JP7414284B2 - コラーゲン固形物、コラーゲン固形物の製造方法、生体材料、および、生体外材料 - Google Patents
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Description
〔1〕上記の課題を解決するための、本発明の一態様に係るコラーゲン固形物は、コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物、または、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物を含む、コラーゲン固形物であって、上記コラーゲン固形物の密度が、50mg/cm3以上のものである。
〔2〕上記の課題を解決するための、本発明の一態様に係るコラーゲン固形物は、上記コラーゲン固形物の接線係数が、90kPa以上のものである。
〔3〕本発明の一態様に係るコラーゲン固形物は、任意の物質を更に含む、コラーゲン固形物である。
〔4〕上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体材料は、〔1〕~〔3〕の何れか1つに記載のコラーゲン固形物を含む生体材料である。
〔5〕上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体外材料は、〔1〕~〔3〕の何れか1つに記載のコラーゲン固形物を含む生体外材料である。
〔6〕上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体材料は、〔1〕~〔3〕の何れか1つに記載のコラーゲン固形物を含む骨再生用材料である。
〔7〕上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るコラーゲン固形物の製造方法は、〔1〕~〔3〕の何れか1つに記載のコラーゲン固形物の製造方法であって、システインプロテアーゼによって、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解する分解工程と、上記分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物から溶媒を除去する除去工程と、を有する。
〔8〕本発明の一態様に係るコラーゲン固形物の製造方法は、上記除去工程では、上記分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物に、任意の物質を加えた後で、当該混合物から溶媒を除去する。
〔9〕本発明の一態様に係るコラーゲン固形物の製造方法は、上記除去工程では、当該除去工程にて得られたコラーゲン固形物に任意の物質を吸着させる。
動物の細胞間の結合組織または骨組織を構成するタンパク質であるコラーゲン、または、その熱変性物質であるゼラチンは、生体内に移植される生体材料(例えば、欠損または損傷した生体組織を補完するための生体材料)、または、生体外材料(例えば、細胞培養のための生体外材料)として用い得る。
本発明の一実施形態に係るコラーゲン固形物の製造方法は、(i)システインプロテアーゼによって、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解する(より具体的に、システインプロテアーゼによって、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの両末端を部分的に切断する)分解工程と、(ii)上記分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物から溶媒を除去する除去工程と、を有している。以下に、下記工程について説明する。
上記分解工程では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをシステインプロテアーゼによって分解する。
(i)高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
(ii)高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。
(iii)低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
除去工程は、分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物から溶媒を除去する工程である。除去工程では、溶媒のみならず、不要な低分子化合物などの不純物を除去してもよい。除去工程は、例えば、透析、限外ろ過、凍結乾燥、風乾、エバポレーター、噴霧乾燥、または、これらの組み合わせによって行われ得る。
本発明の一実施形態に係るコラーゲン固形物の製造方法は、上述した除去工程の後に、除去工程にて得られたコラーゲン固形物に対して更に成型処理(例えば、切削処理、研磨処理、および、貫通孔形成処理など)を加える成型工程を有していてもよい。当該構成であれば、所望の形状を有するコラーゲン固形物を容易に得ることができる。なお、当該成型処理は、周知の方法にしたがって行えばよい。
本発明の一実施形態に係るコラーゲン固形物は、上述した〔2.コラーゲン固形物の製造方法〕の欄にて説明した製造方法によって製造され得る。本発明の一実施形態に係るコラーゲン固形物は、コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物または、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物を含むものである。以下に各構成について説明する。なお、〔2.コラーゲン固形物の製造方法〕の欄にて既に説明した構成については、以下では、その説明を省略する。
