DE102012110690A1

DE102012110690A1 - Künstlicher Knorpel und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE102012110690A1
Application number: DE102012110690A
Authority: DE
Inventors: Machiko KATO
Original assignee: Hoya Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2013-05-08
Also published as: US20130116187A1; CN103083722A; JP2013121496A; JP5973873B2

Abstract

Ein künstlicher Knorpel, umfassend 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure.

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft einen künstlichen Knorpel mit hervorragender Elastizität, der aus Bestandteilen lebenden Knorpels gewonnen ist, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Knorpelgewebe bestehen aus Knorpelzellen und Knorpelmatrix. Die Knorpelzellen, hoch differenzierte Zellen, beanspruchen nur etwa 10% der Knorpelgewebe. Obwohl sie sich nicht wesentlich durch Zellteilung vermehren, erzeugen sie Knorpelmatrixkomponenten und tragen damit zum Erhalt der Knorpelmatrix bei, die ungefähr 90% der Knorpelgewebe ausmacht.
Es sind Versuche unternommen worden, Knorpelgewebe unter Verwendung von Knorpelzellen zu regenerieren, die zur Behandlung beschädigter oder degenerierter Knorpel verwendet werden, doch die Bildung von knorpelartigen Geweben erfordert zwingend einen Prozess, bei dem die Knorpelzellen veranlasst werden, Knorpelmatrixkomponenten zu produzieren. Jedoch ist es schwierig, mit den bekannten Verfahren Knorpelzellen dazu zu veranlassen, Knorpelmatrix, die zum Heilen von Defekten ausreicht, effizient zu erzeugen was viele Probleme offenlässt.
Die chemische Synthese von Gewebe regenerierenden Materialien, die den Knorpelgeweben ähneln, wird ebenfalls untersucht. Beispielsweise offenbart die JP 2002-80501 A einen Glykosaminoglykan-Polykation-Verbundstoff für eine Gewebe-Regenerationsmatrix, der durch die Kondensationsreaktion von Glykosaminoglykanen und Polykationen gewonnen wird. Die JP 2002-80501 A beschreibt, dass der Verbundstoff als Material zum Regenieren von Geweben wie Knorpel, Leber, Blutgefäße, Nerven usw. nützlich ist. Der Verbundstoff der JP 2002-80501 A ist jedoch ein Zweikomponentenverbundstoff, der hauptsächlich aus Glykosaminoglykanen und Polykationen zusammengesetzt ist, sich von lebendem Knorpel unterscheidet und nicht genügend Körperaffinität aufweist. Da bei dem Herstellungsverfahren des Verbundstoffs Vernetzungsmittel und Kondensationsmittel eingesetzt werden, sollten zudem die Kondensationsmittel und ihre Nebenprodukte durch Waschen entfernt werden, wobei viel mehr Schritte benötigt werden, und in dem Verbundstoff verbleibende chemische Substanzen können im Körper gesundheitsschädlich sein. Da unter Verwendung von Vernetzungsmitteln und Kondensationsmittel erzeugte Verbundstoffe keine Nanostrukturen aufweisen, die denjenigen der lebenden Gewebe ähnlich sind, haben sie ferner auch wenig Reibung, Stauchwiderstand und Affinität zum lebenden Körper, was für den Knorpel notwendig ist.
Die US 2009/0311221 A1 offenbart ein Verfahren zum Herstellen eines selbstorganisierten Verbundstoffs aus Glyocsaminoglykan, Proteoglykan und Kollagen, umfassend die Schritte (a) des Mischens von Glykosaminoglykan mit Proteoglykan zum Erzeugen eines Glykosaminoglykan-Proteoglykan-Aggregats und (b) des Mischens des Glykosaminoglykan-Proteoglykan-Aggregats mit Kollagen. Die US 2009/0311221 A1 beschreibt, dass dieser Verbundstoff aus Glyocsaminoglykan, Proteoglykan und Kollagen Eigenschaften aufweist, die für Biomaterialien zum Regenieren des Knorpels geeignet sind, und dass, da er durch Selbstorganisation erzeugt ist, ein Schritt, bei dem Verunreinigungen usw. entfernt werden, nicht notwendig ist. Jedoch bestehen Verbundstoffe, die durch das Verfahren der US 2009/0311221 A1 hergestellt werden, im Wesentlichen nur aus Kollagenkomponenten, wobei keine ausreichende Selbstorganisation stattfindet.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Folglich ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen künstlichen Knorpel mit ausgezeichneter mechanischer Festigkeit, Affinität zum lebenden Körper und Selbstorganisation anzugeben, der aus einem Verbundstoff aus Glyocsaminoglykan, Proteoglykan und Kollagen besteht.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Als Ergebnis intensiver Forschung im Hinblick auf oben genannte Aufgabe kam der Erfinder zu der Erkenntnis, dass ein Verbundstoff, der durch Gefriertrocknen einer Dispersion, die Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in bestimmten Verhältnissen umfasst, hergestellt ist, als künstlicher Knorpel geeignet ist. Die vorliegende Erfindung wurde ausgehend von dieser Erkenntnis ausgeführt.
Somit umfasst der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure.
Der künstliche Knorpel ist vorzugsweise vernetzt.
Der künstliche Knorpel ist vorzugsweise sterilisiert.
