WO2007057178A2 - Angiogenese förderndes substrat - Google Patents

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Burkhard Schlosshauer
Lars Dreesmann
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Gelita Ag
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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis-promoting substrate.
  • endothelial cells that line existing blood vessels form new capillaries wherever they are needed.
  • the endothelial cells have the remarkable ability to adapt their number and arrangement to local requirements. Tissues are dependent on the blood supply that occurs through the blood vessel system.
  • the vascular system in turn depends on the endothelial cells.
  • the endothelial cells create an adaptive life assurance system that ramifies into almost all parts of the body.
  • the newly developing blood vessels always arise first as capillaries, which sprout on existing small vessels. This process is called angiogenesis.
  • Angiogenesis-stimulating factors are well known and include e.g. the factors HGF, FGF, VEGF and others more.
  • the object of the present invention is to provide an angiogenesis-promoting substrate which can be produced simply and in reproducible quality and, in particular, remains stable under physiological conditions for a given period of time and is nevertheless biocompatible and resorbable.
  • angiogenesis-promoting substrate which comprises a porous shaped body which is formed from a physiologically insoluble, absorbable, gelatin-containing material.
  • porous shaped bodies which are made of a physiologically insoluble, resorbable, gelatin-containing material have a very pronounced angiogenesis-promoting effect, in the form that angiogenesis in particular the formation of blood vessels within the porous shaped body in causes a significant density, so that targeted angiogenesis by introducing the porous moldings at the desired locations of the body of the patient or animal to be treated is possible.
  • gelatin-containing material prepared as a porous shaped body promotes angiogenesis as such without, as otherwise described in the literature, promoting angiogenesis-promoting factors such as e.g. the aforementioned factors VEGF, FGF, HGF and others would be needed.
  • the gelatin-containing material is a gelatin-based material and consists of gelatin in predominant proportions. This means, that the gelatine makes the largest contribution to any other components of the material used.
  • a gelatin-based material is used which consists essentially completely of gelatin.
  • Particularly suitable types of gelatin are pork rind gelatin, which is preferably of high molecular weight and has a bloom value of about 160 to about 300 g.
  • angiogenesis-stimulating effect is observed with low molecular weight, water-soluble gelatin having an average molecular weight of less than 6 kDa, but such an effect is comparatively nonspecific compared to other also less stimulating agents.
  • the gelatin used therefore preferably has an average molecular weight greater than 6 kDa.
  • a gelatin with a particularly low content of endotoxins is preferably used as starting material.
  • Endotoxins are metabolic products or fragments of microorganisms found in the animal raw material.
  • the endotoxin content of gelatin is expressed in international units per gram (IU / g) and determined according to the LAL test described in the fourth edition of the European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 4).
  • IU / g international units per gram
  • the endotoxin content of gelatin can be drastically reduced by certain measures in the manufacturing process.
  • measures include, first and foremost, the use of fresh raw materials (e.g., pork rind) to avoid storage times, the thorough cleaning of the entire production line just prior to the start of gelatine production, and, if necessary, the replacement of ion exchangers and filtration systems at the production line.
  • the gelatin used in the present invention preferably has an endotoxin content of 1,200 I.U./g or less, more preferably 200 I.U./g or less. Optimally, the endotoxin content is 50 I.U./g or less, each determined according to the LAL test. In comparison, some commercially available gelatins have endotoxin levels of over 20,000 I.U./g.
  • the gelatin-containing material having a predetermined degree of crosslinking is preferably used.
  • the gelatin can be counteracted by the gelatin together with other slower dissolving components (examples of such resorbable biopolymers are chitosan and hyaluronic acid).
  • Such components may be used for the purpose of temporarily immobilizing the gelatin moieties.
  • the crosslinking is selected to stabilize the material, in particular the gelatin portion of the gelatin-containing material may be crosslinked, it being possible to resort to chemical crosslinking as well as enzymatic crosslinking.
  • Preferred chemical crosslinking agents are aldehydes, dialdehydes, isocyanates, carbodiimides and alkyl dihalides. Particularly preferred is formaldehyde, which simultaneously causes a sterilization of the molding.
  • the enzymatic crosslinking agent used is preferably the enzyme transglutaminase, which brings about linkage of the gluatamine and lysine side chains of proteins, in particular also of gelatin.
  • the stability to resorption under the aforementioned physiological conditions to which the material is exposed when used can be reconstituted in vitro under standard physiological conditions.
  • a PBS buffer (pH 7.2) at 37 0 C is used and under these conditions, the substrates can be tested for their time-dependent stability behavior and compare.
  • the porous shaped body is preferably stabilized in its structure by means of a two-stage cross-linking, wherein in a first stage the gelatin-containing material in solution is subjected to a first cross-linking reaction The material is then foamed and then a porous molded body obtained therefrom is further crosslinked in a second crosslinking step.
  • the porous molding can be brought into contact with a crosslinking solution and thus the degree of crosslinking can be further increased, or especially when the gelatin itself is crosslinked, the porous molding can be exposed to a formaldehyde vapor, so that via the gas phase over the porous Moldings penetrating formaldehyde contribute to further crosslinking.
  • the two-stage cross-linking has the particular advantage that overall a higher degree of cross-linking can be achieved, which then, moreover, can be realized substantially evenly over the entire cross-section of the porous shaped body. This has the consequence that the degradation properties of the porous shaped body in the absorption are homogeneous, so that it retains substantially its structural integrity for the intended time dependent on the degree of crosslinking and then completely absorbed in a relatively short time with loss of structural integrity.
  • the degree of crosslinking should be such that 20% by weight or less of the gelatin-containing material is degraded during 7 days under the standard physiological conditions mentioned above.
  • the porous molded body can be realized in very different forms, about which has not been spoken yet.
  • the shaped body of the substrate has a fiber structure.
  • This fiber structure may on the one hand have a woven or knitted structure, alternatively, a fibrous structure in the form of a nonwoven may be considered.
