、例えば室温または周囲温度で行われる。前記方法は、得られた生成物を架橋することをさらに含み得る。

本発明によれば、組織足場を形成する方法であって、α−エラスチンおよびβ−エラスチンを含む組成物を架橋することを含む方法が提供され得る。

本発明によれば、α−エラスチンおよびβ−エラスチンを含む架橋組成物を含む組織足場が提供され得る。

架橋は、当業者に一般的に公知の多くの架橋剤または架橋技術、例えば化学的方法、放射線法およびデヒドロサーマル法のいずれか１つを使用して起こり得る。

本明細書における「架橋」への言及は、共有結合的架橋に関する。好ましくは、架橋は、化学架橋剤を使用して非酵素的に達成される。

架橋は、可溶化剤（例えば、シュウ酸などの酸）の存在下で起こり得る。このため、本発明は、エラスチン、可溶化剤および架橋剤を含む組成物を提供し得るかまたはそれを使用し得る。

適切な化学架橋剤の例としては、カルボジイミドカップリング剤、例えばＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アジドカップリング剤；ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサムエチレンジイソシアネート；エポキシド架橋剤、例えばエピクロルヒドリン、グリシジルエーテルおよびグリシジルアミン；ならびにアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールが挙げられる。

化学架橋剤は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含み得る。

化学架橋剤は、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールを含み得る。アルデヒド架橋剤は、改善された生体適合性を細胞外マトリックス組成物に提供するという利点を有し得る。好ましい実施形態では、アルデヒド架橋剤はグルタルアルデヒドである。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用は、他のアルデヒドよりも迅速に最適架橋密度をもたらすという利点を提供し得、比較的高い密度の架橋を達成することもできる。好ましい例では、化学架橋剤はグルタルアルデヒドである。

架橋工程の間、架橋剤は、約０．２〜５％（ｖ／ｖ）、例えば０．５〜３％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５〜１．５％（ｖ／ｖ）、例えば１％（ｖ／ｖ）の量で存在し得る。

架橋剤がグルタルアルデヒドまたはＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む場合、本発明の方法は、毒性軽減剤（例えば、リジンまたは水素化ホウ素ナトリウム）の添加をさらに含み得る。

可溶化エラスチンを含む組成物を架橋する工程は、２０℃〜５０℃、好ましくは約３７℃の温度で行われ得る。架橋剤との接触またはインキュベーションは、典型的には、１分間〜２４時間（例えば、４時間）実施され得る。例えば、架橋は、約１時間または少なくとも１時間行われ得る。架橋は、ＣＯ_２、例えば少なくとも２％ＣＯ_２（体積で）、例えば２〜１０％ＣＯ_２（体積で）または約５％ＣＯ_２（体積で）の存在下で行われ得る。

本発明によれば、エラスチンと、エラスチンを可溶化するための可溶化剤と、架橋剤とを含む組成物が提供される。

本発明の方法は、可溶化エラスチンを含む組成物をキャストすることを含み得る。キャストは、可溶化エラスチンを含む組成物を所定の形状の型に適用することを含み得る。キャストは、架橋前またはその間に起こり得る。

本発明の方法は、架橋後に凍結乾燥を含むことが好ましい。例えば、組成物を−８０℃で、好ましくは一晩凍結し、次いで、約４８時間凍結乾燥させ得る。好ましくは、凍結乾燥は少なくとも２４時間行われる。

本発明によれば、架橋エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。本発明によれば、可溶化架橋エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。例えば、架橋未分画可溶化エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。

本発明によれば、組織足場を形成する方法であって架橋エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含み、架橋エラスチンを含む前記組成物が、可溶化エラスチンを含む未分画のエラスチンを含む製剤を架橋することにより形成されたものである方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた可溶化エラスチンを架橋すること；およびｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた未分画可溶化エラスチンを架橋すること；およびｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを、エラスチンを可溶化することができる可溶化剤と接触させて、可溶化エラスチンを含む組成物を形成すること；およびｂ）工程ａ）において生産された組成物を架橋すること；およびｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供される。

本発明によれば、凍結乾燥架橋エラスチンを含む組織足場が提供される。

本発明によれば、凍結乾燥架橋可溶化エラスチンを含む組織足場が提供される。

本発明によれば、凍結乾燥架橋未分画可溶化エラスチンを含む組織足場が提供される。

本発明によれば、架橋α−エラスチンおよびβ−エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む方法が提供され得る。

本発明によれば、凍結乾燥架橋α−エラスチンおよびβ−エラスチンを含む組織足場が提供され得る。

本発明によれば、凍結乾燥架橋エラスチンを含む組織足場であって、前記架橋エラスチンが、可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することにより形成されたものである組織足場が提供され得る。

本発明の方法は、洗浄またはクリーニングして、可溶化および／または架橋に関与する薬剤を除去することを含み得る。洗浄は、好ましくは、可溶化後に行われる。特に架橋剤がアルデヒド架橋剤を含む場合、これは、還元剤との接触または還元剤による洗浄を含み得る。洗浄は、超音波クリーニングを含み得る。例えば、足場は、超音波クリーナーで水を使用して洗浄され得る。

還元剤の存在は架橋プロセスを安定化し、増強された生物学的有効性を有する足場をもたらし得る。さらに、還元剤の存在は、組成物からの非還元架橋剤の浸出により引き起こされる細胞毒性効果を減少させる可能性がある。

適切な還元剤の例としては、水素化ホウ素ナトリウムまたは類似のカルボニル基反応性を有する薬剤が挙げられる。還元剤は、典型的には、０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ（例えば、約１％ｗ／ｖ）の量で添加され得る。

洗浄して、可溶化および／または架橋に関与する薬剤を除去する工程は、少なくとも５時間、好ましくは少なくとも８時間行われ得る。例えば、シュウ酸および未結合グルタルアルデヒドを除去するために、足場は、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）で約８時間洗浄され得る。好ましくは、足場は、還元剤と接触されながら撹拌または振盪される。

還元剤との接触後、水、例えば蒸留水および／またはエタノールで洗浄することを伴い得るさらなる洗浄工程があり得る。これは、残存する未結合架橋剤またはシュウ酸を除去するために役立ち得る。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた可溶化エラスチンを含む組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させること；およびｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄することを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた未分画可溶化エラスチンを含む組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させること；およびｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄することを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを、エラスチンを可溶化することができる可溶化剤と接触させること；ｂ）工程ａ）から得られた組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）から得られた生成物を凍結乾燥させること；およびｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄することを含む方法が提供される。

