DE102007024239A1

DE102007024239A1 - Angiogenese förderndes Substrat

Info

Publication number: DE102007024239A1
Application number: DE102007024239A
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Ahlers; Burkhard Prof. Dr. Schlosshauer; Lars Dr. Dreesmann
Original assignee: Gelita AG
Current assignee: Gelita AG
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2008-11-20
Also published as: US20100056452A1; WO2008138612A3; BRPI0811861A2; AU2008250580A1; EP2155176A2; WO2008138612A2; MX2009012324A; IL201831A0

Abstract

Um ein Angiogenese förderndes Substrat bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig herstellba nicht-porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Angiogenese förderndes Substrat.
In lebenden Säugetieren bilden Endothelzellen, die existierende Blutgefäße auskleiden, neue Kapillaren, wo auch immer diese benötigt werden. Die Endothelzellen haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihre Anzahl und Anordnung den örtlichen Erfordernissen anzupassen. Gewebe sind von der Blutversorgung abhängig, die durch das Blutgefäßsystem erfolgt. Das Gefäßsystem wiederum hängt von den Endothelzellen ab. Die Endothelzellen schaffen ein anpassungsfähiges Lebenssicherungssystem, das sich in fast alle Körperregionen verästelt.
Während die größten Blutgefäße, die Arterien und Venen, eine dicke, starke Wand aus Bindegewebe und teilweise glatter Muskulatur aufweisen und im Innern nur mit einer äußerst dünnen, einfachen Lage von Endothelzellen ausgekleidet sind, findet man in den feinsten Verästelungen des Gefäßsystems, den Kapillaren, Wände, die lediglich aus Endothelzellen und einer so genannten Basallamina bestehen. Endothelzellen kleiden so das gesamte System der Blutgefäße aus, das vom Herzen bis in die kleinste Kapillare reicht und sie kontrollieren den Durchgang von Faktoren und Zellen in die und aus der Blutbahn.
Zellen in Geweben setzen bei Sauerstoffmangel Angiogenesefaktoren frei, die das Wachstum neuer Kapillaren anregen. Örtliche (mechanische) Reizungen und Infektionen verursachen ebenfalls die Proliferation neuer Kapillaren, von denen sich die meisten zurückziehen und verschwinden sobald die Entzündung abklingt.
Die neu entstehenden Blutgefäße entstehen immer zuerst als Kapillaren, die an bestehenden kleinen Gefäßen aussprießen. Dieser Vorgang wird Angiogenese genannt.
Das Aussprießen der Kapillaren setzt sich fort bis der jeweilige Spross auf eine andere Kapillare trifft und sich mit ihr verbinden kann, sodass Blut darin zirkulieren kann (vgl. z. B. B. Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, VCH Weinheim, 3. Auflage 1995, Seiten 1360–1364).
Angiogenese stimulierende Faktoren sind vielfältig bekannt und umfassen z. B. die Faktoren HGF, FGF, VEGF und andere mehr.
Es wurde in der Literatur (vgl. z. B. EP 1 415 663 A1 und EP 1 555 030 A1 ) vorgeschlagen, solche Angiogenese stimulierenden Faktoren in einer Matrix mit Depotwirkung zu applizieren, wobei als Depotmatrix ein Gelatinehydrogel aus einer Gelatine mit einem mittleren Molekulargewicht von 100.000 bis 200.000 Dalton (Da) empfohlen wurde.
Für unterschiedliche Typen von Kollagen werden deren Eignung als Stützstruktur bei der Bildung neuer Gefäße beschrieben, ebenso wie deren anti-angiogenetischen Effekte. Als Beispiele für diese Literatur darf auf S. M. Sweeney et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 278, No. 33, Seiten 30516 bis 30524 (2003) sowie R. Xu et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications 289, Seiten 264 bis 268 (2001) verwiesen werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Angiogenese förderndes Substrat bereit zu stellen, welches einfach und kostengünstig herstellbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Angiogenese förderndes Substrat gelöst, welches einen nicht-porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.