  • a completely different structure of the shaped body of the substrate according to the invention is present in the sponge structure, which preferably comprises a proportion of open pores. Further preferred is a sponge structure with a substantially open-pored structure.
  • the porosity gives the endothelial cells an opportunity to migrate into the substrate and penetrate it.
  • the shape of the body through its porosity even the endothelial cells the ability to form capillaries in the substrate into it.
  • the porosity of the other porous shaped bodies should be selected such that there are similar pore structures, since these are optimally suited to receive the endothelial cells and to permit a penetration of the substrate through capillary vessels.
  • the porous shaped body of the angiogenesis-promoting substrates according to the invention additionally has the advantage that one or more non-gelatin-based pharmaceutical active ingredients can be incorporated in the pores of the shaped body.
  • the pores of the shaped body can already be colonized with cells before the substrate is moved to the point to be treated of the human or animal body.
  • the substrate has not been addressed in detail yet, but it will be understood that the substrate can be varied in its outer dimensions.
  • the substrate can also be present in the form of small particles, in particular in powder form, the particles of the powder preferably being produced from a sponge structure, a fleece, a woven fabric or a knitted fabric, in particular by means of grinding.
  • FIG. 1 shows the degradation behavior of various angiogenesis-promoting substrates according to the invention
  • FIGS 2a and b a schematic representation of the experimental arrangement for the investigation of angiogenesis by means of a chorioallantoic membrane (CAM);
  • CAM chorioallantoic membrane
  • FIG. 3 the angiogenesis triggered by a substrate according to the invention promoting angiogenesis on a CAM after 3, 5 and 7 days;
  • Figure 4 is a graph illustrating the formation of blood vessels around the angiogenesis promoting substrate
  • Figure 5 is a diagram illustrating the development of blood vessels in the angiogenesis promoting substrate itself
  • FIG. 6 shows three light microscope images of a collagen sponge reference substrate after 2, 5 and 7 days.
  • Figures 7a and 7b four light micrographs of a substrate according to the invention promoting angiogenesis after 3, 5, 7 and 8 days.
  • Example 1 Production and Properties of Moldings with Cell Structure Based on Crosslinked Gelatin
  • Five batches of a 12% by weight solution of pork rind gelatin (bloom strength 300 g, average molecular weight 140 kDa) in water were prepared by dissolving the gelatin at 60 ° C., degassed by ultrasound, and in each case with the appropriate amount of aqueous Formaldehyde solution (1.0 wt .-%, room temperature) were added so that 1500 ppm of formaldehyde (based on the gelatin) were present.
  • aqueous Formaldehyde solution 1.0 wt .-%, room temperature
  • the homogenized mixtures were heated to 45 ° C. and, after a reaction time of 10 minutes, were mechanically foamed with air.
  • the approximately 30-minute foaming process was carried out for the six batches with a different ratio of air to gelatin solution, resulting in cell structures with different wet densities and pore sizes according to Table 1.
  • the foamed Gelatine momentsen which had a temperature of 26.5 0 C, were poured into molds with a dimension of 40 x 20 x 6 cm and dried for about four days at 26 0 C and a relative humidity of 10%.
  • the dried moldings of all six batches have a sponge-like cell structure (hereinafter referred to as sponges). They were cut into 2 mm thick layers and exposed to the equilibrium vapor pressure of a 17% by weight aqueous formaldehyde solution at room temperature for 17 hours in a desiccator for the second crosslinking step. For the sixth approach, this was the first (and only) cross-linking step. To ensure uniform fumigation of the entire volume of the To reach moldings, the desiccator was evacuated two to three times and ventilated again.
  • the pore structure of the sponges was determined by light microscopy and confirmed by scanning electron microscopy.
  • FIG. 1 shows the dissolution behavior, ie the absorption behavior of the two-stage crosslinked sponges 1-1 to 1-5 and of the singly crosslinked sponge 1-6 (the sequence of the bars shown is in each case: 1-6, 1-1, 1-2 , 1-3, 1-4, 1-5).
  • sponge 1-6 is already completely dissolved after three days, all two-stage cross-linked sponges are still over 80% preserved even after 14 days.
  • further degradation behavior which are due to the different foaming densities of the materials.
  • sponge 1-1 is completely dissolved after 21 days and sponge 1-2 after 28, while sponges 1-4 and 1-5 are still largely preserved even after 35 days. This results in a further possibility to specifically influence the degradation behavior of these sponges or cell structure materials independently of other parameters.
  • the properties of the cell structure materials can also be significantly modified by changing the gelatin concentration in the starting solution.
  • Breaking strength increases steadily as the gelatin concentration of the starting solution increases from 10 to 18% by weight, covering a wide range from about 500 to almost 2,000 Newtons. At the same time, the deformation changes only slightly until it breaks. Surprisingly, the correlation between breaking strength and gelatin concentration is largely independent of the degree of crosslinking.
  • the degree of crosslinking ie the choice of the concentration of the crosslinking agent, can influence the stability of the moldings, in particular with regard to proteolytic degradation.
  • Example 2 the degree of crosslinking, ie the choice of the concentration of the crosslinking agent, can influence the stability of the moldings, in particular with regard to proteolytic degradation.
  • two-crosslinked moldings dry matter 22 mg / ml, average pore size about 250 microns
  • implants 15 x 15 x 2 mm
  • FIG. 2a shows schematically the structure of a chicken egg in cross section.
  • CAM choriallantois membrane
  • FIG. 3 shows the reorientation and new formation of blood vessels in light micrographs after 3, 5 and 7 days.
  • FIG. 4 shows the evaluation according to the number of blood vessels per image section around the substrate and it is shown that a significantly higher number of blood vessels is present in all three samples compared to the zero value (CAM without attached implant) three samples similar effects, especially when compared to the zero value, were achieved.