洗浄後、足場は滅菌され得る。いくつかの実施形態では、滅菌は、足場をエタノールおよびＰＢＳで洗浄することを伴う。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させること；ｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄すること；およびｅ）工程ｄ）の生成物を滅菌することを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化すること；ｂ）工程ａ）から得られた未分画可溶化エラスチンを含む組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させること；ｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄すること；およびｅ）工程ｄ）の生成物を滅菌することを含む方法が提供される。

本発明によれば、ａ）エラスチンを可溶化剤と接触させること；ｂ）ａ）により生産された組成物を架橋すること；ｃ）工程ｂ）の生成物を凍結乾燥させること；ｄ）工程ｃ）の生成物を洗浄すること；およびｅ）工程ｄ）の生成物を滅菌することを含む方法が提供される。

好ましくは、本発明の足場は滅菌されている。

本発明によれば、本発明による方法により取得されたかまたは取得可能な組織足場が提供される。

いくつかの実施形態では、本発明の足場はヒドロゲルではない。

本発明の方法および足場はまた、エラスチン誘導体または断片、例えば合成エラスチン配列系材料またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）に適用可能であると想定される。ＥＬＰは、重要な反復エラスチン配列に基づく生体高分子である。例えば、ＥＬＰは、Ｖａｌ、Ｇｌｙおよび／またはＰｒｏを含むペンタペプチドまたはヘキサペプチドなどの反復ペプチドを有し得る。ＥＬＰは、ペンタペプチド反復ＶＰＧＸＧ（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）である）を使用して、エラスチンの弾性特性を有し得る（Ｚｈａｎｇら、（２０１５），Ｄａａｍｅｎ（２００７））。

本発明によれば、エラスチン誘導体または断片を架橋することを含む方法が提供され得る。

本発明によれば、架橋エラスチン誘導体または断片を含む組織足場が提供され得る。

本発明によれば、架橋エラスチン誘導体または断片を凍結乾燥させることを含む方法が提供され得る。

本発明によれば、凍結乾燥架橋エラスチン誘導体または断片を含む組織足場が提供され得る。

本発明の足場は、他の細胞外マトリックス成分を含み得る。

本発明の足場は、コラーゲンを含み得る。その結果として、本発明によれば、エラスチンおよびコラーゲンを含む足場が提供される。

本発明の足場は、フィブリンを含み得る。その結果として、本発明によれば、エラスチンおよびフィブリンを含む足場が提供される。

本発明の足場は、コラーゲンおよびエラスチンを含み得る。その結果として、本発明によれば、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンを含む足場が提供される。

好ましくは、エラスチンは可溶化されている。好ましくは、エラスチンは、未分画可溶化エラスチンである。エラスチンは未分画のものであり得る。エラスチンは、可溶化エラスチンを含み得る。エラスチンは、不溶性エラスチンを含み得る。

本発明の足場は、エラスチンを含む組成物を、ａ）コラーゲンを含む組成物および／またはｂ）フィブリンを含む組成物と混合することにより形成され得る。

コラーゲンを含有する組成物は、コラーゲンヒドロゲルを含み得る。例えば、コラーゲンヒドロゲルは、標準的な手順により形成され得る。８０％ラット尾コラーゲンタイプＩおよび１０×最小必須培地を使用して、コラーゲンヒドロゲルを調製し、５Ｍおよび１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して中和し、１０×ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を添加し得る。

フィブリンを含有する組成物は、フィブリンゲルを含有し得る。フィブリンゲルは、標準的な手順により形成され得る。１ｍｌのＰＢＳに溶解した２％フィブリノゲンを用いてフィブリンゲルを調製し、次いで、０．１Ｍ ＣａＣｌ_２と共に１％トロンビンを添加し得る。

本発明によれば、エラスチンを含む組成物（好ましくは、未分画可溶化エラスチンを含む組成物）を、コラーゲン（好ましくはコラーゲンヒドロゲル）を含む組成物および／またはフィブリン（好ましくはフィブリンゲル）を含む組成物と混合することを含む方法が提供される。

本発明によれば、エラスチン（好ましくは未分画可溶化エラスチン）、コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む組成物が提供される。組成物は、架橋剤を含み得る。

エラスチンを含む組成物は、好ましくは、架橋工程の前に、コラーゲンを含む組成物および／またはフィブリンを含む組成物と混合される。その結果として、得られる足場は、架橋エラスチン、架橋コラーゲンおよび／または架橋フィブリンを含み得る。

本発明によれば、エラスチンと；エラスチンを可溶化するための可溶化剤と；架橋剤と；フィブリンおよび／またはコラーゲンとを含む組成物が提供される。

架橋は、本明細書で既に記載されているように進行し得る。例えば、架橋剤はグルタルアルデヒドを含み得、ＣＯ_２の存在下で行われ得る。架橋剤は、エラスチン、コラーゲンおよび／またはフィブリノゲンを含む組成物に添加され得る。あるいは、架橋剤は、組成物を混合する前に、エラスチンを含む組成物、コラーゲンを含む組成物および／またはフィブリノゲンを含む組成物に添加され得る。例えば、エラスチンを含む組成物は、架橋剤を含み得る。エラスチンを含む組成物中の架橋剤の濃度は、エラスチンを含む組成物を、コラーゲンを含む組成物および／またはフィブリンを含む組成物と混合する場合に、濃度が、架橋が起こるために望ましいレベル（例えば、約１％ｖ／ｖ）であるようなレベル（例えば、３体積％）であり得る。

架橋の前に、組成物は、本明細書に記載されるようにキャストされ得る。

架橋が行われたら、足場は、本明細書に記載されるように凍結乾燥および／または洗浄され得る。

エラスチン、コラーゲンおよび／またはフィブリノゲンの相対量は、異なる構造的特性、機械的特性および生分解特性を得られる足場に付与するように調整され得る。例えば、高い割合のエラスチンを含有する足場は、低い割合のエラスチンを有する足場と比較して高密度の構造ネットワーク、高い弾性および遅延した分解をもたらし得る。フィブリンの量の増加は機械的強度を増加させ、生分解速度を加速させ得る。コラーゲンの量の増加もまた、生分解速度を加速させ得る。エラスチン、コラーゲンおよび／またはフィブリノゲンの特定の組み合わせの使用はまた、足場の血管新生特性の増強を可能にし得る。