Materialien auf der Basis von Gelatine werden aufgrund ihrer guten Bioverträglichkeit bereits seit Längerem für medizinische Anwendungen eingesetzt, beispielsweise als Matrixmaterial für die Freisetzung pharmazeutischer Wirkstoffe oder als Trägermaterial für die Besiedlung mit Zellen. Im Gegensatz etwa zu Kollagen ist Gelatine in reproduzierbarer Qualität und hoher Reinheit herstellbar. Weiterhin ist sie im Körper im Wesentlichen vollständig resorbierbar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass das Gelatine enthaltende Material als solches einen Angiogenese fördernden Effekt zeigt, d. h. in seiner unmittelbaren Umgebung die Ausbildung neuer Blutgefäße stimuliert, ohne dass es hierzu weiterer Angiogenese fördernder Faktoren, wie z. B. die oben genannten Signalmoleküle VEGF, FGF oder HGV, bedarf.
Besonders bemerkenswert ist dabei, dass der erfindungsgemäße Angiogenese fördernde Effekt bei einem nicht-porösen Formkörper, der aus dem Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, beobachtet wird. Bei früheren Untersuchungen der Erfinder war zunächst ein Angiogenese fördernder Effekt bei porösen Formkörpern aus Gelatine enthaltendem Material gefunden worden, wobei die Angiogenese in erster Linie innerhalb der Formkörper stattfand, d. h. ein Einwachsen von Blutgefäßen in die Poren, Hohlräume oder Zwischenräume des Formkörpers beobachtet wurde. Der pro-angiogenetische Effekt wurde daher in erster Linie der porösen Struktur des Formkörpers zugeschrieben (siehe die deutsche Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 10 2005 054 937 ). Beispiele für solche Strukturen sind Schwämme, Gewebe oder Vliese.
Demgegenüber konnte nun gezeigt werden, dass gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein nicht-poröser Formkörper als Angiogenese förderndes Substrat verwendet werden kann, wobei die Blutgefäßbildung nicht in dem Formkörper, sondern in seiner räumlichen Umgebung erfolgt. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass dieser Effekt durch eine Freisetzung löslicher Komponenten der Gelatine hervorgerufen wird und daher von der Struktur des Formkörpers weitgehend unabhängig ist.
Nicht-poröse Formkörper aus einem Gelatine enthaltendem Material sind in der Regel einfacher herzustellen als solche mit einer porösen Struktur. Auf der anderen Seite hat der Einsatz eines Formkörpers aus einem unlöslichen Material, welcher erst nach einer bestimmten Zeit resorbiert bzw. abgebaut wird, gegenüber dem Einsatz löslicher bzw. gelöster Gelatine den Vorteil, dass die Angiogenese gezielt an einem bestimmten Ort, nämlich der Umgebung des eingesetzten Formkörpers, stimuliert werden kann.
Vorzugsweise ist das Gelatine enthaltende Material ein Gelatine basierendes Material und besteht zu überwiegenden Anteilen aus Gelatine. Dies bedeutet, dass die Gelatine den größten Anteil bei eventuell weiteren verwendeten Komponenten des Materials stellt.
Weiter bevorzugt wird ein Gelatine basierendes Material verwendet, welches im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
Besonders geeignete Gelatinetypen sind Schweineschwartengelatine, die vorzugsweise hochmolekular ist und einen Bloomwert von ca. 160 bis ca. 320 g aufweist.
In einem erheblich geringeren Umfang beobachtet man einen Angiogenese anregenden Effekt auch bei niedermolekularer, wasserlöslicher Gelatine mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 6 kDa, jedoch ist ein solcher Effekt verglichen mit anderen ebenfalls in geringerem Umfang stimulierenden Agenzien vergleichsweise unspezifisch.
Die verwendete Gelatine hat deshalb bevorzugt ein mittleres Molekulargewicht von mehr als ca. 6 kDa.
