JP5973873B2 - 人工軟骨及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の人工軟骨は、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含む。コラーゲンにより軟骨組織の骨格となる網目構造が形成され、さらにヒアルロン酸及びプロテオグリカンとの架橋が物理的及び/又は化学的に形成され、十分な水分を保持することができ、軟骨特有の弾力性を有する人工軟骨が得られる。人工軟骨中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の量は、それぞれ45〜65質量%、20〜40質量%及び1.5〜5質量%であるのがより好ましい。この範囲である場合、人工軟骨は特に関節軟骨として好適である。
(1) 第一の方法
本発明の人工軟骨を製造する第一の方法は、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第一の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第一及び第2の組成物を混合し混合物を得る工程と、得られた混合物を凍結乾燥する工程(第一の凍結乾燥工程)とを有する。第一の方法はさらに、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、粉砕した凍結乾燥物を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程(第2の凍結乾燥工程)とを有してもよい。以下、人工軟骨を製造する第一の方法について詳細に説明する。
前記第一の組成物を調製する工程において、ヒアルロン酸及びコラーゲンの混合比(質量比)は10000:1〜1:10000であるのが好ましく、5000:1〜1:5000であるのがより好ましく、15:1〜1:15であるのが最も好ましい。コラーゲンはあらかじめ希塩酸(5〜50 mM程度の濃度)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。またヒアルロン酸は、あらかじめ無菌水(注射用水等)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液との混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
第一の組成物と第2の組成物との混合比は、混合後に15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含む組成となるように決める。第一及び第2の組成物の混合は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力を有する方法により行うのが好ましい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を2〜5回繰り返して行うのが好ましい。混合時の試料は3〜25℃程度に保つのが好ましい。別々に調製した第一及び第2の組成物を混合することにより、軟骨の合成の進行を促すことができる。
第一の組成物及び第2の組成物を混合して得られた混合物を、熱伝導性のよい容器(金属のバット等)に入れ、−80℃〜−60℃で一晩凍結する。凍結した混合物に対して、棚温度−50℃〜−5℃程度(好ましくは−40℃〜−5℃)で混合物の水分(氷)がほぼなくなるまで10時間〜10日間程度真空引きする第一の乾燥工程を行い、棚温度を20〜40℃程度(好ましくは25〜40℃)に上げてさらに3〜24時間真空引きする第2の乾燥工程を行う。このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥して優れた保存性を有する凍結乾燥物が得られる。
得られた凍結乾燥物はミル等の固体粉砕器で粉砕する。粉砕方法は特に限定されないが、凍結乾燥物があまり高い温度にならない方法が好ましい。
粉砕した凍結乾燥物は3〜20質量%の濃度となるように水又は生理食塩水と混合し、ホモジナイザー等の器具を用いて、3〜25℃及び1,000〜15,000 rpmの条件で、30秒〜3分間×1〜5回分散する。
得られた分散物は、シャーレ等の容器に入れフタをし、30〜40℃で1〜5時間静置してゲル化させる。
ゲル化させた分散物は再度凍結乾燥するのが好ましい。ゲル化させた分散物を2〜10℃で1〜20時間冷蔵し、さらに−20℃〜−60℃程度で一晩凍結する。凍結は、ゲル化させた分散物を入れた容器をステンレスバット内に置いた網皿の上に載せて行うのが好ましい。凍結した分散物は、前述の第一の凍結乾燥の場合と同様にして乾燥する。
凍結乾燥物は、機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工軟骨を長期間に渡って保持し得るようにするため、架橋処理するのが好ましい。架橋処理は、γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋方法、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋方法により行うことができる。化学的架橋方法には、例えば凍結乾燥物を架橋剤の溶液に浸漬する方法、凍結乾燥物に架橋剤を含有する蒸気を作用させる方法、及び製造中の人工軟骨の水性分散物に架橋剤を添加する方法が挙げられる。
本発明の人工軟骨を製造する第二の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する工程と、得られた混合物を凍結乾燥(第一の凍結乾燥)する工程とを有する。第二の方法はさらに、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、粉砕した凍結乾燥物を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程(第2の凍結乾燥)とを有してもよい。なお、第一の凍結乾燥工程以降は前述の第一の方法と同じであるのでそれらの説明は省略し、第二の方法のうちコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する工程についてのみ以下詳細に説明する。
(1)試料101の作製
市販の1質量%の濃度のコラーゲン水溶液を水で希釈し、0.5質量%の濃度のコラーゲン水溶液を調製した。プロテオグリカンの粉末を水で溶解し、0.5質量%の濃度のプロテオグリカン水溶液を調製した。ヒアルロン酸の粉末を水で溶解し、0.6質量%の濃度のヒアルロン酸水溶液を調製した。得られた0.6質量%の濃度のヒアルロン酸水溶液と、0.5質量%の濃度のプロテオグリカン水溶液とを1:2(質量比)で混合し、さらにこの混合液3 mLに0.5質量%の濃度のコラーゲン水溶液2 mLを混合した。