本発明によれば、医薬として使用するための本発明の組織足場が提供される。

本発明によれば、組織治癒、再生または修復を促進する方法であって、本発明の組織足場を患者に適用することを含む方法が提供される。例えば、足場は、創傷治癒または組織移植片（例えば、皮膚移植片）において使用され得る。本発明の足場は、軟組織再生または修復、例えば皮膚再生または血管組織再生に特に適用可能であり得る。例えば、足場は、脂肪、皮膚、血管移植片、心臓弁または肺組織工学において使用され得る。

本発明によれば、組織治癒、再生または修復の促進において使用するための本発明の組織足場が提供される。

本発明によれば、組織治癒、再生または修復を促進するための医薬の製造における本発明の組織足場の使用が提供される。

本発明は、図面を参照して本明細書に実質的に記載される方法を提供し得る。

本発明は、図面を参照して本明細書に実質的に記載される組織足場を提供し得る。

本発明によれば、細胞が播種された本明細書に記載される足場が提供される。足場は、インビトロまたはエクスビボのものであり得る。細胞は、幹細胞、例えばヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）であり得る。

本発明によれば、本発明の足場に細胞を播種することを含む方法が提供される。

本発明によれば、本明細書で定義される足場を含む細胞または組織培養物が提供され得る。

本発明の足場は、１２０μｍ未満の平均細孔径を有し得る。本発明の足場は、１００μｍ未満の平均細孔径を有し得る。本発明の足場は、１０μｍまたはそれを超える平均細孔径を有し得る。本発明の足場は、２０μｍまたはそれを超える平均細孔径を有し得る。例えば、本発明の足場は、１０〜１２０μｍの平均細孔径を有し得る。本発明の足場は、２０〜１００μｍの平均細孔径を有し得る。

細孔径分布は、コラーゲンおよび／もしくはフィブリンをエラスチンに含めることにより、または各成分の相対量を変更することにより変化され得る（例えば、図１４および１５を参照のこと）。

本発明の足場は、８０μｍまたはそれ未満のモード細孔径を有し得る。例えば、モード細孔径は、６０μｍまたはそれ未満であり得る。モード細孔径は、１μｍまたはそれを超え得る、例えば１０μｍもしくはそれを超え得るかまたは２０μｍもしくはそれを超え得る。例えば、モード細孔径は、１〜８０μｍ、例えば１〜６０μｍ、２０〜６０μｍまたは１〜６０μｍの範囲であり得る。

一例では、モード細孔径は、１〜２０μｍの範囲であり得る。別の例では、モード細孔径は、２０〜４０μｍの範囲であり得る。一実施形態では、モード細孔径は、４０〜６０μｍの範囲であり得る。

足場の特徴、例えば細孔径および孔隙率は、容易に利用可能な適切なソフトウェアを使用して計算され得る。例えば、ＮＤ（「Ｎｅａｒｅｓｔ Ｄｉｓｔａｎｃｅ」）は、前記平均サイズ、および多孔質足場中の細孔とそれらの最近傍との間の距離を計算するために開発されたＩｍａｇｅＪプラグインである（Ｈａｅｒｉら、（２０１５））を参照のこと）。ＤｉａｍｅｔｅｒＪは、細孔パラメータを測定するために使用され得るＩｍａｇｅＪプラグインの別の例である。足場の顕微鏡画像（例えば、ＳＥＭ画像）は、インプットとして使用され得る。

本発明の足場の全孔隙率は、少なくとも２５％であり得る。例えば、全孔隙率は、少なくとも４０％であり得る。

本発明の例は、添付の図面を参照してほんの一例として記載される。

図１は、不溶性エラスチン（Ａ）を０．５Ｍシュウ酸と混合し（Ｂ）、１％ＧＴＡで架橋し、３７℃で１時間インキュベートし（Ｃ）、−８０℃で一晩凍結し（Ｄ）、４８時間凍結乾燥させた（Ｅ）エラスチン足場製造プロセスを示す； 図１は、架橋剤なし（Ａ）または架橋剤あり（Ｂ）で製造した足場を示す； 図２は、ＰＢＳ中で２８日経過後における架橋剤なし（Ａ）および架橋剤あり（Ｂ）の足場安定化研究を示す； 図３は、足場上で成長する脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）に関する１（Ａ）、３（Ｂ）および７日目（Ｃ）のｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイを示し、緑色の点は生細胞を示す； 図４は、１、３および７日目におけるａｌａｍａｒ ｂｌｕｅを使用した細胞増殖アッセイを示す； 図６は、エラスチン足場の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す； 図７は、異なる複合足場（３Ａ＝コラーゲン／エラスチン／フィブリン２：１：１；３Ｂ＝エラスチン／コラーゲン／フィブリン２：１：１；３Ｃ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン２：１：１；３Ｄ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン１：１：１）に関する１、３および７日目のｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイを示す； 図８は、複合足場（３Ａ＝コラーゲン／エラスチン／フィブリン２：１：１；３Ｂ＝エラスチン／コラーゲン／フィブリン２：１：１；３Ｃ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン２：１：１；３Ｄ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン；１：１：１）に関する細胞増殖アッセイ（ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ活性）を示す； 図９は、個々の各組み合わせＡ）３Ａ＝コラーゲン／エラスチン／フィブリン２：１：１、Ｂ）３Ｂ＝エラスチン／コラーゲン／フィブリン２：１：１、Ｃ）３Ｃ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン２：１：１、Ｄ）３Ｄ＝フィブリン／コラーゲン／エラスチン１：１：１のフィブリルネットワークおよび細孔構造の差異を示すＳＥＭ画像を示す； 図１０は、０秒（Ａ）、４秒（Ｂ）、９秒（Ｃ）時点のエラスチン足場のぬれ性および水接触角毎秒測定（Ｄ）を示す； 図１１は、エラスチン系足場の水接触角毎秒測定を示す； 図１２は、一定期間にわたるエラスチン足場の加速分解プロファイルを示す； 図１３は、エラスチン系複合足場の加速分解プロファイルを示す； 図１４は、エラスチン足場のＳＥＭ画像（５０倍および１０００倍）および０〜１２０＋μｍの細孔％を示す； 図１５は、エラスチン系複合足場の細孔径パターンを示す； 図１６は、エラスチン足場の機械的試験を示す：試験前足場（Ａ）、試験後足場（Ｂ）、足場の応力分布（Ｃ）およびエラスチン足場の破壊強度（Ｄ）（＊＊＊は、ｐ＜０．０００１の統計的有意性を示す）； 図１７は、エラスチン系複合足場の機械的特性を示す； 図１８は、胚（ＥＤ）１２日目のエラスチン足場の絨毛尿膜（ＣＡＭ）の発達（Ａ）、総血管面積（Ｂ）、ＣＡＭ分析のための処理画像（Ｃ）および分枝点の数（Ｄ）を示す； 図１９は、エラスチン系複合足場の血管面積（％）を示す； 図２０は、エラスチン足場の遺伝子発現プロファイルを示す； 図２１は、エラスチン系複合足場の遺伝子発現プロファイルを示す； 図２２は、エラスチン／コラーゲン足場とエラスチン／フィブリン足場との間の膨張比の差異を示す； 図２３は、エラスチン／コラーゲン足場とエラスチン／フィブリン足場との間の分解プロファイルの差異を示す； 図２４は、ＳＥＭを使用したエラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場の微細構造を示す； 図２５は、エラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場の細孔径分布を示す； 図２６は、エラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場のｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイの結果を示す；ならびに 図２７は、１２日目のエラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場の血管面積を示す。