Um eine optimale Bioverträglichkeit des erfindungsgemäßen Substrates bei der medizinischen Anwendung zu gewährleisten, wird als Ausgangsmaterial bevorzugt eine Gelatine mit einem besonders geringen Gehalt an Endotoxinen eingesetzt. Bei Endotoxinen handelt sich um Stoffwechselprodukte oder Bruchstücke von Mikroorganismen, welche in dem tierischen Rohmaterial vorkom men. Der Endotoxingehalt von Gelatine wird in internationalen Einheiten pro Gramm (I.E./g) angegeben und gemäß dem LAL-Test bestimmt, dessen Durchführung in der vierten Ausgabe des Europäischen Arzneibuches (Ph. Eur. 4) beschrieben ist.
Um den Gehalt an Endotoxinen möglichst gering zu halten, ist es vorteilhaft, die Mikroorganismen möglichst frühzeitig im Zuge der Gelatineherstellung abzutöten. Ferner sollten entsprechende Hygienestandards beim Herstellungsprozess eingehalten werden.
Somit kann der Endotoxingehalt von Gelatine durch bestimmte Maßnahmen beim Herstellungsprozess drastisch gesenkt werden. Zu diesen Maßnahmen zählen in erster Linie die Verwendung frischer Rohmaterialien (z. B. Schweineschwarte) unter Vermeidung von Lagerzeiten, die sorgfältige Reinigung der gesamten Produktionsanlage unmittelbar vor Beginn der Gelatineherstellung sowie gegebenenfalls das Auswechseln von Ionenaustauschern und Filtersystemen in der Produktionsanlage.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Gelatine weist bevorzugt einen Endotoxingehalt von ca. 1.200 I.E./g oder weniger, noch mehr bevorzugt von ca. 200 I.E/g oder weniger auf. Optimalerweise liegt der Endotoxingehalt bei ca. 50 I.E./g oder weniger, jeweils gemäß dem LAL-Test bestimmt. Im Vergleich hierzu weisen manche handelsübliche Gelatinen Endotoxingehalte von über 20.000 I.E./g auf.
Wie bereits oben angesprochen, ist der nicht-poröse Formkörpers des Angiogenese fördernden Substrats erfindungsgemäß aus einem unter physiologi schen Bedingungen unlöslichen Material gebildet, sodass er über einen bestimmten Zeitraum seine strukturelle Integrität erhält und die Angiogenese auf den gewünschten Zielbereich lokalisiert werden kann. Da jedoch Gelatine unter physiologischen Bedingungen schnell aufgelöst wird, ist das Gelatine enthaltende Material vorzugsweise vernetzt.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann einer schnellen Auflösung entgegengewirkt werden, indem man die Gelatine zusammen mit anderen, langsamer in Lösung gehender Komponenten verwendet (Beispiele für solche resorbierbaren Biopolymere sind Chitosan und Hyaluronsäure). Solche Komponenten können zum Zweck einer zeitweisen Immobilisierung der Gelatineanteile verwendet werden.
Wählt man die Vernetzung zur Stabilisierung des Materials, kann insbesondere der Gelatineanteil des Gelatine enthaltenden Materials vernetzt sein, wobei zum einen auf eine chemische Vernetzung, aber auch auf eine enzymatische Vernetzung zurückgegriffen werden kann.
Bevorzugte chemische Vernetzungsmittel sind Aldehyde, Dialdehyde, Isocyanate, Carbodiimide und Alkyldihalogenide. Besonders bevorzugt ist dabei Formaldehyd, welches gleichzeitig eine Sterilisierung des Formkörpers bewirkt.
Als enzymatisches Vernetzungsmittel wird bevorzugt das Enzym Transglutaminase eingesetzt, welches eine Verknüpfung der Glutamin- und Lysinseitenketten von Proteinen, insbesondere auch von Gelatine, bewirkt.
Die Stabilität gegenüber Resorption unter den zuvor angesprochenen physiologischen Bedingungen, denen das Material bei seiner Verwendung ausgesetzt ist, kann unter entsprechenden physiologischen Standardbedingungen in vitro nachgestellt werden. Hierbei wird ein PBS-Puffer (pH 7,2) bei 37°C verwendet und unter diesen Bedingungen lassen sich die Substrate auf ihr zeitabhängiges Stabilitätsverhalten testen und vergleichen.