Das erste Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Herstellen eines Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure umfassenden künstlichen Knorpels umfasst die Schritte des Zubereitens eines ersten Gemischs umfassend Hyaluronsäure und Kollagen, des Zubereitens eines zweiten Gemischs umfassend Proteoglykan und Kollagen, des Mischens des ersten und des zweiten Gemischs und des Gefriertrocknens der daraus resultierenden Mischung (erstes Gefriertrocknen).
Das zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Herstellen eines Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure umfassenden künstlichen Knorpels umfasst die Schritte des Mischens von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure und des Gefriertrocknens der daraus resultierenden Mischung (erstes Gefriertrocknen).
Die Mischung wird vorzugsweise nach dem Gefriertrocknen vernetzt.
Das erste und das zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Herstellen eines künstlichen Knorpels umfassen vorzugsweise ferner die Schritte des Pulverisierens des gefriergetrockneten Produkts, des Dispergierens des resultierenden Pulvers des gefriergetrockneten Produkts in Wasser und das erneute Gefriertrocknen der daraus resultierenden Dispersion (zweites Gefriertrocknen).
Das Vernetzen wird vorzugsweise nach dem zweiten Gefriertrocknen durchgeführt.
Die Vernetzungsbehandlung ist vorzugsweise Vernetzen durch thermische Dehydration.
Der vernetzte künstliche Knorpel wird vorzugsweise mit γ-Strahlen bestrahlt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
[1] Künstlicher Knorpel
Der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung umfasst 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure. Kollagen bildet eine Netzstruktur, die als Gerüst für Knorpelgewebe fungiert und seine physikalische und/oder chemische Vernetzung mit Hyaluronsäure und Proteoglykan ermöglicht es, ausreichend Wasser zu speichern, was einen künstlichen Knorpel ergibt, der die dem Knorpel eigene Elastizität aufweist. Die Anteile an Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in dem künstlichen Knorpel liegen vorzugsweise bei 45–65 Masseprozent, 20–40 Masseprozent bzw. 1,5–5 Masseprozent. Innerhalb dieses Bereichs ist der künstliche Knorpel besonders als Gelenkknorpel geeignet.
Wenn der Kollagenanteil unter 15 Masseprozent liegt, weist der künstliche Knorpel ein großes Expansionsverhältnis auf, wenn er in einen lebenden Körper eingesetzt ist, sodass er nicht leicht an Knorpeldefekte gepasst werden kann. Zudem vermindert die Expansion die Porosität des künstlichen Knorpels. Beträgt der Kollagenanteil mehr als 95 Masseprozent, ist der künstliche Knorpel extrem gefärbt. Wenn der Proteoglykananteil unter 4,9 Masseprozent liegt, hat der künstliche Knorpel geringe Elastizität, ein schlechtes Verhalten als Knorpel. Beträgt der Proteoglykananteil mehr als 70 Masseprozent, erfährt der künstliche Knorpel starke Größenänderungen durch Expansion, was zu geringer Porosität führt. Wenn der Anteil an Hyaluronsäure unter 0,1 Masseprozent liegt, hat der künstliche Knorpel geringe Elastizität, ein schlechtes Verhalten als Knorpel und geringe Oberflächenfeuchtigkeit (geringe Reibung). Mehr als 20 Masseprozent an Hyaluronsäure übersteigt ihre Menge im lebenden Knorpel bei weitem, was den künstlichen Knorpel von dem lebenden Knorpel verschieden macht, was dazu führt, dass es schwierig wird, in Abhängigkeit der Teile, an denen der künstliche Knorpel eingesetzt wird, ein bestimmtes Verhältnis von Kollagen zu Proteoglykan zu gewährleisten.
Das Kollagen unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sondern kann aus Tieren usw. extrahiert sein. Die Tiere, von denen Kollagen gewonnen wird, sind hinsichtlich ihrer Arten, Gewebe, ihres Alters usw. nicht eingeschränkt. Allgemein sind Kollagene verwendbar, die aus Häuten, Knochen, Knorpeln, Sehnen, inneren Organen usw. von Säugetieren wie beispielsweise Kuh, Schwein, Pferd, Kaninchen und Ratte sowie Vögeln wie beispielsweise Huhn usw. gewonnen sind. Kollagenartige Proteine, die aus Häuten, Gräten, Knorpeln, Flossen, Schuppen, inneren Organen usw. von Fischen wie beispielsweise Dorsch, Flunder, Plattfisch, Lachs, Forelle, Tunfisch, Makrele, Roter Schnapper, Sardine, Hai usw. gewonnen sind, können ebenfalls verwendet werden. Das Verfahren zum Extrahieren von Kollagen ist nicht speziell einschränkend, sondern kann ein gewöhnliches sein. An Stelle von aus Tiergeweben extrahiertem Kollagen kann auch durch Genrekombinationstechniken produziertes Kollagen verwendet werden.
Glykosaminoglykan ist ein saures Polysaccharid mit einer sich wiederholenden Disaccharideinheit, die Aminozucker kombiniert mit Uronsäure oder Galaktose enthält. Die bei vorliegender Erfindung verwendete Hyaluronsäure ist eine Art der Glykosaminoglykane. Zwar sind neben Hyaluronsäure auch Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat, Heparin usw. verwendbar, doch ist es vorzuziehen, Hyaluronsäure zu verwenden.
Das Proteoglykan ist eine Verbindung, die eine oder mehrere Glykosaminoglykan-Ketten hat, die an ein als Kern fungierendes Protein gebunden sind. Das Proteoglykan ist nicht besonders eingeschränkt, sondern kann Aggrekan, Versikan, Neurokan, Brevikan, Dekorin, Biglykan, Serglyzin, Perlekan, Syndekan, Glypikan, Lumikan, Keratokan usw. sein. Davon ist Aggrekan vorzuziehen.
