CN114767930B - 一种3d纳米纤维海绵体、制备方法及在脊髓损伤修复领域的应用 - Google Patents

一种3d纳米纤维海绵体、制备方法及在脊髓损伤修复领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种3D纳米纤维海绵体、制备方法及在脊髓损伤修复领域的应用。通过传统静电纺丝技术所制备的生物支架呈2D膜片状，其致密的孔隙结构不利于细胞迁移和浸润，难以实现满意地神经组织再生。本发明通过气体发泡技术，将2D纳米纤维膜片膨胀为3D纳米纤维海绵体，使其孔隙率和亲水性显著增加，力学性能明显改善，其类细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的3D结构有利于细胞的存活、生长和迁移，并可调控神经干细胞分化和成熟，是脊髓损伤修复的理想载体。

Description

一种3D纳米纤维海绵体、制备方法及在脊髓损伤修复领域的 应用
技术领域
本发明属于生物支架技术领域，具体涉及一种3D纳米纤维海绵体的制备方法及所述制备方法制得的3D纳米纤维海绵体及其在创伤性脊髓损伤修复领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
创伤性脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是一种常见的神经系统损伤性疾病，常导致损伤节段以下的感觉和运动功能的丧失，严重影响病人的生活质量和预期寿命，在我国因脊髓损伤而导致瘫痪和死亡的患者每年高达数十万人。然而，受制于脊髓有限的神经再生能力和SCI抑制性微环境，目前其临床治疗手段有限。随着纳米技术和神经生物学的发展，神经组织工程(Neural tissue engineering，NTE)已成为最具前景的SCI治疗模式，通过提供引导性的仿生微环境，诱导神经网络的动态整合及功能协同，显著促进脊髓损伤修复。
如今，构建具有高比表面积、高孔隙率和类细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)纤维形态的仿生NTE支架引发业界广泛关注。其中，通过静电纺丝技术所制备的NTE支架可明显改善细胞与支架的相互作用、促进ECM重塑，甚至引导干细胞分化。此外，与方向混乱的纳米纤维相比，取向排列的静电纺丝纤维可有效调节神经元和胶质细胞的粘附、伸长和定向迁移，并通过恢复上升和下降的神经通路，引导脊髓缺损部位轴突的定向再生。然而，传统静电纺丝技术所制备的生物支架呈2D膜片状，其致密的孔隙结构不利于细胞迁移和浸润，对3D神经组织的再生效果不理想。因此，亟需开发一种高孔隙率、纤维定向排布的新型3D静电纺丝NTE支架，促进神经再生修复。
此外，细胞对NTE的应用也具有重要意义。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是一类具有自我更新能力和多线分化潜力的细胞。植入外源性NSCs是一种有前景的SCI修复策略。然而，由于损伤局部炎性微环境和细胞支持系统的缺乏，直接将NSCs注射到SCI缺损区的治疗效果不佳，多数细胞难以定植和存活。此外，最新研究表明所移植的NSCs大多分化为星形胶质细胞，而非神经元。因此，如何构建模仿原生ECM形态和结构的理想组织工程支架，以促进移植细胞的存活和命运调控，仍是SCI治疗的巨大挑战。
发明内容
针对现有3D静电纺丝支架的先进工艺，发明人认为，它们仍存在一些局限性：首先，大部分3D静电纺丝支架是由随机取向的纳米纤维和不可控的孔隙组成，不适合高度有序的神经组织。此外，部分3D支架缺乏纳米拓扑线索，尽管一些后处理技术，如超声，可能会保留其微纳结构，但亦会显著影响材料的分子量和纳米纤维的机械性能。另外，部分研究开发了基于微纤维的组织工程支架，其直径大约几十微米，以促进细胞浸润。然而，这种大型微纤维缺乏类ECM特性，不适合神经细胞的粘附和生长。因此，研发一种简单、可控、均一的制备工艺用于生产促进神经再生的3D仿生支架颇具挑战。