実施例１−エラスチン足場
製造方法および材料
不溶性のエラスチン粉末は、Ｓｉｇｍａから入手した（エラスチンの供給源は、ウシ頸部靭帯に由来していた）（図１Ａ）。１００ｍｇの不溶性エラスチン粉末を１ｍｌの（新たに調製した）０．５Ｍシュウ酸（Ｃ_２Ｈ_２Ｏ_４）と室温で混合した（図１Ｂ）。

タンパク質を架橋するために、ホモ二官能性架橋剤である１％グルタルアルデヒド（ＧＴＡ）（ｖ／ｖ）を溶液に添加した（図１Ｃ）。溶液を２４ウェルプレートのウェルにキャストし、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした（図１Ｃ）。

混合物を−８０℃で一晩凍結し（図１Ｄ）、４８時間凍結乾燥させて、足場を形成した（図１Ｅ）。

製造した足場を室温にし、ｐＨ＝１０．４の０．１Ｍグリシン緩衝液で洗浄し（各１５分間の２回の洗浄）、トリス−グリシン緩衝液で１５分間洗浄した。過剰のシュウ酸および未結合グルタルアルデヒドを除去するために、足場をシェーカー上、０．１％ｗ／ｖ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）（還元剤）で約８時間洗浄した。

続いて、足場を蒸留温水（６０℃）で１５分間洗浄し、蒸留水でそれぞれ３０分間にわたって２回洗浄して、足場から残存未結合グルタルアルデヒドを除去した。

滅菌のために、足場を７０％エタノールで１５分間洗浄し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。
構造完全性および安定性

製造した架橋エラスチン足場は損なわれていなかった（図２Ｂ）。しかしながら、非架橋足場は破壊／分解された（図２Ａ）。

ＰＢＳ中、３７℃および５％ＣＯ_２で２８日間の架橋ありおよび架橋なしの足場を比較することにより、インビトロ足場安定化研究を行った。ＰＢＳ中では、２８日後に非架橋足場（図３Ａ）は解体／分解されたが、対照的に、架橋足場は損なわれていなかったことが見出された（図３Ｂ）。これは、この製造方法が一体的な足場を有効に生成したことを示している。
生物学的活性

足場の有効性および生物学的活性を評価するために、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を標準的な培養条件下で培養した（すなわち、２％ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ（商標）成長サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＫ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を補充したＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ（商標）基本細胞培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＫ）中、３７℃、５％ＣＯ_２におけるインキュベーション）。５００００個の細胞を直径６ｍｍの足場に播種し、１、３および７日間培養した。それぞれｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイおよびａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイを使用して、細胞の生存および成長を研究した。ＡＤＳＣは生存しており、１日目までに足場に接着し、３および７日目に非凝集形態を示した（図４）。加えて、細胞は非凝集挙動を維持し、紡錘体形態構造を示したが（図４）、これは、それらが、培養期間中にそれらの幹特性を保持していることを示唆している。

ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ活性、細胞代謝アッセイにより、細胞増殖を定量的に測定し、１、３および７日目に分光光度計を使用して、５７０ｎｍの吸光度を測定した（ｎ＝３／各時点）（図５）。
走査電子顕微鏡法

超音波クリーナーによりエラスチン足場を蒸留水で３分間洗浄して塩を除去し、凍結乾燥機で２４時間乾燥させた。足場をスタブにマウントし、真空下においてカーボンでスパッタコーティングした。５ｋＶで作動させたＰｈｉｌｉｐｓ ＸＬ ３０ Ｆｉｅｌｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ＳＥＭの二次電子検出器を使用して、すべての画像を取得し、平均作動距離は１０ｍｍであった。

図６Ａおよび６ＢのＳＥＭ画像は、エラスチン足場が均一な構造を有し、多孔質性であることを示す。図６Ａは５０倍の倍率であり、図２は２５０倍の倍率である。
考察

本出願の優先日時点では、５ｍｇのウシ頸部靭帯由来不溶性エラスチンは６９．７０イギリスポンド（Ｅ１６２５）であるのに対して、１ｍｇの可溶性α−エラスチンは、商業供給業者のＳｉｇｍａ（商標）からだと２７２．５０イギリスポンド（Ｅ６５２７）かかるので、これは、非常に費用効果が高くて時間効率の良いエラスチン足場製造方法である。

ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイの結果により、細胞が紡錘体形態構造（これは、ＡＤＳＣの特徴の１つである）を維持していたことが示された。本発明の範囲内のエラスチン足場を使用することにより、ＡＤＳＣは接触阻害挙動（Ｍａｊｄら、２０１１）を有するので、本発明者らは、７日目まで接触阻害挙動を維持することができた（図４）。この細胞形態は、いかなる分化も受けずに、ＡＤＳＣ表現型および多能性特徴を維持し得る（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｋｉｌｉａｎ，２０１３）。ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ吸光度の増加は、一定の細胞増殖の指標である。これらの結果はまた、製造した足場が細胞に対して非毒性であったことを示している。
実施例２−エラスチン／コラーゲン／フィブリン足場
製造方法および材料