Proteoglykanquellen sind nicht speziell eingeschränkt, und verschiedene Tiere, wie beispielsweise Säugetiere (Mensch, Kuh, Schwein usw.), Vögel (Huhn usw.), Fische (Hai, Lachs usw.), Kurstentiere (Krabben, Garnelen usw.) können je nach Anwendung des Verbundstoffs geeignet verwendet werden. Insbesondere wenn der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung zum Heilen von Defekten oder Regeneration menschlichen Knorpels verwendet wird, ist es vorzuziehen, diejenigen mit geringer Human-Immunogenität/Immunogenität im menschlichen Körper zu verwenden.
Das Bestimmen von Kollagen in dem künstlichen Knorpel kann durch ein UV-Adsorptionsmessverfahren, ein HPLC-Verfahren usw. durchgeführt werden. Das Bestimmen von Hyaluronsäure kann durch ein Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren, ein Inhibitionsverfahren unter Verwendung eines Hyaluronsäure bindenden Proteins, ein HPLC-Verfahren usw. durchgeführt werden. Das Bestimmen von Proteoglykan kann durch ein kalorimetrisches Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines DMMB-Pigments, ein HPLC-Verfahren usw. durchgeführt werden.
Der künstliche Knorpel ist vorzugsweise vernetzt. Die Vernetzungsbehandlung kann durch ein physikalisches oder ein chemisches Verfahren durchgeführt werden. Der künstliche Knorpel ist auch vorzugsweise durch ein Verfahren, wie beispielsweise ein γ-Strahlen-Bestrahlungsverfahren usw. sterilisiert.
Die Porosität des künstlichen Knorpels ist vorzugsweise 50–99%, insbesondere 60–99%. Der mittlere Porendurchmesser des Knorpels beträgt vorzugsweise 1–1000 μm, insbesondere 50–800 μm.
[2] Herstellverfahren
(1) Erstes Verfahren
Das erste Verfahren zum Herstellen des künstlichen Knorpels der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte des Zubereitens eines ersten Gemischs umfassend Hyaluronsäure und Kollagen, des Zubereitens eines zweiten Gemischs umfassend Proteoglykan und Kollagen, des Mischens des ersten und des zweiten Gemischs und des Gefriertrocknens der daraus resultierenden Mischung (erster Gefriertrocknungsschritt). Das erste Verfahren kann ferner die Schritte des Pulverisierens der gefriergetrockneten Mischung, des Dispergieren der pulverisierten gefriergetrockneten Mischung in Wasser und des erneuten Gefriertrocknens der daraus resultierenden Dispersion (zweiter Gefriertrocknungsschritt). Das erste Verfahren zum Herstellen des künstlichen Knorpels wird nachstehend ausführlich erläutert.
(a) Zubereiten des ersten und des zweiten Gemischs
Bei dem Schritt des Zubereitens des ersten Gemischs ist ein Mischungsverhältnis (massemäßig) von Hyaluronsäure zu Kollagen vorzugsweise 10000/1 bis 1/10000, insbesondere 5000/1 bis 1/5000, am besten 15/1 bis 1/15. Das Kollagen wird vorzugsweise vorab in verdünnter Chlorwasserstoffsäure (Konzentration: ungefähr 5–50 mM) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Die Hyaluronsäure wird vorzugsweise vorab in sterilem Wasser (Injektionswasser, usw.) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Die wässrige Hyaluronsäurelösung und die wässrige Kollagenlösung werden vorzugsweise bi 3°C bis 25°C gemischt.
Bei dem Schritt des Zubereitens des zweiten Gemischs ist ein Mischungsverhältnis (massemäßig) von Proteoglykan zu Kollagen vorzugsweise 10000/1 bis 1/10000, insbesondere 5000/1 bis 1/5000, am besten 10/1 bis 1/10. Das Kollagen wird vorzugsweise vorab in verdünnter Chlorwasserstoffsäure (Konzentration: ungefähr 5–50 mM) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Das Proteoglykan wird vorzugsweise vorab in sterilem Wasser (Injektionswasser, usw.) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Die wässrige Proteoglykanlösung und die wässrige Kollagenlösung werden vorzugsweise bei 3°C bis 25°C gemischt.
Da das Mischen der wässrigen Hyaluronsäurelösung und der wässrigen Kollagenlösung (die Zubereitung des ersten Gemischs) und das Mischen der wässrigen Proteoglykanlösung und der wässrigen Kollagenlösung (die Zubereitung des zweiten Gemischs) kein besonders hohes Scheren erfordern, können gewöhnliche Geräte wie Rührer, Mischer usw. verwendet werden. Das Mischen wird vorzugsweise bei 3°C bis 25°C für ungefähr 1 Sekunde bis ungefähr 3 Minuten durchgeführt, um eine homogene Mischung von Hyaluronsäure und Kollagen und eine homogene Mischung von Proteoglykan und Kollagen zu erhalten.
(b) Mischen des ersten und des zweiten Gemischs
Das Mischungsverhältnis des ersten Gemischs zu dem zweiten Gemisch wird so festgelegt, dass die resultierende Mischung 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure enthält. Das erste Gemisch wird vorzugsweise durch ein eine Scherkraft anwendendes Verfahren mittels eines Homogenisators, eines Dissolvers usw. mit dem zweiten Gemisch gemischt. Wenn beispielsweise der Homogenisator verwendet wird, wird ein Rührschritt bei 1000 bis 12000 U/min für 30 Sekunden bis 3 Minuten vorzugsweise 2 bis 5 Mal wiederholt. Während des Mischens wird eine Probe vorzugsweise auf 3°C bis 25°C gehalten. Das Mischen des ersten und des zweiten Gemischs, die separat zubereitet werden, beschleunigt die Synthese von Knorpel.