考虑到工程支架材料的亲水性和吸水性对细胞的存活状态具有显著影响，本发明首先提供一种3D纳米纤维海绵体(3D NSs)的制备方法及其制备的3D纳米纤维海绵体，所述制备方法包括如下步骤：将聚己内酯(PCL)与聚对二氧环己酮(PPDO)进行混合纺丝并干燥得到2D纳米纤维膜，将2D纳米纤维膜浸润后进行气体发泡膨胀，膨胀后的纤维膜干燥定型即为3D纳米纤维海绵体。
上述3D纳米纤维海绵体采用亲水性聚合物材料，将聚合物溶液置于高压直流电场内，电场驱动纺丝液从毛细管出口处以丝状或雾状射向金属收集器，制得直径为百纳米级的静电纺丝纳米纤维。电纺丝纤维比表面积大、孔隙率高，有利于营养物质交换。然而传统静电纺丝所制备的纳米纤维呈2D膜片状，不利于细胞迁移和渗透。进一步的，本发明利用气体发泡技术，成功将2D膜片状支架膨胀为3D NSs，为细胞、特别是神经细胞的存活提供了更加适宜的空间结构。本发明研究表明，该气体发泡过程中支架不发生化学反应，硼氢化钠可通过清洗尽数去除，发泡后的3D纤维海绵体仍然保持良好的生物相容性。经验证，该3D结构所提供的类ECM空间可有效促进干细胞在体内的黏附、迁移和分化，并且气体发泡后的海绵体孔隙率增加，其亲水性和吸水性也进一步得到了提高。
另外，通过优化3D NSs的制备参数，发明人构筑了一系列不同直径、形态等理化特征的海绵体支架，以实现对NSCs分化方向的精准调控，即本发明提供的3D纤维海绵体可以通过调整膨胀时间实现对吸水能力的调控。
在生物活性方面，本发明研究显示，与传统2D聚苯乙烯(TCPS)培养板对比，上述3D纳米纤维海绵体可显著提高NSCs的细胞活性，其膨胀后形成的类ECM拓扑结构对诱导NSCs向神经元谱系分化有积极影响，可作为一种神经元细胞的生物培养支架，应用于神经组织的生物培养工程。经本发明验证，负载NSCs的3D纳米纤维海绵体可负载神经干细胞，具体作为一种神经组织工程支架应用于脊髓修复领域，可有效改善SCI大鼠的运动能力，因此，本发明还提供上述3D纳米纤维海绵体和/或用于脊髓修复的神经组织工程支架在创伤性脊髓损伤修复领域的应用。
本发明提供的3D NSs与传统2D纳米纤维支架相比，对治疗脊髓损伤有如下有益效果：
1.具备3D仿生拓扑结构，孔隙率高、亲水性好。通过气体发泡技术制备的3D NSs在膨胀过程中完整保留了原2D NMs的拓扑线索，具备类ECM的仿生拓扑结构，层级可控，纤维排列方向一致、直径均匀。具有极高的孔隙率(98.12±0.67％)和较强的亲水性(1秒内可表面的水滴完全吸收)，有利于NSCs的定向迁移和浸润。
2.力学性能优异。与2D PCL/PPDO NMs相比(89.34±5.09MPa)，3D NSs的弹性模量显著下降(0.61±0.12MPa)，与动物脊髓高度匹配(0.2-0.6MPa)。这种类脊髓组织工程支架可显著降低移植物的异物反应，减轻移植物-宿主的界面炎症，生物相容性好。
3.诱导NSCs向神经元分化和成熟。通过反复优化支架的制备参数和膨胀过程，3DNSs可提供一个引导性的再生微环境，有利于保障NSCs长时程的存活和生长。此外，类ECM的3D多层级结构可促进NSCs向神经元分化，其轴突显著延长，排布方向与纳米纤维一致，并可见大量神经突触及其分泌囊泡。
4.促进脊髓损伤大鼠的神经再生和功能恢复。动物实验证实，移植搭载NSCs的3DNSs，可显著促进脊髓损伤大鼠的感觉和运动功能恢复(BBB运动评分提升近7倍)；组织化学染色表明，表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的外源性NSCs在3D NSs保护下可长时程存活，并分化、成熟、发挥神经功能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中所述3D NSs促进脊髓损伤修复的示意图；
图2为实施例1中所述2D NMs和3D NSs的表面形态及理化性质；
图2A为2D纳米纤维膜膨胀至3D纳米纤维海绵体的SEM表征，其中a1为2D纳米纤维膜照片，a2为膨胀后的3D纳米纤维海绵体照片，Ⅰ为2D纳米纤维膜上面观的SEM图，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为3D纳米纤维海绵体侧面观的SEM图，其中Ⅳ为Ⅲ的局部放大图。
图2B为发泡时间与膨胀高度的关系；
图2C为发泡时间与孔隙率的关系；
图2D为发泡时间与亲水接触角的关系；