チューブ１：エラスチン粉末（９．７％ｗ／ｖ）＋０．５Ｍシュウ酸＋３％グルタルアルデヒド（ｗ／ｖ）。

チューブ２：コラーゲンヒドロゲル−８０％ラット尾コラーゲンタイプＩ（ｖ／ｖ）（Ｆｉｒｓｔ Ｌｉｎｋ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）および１０％の１０×最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を使用して調製し、５Ｍおよび１Ｍ水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を使用して中和し、１０×ＤＭＥＭを添加した。
チューブ３：フィブリンゲル−１ｍｌのＰＢＳに溶解した２％フィブリノゲン（ｗ／ｖ）を用いて調製し、原線維形成のために、０．１Ｍ ＣａＣｌ２と一緒に１％トロンビン（ｗ／ｖ）を添加した。

チューブ１〜３を様々な比で混合し、キャストし、次いで、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。３本のチューブを混合した後の最終体積は常に１ｍｌであり、次いで、これをキャストした。
・２：１：１（コラーゲン／エラスチン／フィブリン）の足場の場合、５００μｌのチューブ２を２５０μｌのチューブ１および２５０μｌのチューブ３と混合した（本明細書では足場３Ａとも称される）。
・２：１：１（エラスチン／コラーゲン／フィブリン）の足場の場合、５００μｌのチューブ１を２５０μｌのチューブ２および２５０μｌのチューブ３と混合した（本明細書では足場３Ｂとも称される）。
・２：１：１（フィブリン／エラスチン／コラーゲン）の足場の場合、５００μｌのチューブ３を２５０μｌのチューブ１および２５０μｌのチューブ２と混合した（本明細書では足場３Ｃとも称される）。
・１：１：１の足場の場合、３３３．３μｌの各チューブを混合し、キャストした（本明細書では足場３Ｄとも称される）。

混合物を４８時間凍結乾燥させた。

洗浄：第１に、トリス−グリシン緩衝液による１５分間の洗浄。第２に、過剰の未結合グルタルアルデヒドを除去するために、足場をシェーカー上、０．１％ｗ／ｖ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）（還元剤）で約８時間洗浄した。
生体適合性

各複合足場の生体適合性を評価するために、１つの足場当たり５００００個の脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を播種し、最大７日間培養した。それぞれｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイおよびａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイを使用して、播種後１、３および７日目の細胞の生存および増殖を研究した。

例として、３成分足場の結果は、ＡＤＳＣが生存しており、足場に接着し（図７）、７日目まで増殖していた（図８）ことを示している。２成分足場（すなわち、エラスチンおよびコラーゲンまたはエラスチンおよびフィブリンを含む足場）において、同じ結果が観察された。
微細構造

ＳＥＭを使用して、各足場の微細構造を研究した。３成分足場の結果（図９）により、各足場の組み合わせは、ユニークな超微細構造フィブリルネットワークおよび細孔径を有することが示された。２成分足場についても、同様の観察を行った。この構造変化は、ＡＤＳＣの挙動および分化ならびに足場の生物力学的特性を変化させ得る（Ｇｈａｓｅｍｉ−Ｍｏｂａｒａｋｅｈら、（２０１５）を参照のこと）。
実施例３−水接触角（ＷＣＡ）

実験設定を開発することにより、エラスチン足場のぬれ性を調査し、３０μＬの蒸留水滴を各足場に分配し、いくつかの画像を０〜５秒の時間間隔で撮影した。０秒の時間は、液体媒体（水）との初期接触時間とみなした。ヤング式を使用してＷＣＡを計算し、水−足場境界から水滴の接線および周囲まで角度を測定した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ（２０１４））。計算ＷＣＡは、水−物質相互作用の実証である。

０秒時点のエラスチンの計算ＷＣＡは１０２±７．７５°であり、それは、４秒時点では７３．８８±５．９０°に減少した。時間と共に、ＷＣＡは経時的に減少し続け、９秒時点で０°に達したが、これは、エラスチン足場の完全なぬれ性を示す（図１０）。

しかしながら、エラスチンを他の天然ポリマー、例えばフィブリンおよびコラーゲンと異なる比で組み合わせることにより、３Ａ（０秒時点で６８．１８±３．３８°から３秒時点で０°）、３Ｃ（０秒時点で６７．４６±４．５１°から４秒時点で０°）のＷＣＡは変化し、４秒までに完全なぬれ性を示した。興味深いことに、３Ｂ（０秒時点で１１２．３４±５．３７°から１０秒時点で９９．３２±１４．５５°）および３Ｄ（０秒時点で１２０．１８±５．３６°から１０秒時点で１１３．２３±８．９３）のＷＣＡ（図１１）は、１０秒時点であっても完全なぬれ性を示さなかったので疎水性であり、＞９０°の任意の材料については疎水性であると考えられるため、エラスチン、３Ａおよび３Ｃの足場は親水性の性質を示し、水に対して高い凝集性を示し、９秒までに完全なぬれ性を獲得したが、足場３Ｂおよび３Ｄは親水性の性質を示し、水に対する凝集性が低かった。
実施例４−トリプシン分解の加速

足場の安定性を測定するために、１×トリプシンを使用することにより、加速分解プロファイルを行った。ＸＳ２０５ Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ（登録商標）デジタルスケールを使用して、足場の初期重量を測定した。足場を、１×トリプシンを含む２４ウェルプレートに入れ、３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートした。各時点において、足場を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させ、重量を測定した。

分解のパラメータとして、正味の重量変化を測定した。インビトロ加速分解の結果により、１日目からエラスチン足場は分解したことが示された（１３６．０６±１１．９０ｍｇ）。５日目までに、重量は２５％減少し、この傾向は継続し、４２日目までに、足場は７０％分解した（図１２）。