(c) Erstes Gefriertrocknen
Eine Mischung aus dem ersten und dem zweiten Gemisch wird in ein Wärme leitendes Gefäß (Metallschale usw.) gegeben und bei –80°C bis –60°C über Nacht gefroren. Die gefrorene Mischung wird bei einer Regaltemperatur von ungefähr –50°C bis ungefähr –5°C (vorzugsweise –40°C bis –5°C) im Vakuum für ungefähr 10 Stunden bis ungefähr 10 Tage einem ersten Trocknungsschritt unterzogen, bis die Mischung Wasser (Eis) im Wesentlichen vollständig verliert, und wird bei einer Regaltemperatur von ungefähr 20°C bis ungefähr 40°C (vorzugsweise 25°C bis 40°C) im Vakuum für 3 bis 24 Stunden einem zweiten Trocknungsschritt unterzogen. Selbst gebundenes Wasser kann durch derartiges zweistufiges Gefriertrocknen bei unterschiedlichen Temperaturen entfernt werden, was ein gut gefriergetrocknetes Produkt mit exzellenter Lagerfähigkeit ergibt.
Zwar kann das gefriergetrocknete Produkt als künstlicher Knorpel verwendet werden, wie es ist, doch kann es einem Pulverisierungsschritt (d) durch einen zweiten Gefriertrocknungsschritt (g) wie unten beschrieben unterzogen werden. Der Pulverisierungsschritt verleiht dem künstlichen Knorpel hohe Dichte. Das durch den ersten und den zweiten Gefriertrocknungsschritt erzeugte Produkt wird vorzugsweise einer Vernetzungsbehandlung und/oder einer Sterilisierungsbehandlung unterzogen, wie unten beschrieben.
(d) Pulverisierung
Das gefriergetrocknete Produkt wird durch ein Feststoff-Pulverisierungsgerät, wie z. B. eine Mühle usw. pulverisiert. Ein Pulverisierungsverfahren ist nicht speziell eingeschränkt, ist aber vorzugsweise ein Verfahren, das das gefriergetrocknete Produkt keinen übermäßig hohen Temperaturen aussetzt.
(e) Dispergieren
Das pulverisierte gefriergetrocknete Produkt wird mit Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 3–20 Masseprozent gemischt und bei 3°C bis 25°C und bei 1000 bis 15000 U/min für 30 Sekunden bis 3 Minuten unter Verwendung eines Geräts, wie z. B. eines Homogenisators usw. 1 bis 5 Mal einer Dispergierungsbehandlung unterzogen.
(f) Gelieren
Die resultierende Dispersion wird in ein Gefäß, wie z. B. eine Petrischale usw. gegossen und abgedeckt und dann bei 30°C bis 40°C für 1 bis 5 Stunden zum Gelieren stehen gelassen.
(g) Zweites Gefriertrocknen
Die gelierte Dispersion wird vorzugsweise erneut gefriergetrocknet. Die gelierte Dispersion wird bei 2°C bis 10°C für 1 bis 20 Stunden abgekühlt und dann bei ungefähr –20°C bis ungefähr –60°C über Nacht gefroren. Das Gefrieren wird vorzugsweise mit einem Gefäß durchgeführt, das die gelierte Dispersion enthält und in einem Tablett aus rostfreiem Stahl auf einem Netzregal platziert ist. Die gefrorene Dispersion wird auf die gleiche Weise getrocknet wie bei der oben beschriebenen ersten Gefriertrocknung.
(h) Vernetzungs- und Sterilisierungsbehandlung
Um dem künstlichen Knorpel erhöhte mechanische Festigkeit zu verleihen und den künstlichen Knorpel über einen langen Zeitraum in dem Körper behaltbar zu machen, wird die gefriergetrocknete Dispersion vorzugsweise vernetzt. Das Vernetzen kann durch physikalische Vernetzungsverfahren unter Verwendung von γ-Strahlen, UV-Strahlen, Elektronenstrahlen, thermische Dehydratation usw. oder durch chemische Vernetzungsverfahren unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, Kondensationsmitteln usw. durchgeführt werden. Zu den chemischen Vernetzungsverfahren gehört beispielsweise ein Verfahren, bei dem die gefriergetrocknete Dispersion in eine Vernetzungsmittellösung getaucht wird, ein Verfahren, bei dem ein ein Vernetzungsmittel enthaltender Dampf auf die gefriergetrocknete Dispersion angewendet wird, und ein Verfahren, bei dem einer wässrigen Dispersion des in der Herstellung befindlichen künstlichen Knorpels ein Vernetzungsmittel zugegeben wird.
Von diesen Verfahren ist für vorliegende Erfindung das Vernetzungsverfahren der thermischen Dehydratation vorzuziehen. Die Vernetzung durch thermische Dehydratation kann durchgeführt werden, indem die gefriergetrocknete Dispersion bei 100°C bis 160°C und bei 0 bis 100 hPa für 10 bis 30 Stunden in einem Vakuumofen gehalten wird.
Der so erzeugte künstliche Knorpel wird vorzugsweise durch UV-Strahlen, γ-Strahlen, Elektronenstrahlen, Trocknen durch Wärme usw. sterilisiert. Eine besonders bevorzugte Sterilisierung ist die Bestrahlung mit γ-Strahlen von 25 kGy oder darunter.
(2) Zweites Verfahren
Das zweite Verfahren zum Herstellen des künstlichen Knorpels der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte des Mischens von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure und des Gefriertrocknens der resultierenden Mischung (erster Gefriertrocknungsschritt). Das zweite Verfahren kann ferner die Schritte des Pulverisierens des gefriergetrockneten Produkts, des Dispergierens des pulverisierten gefriergetrockneten Produkts in Wasser und des erneuten Gefriertrocknens der resultierenden Dispersion (zweiter Gefriertrocknungsschritt) umfassen. Da sich das zweite Verfahren in dem ersten Gefriertrocknungsschritt und den folgenden Schritten nicht von dem ersten Verfahren unterscheidet, entfallen die Erläuterungen dieser Schritte, und nur der Schritt des Mischens von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure bei dem zweiten Verfahren wird nachfolgend ausführlich beschrieben.
Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure werden so gemischt, dass das resultierende Gemisch 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure enthält. Das Kollagen wird vorzugsweise vorab in Wasser oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure (Konzentration: ungefähr 5–50 mM) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Das Proteoglykan wird vorzugsweise vorab in sterilem Wasser (Injektionswasser, usw.) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst. Die Hyaluronsäure wird vorzugsweise vorab in sterilem Wasser (Injektionswasser, usw.) in einer Konzentration von 0,1–20 Masseprozent gelöst.
Die wässrige Kollagenlösung, die wässrige Proteoglykanlösung und die wässrige Hyaluronsäurelösung werden vorzugsweise unter einer Scherkraft unter Verwendung eines Geräts wie eines Homogenisators, eines Dissolvers usw. gemischt. Beispielsweise wird, wenn der Homogenisator verwendet wird, Rühren bei 1000 bis 12000 U/min für 30 Sekunden bis 3 Minuten vorzugsweise 2 bis 5 Mal wiederholt. Das Mischen der wässrigen Kollagenlösung, der wässrigen Proteoglykanlösung und der wässrigen Hyaluronsäurelösung wird vorzugsweise bei 3°C bis 25°C durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher erläutert, ohne die vorliegende Erfindung auf diese beschränken zu wollen.
Vergleichsbeispiel 1
(1) Herstellung der Probe 101
Eine im Handel erhältliche wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration von 1 Masseprozent wurde mit Wasser verdünnt, um eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration von 0,5 Masseprozent zuzubereiten. Proteoglykanpulver wurde in Wasser gelöst, um eine wässrige Proteoglykanlösung mit einer Konzentration von 0,5 Masseprozent zuzubereiten. Hyaluronsäurepulver wurde in Wasser gelöst, um eine wässrige Hyaluronsäurelösung mit einer Konzentration von 0,6 Masseprozent zuzubereiten. Die wässrige Hyaluronsäurelösung mit einer Konzentration von 0,6 Masseprozent wurde mit der wässrigen Proteoglykanlösung mit einer Konzentration von 0,5 Masseprozent in einem Massenverhältnis von 1/2 gemischt, und 3 mL der resultierenden Mischungslösung wurden weiter mit 2 mL der wässrigen Kollagenlösung mit einer Konzentration von 0,5 Masseprozent gemischt.
Die resultierende Mischungslösung aus Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure mit einem pH-Wert von 4.40 wurde mit 8 μL einer 1 – N wässrigen NaOH-Lösung gemischt, um den pH-Wert der Mischungslösung auf 6,03 einzustellen. Der pH-Wert von 6,03 wurde als im Wesentlichen neutral angesehen. Die Mischungslösung aus Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure, deren pH-Wert eingestellt war, wurde bei 37°C in einen schwingungsfähigen Inkubator gefüllt (Hybridisierungs-Inkubator HB-100, erhältlich von TAITEC), für 4 Stunden bei 60 U/min gerüttelt und dann bei 23000 U/min für 30 Minuten einem ersten Ultrazentrifugalseparations-Vorgang unterzogen, um eine feste Komponente auszufällen. Der resultierende Bodenkörper und der Überstand wurden ohne Separation bei 37°C über Nacht stehen gelassen. Der Bodenkörper behielt direkt nach dem Ultrazentrifugalseparations-Vorgang die Form. Der Bodenkörper und der Überstand, die über Nacht stehen gelassen worden waren, wurden einem zweiten Ultrazentrifugalseparations-Vorgang bei 23000 U/min für 30 Minuten unterzogen. Nach Ersetzen des Überstands durch eine physiologische Kochsalzlösung wurde ein dritter Ultrazentrifugalseparations-Vorgang bei 23000 U/min für 30 Minuten durchgeführt, um einen Bodenkörper (künstlichen Knorpel) zu gewinnen.
(2) Herstellung der Probe 102
Künstlicher Knorpel wurde auf die gleiche Weise wie bei Beispiel 101 hergestellt, außer dass die Mischungslösung aus Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure mit einem pH-Wert von 4,40 mit 10 μL einer 1 – N wässrigen NaOH-Lösung gemischt wurde, um den pH-Wert der Mischungslösung auf 9,04 einzustellen.
Da im Wesentlichen alle unreagierten Bestandteile nach der zweiten Ultrazentrifugalseparation in dem Überstand enthalten waren, wurden die Mengen von Proteoglykan und Hyaluronsäure in diesem Überstand bestimmt, um die Mengen von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in dem Bodenkörper (dem künstlichen Knorpel) zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Aus Tabelle 1 geht hervor, dass der Bodenkörper von Probe 101 (im Wesentlichen neutral) im Wesentlichen kein Proteoglykan und keine Hyaluronsäure enthielt, die in dem lebenden Knorpel enthalten sein sollten, sondern dass er im Wesentlichen nur aus Kollagen bestand, und dass der Bodenkörper der Probe 102 (alkalisch), bei einer kleinen Menge Proteoglykan, im Wesentlichen keine Hyaluronsäure enthielt. Tabelle 1