图2E为发泡时间与吸水率的关系；
图2F为FTIR光谱测定2D PCL NMs、2D PPDO NMs、2D PCL/PPDO NMs和3D PCL/PPDONSs的化学基团；
图2G为X射线衍射(XRD)分析纳米纤维样品的结晶度结果；
图2H为2D PCL/PPDO NMs和3D PCL/PPDO NSs的拉伸载荷-伸长曲线(h1)、杨氏模量(h2)、极限应力(h3)和极限应变(h4)；
图3为实施例1的3D NSs调控NSCs分化命运；
图3A为NSCs种植于3D PCL/PPDO NSs后的流程图；
图3B为NSCs于3D PCL/PPDO NSs中的活(绿)/死(红)染色与分层状态；
图3C为CCK-8测定示3D NSs中NSCs的细胞活性；
图3D为2D TCPS组与3D NSs组Nestin+的细胞比例；
图3E为2D TCPS组Nestin+(绿)NSCs的免疫荧光图；
图3F为3D NSs组Nestin+(绿)NSCs的免疫荧光图；
图3G为2D TCPS组GFAP+(绿)和Tuj-1+(红)NSCs的免疫荧光图；
图3H为3D NSs组GFAP+(绿)和Tuj-1+(红)NSCs的免疫荧光图；
图3I为2D TCPS组与3D NSs组Tuj-1+的细胞比例；
图3J为2D TCPS组与3D NSs组GFAP+的细胞比例；
图3K为3D NSs组NF200+(绿)和Syn+(红)NSCs的免疫荧光图；
图3L为3D NSs组NF200+(绿)和DCX+(红)NSCs的免疫荧光图；
图3M为3D NSs组的SEM图；
图3N为RT-qPCR测定2D TCPS组与3D NSs组Tuj-1的mRNA水平；
图3O为RT-qPCR测定2D TCPS组与3D NSs组Gfap的mRNA水平；
图3P为RT-qPCR测定2D TCPS组与3D NSs组Olig2的mRNA水平；
图3Q为RT-qPCR测定2D TCPS组与3D NSs组中NeuroD1、Mash1、Hes6、Wnt7a和Ngn2的mRNA水平；
图3R为RT-qPCR测定2D TCPS组与3D NSs组中Nestin、NR2E1和Hes5的mRNA水平；
图4为实施例1中所述3D NSs促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的研究结果；
图4A为SD大鼠T10脊髓半切模型评价流程；
图4B为3D NSs移植后动物感觉功能的恢复结果；
图4C为3D NSs移植后动物运动功能(BBB评分)的恢复结果；
图4D为3D NSs移植后斜板实验的结果；
图4E为SCI后第8周动物足迹分析结果；
图4F为SCI后第8周动物后肢的旋转角度；
图4G为SCI后第8周动物前后爪相对距离；
图4H为SCI后第4周动物的MRI结果；
图4I为SCI后第8周动物的运动诱发电位结果；
图4J为SCI后第8周动物的感觉诱发电位结果；
图4K为3D NSs组运动诱发电位的波幅变化；
图4L为3D NSs组运动诱发电位的潜伏期变化；
图4M为3D NSs组感觉诱发电位的波幅变化；
图4N为3D NSs组运动诱发电位的潜伏期变化；
图5为实施例1中所述大鼠脊髓的组织学评估结果；
图5A为Sham组(假手术组)大鼠的Tuj-1+(红)和GFAP+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5B为SCI组大鼠的Tuj-1+(红)和GFAP+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5C为3D NSs组大鼠的Tuj-1+(红)和GFAP+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5D为3D NSs+NSCs组大鼠的Tuj-1+(红)和GFAP+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5E为3D NSs+NSCs组的脊髓损伤中心的NF200+(红)和ChAT+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5F为3D NSs+NSCs组的脊髓损伤中心的NF200+(红)和5-HT+(绿)免疫荧光组织切片结果；