３Ａ、３Ｃおよび３Ｄについて、エラスチン系コポリマーの分解プロファイルは同一であった。７日目までに、ほぼ４０％の足場が分解し、このパターンは、足場のほぼ７０％が分解した４２日目まで継続した。しかしながら、５０％のエラスチンを有する３Ｂは最も安定な足場であり、４２日目までの分解は５５％であった（図１３）。これは、各組織タイプの再生特性に応じて、異なる分解パターンのエラスチン系足場を様々な組織工学用途に使用し得ることを示している。
実施例５−構造物性

細孔径範囲および孔隙率を測定するために、６４−ｂｉｔ Ｊａｖａ（登録商標） １．６．０（ＮＩＨ，ＵＳＡ）にバンドルされているＩｍａｇｅＪを使用して、すべてのＳＥＭ画像を定量的に分析した。閾値関数を使用して、足場のすべての細孔を視覚化した。加えて、粒子分析関数である摩擦面積を使用した。

足場の計算細孔径率は０〜１２０＋μｍの範囲であり、２８％の細孔は０〜１９μｍの範囲であり、４８％の細孔は２０〜７９μｍの範囲であり、残りの２４％は８０〜１２０＋μｍの範囲であり（図１４）、足場の全孔隙率は４８％であった。

エラスチンを他のポリマーと組み合わせた場合、３Ａでは、７０％の細孔は０〜５９内に存在し、残りの５０％は６０〜１２０＋μｍの範囲であった。３Ｂでは、細孔の大部分（６５％）は２０〜５９μｍの範囲であったが、３Ｃでは、細孔パターンは均一であり、５５％の細孔は２０〜５９μｍの範囲であった。しかしながら、３Ｄでは、７５％の細孔は０〜５９μｍの範囲であった（図１５）。

細孔および孔隙率は、血管新生および栄養素の拡散において重要な役割を果たす。結果は、エラスチン系足場を様々な組織工学用途に使用し得ることを示唆している。
実施例６−機械的特性

二軸バイオテスター（ＣｅｌｌＳｃａｌｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、エラスチン足場を破損まで試験した。このシステムは、細胞播種足場の試験中に足場の乾燥を防止するために、温度制御培地槽を有する２つの高性能アクチュエータを含む。リアルタイム応力分布を分析するために、試験結果の取得および処理のための時間同期高解像度ＣＣＤカメラを使用した。

０日目のエラスチン足場の湿潤機械的特性は１５４±１ｍＮであり、ｈＡＤＳＣ細胞を２８日間播種した後、足場の強度は、１８５．５±１．５ｍＮに有意に（ｐ＜０．０００１）増加した（図１６）。これは、足場に播種した細胞が、組織再構築機構により足場の機械的完全性を増大させることを実証している。

３Ａの計算破壊強度は７４．３３±３．７８ｍＮであり、３Ｂについては１１９．３３±３３．１２ｍＮであり、３Ｃについては１０３．３４±２０．２３ｍＮであり、３Ｄについては７１．６８±４．７２ｍＮである。これは、別のコポリマーを添加した後、エラスチンの機械的特性が減少することを実証している。これは、ポリマーの非フィブリル配置によるものであると考えられる（Ｌａｋｅら、（２０１２））。
実施例７−血管新生

商業的供給業者から病原体除去受精卵を入手し、３８℃、湿度４０〜４５％で３日間インキュベートした。胚３日目（ＥＤ３）に、ｅｘ ｏｖｏガラスボウルセットアップを構築して胚培養物を成長させ、３７．５℃、３％ＣＯ_２および８０〜８５％の範囲の平均湿度で維持した（３）。ＥＤ９に、エラスチン足場を発達中の絨毛尿膜（ＣＡＭ）に配置して血管の浸潤を可能にし、ＥＤ１２に、ホームオフィスガイドラインにしたがって胚を安楽死させ、足場を切除し、４％グルタルアルデヒドで固定し、分析した。

ＥＤ１０の総計算血管面積は４．７８±２．１２％であり、ＥＤ１１に、この血管面積は６．０１±３．３４％に増加したが、この増加は統計的に有意ではなかったが、多くの毛管網を有する２つの大きな血管を発達させた。この傾向は、引き続きＥＤ１２において継続し、計算血管面積は８．３４±２．６７％であった（図１８）。

エラスチンをフィブリンおよびコラーゲンと異なる比で組み合わせた場合、１２日目までに、総血管面積％が増加した。計算％血管面積は、３Ａについては１２．９７±０．６１％であり、３Ｂについては１１．３３±１．５２％であり、３Ｃについては１４．４１±０．６７％であり、３Ｄについては１６．５２±０．５７であった（図１９）。したがって、ポリマーの組み合わせを使用して、エラスチンの血管新生特性を増強することは有益であると思われる。ＣＡＭアッセイは、エラスチン系足場への血管浸潤を理解するためのエクスビボバイオリアクターとして機能した。足場は、０μｍ〜１２０＋μｍの範囲の細孔分布を有し、血管浸潤の血管新生促進物質として作用することを考慮する。
実施例８−細胞分化

エラスチン足場上のヒト脂肪由来細胞（ｈＡＤＳＣ）分化経路を理解するために、１ｍｍ^３当たり合計５×１０^５個の４継代目ｈＡＤＳＣを足場に播種した。１、７、１４日目に、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）法を使用することによりＲＮＡを単離し、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃａｍｓｐｅｃ Ｌｔｄ，Ｇａｒｆｏｒｔｈ，ＵＫ）を使用することにより全ＲＮＡ収量を定量した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｎａｎｏｓｃｒｉｐｔ ２逆転写キット（Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を使用してｃＤＮＡ合成を行い、カスタムデザインの合成プライマー（表１）（Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて定量ＰＣＲを実施した。

間葉系特異的分化マーカーである脂肪生成マーカー（ＣＥＢＰＡおよびＰＰＡＲＧ）、骨形成マーカー（ＲＵＮＸ２）、筋原性マーカー（ＭＹＯＤ１）、軟骨形成マーカー（ＳＯＸ９）およびＭＳＣマーカー（ＯＣＴ４およびＲＥＸ１）の遺伝子発現をｈＡＤＳＣにおいて研究した。