本発明の一実施形態に係るコラーゲン固形物の密度としては、略50mg/cm3以上が好ましく、より好ましくは略50mg/cm3~略400mg/cm3、より好ましくは略50mg/cm3~略350mg/cm3、より好ましくは略80mg/cm3~略350mg/cm3、より好ましくは略80mg/cm3~略300mg/cm3、より好ましくは略100mg/cm3~略300mg/cm3、より好ましくは略120mg/cm3~略300mg/cm3、より好ましくは略120mg/cm3~略280mg/cm3、より好ましくは略140mg/cm3~略280mg/cm3、より好ましくは略140mg/cm3~略260mg/cm3、より好ましくは略140mg/cm3~略240mg/cm3、最も好ましくは略140mg/cm3~略220mg/cm3である。
上記コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物、および、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物は、コラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいるものであり得る。つまり、上記分解物は、コラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物、または、
コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断されている、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解物であり得る:
(1)-G-X1-X2-G-X3-X4-G-X5-X6-G-(配列番号1):
(2)-G-X1-X2-G-X3-X4-G-X5-X6-G-X7-X8-G-X9-X10-G-X11-X12-G-X13-X14-G-(配列番号2):
(3)-Y1-Y2-Y3-G-Y4-Y5-G-Y6-Y7-G-Y8-Y9-G-(配列番号3):
(但し、Gは、グリシンであり、X1~X14およびY1~Y9は、任意のアミノ酸である)。
本発明の一実施形態に係る生体材料および生体外材料は、上述したコラーゲン固形物を含むものである。
システインプロテアーゼであるアクチニダインを用いて、ブタ由来のI型コラーゲンに対して20℃にて7日間、分解処理を行い、3本鎖構造を含む本発明のコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物「LASCol」(Low Adhesive Scaffold Collagen、細胞低接着性(I型)コラーゲンを得た。当該LASColを1000万倍の超純水に対して透析し、不純物などを除いた後、透析後の溶液を適当な容器に入れ、-80℃の超低温冷凍庫で凍結させた。その後、凍結乾燥機(東京理科器械製、FDU-2200)で凍結乾燥した。
カミソリを用いて、円柱状LASCol固形物または円柱状アテロコラーゲン固形物を長軸方向に半分に切断し、当該円柱状LASCol固形物または円柱状アテロコラーゲン固形物の断片を、切断面が上を向くように、SEM用カーボン両面テープで、SEM用の試料台上に貼り付けた。次いで、蒸着装置(Ion Sputter E-1030、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)によって、切断面上に白金パラジウムを5nm蒸着し、観察試料とした。
上記実施例1と同様の方法で、凍結乾燥したLASColを100mg/mLとなるように超純水を加えて完全に溶解させた。当該LASColが完全に溶解した溶液を、蛇腹状の屈曲した筒状鋳型1(谷径(D1):4.5mm、外径(D2):5.1mm、長さ(L1):20.1mm、(L2):16.5mm)、または、蛇腹状の伸長した筒状鋳型2(谷径(D1):4.5mm、外径(D2):5.1mm、長さ(L3):27.5mm)内に充填して、-80℃で凍結した。
上記実施例1と同様の方法で、凍結乾燥したLASColを100mg/mLまたは150mg/mLとなるように超純水に完全に溶解させた。当該LASColが完全に溶解した溶液を、筒状鋳型3(内径(D1):4.0mm、外径(D2):6.7mm、長さ(L4):7.5mm)、筒状鋳型4(内径(D1):2.2mm、外径(D2):3.4mm、長さ(L5):29.1mm)、または、筒状鋳型5(内径(D1):0.95mm、外径(D2):2.50mm、長さ(L6):24.5mm)内に充填して、-80℃で凍結した。
実施例1と同様の方法で、所定のコラーゲン濃度(30mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、180mg/mL)のLASColを含む溶液を凍結乾燥させた円柱状LASCol固形物(直径:2.5mm)、および、所定のコラーゲン濃度(20mg/mL)のアテロコラーゲンを含む溶液を凍結乾燥させた円柱状アテロコラーゲン固形物(直径:2.5mm)を得た。当該円柱状LASCol固形物および円柱状アテロコラーゲン固形物をカミソリによって切断し、直径5mm、長さ5mmの円柱状の断片を得た。
実施例1と同様の方法で、LASColを凍結乾燥した。次いで、当該凍結乾燥したLASColを、最終コラーゲン濃度が50mg/mLになるように5mMのCa2+と、4mMのNa+と、15mMのCl-と、を含む超純水に添加し、当該溶液を、0℃~10℃の冷蔵庫内で、3日間~10日間、静置した。その間、当該溶液を、ときどき泡立てずに穏やかに混合し、上記凍結乾燥したLASColを完全に溶解させた。