  • the CAM is a tissue that represents the interface between air and egg fluid. It may be that the mechanical stimulus of applying the substrate to the CAM alone leads to activation of receptors, which could lead to a release of pro-angiogenic factors such as VEGF of the cells. As a result, endothelial cells could be attracted and blood vessel formation directed to the implant would then occur. Another explanation is that due to the placement of the implant, the access of atmospheric oxygen to the epithelial tissue is hindered. Thus, in the region of the implant so-called anoxia, as in the epithelial tissue less oxygen is available. Cells typically respond to anoxia with the release of VEGF, thereby inducing blood vessel rebuilding. This means that the underserved part of the cells is organizing new supply lines. This biological phenomenon probably occurs above a critically underserved (deformed) tissue surface.
  • the area of the blood vessels (in ⁇ m 2 ) within the substrates or implants of the comparison materials and the angiogenesis-promoting substrate of the present invention is applied after 3, 5 and 7 days.
  • the sequence gelatin sample, collagen sample, poly-DL-lactide sample applies.
  • the measurable blood vessels after 5 days show an extreme increase in the angiogenesis-promoting substrates according to the invention, while for the Poly-DL-Lactidprobe and for the collagen sponge still no effect is observed.
  • the regression of the blood vessels in the implant according to the invention after 7 days is expressed in a reduction of the measured area. This could be due to the fact that the blood vessel network is again reduced as much as it actually is needed for the implant areas, because, for example, relatively few other cell types have yet to migrate, which must be supplied. This corresponds to a process that is also found in infections where a blood vessel network regresses as soon as the inflammation goes down.
  • Solutions containing angiogenic factors can also be accommodated in the porous shaped body, thus further enhancing the pro-angiogenic effects, at least in the initial phase. Furthermore, it appears possible to use the porous shaped body as a carrier for pharmaceutical active ingredients without hindering its effect of promoting angiogenesis.

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Abstract

Um ein Angiogenese förderndes Substrat bereit zu stellen, welches einfach und in reproduzierbarer Qualität herstellbar ist und insbesondere unter physiologischen Bedingungen für einen vorgegebenen Zeitraum stabil erhalten bleibt und trotzdem bioverträglich und resorbierbar ist, wird vorgeschlagen, dass das Angiogenese fördernde Substrat einen porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.

Description

Angiogenese förderndes Substrat
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Angiogenese förderndes Substrat.
In lebenden Säugetieren bilden Endothelzellen, die existierende Blutgefäße auskleiden, neue Kapillaren, wo auch immer diese benötigt werden. Die Endothelzellen haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihre Anzahl und Anordnung den örtlichen Erfordernissen anzupassen. Gewebe sind von der Blutversorgung abhängig, die durch das Blutgefäßsystem erfolgt. Das Gefäßsystem wiederum hängt von den Endothelzellen ab. Die Endothelzellen schaffen ein anpassungsfähiges Lebenssicherungssystem, das sich in fast alle Körperregionen verästelt.
Während die größten Blutgefäße, die Arterien und Venen, eine dicke, starke Wand aus Bindegewebe und teilweise glatter Muskulatur aufweisen und im Innern nur mit einer äußerst dünnen, einfachen Lage von Endothelzellen ausgekleidet sind, findet man in den feinsten Verästelungen des Gefäßsystems, den Kapillaren, Wände, die lediglich aus Endothelzellen und einer so genannten Basallamina bestehen. Endothelzellen kleiden so das gesamte System der Blutgefäße aus, das vom Herzen bis in die kleinste Kapillare reicht und sie kontrollieren den Durchgang von Materialien in die und aus der Blutbahn.
Zellen in Geweben setzen bei Sauerstoffmangel Angiogenesefaktoren frei, die das Wachstum neuer Kapillaren anregen. Örtliche (mechanische) Reizungen und Infektionen verursachen ebenfalls die Proliferation neuer Kapillaren, von denen sich die meisten zurückziehen und verschwinden sobald die Entzündung abklingt.
Die neu entstehenden Blutgefäße entstehen immer zuerst als Kapillaren, die an bestehenden kleinen Gefäßen aussprießen. Dieser Vorgang wird Angioge- nese genannt.
Das Aussprießen der Kapillaren setzt sich fort bis der jeweilige Spross auf eine andere Kapillare trifft und sich mit ihr verbinden kann, sodass Blut darin zirkulieren kann (vgl. z.B. B. Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, VCH Weinheim, 3. Auflage 1995, Seiten 1360 - 1364).
Angiogenese stimulierende Faktoren sind vielfältig bekannt und umfassen z.B. die Faktoren HGF, FGF, VEGF und andere mehr.
Es wurde in der Literatur (vgl. z.B. EP 1 415 663 Al und EP 1 555 030 Al) vorgeschlagen, solche Angiogenese stimulierenden Faktoren in einer Matrix mit Depotwirkung zu applizieren, wobei als Depotmatrix ein Gelatinehydrogel aus einer Gelatine mit einem mittleren Molekulargewicht von 100.000 bis 200.000 Dalton (Da) empfohlen wurde.
Für unterschiedliche Typen von Kollagen werden deren Eignung als Stützstruktur bei der Bildung neuer Gefäße beschrieben, ebenso wie deren anti-an- giogenetischen Effekte. Als Beispiele für diese Literatur darf auf S. M. Sweeney et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 278, No. 33, Seiten 30516 bis 30524 (2003) sowie R. Xu et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications 289, Seiten 264 bis 268 (2001) verwiesen werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Angiogenese förderndes Substrat bereit zu stellen, welches einfach und in reproduzierbarer Qualität herstellbar ist und insbesondere unter physiologischen Bedingungen für einen vorgegebenen Zeitraum stabil erhalten bleibt und trotzdem bioverträglich und resorbierbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Angiogenese förderndes Substrat gelöst, welches einen porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass poröse Formkörper, die aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material hergestellt sind, einen sehr ausgeprägten Angiogenese fördernden Effekt aufweisen, in der Gestalt, dass die Angiogenese insbesondere die Ausbildung von Blutgefäßen innerhalb des porösen Formkörpers in einer erheblichen Dichte bewirkt, sodass gezielt die Angiogenese durch Einbringen der porösen Formkörper an den gewünschten Stellen des Körpers des zu behandelnden Patienten oder Tieres möglich ist.