得られたコラーゲン/プロテオグリカン/ヒアルロン酸の混合液(pH 4.40)に、1 NのNaOH水溶液を10μL添加して前記混合液のpHを9.04に調節した以外は試料101と同様にして人工軟骨を得た。
(1) 原料溶液の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量%の濃度のコラーゲン水溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量%の濃度のプロテオグリカン水溶液を作製した。さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.1質量%の濃度のヒアルロン酸水溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
前記コラーゲン水溶液及びプロテオグリカン水溶液を、1:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Aを得た。同様に、前記コラーゲン水溶液及びヒアルロン酸水溶液を、1:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Bを得た。混合液A及びBを2:1(質量比)で混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの回転数で1分間の攪拌を30秒のインターバルをおいて3回行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
得られた混合物をバットに流し込み-80℃で19時間凍結した後、棚温度-5℃で10日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに3時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を10.7質量%の濃度となるように生理食塩水を混合しホモジナイザーで10,000 rpmの条件で、1分間の分散を3回行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
得られた分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で1時間静置してゲル化させた後、5℃で2時間冷蔵した。
ステンレスバット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で16時間凍結した後、棚温度-5℃以下で3日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに3時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
真空オーブンで110℃の条件で20時間熱脱水架橋した後、15 kGyの線量のガンマ線を照射して滅菌処理し、58.8質量%のコラーゲン、39.2質量%のプロテオグリカン及び1.96質量%のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
(1) 原料溶液の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量%の濃度のコラーゲン水溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量%の濃度のプロテオグリカン水溶液を作製した。さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.2質量%の濃度のヒアルロン酸水溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
作製したコラーゲン水溶液22.5 mL、プロテオグリカン水溶液105 mL、及びヒアルロン酸水溶液112.5 mLを混合し、ホモジナイザーで2,000 rpmの回転数で1分間の攪拌行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
得られた混合物をバットに流し込み-80℃で12時間凍結した後、棚温度-5℃で8日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに24時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を10.7質量%の濃度となるように生理食塩水を混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの条件で、1分間の分散を3回(インターバル:1分)行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
得られた分散物を、自転・公転ミキサー(シンキー社製、あわとり練太郎ARE-250)で1分攪拌し、分散物中に含まれる気泡を取り除いた。
脱泡した分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で3時間静置してゲル化した後、5℃で3時間冷蔵した。
ステンレスバット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で12時間凍結した後、棚温度-5℃で4日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
真空オーブン中で110℃の条件で20時間凍結乾燥物に熱脱水架橋をした後、15 kGyの線量のガンマ線を照射して滅菌処理し、15質量%のコラーゲン、70質量%のプロテオグリカン及び15質量%のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
285 mLのコラーゲン水溶液、14.7 mLのプロテオグリカン水溶液、及び1.5 mLのヒアルロン酸水溶液を用いた以外は実施例2と同様にして、95質量%のコラーゲン、4.9質量%のプロテオグリカン及び0.1質量%のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
82.5 mLのコラーゲン水溶液、37.5 mLのプロテオグリカン水溶液、及び150 mLのヒアルロン酸水溶液を用いた以外は実施例2と同様にして、55質量%のコラーゲン、25質量%のプロテオグリカン及び20質量%のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
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