图5G为Sham组(假手术组)大鼠脊髓的LFB染色组织切片结果；
图5H为SCI组大鼠脊髓的LFB染色组织切片结果；
图5I为3D NSs组大鼠脊髓的LFB染色组织切片结果；
图5J为3D NSs+NSCs组大鼠脊髓的LFB染色组织切片结果；
图5K为Tuj-1+细胞定量图；
图5L为GFAP+细胞定量图；
图5M为髓鞘面积定量图；
图5N为ChAT+细胞定量图；
图5O为5-HT+细胞定量图；
图5P为SCI组脊髓纵切面Nissl染色图；
图5Q为3D NSs+NSCs组脊髓纵切面Nissl染色图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释：
3D纳米纤维海绵体：是一种基于气体发泡技术的静电纺丝神经组织工程支架。
神经组织工程(Neural tissue engineering,NTE)支架：指可植入神经组织，并支持轴突生长和神经再生的细胞载体。
损伤部位的神经元和轴突再生对SCI修复至关重要。该发明通过联合定向静电纺丝技术和气体发泡技术创新性地制备了3D NSs。体外和体内结果表明，3D NSs的类ECM形态和优异的力学性能可维持NSCs长期存活，并具有神经保护、诱导分化、促进成熟等作用，从而使SCI大鼠的神经功能获得极大改善。因此，基于气体发泡技术的3D NSs是一种理想的神经组织工程支架(图1)。
为克服上述难题，发明人首先设计并制备了新型的基于气体发泡技术的3D纳米纤维海绵体(Nanofibrous sponges,NSs)，其结构整齐，层次可控，可引导所搭载的NSCs向神经元分化；具体的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种3D纳米纤维海绵体的制备方法，所述制备方法包括：将聚己内酯(PCL)与聚对二氧环己酮(PPDO)进行混合静电纺丝，并干燥得到2D纳米纤维膜，将2D纳米纤维膜浸润于NaBH4溶液中进行膨胀，膨胀后的纤维膜干燥定型即得。
优选的，所述混合纺丝的具体步骤如下：将PCL与PPDO以质量比3～6：1加入六氟异丙醇中获得混合溶液，所述混合溶液中PCL与PPDO的质量分数为8～12％；将上述混合溶液装入注射器，置于高压直流电场中进行静电纺丝。
进一步的，所述静电纺丝的参数如下：纺丝电压为+10～14kV、纺丝距离14～18cm、注射速度0.6-1.0mL/h，接收滚筒转速1500～1900r/min.
上述混合纺丝最终得到具有一定厚度和取向性的2D纳米纤维膜，使纺丝沿着特定方向排布，其厚度约为0.1-0.2mm，所述混纺后的2D纳米纤维膜优选通过真空干燥，使残留的溶剂进行挥发。
所述2D纳米纤维膜在浸润前需要处理成适宜使用的尺寸，并且截面应保持整齐，从而有利于气体进入。为了实现上述裁剪的效果，本发明优选的方式中，将干燥后的2D纳米纤维膜置于液氮中进行脆断。
优选的，所述2D纳米纤维膜置于NaBH4溶液中进行浸润，所述膨胀反应的时间为10～60min。上述膨胀反应过程中，所述浸润2D纳米纤维膜的溶液中NaBH4的浓度为1-4M。所述膨胀时间、NaBH4浓度与3D纳米纤维海绵体的厚度及孔隙率相关，随膨胀时间延长和NaBH4浓度升高，3D纳米纤维海绵体的厚度也会随之增加，孔隙率也具有一定的上升趋势，本领域技术人员可根据实际使用的需求，对上述参数进行调整。
优选的，所述膨胀纤维膜的干燥采用冷冻干燥的方式，低温处理在去除溶剂的同时有助于对所述3D纳米纤维海绵体的膨胀效果进行定型。
本发明第二方面，提供第一方面所述制备方法得到的3D纳米纤维海绵体。
优选的，所述3D纳米纤维海绵体可作为一种生物支架用于负载离体细胞或组织，进一步优选的，所述3D纳米纤维海绵体用于负载神经干细胞。
本发明第三方面，提供一种用于脊髓修复的神经组织工程支架，所述神经组织工程支架以第二方面所述3D纳米纤维海绵体作为载体负载神经干细胞。
优选的，所述神经组织工程支架的制备方式如下：将神经干细胞置于含有生长因子的培养基中进行增殖培养，并种植于第一方面所述的3D纳米纤维海绵体中。
进一步的，所述生长因子为EGF及bFGF；更进一步的，所述神经干细胞的培养基为DMEM/F12，另外添加谷氨酰胺、B27、EGF及bFGF。