Nr. Anteil¹ an gesammeltem Bodenkörper (%) Zusammensetzung (Masseprozent)

Kollagen Proteoglykan Hyaluronsäure

Probe 101 42 100 0 0

Probe 102 42 95,6 4,4 0

*Hinweis: (1) Der Anteil der Menge des gesammelten Bodenkörpers pro Gesamtmenge der verwendeten Ausgangsmaterialien.
Beispiel 1
(1) Zubereitung der Ausgangsmateriallösung
Kollagen wurde in 5-mM-Chlorwasserstoffsäure gelöst, um eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration von 1 Masseprozent zuzubereiten. Proteoglykan wurde in Injektionswasser gelöst, um eine wässrige Proteoglykanlösung mit einer Konzentration von 1 Masseprozent zuzubereiten. Hyaluronsäure wurde in Injektionswasser gelöst, um eine wässrige Hyaluronsäurelösung mit einer Konzentration von 0,1 Masseprozent zuzubereiten. Alle diese Zubereitungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt.
(2) Mischen der Ausgangsmaterialien
Die wässrige Kollagenlösung wurde mit der wässrigen Proteoglykanlösung in einem Massenverhältnis von 1/1 gemischt und durch einen Mixer gerührt, um eine Mischungslösung A zuzubereiten. Entsprechend wurde die wässrige Kollagenlösung mit der wässrigen Hyaluronsäurelösung in einem Massenverhältnis von 1/1 gemischt und durch einen Mixer gerührt, um eine Mischungslösung B zuzubereiten. Die Mischungslösungen A und B wurden in einem Massenverhältnis 2/1 gemischt und 3 Mal in 30-Sekunden-Inverallen dem Rühren durch einen Homogenisator bei 10000 U/min für 1 Minute unterzogen. Das Rühren wurde durchgeführt, während die Temperatur der Probe auf 5°C gehalten wurde.
(3) Gefriertrocknen
Die resultierende Mischung wurde in eine Schale gegossen, bei –80°C für 19 Stunden gefroren und dann einer ersten Trocknung bei einer Regaltemperatur von –5°C im Vakuum für 10 Tage unterzogen. Durch die erste Trocknung verlor die Mischung im Wesentlichen das gesamte Wasser (Eis). Während die Evakuierung fortgesetzt wurde, wurde dann die zweite Trocknung bei einer Regaltemperatur von 25°C für 3 Stunden durchgeführt, wodurch ein gefriergetrocknetes Produkt gewonnen wurde.
(4) Pulverisieren und Dispergieren
Das gefriergetrocknete Produkt wurde durch eine Mühle pulverisiert, und das pulverisierte gefriergetrocknete Produkt wurde mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 10,7 Masseprozent gemischt und 3 Mal einer Dispergierungsbehandlung durch einen Homogenisator bei 10000 U/min für 1 Minute unterzogen. Während der Dispergierung durch den Homogenisator wurde die Mischung auf 5°C gehalten.
(5) Gelieren
Die resultierende Dispersion wurde in eine Glas-Petrischale gegossen, abgedeckt bei 37,5°C für eine Stunde zum Gelieren stehen gelassen und dann für 2 Stunden bei 5°C gekühlt.
(6) Gefriertrocknen
Die abgekühlte Mischung in der Petrischale wurde in einer Schale aus rostfreiem Stahl auf einem Netzregal platziert, bei –60°C für 16 Stunden gefroren und dann für 3 Tage einer ersten Trocknung bei einer Regaltemperatur von –5°C oder darunter im Vakuum unterzogen. Durch die erste Trocknung verlor die Mischung im Wesentlichen das gesamte Wasser (Eis). Während die Evakuierung beibehalten wurde, wurde dann die zweite Trocknung bei einer Regaltemperatur von 25°C für 3 Stunden durchgeführt, wodurch ein gefriergetrocknetes Produkt gewonnen wurde.
(7) Vernetzung und Sterilisierung
Das gefriergetrocknete Produkt wurde dann der Vernetzung durch thermische Dehydratation bei 110°C für 20 Stunden in einem Vakuumofen unterzogen und zur Sterilisierung mit γ-Strahlen in einer Dosierung von 15 kGy bestrahlt, wodurch der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung umfassend 58,8 Masseprozent Kollagen, 39,2 Masseprozent Proteoglykan und 1,96 Masseprozent Hyaluronsäure gewonnen wurde.
Beispiel 2
(1) Zubereiten der Ausgangsmateriallösung