Überraschend ist insbesondere, dass das als poröser Formkörper aufbereitete Gelatine enthaltende Material als solches Angiogenese fördernd in Erscheinung tritt, ohne dass es, wie sonst in der Literatur beschrieben, Angiogenese fördernder Faktoren wie z.B. die vorerwähnten Faktoren VEGF, FGF, HGF und anderer bedürfte.
Vorzugsweise ist das Gelatine enthaltende Material ein Gelatine basierendes Material und besteht aus Gelatine zu überwiegenden Anteilen. Dies bedeutet, dass die Gelatine den größten Anteil bei eventuell weiteren verwendeten Komponenten des Materials stellt.
Weiter bevorzugt wird ein Gelatine basierendes Material verwendet, welches im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
Besonders geeignete Gelatinetypen sind Schweineschwartengelatine, die vorzugsweise hochmolekular ist und einen Bloomwert von ca. 160 bis ca. 300 g aufweist.
In einem erheblich geringeren Umfang beobachtet man einen Angiogenese anregenden Effekt bei niedermolekularer, wasserlöslicher Gelatine mit einem mittleren Molekularwert von weniger als 6 kDa, jedoch ist ein solcher Effekt verglichen mit anderen ebenfalls in geringerem Umfang stimulierenden Agenzien vergleichsweise unspezifisch.
Die verwendete Gelatine hat deshalb bevorzugt ein mittleres Molekulargewicht größer 6 kDa.
Um eine optimale Bioverträglichkeit des erfindungsgemäßen Substrates bei der medizinischen Anwendung zu gewährleisten, wird als Ausgangsmaterial bevorzugt eine Gelatine mit einem besonders geringen Gehalt an Endotoxinen eingesetzt. Bei Endotoxinen handelt sich um Stoffwechselprodukte oder Bruchstücke von Mikroorganismen, welche in dem tierischen Rohmaterial vorkommen. Der Endotoxingehalt von Gelatine wird in internationalen Einheiten pro Gramm (I.E./g) angegeben und gemäß dem LAL-Test bestimmt, dessen Durchführung in der vierten Ausgabe des Europäischen Arzneibuches (Ph. Eur. 4) beschrieben ist. Um den Gehalt an Endotoxinen möglichst gering zu halten, ist es vorteilhaft, die Mikroorganismen möglichst frühzeitig im Zuge der Gelatineherstellung abzutöten. Ferner sollten entsprechende Hygienestandards beim Herstellungs- prozess eingehalten werden.
Somit kann der Endotoxingehalt von Gelatine durch bestimmte Maßnahmen beim Herstellungsprozess drastisch gesenkt werden. Zu diesen Maßnahmen zählen in erster Linie die Verwendung frischer Rohmaterialien (z.B. Schweineschwarte) unter Vermeidung von Lagerzeiten, die sorgfältige Reinigung der gesamten Produktionsanlage unmittelbar vor Beginn der Gelatineherstellung sowie gegebenenfalls das Auswechseln von Ionenaustauschern und Filtersystemen in der Produktionsanlage.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Gelatine weist bevorzugt einen Endotoxingehalt von 1.200 I.E./g oder weniger, noch mehr bevorzugt von 200 I. E/g oder weniger auf. Optimalerweise liegt der Endotoxingehalt bei 50 I.E./g oder weniger, jeweils gemäß dem LAL-Test bestimmt. Im Vergleich hierzu weisen manche handelsübliche Gelatinen Endotoxingehalte von über 20.000 I.E./g auf.
Da Gelatine bei den physiologischen Bedingungen, denen das Substrat bei seiner Verwendung zur Angiogeneseförderung ausgesetzt ist, schnell aufgelöst wird und somit der poröse Formkörper schnell seine strukturelle Integrität verlieren würde, wird vorzugsweise das Gelatine enthaltende Material mit einem vorgegebenen Vernetzungsgrad verwendet.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann dem entgegengewirkt werden, indem man die Gelatine zusammen mit anderen, langsamer in Lösung gehender Komponenten verwendet (Beispiele für solche resorbierbaren Biopolymere sind Chitosan und Hyaluronsäure). Solche Komponenten können zum Zweck einer zeitweisen Immobilisierung der Gelatineanteile verwendet werden.
Wählt man die Vernetzung zur Stabilisierung des Materials, kann insbesondere der Gelatineanteil des Gelatine enthaltenden Materials vernetzt sein, wobei zum einen auf eine chemische Vernetzung, aber auch auf eine enzymatische Vernetzung zurückgegriffen werden kann.
Bevorzugte chemische Vernetzungsmittel sind Aldehyde, Dialdehyde, Isocya- nate, Carbodiimide und Alkyldihalogenide. Besonders bevorzugt ist dabei Formaldehyd, welches gleichzeitig eine Sterilisierung des Formkörpers bewirkt.
Als enzymatisches Vernetzungsmittel wird bevorzugt das Enzym Transglutami- nase eingesetzt, welches eine Verknüpfung der Gluatamin- und Lysinseiten- ketten von Proteinen, insbesondere auch von Gelatine, bewirkt.
Die Stabilität gegenüber Resorption unter den zuvor angesprochenen physiologischen Bedingungen, denen das Material bei seiner Verwendung ausgesetzt ist, kann unter entsprechenden physiologischen Standardbedingungen in vitro nachgestellt werden. Hierbei wird ein PBS-Puffer (pH 7,2) bei 37 0C verwendet und unter diesen Bedingungen lassen sich die Substrate auf ihr zeitabhängiges Stabilitätsverhalten testen und vergleichen.