Bevorzugt weist das Gelatine enthaltende Material einen vorgegebenen Vernetzungsgrad auf. Durch die Vorgabe des Vernetzungsgrades kann insbesondere die Resorptionsstabilität des Formkörpers eingestellt werden, d. h. die Zeit, während der er unter physiologischen Bedingungen seine strukturelle Integrität erhält. So können beispielsweise nicht-poröse Formkörper als Angiogenese fördernde Substrate eingesetzt werden, die in Abhängigkeit vom Vernetzungsgrad des Gelatine enthaltenden Materials z. B. ein, drei, sechs oder zwölf Wochen unter physiologischen Standardbedingungen stabil sind, je nachdem, über welchen Zeitraum eine angiogenetische Wirkung vom behandelnden Arzt gewünscht wird.
Überraschenderweise hat sich auch gezeigt, dass die Angiogenese fördernde Wirkung des Formkörpers umso höher ist, je höher der Vernetzungsgrad des Gelatine enthaltenden Materials ist, insbesondere im Fall einer chemischen Vernetzung der Gelatine. Dieser öffnet weitere Möglichkeiten, die Angiogenese auch quantitativ gezielt zu stimulieren.
Der nicht-poröse Formkörper wird vorzugsweise mittels einer zweistufigen Vernetzung in seiner Struktur stabilisiert, wobei in einer ersten Stufe das Gelatine enthaltende Material in Lösung einer ersten Vernetzungsreaktion unterworfen wird, und dann ein aus diesem Material hergestellter Formkörper in einer zweiten Vernetzungsstufe weiter vernetzt wird.
Während bei der ersten Vernetzungsstufe die Vernetzung in Lösung geschieht, bietet sich für die zweite Vernetzungsstufe insbesondere eine Vernetzung in der Gasphase an, beispielsweise unter Verwendung von Formaldehyd.
Die Herstellung von Formkörpern aus einem Gelatine enthaltenden Material mittels eines zweistufigen Vernetzungsverfahrens ist in der Offenlegungsschrift DE 10 2004 024 635 A1 im Detail beschrieben.
Die zweistufige Vernetzung hat insbesondere den Vorteil, dass insgesamt ein höherer Vernetzungsgrad erzielbar ist, der dann darüber hinaus auch noch über den gesamten Querschnitt des Formkörpers im Wesentlichen gleichmäßig realisiert werden kann. Dies hat zur Folge, dass die Abbaueigenschaften des Formkörpers bei der Resorption homogen sind, sodass dieser für die vom Vernetzungsgrad abhängige vorgesehene Zeitdauer im Wesentlichen seine strukturelle Integrität behält und dann in relativ kurzer Zeit unter Verlust der strukturellen Integrität vollends resorbiert wird.
Durch den vorgegebenen Vernetzungsgrad und das oben beschriebene homogene Abbauverhalten lässt sich somit der Angiogenese fördernde Effekt des erfindungsgemäßen Substrates sowohl zeitlich als auch räumlich sehr gezielt einsetzen.
Für viele Anwendungsfälle sollte der Vernetzungsgrad so gewählt werden, dass während 7 Tagen ca. 20 Gew.-% oder weniger des Gelatine enthaltenden Ma terials unter den oben genannten physiologischen Standardbedingungen abgebaut werden.
Der nicht-poröse Formkörper kann in sehr unterschiedlichen Ausprägungen realisiert werden, über die bisher noch nicht gesprochen wurde.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Formkörper ein Flächenmaterial. Flächenmaterialien können in vielfältiger Weise als medizinische Substrate im oder am Körper eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Formkörper um eine Folie. Derartige Folien können auf einfache Weise durch Gießen einer Lösung eines Gelatine enthaltenden Materials hergestellt werden, wobei dieses Verfahren mit dem oben beschriebenen zweistufigen Vernetzungsverfahren kombiniert werden kann.