本发明第四方面，提供第二方面所述3D纳米纤维海绵体和/或第三方面所述用于脊髓修复的神经组织工程支架在创伤性脊髓损伤修复领域的应用。
上述在创伤性脊髓创伤性脊髓损伤修复领域的应用中，具体应用方式包括以第二方面所述3D纳米纤维海绵体为载体负载具有修复活性的生物样本，或将第三方面所述用于脊髓修复的神经组织工程支架移植于待修复的脊髓部位。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、搭载NSCs的3D NSs制备
1. 2D PCL/PPDO纳米纤维膜的制备：
将聚己内酯(PCL)与聚对二氧环己酮(PPDO)按照4:1的比例与六氟异丙醇(HFIP)混合，搅拌过夜至均匀得到浓度为10％的混合溶液。将溶液装在配有18G针头的10ml注射器中，在纺丝电压+12kV、纺丝距离16cm、接收滚筒转速1700r/min的条件下制备静电纺丝，最终得到一定厚度的取向性2D NMs，放置在真空干燥箱中过夜，使残留溶剂挥发。
2. 3D PCL/PPDO纳米纤维海绵体的制备：
通过气体发泡技术处理将2D NMs膨胀为3D NSs。首先将2D NMs在液氮环境中脆断为所需大小，保证截面整齐，有利于气体进入。准备五组同等尺寸大小的2D NMs，分别浸泡在20ml的蒸馏水中，使纤维膜被完全浸润，加入0.04M NaBH4充分反应40min，之后将各组膨胀好的样品取出，用蒸馏水冲洗5次以上，去除表面残留的硼氢化钠。放入-80℃冷冻数小时后，放入冷冻干燥机36h以固定形态，最终得到3D PCL/PPDO NMs。
3.NSCs提取与培养：
选取孕14天大鼠，取出子宫，立即置于预冷的DMEM中，快速解剖子宫，取出胎鼠的大脑皮层(注意小心剥离血管膜)置于另一预冷的DMEM培养皿中。用Accutase消化NSCs20min，并小心吹打，制成均一的细胞悬液。将细胞离心，转移至DMEM/F12+0.5％谷氨酰胺+2％B27+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF增殖培养基重悬，过70um滤器，24h后换液。之后每2～3天进行一次半量换液，7天进行全换液。培养2代后，种植于3D NMs。7天后，将搭载NSCs的3DNSs移植于脊髓损伤大鼠的脊髓缺损区，观察其神经功能的恢复效果。
二、搭载NSCs的3D NSs神经功能修复效果的表征
1. 3D NSs的制备与表征分析
本实施例首先利用定向静电纺丝成功制备2D PCL/PPDO NMs(图2A(a1))，随后通过在NaBH4水溶液中产生的气泡，将其膨胀为3D PCL/PPDO3D NSs(图2A(a2))。根据广泛筛选和反复优化，在流速为0.8mL/h、电压为12kV、纺丝距离为16cm的条件下，制备了平均纤维直径为394.7±99.3nm的2D PCL/PPDO NMs。SEM图像(图2A(a1))显示，纳米纤维呈单轴排列，形态光滑，无串珠样结构；膨胀后的PCL/PPDO NSs拥有3D层状结构，层次可控，同时可保持源于2D PCL/PPDO NMs的取向性纳米纤维形态。随着气体发泡时间的增加，可制备一系列具有不同膨胀高度的3D NSs(图2B)。最初的2D NMs表现为致密的片状结构，厚度为0.13±0.01毫米。相比之下，当气体发泡时间设置为10分钟、20分钟、40分钟和60分钟时，3D NSs的厚度分别增加到2.3±0.67毫米、3.8±0.79毫米、5.4±1.1毫米和8.9±1.2毫米(图2B)。此外，3D NSs的孔隙率随气体发泡时间的增加也呈现出上升趋势。具体来说，其孔隙率在膨胀的前10分钟内迅速上升(从75.46±3.21％到90.35±3.73％)，然后逐渐保持不变(20分钟时为94.86±1.61％，40分钟时为97.02±0.39％，60分钟时为98.14±0.36％)(图2C)。