Der poröse Formkörper wird vorzugsweise mittels einer zweistufigen Vernetzung in seiner Struktur stabilisiert, wobei in einer ersten Stufe das Gelatine enthaltende Material in Lösung einer ersten Vernetzungsreaktion unterworfen wird, das Material danach aufgeschäumt und dann ein hieraus gewonnener poröser Formkörper in einer zweiten Vernetzungsstufe weiter vernetzt wird.
Während bei der ersten Vernetzungsstufe die Vernetzung in Lösung geschieht, bieten sich für die zweite Vernetzungsstufe zwei unterschiedliche Vernetzungsverfahren an.
Zum einen kann der poröse Formkörper mit einer Vernetzungslösung in Kontakt gebracht werden und so der Vernetzungsgrad weiter erhöht werden, oder aber insbesondere dann, wenn die Gelatine selbst vernetzt wird, kann der poröse Formkörper einem Formaldehyddampf ausgesetzt werden, sodass die über die Gasphase über den porösen Formkörper eindringenden Formaldehydanteile zu einer weiteren Vernetzung führen.
Die zweistufige Vernetzung hat insbesondere den Vorteil, dass insgesamt ein höherer Vernetzungsgrad erzielbar ist, der dann darüber hinaus auch noch über den gesamten Querschnitt des porösen Formkörpers im Wesentlichen gleichmäßig realisiert werden kann. Dies hat zur Folge, dass die Abbaueigenschaften des porösen Formkörpers bei der Resorption homogen sind, sodass dieser für die vom Vernetzungsgrad abhängige vorgesehene Zeitdauer im Wesentlichen seine strukturelle Integrität behält und dann in relativ kurzer Zeit unter Verlust der strukturellen Integrität vollends resorbiert wird.
Im Hinblick auf den eingangs geschilderten Effekt der Konzentration der An- giogenese auf den Bereich, den der poröse Formkörper selbst einnimmt, hat dies den großen Vorteil, dass die Angiogenese sehr gut steuerbar ist und auf die von dem behandelnden Arzt gewünschten Stellen fokussiert werden kann. Über die Variation des Vernetzungsgrades wiederum lässt sich je nach Anwendungsfall die Resorbtionsstabilität des Formkörpers einstellen und somit der Zeitpunkt, zu dem der poröse Formkörper seine strukturelle Integrität verliert, anwendungsbezogen vorgeben.
Für viele Anwendungsfälle sollte der Vernetzungsgrad so gewählt werden, dass während 7 Tagen 20 Gew.-% oder weniger des Gelatine enthaltenden Materials unter den oben genannten physiologischen Standardbedingungen abgebaut werden.
Der poröse Formkörper kann in sehr unterschiedlichen Ausprägungen realisiert werden, über die bisher noch nicht gesprochen wurde.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Formkörper des Substrats eine Faserstruktur auf. Diese Faserstruktur kann zum einen eine Gewebe- oder Gewirkstruktur aufweisen, alternativ kommt auch eine Faserstruktur in Form eines Vlieses in Betracht.
Eine hiervon gänzlich verschiedene Struktur des Formkörpers des erfindungsgemäßen Substrats liegt in der Schwammstruktur vor, die vorzugsweise einen Anteil an offenen Poren umfasst. Weiter bevorzugt ist eine Schwammstruktur mit einer im Wesentlichen offenporigen Struktur.
Gemeinsam ist allen Ausprägungen des porösen Formkörpers, dass durch die Porosität den Endothelzellen eine Möglichkeit gegeben wird, in das Substrat einzuwandern und dieses zu durchdringen. Gleichfalls bietet der Formkörper durch seine Porosität auch schon den Endothelzellen die Möglichkeit, Kapillargefäße in das Substrat hinein auszubilden. Im Falle der Wahl der Schwammstruktur für den porösen Formkörper ist es vorteilhaft, wenn dieser eine Vielzahl an Poren mit einer mittleren Porengröße im Bereich von ca. 50 bis 500 μm aufweist.
Die Porosität der anderen porösen Formkörper sollte so gewählt sein, dass dort ähnliche Porenstrukturen existieren, da diese optimal geeignet sind, die En- dothelzellen aufzunehmen und ein Durchwachsen des Substrates mit Kapillargefäßen zuzulassen.
Der poröse Formkörper der erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrate hat zudem den Vorteil, dass sich in den Poren des Formkörpers ein oder mehrere, nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe einlagern lassen.
Darüber hinaus können die Poren des Formkörpers bereits mit Zellen besiedelt werden, bevor das Substrat an die zu behandelnde Stelle des menschlichen oder tierischen Körpers verbracht wird.
Die geometrische Form des Substrats wurde bislang nicht im Einzelnen angesprochen, jedoch versteht sich, dass das Substrat in seinen äußeren Dimensionen vielfältig gewählt werden kann. So lässt sich vorteilhaft ein flächiges Substrat für die Förderung der Blutgefäßbildung in vielen Anwendungsfällen als Implantat einsetzen. Daneben kann das Substrat jedoch auch in Form von kleinen Partikeln vorliegen, insbesondere in Pulverform, wobei die Partikel des Pulvers vorzugsweise aus einer Schwammstruktur, einem Vlies, einem Gewebe oder einem Gewirk, insbesondere mittels Vermählen hergestellt werden. Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden im Folgenden anhand der Zeichnung sowie der Beispiele im Einzelnen noch erläutert. Es zeigen im Einzelnen:
Figur 1 : Das Abbauverhalten verschiedener erfindungsgemäßer Angioge- nese fördernder Substrate;
Figuren 2a und b: eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung zur Untersuchung der Angiogenese mittels einer Chorioallantois- Membran (CAM);
Figur 3: die Angiogenese ausgelöst durch ein erfindungsgemäßes Angiogenese förderndes Substrat auf einer CAM nach 3, 5 und 7 Tagen;
Figur 4: ein Schaubild zur Veranschaulichung der Bildung von Blutgefäßen um das Angiogenese fördernde Substrat herum;
Figur 5: ein Diagramm zur Veranschaulichung der Entwicklung von Blutgefäßen im Angiogenese fördernden Substrat selbst;
Figur 6: drei lichtmikroskopische Aufnahmen eines aus Kollagenschwamm bestehenden Referenzsubstrates nach 2, 5 und 7 Tagen; und
Figuren 7a und 7b: vier lichtmikroskopische Aufnahmen eines erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrates nach 3, 5, 7 und 8 Tagen.