エラスチン足場上のｈＡＤＳＣの分化プロファイル。ＯＣＴ４、ＣＥＢＰＡ、ＰＰＡＲＧおよびＭＹＯＤ１は、７および１４日目において、１日目と比較して０．０３〜０．０４単位有意なアップレギュレーションの同一傾向を示した（ｐ＜０．０００１）。しかしながら、１４日目において、７日目と比較して有意なアップレギュレーションはなかった。ＲＵＮＸ２は、いかなる傾向も示さなかった。ＳＯＸ９は、上記で報告されているすべての他の足場と同一の３つの時点すべてにおいて、無視可能な発現（＜０．０２７）を示したが、それは、１４日目（０．０２５、ｐ＜０．０５）において、１日目（０．０２７）と比較して有意なアップレギュレーションを示した。ＲＥＸ１は、７日目において、最初のダウンレギュレーションを示し（０．０３６〜０．０２８、ｐ＜０．０００１）、続いて１４日目において、有意なアップレギュレーション傾向を示した（０．０３１、ｐ＜０．０００１）（図２０）。

３Ａでは、Ｏｃｔ−４は、７および１４日目（０．０２８、ｐ＜０．０００１）において、１日目（０．０３１）からの有意なダウンレギュレーションを示した。Ｒｅｘ−１は、７（０．０２６、ｐ＜０．０００１）および１４（０．０２９、ｐ＜０．０００１）日目において、１日目（０．０３１）と比較して有意にダウンレギュレートした。しかしながら、１４日目の発現は、７日目よりも有意に高かったのに対して（ｐ＜０．０００１）、ＭｙｏＤ−１は０．０３２で一定であった。ＣＥＢＰは、７日目において、わずかなアップレギュレーションを示し（ｐ＜０．０５）、１４日目において、０．０２５に有意にダウンレギュレートした（ｐ＜０．０００１）。３Ｂでは、Ｏｃｔ−４、ＲＵＸ−２およびＣＥＢＰは、７および１４日目において、比較して有意なダウンレギュレーションを示し（ｐ＜０．０００１）、７および１４日目の発現間に有意差はなかった。３Ｃでは、Ｏｃｔ−４は、日目の０．０３０から１４日目の０．０２９への着実かつ有意なダウンレギュレーションを示した（ｐ＜０．００１）。Ｒｅｘ−１およびＲＵＮＸ−２は、１日目の０．０３２から７日目のそれぞれ０．０３０および０．０２９に有意にダウンレギュレートした（ｐ＜０．０００１）。３Ｄでは、Ｏｃｔ−４、ＣＥＢＰ、ＰＰＡＲ−γおよびＭｙｏＤ−１は、７および１４日目において、１日目と比較して０．０４〜０．０６単位有意なダウンレギュレーションの同一傾向を示した（ｐ＜０．０００１）
実施例９−２成分エラスチン系足場
・エラスチン／コラーゲン−１：１の比
・エラスチン／フィブリン−１：１の比

実施例２に示されているように、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンを調製した。
・膨潤比

図２２は、エラスチン／コラーゲン足場とエラスチン／フィブリン足場との間の膨張比の差異を示す。膨潤比は、溶媒とポリマーとの間の相互作用の指標である。それは、２つの相間の親和性およびエンタルピーの交換を示す。ポリマー内部の架橋密度が高いほど、膨潤特性は低くなり、その逆も同様である。以下の式
（式中、Ｍ_ｄは足場の乾燥重量であり、Ｍ_ｗは足場の湿潤重量である）を用いて、乾燥質量および湿潤質量から、エラスチンおよびその複合物の膨潤比（ＳＲ）を測定した。２ｍｌの蒸留水に浸漬することにより、足場の湿潤質量を測定した。デジタルスケール（ＸＳ２０５ Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ（登録商標））を用いて乾燥質量および湿潤質量を測定し、式（１）を使用してＳＲを計算した。
・分解

図２３は、エラスチン／コラーゲン足場とエラスチン／フィブリン足場との間の分解プロファイルの差異を示す。実験プロトコールは、実施例４に記載されているものと同じであった。
・微細構造

図２４は、ＳＥＭを使用したエラスチン／コラーゲン足場（Ａ）およびエラスチン／フィブリン足場（Ｂ）の微細構造を示す。
・細孔径分布

図２５は、エラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場の細孔径分布を示す。
・生物学的活性

図２６は、エラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場のｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイの結果を示す。実験プロトコールは、実施例１に記載されているものと同じであった。
・血管新生

図２７は、１２日目のエラスチン／コラーゲン足場およびエラスチン／フィブリン足場の血管面積を示す。実験プロトコールは、実施例７に記載されているものと同じであった。
参考文献

Claims (74)