工程支架的亲水性和吸水性对细胞与支架的相互作用有关键影响。为了提高电纺支架的表面亲水性，本实施例将亲水性生物材料和气体发泡技术相结合。疏水性静电纺丝2D PCL NMs的水接触角在90秒后从最初的128.7°变为116.3°，而亲水性静电纺丝2D PPDONMs能够在4秒内快速吸收液滴。在将PCL和PPDO混合到同一电纺系统后，2D PCL/PPDO NMs的接触角从最初的102.1°变为21.6°。有趣的是，通过气体发泡技术产生的3D多孔PCL/PPDONSs的表面亲水性得到极大改善，它可在1秒内立即吸收液滴(图2D)。研究还发现，气体发泡时间对3D PCL/PPDO NSs的吸水能力有积极影响，在膨胀10、20、40、60分钟后，吸水能力分别为18.02±3.36％、22.47±2.43％、31.19±2.94％、37.83±1.21％(图2E)。相比之下，原始未膨胀的2D PCL/PPDO NMs的吸水率只有9.13±1.12％。发明人认为，气体发泡后海绵体孔隙率的明显增加是导致其表面亲水性和吸水性提升的关键原因。
本实施例利用FTIR光谱来确定2D PCL NMs、2D PPDO NMs、2D PCL/PPDO NMs和3DPCL/PPDO NSs的化学基团的改变(图2F)。数据清楚地表明，PCL和PPDO混合纺丝后，特征峰的位置没有明显的移动，表明在混纺过程中没有产生新的化学基团。以2945cm-1和2868cm-1为中心的吸收峰归因于C-H的拉伸振动。1724cm-1和1472cm-1的峰分别归属于C＝O的拉伸振动和CH2的弯曲振动。此外，在1234cm-1、1168cm-1和1042cm-1的三个峰都属于C-O的拉伸振动。因此在气体发泡过程中，支架没有发生化学反应。
本实施例通过使用X射线衍射(XRD)分析确定上述纳米纤维样品的结晶度(图2G)。所有四个样品都表现出两组明显的衍射峰，大致位于21.3°和23.6°，分别归属于(110)和(200)晶斑。重要的是，与其他2D NMs组相比，3D PCL/PPDO NSs表现出明显增加的衍射峰强度。结果表明气体发泡技术可有效地提高纳米纤维支架的结晶度。
拉伸试验的结果表明，2D PCL/PPDO NMs和3D PCL/PPDO NSs都表现出类似的拉伸载荷-伸长曲线(图2H(h1))。3D PCL/PPDO NSs的杨氏模量明显低于2D PCL/PPDO NMs(0.61±0.12MPa vs 89.34±5.09MPa)(图2H(h2))，因此3D NSs的杨氏模量与正常脊髓(200-600kPa)接近。此外，与2D PCL/PPDO NMs相比，3D PCL/PPDO NSs显示出明显较低的极限强力，和较高的极限应变(图2H(h2和3))。这种类脊髓的力学特征可明显降低局部的炎症反应，从而提供一个优良的脊髓再生微环境。
2. 3D NSs可显著增强NSCs的生存、分化和成熟
生物相容性是决定NTE支架治疗作用的重要因素。本实施例将NSCs种植于3D PCL/PPDO NSs中，以研究其生物相容性及细胞与支架的相互作用(图3A)。以经典的2D聚苯乙烯(Tissue culture polystyrene，TCPS)组织培养板作为对照，细胞活/死染色结果显示，在3D NSs中培养的NSCs在7天的培养过程中呈现出较高的存活率(约90％)，这与在2D TCPS板上培养的NSCs相似。图3B显示NSCs在3D NSs中培养7天后有序、分层排列，并可见相邻层间的神经连接。相似地，CCK-8结果显示3D NSs组的NSCs表现出旺盛的细胞活力(图3C)。
本实施例进一步采用免疫荧光(Immunofluorescence，IF)染色来评估NSCs在培养1和7天后的干性(图3D-F)。在第1天，3D NSs组所培养的Nestin+细胞的百分比明显低于对照组(52.37±12.35％vs 85.94±8.68％，P<0.01)。同时，为探索NSCs在第7天的分化方向，本实施例亦测定了神经特异性标志物的表达，包括：Tuj-1、GFAP、NF200、DCX和Syn。GFAP主要分布在星形胶质细胞中，而Tuj-1是早期神经元的特异性标志物。图3G和2H显示，3D NSs可明显促进NSCs向神经元分化，并沿纳米纤维排布方向取向性生长。荧光信号的半定量分析也显示，3D NSs中Tuj-1+细胞的比例约为2D对照的14倍(图3I)，而3D NSs组中GFAP+细胞的比例约为2D对照的一半(图3J)。值得注意的是，神经元之间的突触信号转导是神经功能形成的基础。因此，进一步探索3D NSs中的突触水平非常重要。Syn是一种丰富的神经蛋白，作为突触小泡的包膜蛋白，主要用于调节神经递质的释放。通过对Syn和NF200进行荧光双染，图3K可见大量的神经轴突、紧密的细胞间连接和密集的突触小泡，这说明NSCs在3D NSs中构建了复杂的神经突触网络。DCX(主要表达于新生神经元)，和NF200双染也证明3D NSs组中的NSCs有很强的轴突再生和神经发生能力(图3L)。此外，图3M显示了3D NSs中NSCs的微观形态，可见NSCs沿纵向纳米纤维排列，轴突相互沟通，形成神经网络。