Kollagen wurde in 5-mM-Chlorwasserstoffsäure gelöst, um eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration von 1 Masseprozent zuzubereiten. Proteoglykan wurde in Injektionswasser gelöst, um eine wässrige Proteoglykanlösung mit einer Konzentration von 1 Masseprozent zuzubereiten. Hyaluronsäure wurde in Injektionswasser gelöst, um eine wässrige Hyaluronsäurelösung mit einer Konzentration von 0,2 Masseprozent zuzubereiten. Alle diese Zubereitungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt.
(2) Mischen der Ausgangsmaterialien
22,5 mL der wässrigen Kollagenlösung, 105 mL der wässrigen Proteoglykanlösung und 112,5 mL der wässrigen Hyaluronsäure wurden gemischt und bei 2000 U/min für 1 Minute mit einem Homogenisator gerührt. Während des Rührens wurde die Temperatur einer Probe auf 5°C gehalten.
(3) Gefriertrocknen
Die resultierende Mischung wurde in eine Schale gegossen, bei –80°C für 12 Stunden gefroren und dann einer ersten Trocknung bei einer Regaltemperatur von –5°C im Vakuum für 8 Tage unterzogen. Durch die erste Trocknung verlor die Mischung im Wesentlichen das gesamte Wasser (Eis). Während die Evakuierung fortgesetzt wurde, wurde dann die zweite Trocknung bei einer Regaltemperatur von 25°C für 24 Stunden durchgeführt, wodurch ein gefriergetrocknetes Produkt gewonnen wurde.
(4) Pulverisieren und Dispergieren
Das gefriergetrocknete Produkt wurde durch eine Mühle pulverisiert, und das pulverisierte gefriergetrocknete Produkt wurde mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 10,7 Masseprozent gemischt und in Abständen von 1 Minute 3 Mal für 1 Minute einer Dispergierung durch einen Homogenisator bei 10000 U/min unterzogen. Während der Dispergierung durch den Homogenisator wurde die Mischung auf 5°C gehalten.
(5) Entgasen
Die resultierende Dispersion wurde für eine 1 Minute durch einen Planeten-Zentrifugalmischer (ARE-250, erhältlich von Thinky Corporation) gerührt, um Blasen aus der Dispersion zu entfernen.
(6) Gelieren
Die entgaste Dispersion wurde in eine Glas-Petrischale gegossen, abgedeckt und bei 37,5°C für 3 Stunden zum Gelieren stehen gelassen und dann für 3 Stunden bei 5°C gekühlt.
(6) Gefriertrocknen
Die abgekühlte Mischung in der Petrischale wurde in einer Schale aus rostfreiem Stahl auf einem Netzregal platziert, bei –60°C für 12 Stunden gefroren und dann für 4 Tage einer ersten Trocknung bei einer Regaltemperatur von –5°C im Vakuum unterzogen. Durch die erste Trocknung verlor die Mischung im Wesentlichen das gesamte Wasser (Eis). Während die Evakuierung fortgesetzt wurde, wurde dann die zweite Trocknung bei einer Regaltemperatur von 25°C für 4 Stunden durchgeführt, wodurch ein gefriergetrocknetes Produkt gewonnen wurde.
(7) Vernetzung und Sterilisierung
Das gefriergetrocknete Produkt wurde dann der Vernetzung durch thermische Dehydratation bei 110°C für 20 Stunden in einem Vakuumofen unterzogen und zum Sterilisieren mit γ-Strahlen in einer Dosierung von 15 kGy bestrahlt, wodurch der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung umfassend 15 Masseprozent Kollagen, 70 Masseprozent Proteoglykan und 15 Masseprozent Hyaluronsäure gewonnen wurde.
Beispiel 3
Der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung, umfassend 95 Masseprozent Kollagen, 4,9 Masseprozent Proteoglykan und 0,1 Masseprozent Hyaluronsäure wurde auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 2, außer dass 285 mL der wässrigen Kollagenlösung, 14,7 mL der wässrigen Proteoglykanlösung und 1,5 ml der wässrigen Hyaluronsäure verwendet wurden.
Beispiel 4
Der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung, umfassend 55 Masseprozent Kollagen, 25 Masseprozent Proteoglykan und 20 Masseprozent Hyaluronsäure wurde auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 2, außer dass 82,5 mL der wässrigen Kollagenlösung, 37,5 mL der wässrigen Proteoglykanlösung und 150 ml der wässrigen Hyaluronsäure verwendet wurden.