Beispiel 1 : Herstellung und Eigenschaften von Formkörpern mit Zellstruktur auf der Basis von vernetzter Gelatine Es wurden fünf Ansätze einer 12 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300 g, mittleres Molekulargewicht 140 kDa) in Wasser durch Lösen der Gelatine bei 60 0C hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und jeweils mit der entsprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) versetzt, so dass 1500 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen. Bei einem sechsten Ansatz erfolgte keine Zugabe von Formaldehyd.
Die homogenisierten Mischungen wurden auf 45 0C temperiert und nach einer Reaktionszeit von 10 min maschinell mit Luft aufgeschäumt. Der ca. 30minüti- ge Aufschäumvorgang wurde für die sechs Ansätze mit einem unterschiedlichen Verhältnis von Luft zu Gelatinelösung durchgeführt, wodurch Zellstrukturen mit unterschiedlichen Nassdichten und Porengrößen gemäß Tabelle 1 erhalten wurden.
Die aufgeschäumten Gelatinelösungen, die eine Temperatur von 26,5 0C aufwiesen, wurden in Formen mit einer Abmessung von 40 x 20 x 6 cm gegossen und ca. vier Tage bei 26 0C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 10% getrocknet.
Die getrockneten Formkörper von allen sechs Ansätzen weisen eine schwammartige Zellstruktur auf (im Folgenden als Schwämme bezeichnet). Sie wurden in 2 mm dicke Schichten geschnitten und für den zweiten Vernetzungsschritt 17 Stunden in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17 Gew.-%igen wässrigen Formaldehyd-Lösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Für den sechsten Ansatz stellte dies den ersten (und einzigen) Vernetzungsschritt dar. Um eine gleichmäßige Begasung des gesamten Volumens der Formkörper zu erreichen, wurde der Exsikkator dabei jeweils zwei- bis dreimal evakuiert und wieder belüftet.
Die Porenstruktur der Schwämme wurde lichtmikroskopisch ermittelt und konnte durch Rasterelektronenmikroskopie bestätigt werden.
Tabelle 1
Figure imgf000014_0001
Um die Stabilität der Schwämme zu bestimmen, wurden 30 x 30 x 2 mm große Stücke eingewogen, in je 75 ml PBS-Puffer gelegt und bei 37 0C gelagert. Nach der jeweiligen Lagerzeit wurden die Stücke 30 min in Wasser gewaschen, getrocknet und ausgewogen.
Die Figur 1 zeigt das Auflösungs-, d.h. das Resorptionsverhalten der zweistufig vernetzten Schwämme 1-1 bis 1-5 sowie des einfach vernetzten Schwammes 1-6 (die Abfolge der dargestellten Balken ist jeweils: 1-6, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5). Während der Schwamm 1-6 nach drei Tagen bereits vollständig aufgelöst ist, sind alle zweistufig vernetzten Schwämme auch nach 14 Tagen noch zu über 80 % erhalten. Es zeigen sich jedoch erhebliche Unterschiede im weiteren Abbauverhalten, die auf die unterschiedlichen Aufschäumdichten der Materialien zurückzuführen sind. So ist der Schwamm 1-1 nach 21 Tagen und der Schwamm 1-2 nach 28 vollständig aufgelöst, während die Schwämme 1-4 und 1-5 auch nach 35 Tagen noch weitgehend erhalten sind. Daraus ergibt sich eine weitere Möglichkeit, das Abbauverhalten dieser Schwämme oder Zellstrukturmaterialien unabhängig von anderen Parametern gezielt zu beeinflussen.
Die Eigenschaften der Zellstrukturmaterialien können aber auch über eine Änderung der Gelatinekonzentration in der Ausgangslösung deutlich modifiziert werden.
Höhere Gelatinekonzentrationen führen zu breiteren (dickeren) Zellwänden oder Stegen zwischen den einzelnen Poren, was sich in einer erhöhten Bruchfestigkeit der entsprechenden Schwämme niederschlägt.
Die Bruchfestigkeit nimmt mit Erhöhung der Gelatinekonzentration der Ausgangslösung von 10 auf 18 Gew.-% stetig zu, wobei ein weiter Bereich von ca. 500 bis fast 2000 Newton abgedeckt wird. Gleichzeitig ändert sich die Verformung bis zum Bruch nur geringfügig. Überraschenderweise ist die Korrelation zwischen Bruchkraft und Gelatinekonzentration dabei weitgehend unabhängig vom Vernetzungsgrad.
Über den Vernetzungsgrad, d.h. durch die Wahl der Konzentration des Vernetzungsmittels, kann hingegen die Stabilität der Formkörper, insbesondere im Hinblick auf proteolytischen Abbau, beeinflusst werden. Beispiel 2:
Aus analog Beispiel 1 erhältlichen, zweifach vernetzten Formkörpern (Trockendichte 22 mg/ml, mittlere Porengröße ca. 250 μm) wurden Proben hergestellt mit den Abmessungen 15 x 15 x 2 mm, im Folgenden Implantate genannt.
Die Angiogenese fördernden Eigenschaften dieser Implantate wurden mittels eines Versuches an befruchteten Hühnereiern, der schematisch in der Figur 2 dargestellt ist, untersucht.