Folien aus einem Gelatine enthaltenden Material sind gut handhabbar und können vom behandelnden Arzt jeweils auf die benötigte Größe zugeschnitten werden. Um die Flexibilität der Folie zu erhöhen, kann das Gelatine enthaltende Material zusätzlich einen oder mehrere Weichmacher enthalten. Bevorzugte Weichmacher sind ausgewählt aus Glycerin, Oligoglycerinen, Oligoglykolen, Sorbit und Mannit.
Die Folie weist bevorzugt eine Dicke im Bereich von ca. 20 bis ca. 500 μm, weiter bevorzugt von ca. 50 bis ca. 100 μm, auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt der nicht-poröse Formkörper in Form von Partikeln vor. Bei den Partikeln kann es sich beispielsweise um Kügelchen, Granulat oder Pulver aus einem Gelatine enthaltenden Material handeln.
Bevorzugte Partikel weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 0,1 mm bis ca. 5 mm auf.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst der nichtporöse Formkörper ein oder mehrere nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe. Hierbei kann es sich beispielsweise um entzündungshemmende oder antibiotische Wirkstoffe handeln.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist der nicht-poröse Formkörper mit Zellen besiedelt. In diesem Fall kann das erfindungsgemäße Substrat für Zelltransplantationen eingesetzt werden, bei denen eine Angiogenese im Bereich der implantierten Zellen erwünscht ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines nichtporösen Formkörpers, der aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, zur Herstellung eines Angiogenese fördernden Substrats, welches zum Einsatz im oder am menschlichen oder tierischem Körper bestimmt ist. Vorteile und bevorzugte Ausführungsform dieser Verwendung ergeben sich insbesondere aus der obigen Beschreibung des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrats.
Bei einer bevorzugten Verwendung wird das Substrat als Wundauflage oder -abdeckung eingesetzt. Durch das Aufbringen des Substrates auf Verletzungen oder Verbrennungen insbesondere der Haut kann die angiogenetische Wirkung zur schnelleren Wundheilung beitragen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Angiogenese fördernde Substrat zur Implantation in den Körper bestimmt. Das Substrat kann hierbei an den verschiedensten Stellen des Körpers intracorporal eingesetzt werden, wo immer eine gezielte Förderung der Angiogenese erforderlich oder wünschenswert ist.
Bevorzugte Anwendungsbereiche des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrats sind z. B. Transplantationen, die Behandlung von Diabetes oder von Infarkten.
Bei der Durchführung von therapeutischen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrates wird ein nicht-poröser Formkörper in der jeweils erforderlichen Gestalt und Größe zur Verfügung gestellt oder vom behandelnden Arzt entsprechend zugeschnitten, um anschließend in oder an den entsprechenden Bereich des menschlichen oder tierischen Körpers eingebracht zu werden.
Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden im Folgenden anhand der Zeichnung sowie der Beispiele im Einzelnen erläutert. Es zeigen im Einzelnen:
1: Fotografische Darstellung der Blutgefäßbildung ohne ein Angiogenese förderndes Substrat;
2a bis 2c: fotografische Darstellungen der Blutgefäßbildung bei verschiedenen erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substraten;
3: fotografische Darstellung der Blutgefäßbildung nach Resorption des Angiogenese fördernden Substrats.
Herstellung von Folien aus einem Gelatine enthaltenden Material
Als Beispiele für nicht-poröse Formkörper wurden Gelatinefolien mit drei unterschiedlichen Vernetzungsgraden (Folien A, B und C) mittels eines zweistufigen Vernetzungsverfahrens hergestellt.
Für jeden der drei Ansätze wurden 25 g Schweineschwartengelatine (300 g Bloom), 9 g einer 85 Gew.-%igen Glycerinlösung sowie 66 g destilliertes Wasser gemischt und die Gelatine bei einer Temperatur von 60°C gelöst. Nach dem Entgasen der Lösungen durch Ultraschall wurde zur Durchführung des ersten Vernetzungsschrittes eine wässrige Formaldehydlösung (2,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugegeben, und zwar 3,75 g dieser Lösung beim Ansatz A und jeweils 6,25 g der Lösung bei den Ansätzen B und C.
Die Mischungen wurden homogenisiert und bei ca. 60°C in einer Dicke von ca. 250 μm auf eine Polyethylenunterlage gerakelt.