Die Zusammensetzungen von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in den Proben 101 und 102 des Vergleichsbeispiels 1 und den Proben der Beispiele 1–4 sind Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Nr.	Zusammensetzung (Masseprozent)
Nr.	Kollagen	Proteoglykan	Hyaluronsäure
Beispiel 1	58,8	39,2	1,96
Beispiel 2	15	70	15
Beispiel 3	95	4,9	0,1
Beispiel 4	55	25	20
Vergleichsbeispiel 1 (Probe 101)	100	0	0
Vergleichsbeispiel 1 (Probe 102)	95,6	4,4	0

Tabelle 3 zeigt die Elastizität der Beispiele 1–4. Da die Proben 101 und 102 des Vergleichsbeispiels 1 in einem Elastizitätstest gebrochen waren, konnte ihre Elastizität nicht gemessen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die künstlichen Knorpel der Beispiele 1–4 im Rahmen der vorliegenden Erfindung hohe Elastizität aufweisen. Tabelle 3

Nr.	Elastizität (MPa)
Nr.	Mittelwert	Standardabweichung
Beispiel 1	0,091	0,032
Beispiel 2	0,077	0,069
Beispiel 3	0,025	0,012
Beispiel 4	0,085	0,041
Vergleichsbeispiel 1 (Probe 101)	Während der Messung gebrochen
Vergleichsbeispiel 1 (Probe 102)	Während der Messung gebrochen

Somit ist klar, dass, während künstliche Knorpel, die durch herkömmliche Verfahren (das Verfahren des Vergleichsbeispiels 1) hergestellt sind, im Wesentlichen kein Proteoglykan und keine Hyaluronsäure enthalten, andere Zusammensetzungen als lebender Knorpel haben und nicht die für den künstlichen Knorpel notwendigen Eigenschaften aufweisen, der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung hat, die derjenigen des lebenden Knorpels ähnlich ist und Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in bestimmten Verhältnissen enthält, wodurch er eine genügend größere mechanische Festigkeit aufweist als derjenige des Vergleichsbeispiels 1.
WIRKUNG DER ERFINDUNG
Da der künstliche Knorpel der vorliegenden Erfindung Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure in bestimmten Verhältnissen enthält, weist er exzellente mechanische Festigkeit, Affinität zum lebenden Körper und Selbstorganisation auf. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann solchen künstlichen Knorpel mit exzellenter mechanischer Festigkeit, Affinität zum lebenden Körper und Selbstorganisation leicht herstellen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

JP 2002-80501 A [0004, 0004, 0004]
US 2009/0311221 A1 [0005, 0005, 0005]

Claims

Künstlicher Knorpel, umfassend 15–95 Masseprozent Kollagen, 4,9–70 Masseprozent Proteoglykan und 0,1–20 Masseprozent Hyaluronsäure.
Künstlicher Knorpel nach Anspruch 1, der vernetzt ist.
Künstlicher Knorpel nach Anspruch 1 oder 2, der sterilisiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure umfassenden künstlichen Knorpels, umfassend die Schritte des Zubereitens eines ersten Gemischs, umfassend Hyaluronsäure und Kollagen, des Zubereitens eines zweiten Gemischs, umfassend Proteoglykan und Kollagen, des Mischens des ersten und des zweiten Gemischs und des Gefriertrocknens der resultierenden Mischung.
Verfahren zum Herstellen eines Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure umfassenden künstlichen Knorpels, umfassend die Schritte des Mischens von Kollagen, Proteoglykan und Hyaluronsäure und des Gefriertrocknens der resultieren Mischung.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 4 oder 5, bei dem nach dem Gefriertrocknen Vernetzen durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 6, bei dem die Vernetzungsbehandlung Vernetzung durch thermische Dehydratation ist.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 6 oder 7, bei dem der vernetzte künstliche Knorpel mit γ-Strahlen bestrahlt wird.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 4 oder 5, das ferner die Schritte des Pulverisierens des gefriergetrockneten Produkts, des Dispergierens des resultierenden Pulvers des gefriergetrockneten Produkts in Wasser und des erneuten Gefriertrocknens der resultierenden Dispersion umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 9, bei dem die erneut gefriergetrocknete Dispersion ferner vernetzt wurde.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 10, bei dem die Vernetzungsbehandlung Vernetzung durch thermische Dehydratation ist.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Knorpels nach Anspruch 10, bei dem der vernetzte künstliche Knorpel mit γ-Strahlen bestrahlt wird.