Figur 2a zeigt schematisch den Aufbau eines Hühnereis im Querschnitt. Unterhalb der Kalkschale 10 befindet sich die Choriallantois-Membran 12 (im Folgenden kurz CAM genannt). Ausgehend von dem am Rand des Eidotters 14 befindlichen Embryo 16 erfolgt eine Bildung von extraembryonalen Blutgefäßen 18, die sich entlang der CAM ausbreiten. Wird mittels einer Kanüle ein Teil des Eiweißes entnommen, kann anschließend ein Fenster 20 in die Kalkschale 10 geschnitten werden, ohne die CAM 12 zu verletzen (wie in Figur 2b dargestellt). Nun kann ein Implantat 22 auf die CAM 12 aufgelegt und dessen Wirkung auf die Blutgefäßbildung untersucht werden (vgl. z.B. J. Borges et al. (2004) Der Chirurg 75, 284-290).
Figur 3 zeigt die Umorientierung und Neubildung von Blutgefäßen in lichtmikroskopischen Aufnahmen nach 3, 5 und 7 Tagen.
Als Referenzbeispiele wurden neben dem erfindungsgemäßen Substrat vergleichbare schwammartige Materialien aus Kollagen (renaturiertes, bovines Kollagen, Dichte 5,6 mg/cm3, erhältlich von der Firma Innocoll) und PoIy-DL- Lactid (Hersteller ITV Denkendorf) getestet.
Alle Implantate wurden auf eine CAM aufgelegt und nach 3, 4, 5, 6 und 7 Tagen die Anzahl der Blutgefäße bestimmt, die sich in direkter Umgebung der Implante entwickelt hatten. Wie in der Figur 3 ersichtlich, orientieren sich die Blutgefäße innerhalb weniger Tage sehr deutlich auf das Angiogenese fördernde Substrat bzw. die Referenzproben aus schwammartigem Kollagen und PoIy- DL-Lactid hin.
In der Figur 4 ist die Auswertung nach der Anzahl der Blutgefäße pro Bildausschnitt um das Substrat herum dargestellt und es zeigt sich, dass bei allen drei Proben gegenüber dem Nullwert (CAM ohne aufgelegtes Implant) eine merklich höhere Anzahl an Blutgefäßen vorhanden ist, wobei bei allen drei Proben ähnliche Effekte, insbesondere gesehen gegenüber dem Nullwert, erzielt wurden.
Das heißt, alle getesteten Materialien liegen in ihrer angiogenetischen Wirkung in ihrem Umfeld ungefähr auf dem gleichen erhöhten Niveau. Der beobachtete Effekt wird über eine gewisse Distanz hinweg verursacht und beruht deshalb vermutlich auf so genannten diffusiblen Faktoren.
Bei der CAM handelt es sich um ein Gewebe, das die Grenzfläche zwischen Luft und Eiflüssigkeit darstellt. Möglicherweise kommt es alleine durch den mechanischen Reiz durch das Auflegen des Substrates auf die CAM zu einer Aktivierung von Rezeptoren, was zu einer Ausschüttung von pro-angiogenetischen Faktoren wie z.B. VEGF der Zellen führen könnte. Hierdurch könnten Endothel- zellen angelockt werden und es würde dann zu einer auf das Implantat gerichteten Blutgefäßbildung kommen. Eine andere Erklärungsmöglichkeit besteht darin, dass aufgrund des Auflegens des Implantats der Zutritt von Luftsauerstoff zu dem Epithelgewebe behindert wird. So entsteht in der Region des Implantats eine so genannte Anoxie, da in dem Epithelgewebe weniger Sauerstoff zur Verfügung steht. Zellen reagieren auf eine Anoxie typischerweise mit der Ausschüttung von VEGF, wodurch eine Blutgefäßum- bzw. neubildung induziert wird. Dies bedeutet, dass der unterversorgte Teil der Zellen sich neue Versorgungsleitungen organisiert. Dieses biologische Phänomen tritt vermutlich oberhalb einer kritisch unterversorgten (deformierten) Gewebefläche auf.
Dies würde erklären, warum in Versuchen, bei denen beim bloßen Auflegen von schmalen Gummiringen auf die CAM (sehr kleine belegte Fläche) keine pro-angiogenetischen Effekte beobachtet werden konnten.
In der Figur 5 ist die Fläche der Blutgefäße (in μm2) innerhalb der Substrate oder Implantate der Vergleichsmaterialien und dem Angiogenese fördernden Substrat der vorliegenden Erfindung nach 3, 5 und 7 Tagen aufgetragen. In der Abfolge der dargestellten Säulen gilt die Reihenfolge Gelatineprobe, Kollagenprobe, Poly-DL-Lactidprobe.
Wie aus Figur 5 ersichtlich, zeigt sich nach 3 Tagen lediglich bei dem erfϊn- dungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrat ein messbarer Anteil an Blutgefäßen im Implantat selbst, während in dem Kollagenschwamm und dem Poly-DL-Lactidschwamm keine messbaren Anteile an Blutgefäßen vorhanden sind.
Die messbaren Blutgefäße nach 5 Tagen zeigen eine extreme Steigerung bei den erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substraten, während für die Poly-DL-Lactidprobe und für den Kollagenschwamm noch keinerlei Effekt beobachtet wird.
Nach 7 Tagen sinkt der Anteil an Blutgefäßen im Implantat bei dem erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrat deutlich ab, der Effekt ist aber immer noch etwa doppelt so hoch wie nach 3 Tagen. Zu diesem Zeitpunkt beobachtet man bei dem Kollagenschwamm immer noch keinen messbaren Erfolg, während sich bei dem Poly-DL-Lactidschwamm nun ein Effekt einstellt, wie er bei der erfindungsgemäßen Gelatineschwammimplantatprobe bereits nach 3 Tagen festzustellen war.