Nach dem Trocknen bei 30°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30 für etwa einen Tag wurden die Folien von der PE-Unterlage abgezogen und ca. 12 h unter denselben Bedingungen nachgetrocknet. Die getrockneten Folien (Dicke ca. 50 μm) wurden zur Durchführung des zweiten Vernetzungsschrittes in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17 Gew.-%igen wässrigen Formaldehydlösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Im Falle der Folien A und B betrug die Einwirkzeit des Formaldehyddampfs 2 h, im Falle der Folie C 17 h.
Von den auf diese Weise hergestellten Formkörpern weist die Folie A insgesamt den geringsten und die Folie C insgesamt den höchsten Vernetzungsgrad auf, die Folie B liegt dazwischen. Dies spiegelt sich im unterschiedlichen Abbauverhalten der Folien wider, wobei die Resorptionszeiten der beschriebenen Folien unter physiologischen Bedingungen im Tierversuch (siehe unten) zwischen ca. 14 Tagen (Folie A) und ca. 21 Tagen (Folie C) liegen.
Aufgrund des Einsatzes von Glycerin als Weichmacher zeigen die Folien eine ausreichende Flexibilität, insbesondere in hydratisiertem Zustand, um eine gute Handhabbarkeit bei der medizinischen Anwendung zu gewährleisten, ohne dass ein Brechen oder Reißen der Folien zu befürchten ist.
Nachweis der Angiogenese fördernden Wirkung im Tierversuch
Die Wirksamkeit der Gelatinefolien A, B und C als Angiogenese fördernde Substrate in vivo wurde im Tierversuch untersucht. Als Versuchstiere wurden zehn Wochen alte Mäuse des Stammes Balb/C der Firma Charles River (Sulzfeld) mit einem Körpergewicht von 20 g verwendet.
Als Substrate wurden jeweils 5 × 5 mm² große Stücke der oben beschriebenen Gelatinefolien eingesetzt. Den Mäusen wurden jeweils zwei Folienstücke eines bestimmten Vernetzungsgrades subkutan im Nackenbereich implantiert. Hierzu wurden die Tiere narkotisiert und das Fell im Nackenbereich abrasiert. Mit einer Pinzette wurde ein Stück der Nackenhaut angehoben und ein Einschnitt von ca. 1 cm Länge durchgeführt. Über diesen Einschnitt wurde mit einer stumpfen Schere eine subkutane Tasche geschaffen, in die je zwei der Folienstücke mit einer Pinzette eingelegt wurden. Der Wundverschluss erfolgte mittels zweier Einzelknopfhefte.
Nach 12 Tagen wurden die Tiere getötet und die angiogenetische Wirkung der implantierten Substrate optisch ausgewertet.
Die 1 zeigt als Negativkontrolle den entsprechenden Bereich des subkutanen Gewebes einer Maus, bei der keine Implantation des Angiogenese fördernden Substrats durchgeführt wurde. Es ist eine nur sehr geringe Durchsetzung mit Blutgefäßen zu beobachten, wie es für das subkutane Hautgewebe der Maus normal ist.
Die 2a bis 2c zeigen fotografische Aufnahmen des subkutanen Hautgewebes im Bereich der implantierten Folienstücke A, B bzw. C, nachdem die entsprechenden Mäuse 12 Tage nach der Implantation getötet wurden. Die Lage der Folienstücke ist durch schwarze Quadrate gekennzeichnet (Bezugszeichen A, B bzw. C für die entsprechende Folie), da die Folien selbst in der Fotografie schlecht sichtbar sind. Versuchsweise wurden die Folien z. T. mit Coomassie Brilliant Blue eingefärbt, wie dies in der 2a sichtbar ist.
In allen drei Abbildungen ist eine deutlich verstärkte Blutgefäßbildung in der Umgebung der implantierten Folienstücke zu erkennen. Sowohl die Anzahl als auch die Größe der Blutgefäße sind jeweils deutlich höher als bei der Negativkontrolle in 1. Dieses Ergebnis belegt, dass durch nicht-poröse Formkörper, die aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet sind, die Angiogenese lokal stimuliert werden kann.