RT-qPCR也被用来评估神经特异性基因标记物的表达。与2D对照组相比，3D NSs组中Tuj-1、Gfap和Olig2的mRNA相对表达量分别显著增加了38.9倍、1.4倍和4.2倍。这一发现意味着3D NSs的类ECM拓扑结构对诱导NSCs向神经元谱系分化有积极影响，这加强了上述IF染色的证据等级。为了进一步探索神经分化的潜在分子机制，本实施例通过RT-qPCR进一步测定了几个有代表性的神经分化相关基因，包括NeuroD1、Mash1、Hes6、Wnt7a和Ngn2。图3Q清楚地表明，所有上述基因的mRNA水平在3D NSs组有明显上升，与2D对照组相比，NeuroD1增加到5.7倍，Mash1增加到1.7倍，Hes6增加到1.4倍，Wnt7a增加到30.6倍，Ngn2增加到17.2倍。相反，一些典型的干性相关基因，如Nestin、NR2E1和Hes5在3D NSs组下调(图3R)。综上所述，高度取向的3D NSs可显著提高NSCs的生存、分化和成熟。
3.移植搭载NSCs的3D NSs可改善SCI大鼠的运动功能
本实施例利用SD大鼠T10脊髓半切模型对3D NSs的体内性能进行综合评价(图4A)。感觉测试结果显示，与SCI组(134.6±42.3秒)和3D NSs组(60.5±30.1秒)相比，3DNSs+NSCs组动物明显表现出更灵敏的感觉反应(44.3±16.9秒)(图4B)。Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)运动评分的结果显示，在第14天，BBB评分为0的SCI大鼠没有观察到后肢运动，而3D NSs+NSCs组显示出比SCI组和3D NSs组更强的恢复能力。同样，倾斜实验显示，3DNSs+NSCs组(62.2±2.4°，65.2±5.1°和67.4±2.5°)的后肢抓握力更强(图4D)。足迹分析也被用来测试损伤后8周(Weeks post injury,wpi)时的运动恢复情况(图4E)。SCI后，动物前爪和后爪的协调受到严重损害，前后爪脚印不重叠，旋转角度和相对距离(同侧前爪和后爪之间的距离)增加，及明显的后肢拖曳现象。然而，3D NSs移植后明显减少了同侧后肢的旋转角度(图4F)和前后爪相对距离(图4G)，表明在该时间段内，肢体间的协调性得到了良好的恢复。重要的是，3D NSs+NSCs组仍显示出比三维NSs组更好的运动性能。
本实施例进一步收集了T2WI的核磁共振成像(MRI)数据，以评估横断脊髓在4wpi的总恢复情况(图4H)。SCI组仍可见上下脊髓断端的明显缺损，这表明如果SCI后不采取任何治疗措施，脊髓几乎没有任何恢复，解剖连续性极差。相比之下，植入的3D NSs可明显增强细胞的迁移和渗透，从而使横断脊髓的解剖结构得到部分恢复。值得注意的是，与SCI组和3D NSs组相比，搭载NSCs的3D NSs组表现出最为优异的脊髓解剖恢复。
在8wpi时，本实施例进行了电生理评估以测试再生脊髓的电信号传导性。如图4I和J所示，分别进行了运动诱发电位(Motor evoked potential，MEP)和体感诱发电位(Somatosensory evoked potential，SEP)分析来监测下行和上行的电生理信号。SCI组的电传导不良，MEP和SEP的振幅明显下降，潜伏期延长。相比之下，3D NSs组和3D NSs+NSCs组通过重建替代受损脊髓的神经中继器，明显增强了动物的电生理恢复，表现为波幅上升、潜伏期下降(图4K-N)。
4.大鼠脊髓的组织学评估