100mgのLASColを50mg/mLとなるように超純水を添加した以外は、実施例1と同様の方法で作製した凍結乾燥後のLASCol固形物を円柱形の鋳型(直径:3.5mm、長さ:10mm)から取り出し、円柱状LASCol固形物とした。当該LASCol固形物を37℃に保温した10mMのCa2+を含む超純水に、保温しながら15分間浸し、再度凍結乾燥させ、Ca2+含浸円柱状LASCol固形物を作製した。
上記凍結乾燥した100mgのLASColを100mg/mLのコラーゲン濃度になるように超純水に添加し、上記円柱形の鋳型(直径:2.5mm~3.0mm、長さ:4mm~7mm)を、円柱形の鋳型(直径:3.5mm、長さ:2mm~5mm)に変更した以外は、実施例1と同様の方法で、円柱状LASCol固形物を作製した。得られた円柱状LASCol固形物に、針棒(外径:200μm)を使用して3箇所の貫通孔を開け、観察試料とした。当該観察試料を、実態顕微鏡(SZ61、オリンパス株式会社製)で撮影した。結果を、図7に示す。
100mgのLASColを、最終コラーゲン濃度50mg/mLとなるように10mMのCa2+、または20mMのCa2+を含む超純水に、および、最終コラーゲン濃度100mg/mLとなるように5mMのCa2+、または10mMのCa2+を含む超純水に、それぞれ添加した以外は、実施例6と同様の方法により、凍結乾燥後のLASCol固形物を円柱形の鋳型(直径:3.5mm、長さ:5~10mm)から取り出し、Ca2+のモル濃度が異なるCa2+含浸円柱状LASCol固形物とした。
〔10-1.移植用円柱状LASCol固形物の作製〕
LASColを含む溶液を円柱状に成型する前に、フィルター濾過および凍結乾燥にて滅菌した。そして、滅菌後のLASColを含む溶液を、上記実施例5と同様の方法により、所定のコラーゲン濃度(50mg/mL、100mg/mL、および150mg/mL)のLASColを含む溶液を凍結乾燥させた円柱状LASCol固形物を作製した。当該円柱状LASCol固形物の形状は、後述する大腿骨1mmの欠損骨形状と同じである。そして、当該円柱状LASCol固形物を、後述する実施例に使用した。
本実施例では、ラットを用いた。使用したすべてのラットは、25℃、12時間毎の明暗サイクル、病原菌フリー状態にて飼育し、飼料および水は自由に摂取させた。また、全ての動物実験は、神戸大学医学部の実験ガイドラインに従って行った。
ラットに全身麻酔を施し、大腿骨を露出させた後、大腿骨の近位および遠位にそれぞれ2本ずつねじ付きK-wireを挿入し、これらを創外固定器で連結した。その後、大腿骨の骨幹部中央において、小型ボーンソーを用いて幅1mmの骨の切除を行い、ラット大腿骨1mm欠損モデルを作製した。次いで、上記所定の濃度(50mg/mL、100mg/mL、および150mg/mL)のLASColを含む溶液を凍結乾燥させた円柱状LASCol固形物をラット大腿骨1mm欠損モデルにそれぞれ移植した後、手術した部位を縫合した。当該ラットを所定の時間飼育した後、骨の再生状況を評価した。
〔11-1.Modified RUST scoreの評価基準〕
後述するレントゲン画像に基づく骨癒合度合の評価は、Modified RUST scoreに準拠して行った。Whelan D. B. et al. The Journal of Trauma, 2010に記載のRust(radiographic union scale in tibial)fracture scoreの評価基準を一部改変した評価基準を、本試験に使用した(図10参照)。また、本試験では、score1~score5の5段階の評価基準を使用した。当該scoreでは、数が高い程、良好に骨癒合が進行していることを示す。本実施例では、レントゲン画像に基づくModified RUST scoreが、score4および5に評価された場合に、「骨癒合」が生じていると判定した。
円柱状LASCol固形物を移植直後、14日後、および28日後において、レントゲン装置(TOSHIBA製、Qpix VPX-30E)を用いて、上記個体群を撮影した。
大腿骨1mm欠損個体群、およびLASCol固形物移植個体群において、移植手術28日後の上記レントゲン画像について、Modified RUST scoreによる骨癒合の評価を行った。各個体群の平均点を算出し、図12に示した。また、各個体群間の点数を統計学的に評価した(p=0.01)。
移植手術後14日後、および28日後に、μCT装置(R_mCT;Rigaku Mechatronics Co.、 Ltd.、Tokyo、Japan)にて、CT撮影(Computed Tomography、コンピューター断層撮影)を実施し、骨癒合の進行度合を評価した。なお、ラットは、頸椎脱臼により安楽死させCT撮影に供し、次いで、後述する組織学的評価にも供した。その結果を図13~17に示す。
〔12-1.大腿骨摘出〕
上記〔11-4.μCT画像評価〕に供した移植手術14日後、および28日後の50mg/mL、100mg/mLおよび150mg/mL LASCol固形物移植個体群から大腿骨を摘出した。図17は、移植手術28日後、150mg/mL LASCol固形物移植個体群から摘出した大腿骨の像を示す。
組織学的評価において、後述する染色画像における骨癒合の進行度合は、Allen’s scoreに準拠して評価した。当該評価基準は、H. L. Allen et al. Acta Orthopaedica Scandinavica, 1980に記載の評価基準に準拠した。当該骨癒合進行度(ここで、Allen’s scoreと称する)の評価基準を図18に示す。