Zur Auswertung der Proben und Bestimmung der Anzahl der Blutgefäße im Implantat wurden von den jeweiligen Proben Gefrierschnitte angefertigt und mit DAPI gefärbt, um die Fläche der Blutgefäße innerhalb des Implantats zu analysieren. Dazu wurden Aufnahmen aus der mittleren Region der Schnitte gemacht und anschließend mit Bildverarbeitungsverfahren quantitativ ausgewertet. Bei Kollagenschwämmen konnte in der mittleren Region keinerlei Blutgefäßbildung beobachtet werden. Bei den Poly-DL-Lactidschwämmen war erst nach 7 Tagen, verbunden mit einer voranschreitenden Bindegewebszellenbesiedlung, Angiogenese festzustellen. Insgesamt schritt die Besiedlung mit Zellen aber auch bei dieser Vergleichsprobe deutlich langsamer voran als bei den erfindungsgemäßen Implantaten.
Die Rückbildung der Blutgefäße bei dem erfindungsgemäßen Implantat nach 7 Tagen drückt sich in einer Verringerung der gemessenen Fläche aus. Dies könnte darauf beruhen, dass das Blutgefäßnetzwerk wieder soweit reduziert wird, wie es tatsächlich für die Implantbereiche benötigt wird, weil z.B. noch relativ wenige andere Zelltypen eingewandert sind, die versorgt werden müssen. Dies entspricht einem Vorgang, den man auch bei Infektionen findet, wo sich ein Blutgefäßnetzwerk wieder zurückbildet, sobald die Entzündung zurückgeht.
Ein Vergleich der Daten, die mit den erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substraten erzielt worden sind, macht deutlich, dass die Verwendung eines porösen Formkörpers aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbieren Gelatine enthaltenden Material von erheblicher Bedeutung ist.
Beispiel 3:
Zur Verdeutlichung des erfindungsgemäßen Effekts ist in den Figuren 6 und 7 die Entwicklung der Angiogenese bei Kollagenschwamm und Gelatineschwamm in lichtmikroskopischen Aufnahmen dargestellt.
Während bei dem Kollagenschwamm nur eine Angiogenese im Umfeld der Probe stattfindet und in der Probe selbst wenig bis gar keine Kapillargefäße auch nach 7 Tagen zu beobachten sind (Figur 6), ist im Gegensatz hierzu bei der Gelatienschwammprobe ein völliges Durchwachsen des Substrats mit zunehmender Versuchszeit zu beobachten (Figuren 7a und b). Auch diese lichtmikroskopischen Aufnahmen belegen wiederum die Bedeutung des Vorhandenseins von Gelatine in dem porösen Formkörper.
Es lassen sich auch Lösungen, die angiogenetische Faktoren enthalten, in dem porösen Formkörper unterbringen und so mindestens in der Anfangsphase die pro-angiogenetischen Effekte weiter verstärken. Ferner erscheint es möglich, den porösen Formkörper als Träger für pharmazeutische Wirkstoffe mitzubenutzen, ohne dass dessen Effekt der Angiogene- seförderung dadurch gehindert wird.

Claims

Ansprüche
1. Angiogenese förderndes Substrat, umfassend einen porösen Formkörper aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material.
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelatine enthaltende Material ein Gelatine basierendes Material ist und zu überwiegenden Anteilen aus Gelatine besteht.
3. Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelatine basierende Material im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
4. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelatine hochmolekulare Gelatine, insbesondere Schweineschwartengelatine, umfasst.
5. Substrat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die hochmolekulare Gelatine einen Bloom-Wert im Bereich von ca. 160 bis ca. 300 g aufweist.
6. Substrat nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelatine ein mittleres Molekulargewicht von größer als 6 kDa aufweist.
7. Substrat nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelatine einen gemäß dem LAL-Test bestimmten Endotoxinge- halt von 1.200 I.E./g oder weniger, insbesondere von 200 I.E./g oder weniger, aufweist.
8. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelatine enthaltende Material einen vorgegebenen Vernetzungsgrad aufweist.
9. Substrat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Gelatineanteil des Gelatine enthaltenden Materials vernetzt ist.
10. Substrat nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzungsgrad so gewählt ist, dass das Gelatine enthaltende Material unter physiologischen Standardbedingungen während 7 Tagen zu 20 Gew.% oder weniger abgebaut wird.
11. Substrat nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelatine enthaltende Material unter Verwendung von Formaldehyd vernetzt ist.
12. Substrat nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelatine enthaltende Material enzymatisch vernetzt ist.
13. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Formkörper eine Faserstruktur aufweist.
14. Substrat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Faserstruktur ein Gewebe oder Gewirk umfasst.
15. Substrat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Faserstruktur ein Vlies umfasst.
16. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Formkörper eine Schwammstruktur aufweist.
17. Substrat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwammstruktur einen Anteil an offenen Poren umfasst.
18. Substrat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwammstruktur eine im Wesentlichen offenporige Struktur ist.
19. Substrat nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwammstruktur ein Vielzahl an Poren mit einer mittleren Porengröße von ca. 50 bis 500 μm aufweist.
20. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass in die Poren des Formkörpers angiogenetisch wirksame Gelatine eingelagert ist.
21. Substrat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die angiogenetisch wirksame Gelatine verzögert freisetzbar in den Formkörper eingelagert ist.
22. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in den Poren des Formkörpers ein oder mehrere nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe eingelagert sind.
23. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren des Formkörpers mit Zellen besiedelt sind.
24. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Formkörper ein Flächenmaterial ist.
25. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Formkörper als pulverförmige Partikel vorliegt.
26. Substrat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die pulver- förmigen Partikel durch Mahlung eines porösen schwammartigen oder Fasermaterials, insbesondere Vlies- oder Gewebematerials, hergestellt sind.
27. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass es ein humanmedizinisches Substrat ist.
28. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass es ein veterinärmedizinisches Substrat ist.
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