在8wpi时，对大鼠脊髓的损伤中心进行Tuj-1和GFAP的IF双染(图5A-D)，在SCI组，几乎检测不到Tuj-1+和GFAP+细胞(图5B)，而3D NSs组可见少数Tuj-1+神经元(面积为1.3±1.1％)和零星的GFAP+星形胶质细胞(面积为4.3±1.2％)(图5C)。这表明，3D NSs可提供特定的引导线索，以加强内源性神经细胞对病变部位的招募。此外，与SCI和3D NSs组相比，3DNSs+NSCs组出现了明显更多的Tuj-1+(面积为12.7±5.1％)和GFAP+(面积为12.5±5.2％)细胞(图5D)(图5I和J)。这些数据表明，预分化的外源性NSCs可在3D仿生材料的保护下于损伤部位长期生存。此外，3D仿生支架可引导细胞生长，促进NSCs向神经谱系分化和成熟。更重要的是，本实施例发现移植的NSCs被宿主神经元包围，从而促进供体细胞与宿主神经组织的有机整合。
然后，本实施例进一步检查了分化后的成熟神经元是否能发挥神经功能。通过对NF200/ChAT(胆碱能神经元标志物)和NF200/5-HT(血清素能神经元标志物)进行了IF染色。在3D NSs+NSCs组的病变部位观察到大量的ChAT+(8.1±2.7％)和5-HT+(1.7±0.3％)细胞(图5E和F)，分别占Sham组的39％和48％(图5N，O)。
接下来，为了进一步评估脊髓的组织学恢复情况，本实施例进行了多种组织化学染色，包括LFB染色和Nissl染色。首先，LFB染色显示，3D NSs+NSCs组表现出最高的髓鞘再生能力(图5G-J)，有助于轴突支持和细胞代谢。如图5M所示，SCI组尚未检测到脊髓再髓鞘化，而3D NSs和3D NSs+NSCs组的髓鞘面积分别达到23.3±3.1％和29.0±3.5％。然后，用Nissl染色来评估脊髓纵切面(图5P和Q)神经细胞的形态和分布，可见大量的神经细胞迁移至支架内部。上述结果表明，3D NSs独特的微纳结构可促进移植细胞在SCI后的存活、浸润、分化和成熟。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于脊髓修复的神经组织工程支架，其特征在于，所述神经组织工程支架以3D纳米纤维海绵体作为载体负载神经干细胞；所述3D纳米纤维海绵体促进神经干细胞向神经元分化；
所述3D纳米纤维海绵体制备方法包括：将聚己内酯与聚对二氧环己酮进行混合纺丝并干燥得到2D纳米纤维膜，将2D纳米纤维膜浸润后在NaBH4环境中膨胀，膨胀后的纤维膜干燥定型即得；
具体步骤如下：
将聚己内酯与聚对二氧环己酮以质量比3~6：1加入六氟异丙醇中获得混合溶液，所述混合溶液中聚己内酯与聚对二氧环己酮的质量分数为8~12%；将上述混合溶液装入注射器，置于高压直流电场中进行静电纺丝；所述静电纺丝的参数如下：纺丝压力为+10~14kV、纺丝距离14~18cm、接收滚筒转速1500~1900r/min；
通过混合纺丝得到具有一定厚度和取向性的2D纳米纤维膜，所述厚度为0.1-0.2mm；所述混合纺丝后的2D纳米纤维膜通过真空干燥，使残留的溶剂进行挥发；干燥后的2D纳米纤维膜置于液氮中进行脆断，所述2D纳米纤维膜置于蒸馏水中进行浸润，向浸润的水中加入NaBH4溶液进行膨胀反应，所述膨胀反应的时间为10~60min；所述膨胀纤维膜的干燥采用冷冻干燥的方式；
所述神经组织工程支架的制备方式如下：将神经干细胞置于含有生长因子的培养基中进行增殖培养，并种植于所述3D纳米纤维海绵体中。
2.如权利要求1所述的用于脊髓修复的神经组织工程支架，其特征在于，所述2D纳米纤维膜在浸润前需要处理成适宜使用的尺寸。
3.如权利要求1所述的用于脊髓修复的神经组织工程支架，其特征在于，所述膨胀反应过程中NaBH4的浓度为1-4M。
4.如权利要求1所述的用于脊髓修复的神经组织工程支架，其特征在于，
所述生长因子为EGF及bFGF；所述神经干细胞的培养基为DMEM/F12，另外添加谷氨酰胺、B27、EGF及bFGF。
5.权利要求1所述的用于脊髓修复的神经组织工程支架在制备创伤性脊髓损伤修复材料中的应用，应用方式为以3D纳米纤维海绵体为载体负载具有修复活性的生物样本。
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GR01 Patent grant
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