上記〔12-1.大腿骨摘出〕にて摘出した摘出した大腿骨の組織切片を作製し、当該組織切片に対して、HE染色(Hematoxylin Eosin Stain:ヘマトキシリン・エオシン染色)を実施した。HE染色において、ヘマトキシリンは武藤化学株式会社、製品名:Mayer’s Hematoxylin、品番:30002、エオシンはWako、製品名:Eosin Y、品番:058-00062をそれぞれの使用方法に準拠して組織切片を染色した。染色後の組織切片は、光学顕微鏡(Keyence Corporation、Osaka、Japan、製品名:BA-X700)にて観察した。
上記〔12-3.HE染色〕で使用した組織切片において、SO染色(Safranin O Stain:サフラニン O染色)を実施した。SO染色において、サフラニン Oは、CHROMA-GESELLSCHAFT製、製品名:Fastgreen FCF、品番:10720、オイルレッドは、東京化成工業株式会社製、製品名:Basic Red2、品番GB01-PALOを使用し、使用方法に準拠して当該切片を染色した。染色後の組織切片は、光学顕微鏡(Keyence Corporation、Osaka、Japan、製品名:BA-X700)にて観察した。その結果を図20、22~24に示す。
発明者は、カルシウム、リンなど硬組織を構成する元素は、骨形成を促進させる働きを持ち、カルシウムイオンを徐放させる骨補填材を作製すれば、骨形成を促進させる働きが期待できると考えた。具体的に、カルシウム源を炭酸カルシウムとし、これをLASCol固形物に含有させることにより、生体内でカルシウムイオンを徐放でき、骨誘導能が更に上がることが期待できるのではないかと考えた。当該仮説の下、以下の試験を行った。
線維芽細胞増殖因子(以下bFGFとする)は、未分化間葉系幹細胞を増殖および分化させることによって骨再生を促進することが知られている。発明者は、LASCol固形物は生体内に埋入されると分解され始めるので、bFGFなどの生理活性物質を放出させ続ける徐放材としての役割を具備した骨補填剤としての機能を有すると考えた。そこで、発明者は、遺伝子組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(商品名:フィブラスト、科研製薬)を含有させたLASCol固形物を作製し、一般的に自然経過では骨癒合しないとされるラット大腿骨critical欠損モデルを用いて、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有させたLASCol固形物が骨再生に与える影響について検討した。
Claims (10)
- コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物、または、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物を含む、コラーゲン固形物であって、
上記コラーゲン固形物の密度が、50mg/cm3以上であり、
上記コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物、および、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物は、コラーゲンのトリプルヘリカルドメインを含み、
上記トリプルヘリカルドメインは、Gly-X-Y(XおよびYは任意のアミノ酸)にて示されるアミノ酸配列を、少なくとも100個以上含み、
上記コラーゲン-システインプロテアーゼ分解物、および、アテロコラーゲン-システインプロテアーゼ分解物は、3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているものであり、
前記システインプロテアーゼは、アクチニダイン、カテプシンK、または、パパインである、
コラーゲン固形物。 - 上記コラーゲン固形物の接線係数が、90kPa以上である、請求項1に記載のコラーゲン固形物。
- 任意の物質を更に含む、請求項1または2に記載のコラーゲン固形物。
- 請求項1~3の何れか1項に記載のコラーゲン固形物を含む、生体材料。
- 請求項1~3の何れか1項に記載のコラーゲン固形物を含む、生体外材料。
- 請求項1~3の何れか1項に記載のコラーゲン固形物を含む、骨再生用材料。
- 請求項1~3の何れか1項に記載のコラーゲン固形物の製造方法であって、
システインプロテアーゼによって、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解する分解工程と、
上記分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物から溶媒を除去する除去工程と、を有し、
前記システインプロテアーゼは、アクチニダイン、カテプシンK、または、パパインである、
コラーゲン固形物の製造方法。 - 上記除去工程では、上記分解工程により得られた、コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物に、任意の物質を加えた後で、当該コラーゲン分解物またはアテロコラーゲン分解物と任意の物質との混合物から溶媒を除去する、請求項7に記載のコラーゲン固形物の製造方法。
- 上記除去工程では、当該除去工程にて得られたコラーゲン固形物に任意の物質を吸着させる、請求項7に記載のコラーゲン固形物の製造方法。
- 上記コラーゲン固形物は、円盤形、管形、円柱形、円錐形、矢じり形、六面体、多面体、多角柱形、蛇腹形、ネジ形、オスネジ形、メスネジ形、これら複数の形状が繋がった形状、または、粉末形状のものである、請求項1~3のいずれか1項に記載のコラーゲン固形物。
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