Um den zeitlichen Rahmen der Angiogenese fördernden Wirkung zu untersuchen, wurden bei einer weiteren Maus zwei Folienstücke der Folie B (mittlerer Vernetzungsgrad) implantiert (wie oben beschrieben). Diese Maus wurde nach 21 Tagen getötet und das subkutane Gewebe im Bereich der Implantate wiederum optisch ausgewertet.
Das Ergebnis zeigt die 3. Die relativ dünnen Gelatinefolien B sind nach 21 Tagen bereits weitgehend resorbiert und haben ihre strukturelle Integrität verloren. Gleichzeitig zeigt die fotografische Darstellung, dass die neu gebildeten Blutgefäße, die bei den entsprechenden Folien nach 12 Tagen beobachtet wurden (vgl. 2b), sich wieder zurückgebildet haben.
Dieses Ergebnis zeigt, dass der angiogenetische Effekt des nicht-porösen Formkörpers zeitlich begrenzt ist. Mit der fortschreitenden Resorption des Angiogenese fördernden Substrats bilden sich auch die Blutgefäße wieder zurück. Über die Wahl des vorgegebenen Vernetzungsgrades kann jedoch die Resorptionsgeschwindigkeit und damit auch der zeitliche Rahmen der Angiogenese beeinflusst werden.
Insgesamt bestätigen diese Versuche, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Substrates gezielt, sowohl räumlich als auch zeitlich, die Angiogenese im menschlichen oder tierischen Körper stimuliert werden kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- EP 1415663 A1 [0008]
- EP 1555030 A1 [0008]
- DE 102005054937 [0014]
- DE 102004024635 A1 [0036]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- B. Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, VCH Weinheim, 3. Auflage 1995, Seiten 1360–1364 [0006]
- S. M. Sweeney et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 278, No. 33, Seiten 30516 bis 30524 (2003) [0009]
- R. Xu et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications 289, Seiten 264 bis 268 (2001) [0009]

Claims

Angiogenese förderndes Substrat, umfassend einen nicht-porösen Formkörper, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.
Substrat nach Anspruch 1, wobei das Gelatine enthaltende Material zu einem überwiegenden Anteil aus Gelatine besteht.
Substrat nach Anspruch 2, wobei das Gelatine enthaltende Material im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine einen Bloom-Wert im Bereich von ca. 160 bis ca. 320 g aufweist.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine ein Molekulargewicht von mehr als ca. 6 kDa aufweist.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine einen gemäß dem LAL-Test bestimmten Endotoxingehalt von ca. 1.200 I.E./g oder weniger, insbesondere von ca. 200 I.E./g oder weniger, aufweist.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gelatine enthaltende Material vernetzt ist.
Substrat nach Anspruch 7, wobei die Gelatine vernetzt ist.
Substrat nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Gelatine enthaltende Material unter Verwendung von Formaldehyd vernetzt ist.
Substrat nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Gelatine enthaltende Material einen vorgegebenen Vernetzungsgrad aufweist.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper ein Flächenmaterial ist.
Substrat nach Anspruch 11, wobei das Flächenmaterial eine Folie ist.
Substrat nach Anspruch 12, wobei die Folie eine Dicke im Bereich von ca. 20 bis ca. 500 μm, bevorzugt von ca. 50 bis ca. 100 μm, aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der nicht-poröse Formkörper in Form von Partikeln vorliegt.
Substrat nach Anspruch 14, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser von ca. 0,1 mm bis ca. 5 mm aufweisen.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper ein oder mehrere nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe umfasst.
Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper mit Zellen besiedelt ist.
Verwendung eines nicht-porösen Formkörpers, der aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, zur Herstellung eines Angiogenese fördernden Substrats, welches zum Einsatz im oder am menschlichen oder tierischen Körper bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Substrat als Wundauflage oder -abdeckung eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Substrat zur Implantation in den Körper bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat bei Transplantationen eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat zur Behandlung von Infarkten bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat zur Behandlung von Diabetes bestimmt ist.