1. 組織足場を形成するための方法であって、エラスチンを含む組成物を架橋することを含み、前記エラスチンが、未分画のものであってかつ可溶化エラスチンを含む、方法。
2. エラスチンを可溶化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 組織足場を形成するための方法であって、未分画可溶化エラスチンを含む組成物を架橋することを含む、方法。
4. エラスチンを可溶化して、未分画可溶化エラスチンを含む組成物を形成する工程を含む、請求項３に記載の方法。
5. シュウ酸との接触により、前記エラスチンが可溶化されるかまたは可溶化されている、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
6. 前記エラスチンが、１００℃未満の温度で可溶化されるかまたは可溶化されている、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
7. 前記エラスチンを可溶化する前記工程が、５０℃未満またはそれに等しい温度で行われるかまたは行われている、請求項６に記載の方法。
8. 前記エラスチンを可溶化する前記工程が、１５〜３０℃の温度で行われるかまたは行われている、請求項７に記載の方法。
9. 架橋される前記組成物が不溶性エラスチンを含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
10. 組織足場を形成するための方法であって、可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することを含む、方法。
11. 架橋される前記組成物がコラーゲンおよび／またはフィブリンを含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
12. 未分画可溶化エラスチンならびにａ）コラーゲンおよび／またはｂ）フィブリンを含む組成物を架橋することを含む、請求項３もしくは請求項４または請求項３もしくは請求項４に従属するいずれかの請求項に記載の方法。
13. 前記コラーゲンがコラーゲンヒドロゲルの形態である、請求項１１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記フィブリンがフィブリンゲルの形態である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記架橋が化学架橋を含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
16. 前記架橋が、前記組成物をアルデヒド架橋剤と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記アルデヒド架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記架橋が２５℃〜５０℃の温度で行われる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
19. 前記架橋がＣＯ_２の存在下で行われる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
20. 前記架橋が２〜１０％ＣＯ_２の存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記架橋が１〜２４時間行われる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
22. 架橋未分画可溶化エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む、請求項３もしくは請求項４または請求項３もしくは請求項４に従属するいずれかの請求項に記載の方法。
23. 可溶化および架橋後に、凍結乾燥が行われる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
24. 組織足場を形成する方法であって、架橋エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含み、必要に応じて、架橋エラスチンを含む前記組成物が、未分画のものであってかつ可溶化エラスチンを含むエラスチンを含む製剤を架橋することにより形成されたものである、方法。
25. 架橋未分画可溶化エラスチンを含む組成物を凍結乾燥させることを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 洗浄して、可溶化および／または架橋に関与する薬剤を除去することを含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
27. 凍結乾燥および洗浄することを含み、凍結乾燥後に前記洗浄が行われる、請求項２６に記載の方法。
28. 洗浄して、可溶化および／または架橋に関与する薬剤を除去する前記工程が、還元剤で洗浄することを含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
29. 前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムまたは類似のカルボニル基反応性を有する薬剤を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 洗浄して、可溶化および／または架橋に関与する薬剤を除去する前記工程が少なくとも５時間、好ましくは少なくとも８時間行われる、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記足場を滅菌することを含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
32. 前記足場をエタノールと接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
33. ａ）エラスチン、前記エラスチンを可溶化することができる可溶化剤および架橋剤、またはｂ）エラスチンおよび架橋剤を含む組成物であって、前記組成物中の前記エラスチンが、未分画のものであってかつ可溶化エラスチンを含む、組成物。
34. 未分画可溶化エラスチンおよび架橋剤を含む、組成物。
35. コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む、請求項３３または請求項３４に記載の組成物。
36. 請求項１〜３２のいずれかに開示される方法により取得されたかまたは取得可能な組織足場。
37. 架橋エラスチンを含む組織足場であって、前記架橋エラスチンが、未分画のものであってかつ可溶化エラスチンを含むエラスチンを含む組成物を架橋することにより形成されたものである、組織足場。
38. 架橋未分画可溶化エラスチンを含む、組織足場。
39. 架橋エラスチンを含む組織足場であって、前記架橋エラスチンが、可溶性エラスチンおよび不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することにより形成されたものである、組織足場。
40. 前記架橋エラスチンが、不溶性エラスチンを含む組成物を架橋することにより形成されたものである、請求項３７に記載の組織足場、または不溶性エラスチンを含む、請求項３８に記載の組織足場。
41. コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む、請求項３７〜４０のいずれかに記載の組織足場。
42. 凍結乾燥されている、請求項３７〜４１のいずれかに記載の組織足場。
43. 滅菌されている、請求項３７〜４４のいずれかに記載の組織足場。
44. 組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための方法であって、請求項３６〜４３のいずれかに記載の組織足場を、それを必要とする患者に適用することを含む、方法。
45. 軟組織再生または修復を促進するためのものである、請求項４４に記載の方法。
46. 組織再生、組織治癒または組織修復の促進において使用するための、請求項３６〜４３のいずれかに記載の組織足場。
47. 軟組織修復を促進するための、請求項４６に記載の使用のための組織足場。
48. エラスチンを可溶化するための方法であって、エラスチンをシュウ酸と１００℃未満の温度で接触させることを含む、方法。
49. エラスチンをシュウ酸と５０℃未満の温度、好ましくは１５〜３０℃の温度で接触させることを含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記エラスチンを前記酸と５分間またはそれ未満、好ましくは１〜３分間接触させる、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
51. エラスチンを可溶化するための方法であって、エラスチンをシュウ酸と５分間またはそれ未満接触させることを含む、方法。
52. 前記エラスチンをシュウ酸と１００℃未満の温度で接触させる、請求項５１に記載の方法。
53. エラスチンをシュウ酸と５０℃未満の温度、好ましくは１５〜３０℃の温度で接触させることを含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記シュウ酸が０．２Ｍ〜１Ｍである、請求項４８〜５３のいずれかに記載の方法。
55. 請求項４８〜５４のいずれかに記載の方法により取得されたかまたは取得可能な組成物。
56. 請求項５５で定義される組成物を架橋することを含む、方法。
57. ｉ）エラスチン；ならびにｉｉ）コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む組織足場であって、前記エラスチンが架橋されている、組織足場。
58. 前記コラーゲンおよび／またはフィブリンが架橋されている、請求項５６に記載の組織足場。
59. 前記エラスチンが可溶化エラスチンを含む、請求項５７または請求項５８に記載の組織足場。
60. 前記エラスチンが不溶性エラスチンを含む、請求項５７〜５９のいずれかに記載の組織足場。
61. 前記エラスチンが未分画のものである、請求項５７〜６０のいずれかに記載の組織足場。
62. ｉ）エラスチン、ｉｉ）架橋剤；ならびにｉｉｉ）フィブリンおよび／またはコラーゲンを含む、組成物。
63. 前記エラスチンが可溶化エラスチンを含む、請求項６１に記載の組成物。
64. 前記エラスチンが未分画エラスチンである、請求項６２〜６３のいずれかに記載の組成物。
65. エラスチンを可溶化するための可溶化剤を含む、請求項６２〜６４のいずれかに記載の組成物。
66. ｉ）エラスチンならびにｉｉ）コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む組成物を架橋することを含む、方法。
67. 前記エラスチンが未分画のものである、請求項６６に記載の方法。
68. 前記エラスチンが可溶化エラスチンを含む、請求項６６または請求項６７に記載の方法。
69. 前記エラスチンが不溶性エラスチンを含む、請求項６６〜６８のいずれかに記載の方法。
70. 組織治癒、再生または修復の促進において使用するための、請求項５７〜６０のいずれかに記載の組織足場。
71. 組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための方法であって、請求項５７〜６１のいずれかに記載の組織足場を、それを必要とする患者に適用することを含む、方法。
72. 細胞が播種された、請求項３６〜４３または５７〜６１のいずれかに記載の組織足場。
73. 細胞を足場に播種することを含む方法であって、前記足場が、請求項３６〜４３または５７〜６１のいずれかで定義されるとおりである、方法。
74. 足場を含む細胞または組織培養物であって、前記足場が、請求項３６〜４３または５７〜６１のいずれかで定義されるとおりである、細胞または組織培養物。