DE69829662T2

DE69829662T2 - Vorrichtung und verfahren zur wundbehandlung

Info

Publication number: DE69829662T2
Application number: DE69829662T
Authority: DE
Inventors: Vladimir Ritter
Original assignee: Polyheal Ltd
Current assignee: Polyheal Ltd
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: US5861149A; BR9809725A; ES2241145T3; KR20010013349A; AU7671898A; EP0988029A4; AU764113B2; WO1998055108A1; CA2292528A1; KR100589064B1; US6086863A; EP0988029A1; ATE292454T1; BRPI9809725B1; IL133162A0; JP4594454B2; DE69829662D1; EP0988029B1; CA2292528C; JP2002502413A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Wunden und insbesondere die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Beschleunigung der Wundheilung und Verbesserung der Muskelregeneration, wobei als therapeutisches Agens Mikrosphären dienen.
Die Wundheilung ist ein komplexer Vorgang und umfasst Faktoren, wie Zellen, Bestandteile der extrazellulären Matrix (extracellular matrix, ECM) und die zelluläre Mikroumgebung. Jede Wundheilung umfasst im Wesentlichen die Wiederherstellung oder den Ersatz von beschädigtem Gewebe. Die genaue Art dieser Reparatur oder des Ersatzes hängt von dem beteiligten Gewebe ab, obwohl diese Vorgänge alle auf bestimmten Grundprinzipien beruhen. Um diese Prinzipien zu veranschaulichen, wird die kutane oder Haut-Wundheilung beschrieben, aber natürlich kann sich die Diskussion auch auf alle Arten der Wundheilung erstrecken.
Die Haut besteht aus mehreren Schichten, einschließlich Keratin, Epidermis und Dermis. Ist nur die Epidermis geschädigt, wie bei den meisten kleinen Verletzungen, wandern Keratinocyten vom Rand der Wunde und bedecken diese schließlich, wodurch die Epidermis und das Keratin wiederhergestellt werden [D.R. Knighton und V.D. Fiegel, Invest. Radiol., 26:604-611, 1991].
Sind alle Hautschichten beschädigt oder zerstört, muss zuerst neues Bindegewebe, das sogenannte Granulationsgewebe, den Wundraum ausfüllen. Dieses Gewebe wird durch Abscheidung von ECM-Bestandteilen durch Fibroblasten gebildet, die in den Wundraum einwandern [D.R. Knighton und V.D. Fiegel, Invest. Radiol., 26:604-611, 1991]. Die Abscheidung dieser ECM-Bestandteile, wie z.B. Kollagen, wird heute als wichtig für die Wundheilung angesehen. Tatsächlich lehrt der Stand der Technik, dass die Festigkeit der heilenden Wunde letztlich von der Kollagenabscheidung abhängt [Haukipuro, K., et al., Ann. Surg., 213:75-80, 1991]. Eine Kollagenabscheidung muss daher auf einem ausreichend hohen Niveau erfolgen, damit die heilende Wunde verstärkt und unterstützt wird.
Dieser gesamte, mehrstufige Vorgang muss beendet sein, damit eine erfolgreiche Wundheilung stattfindet. Fehlen eine oder mehrere dieser Komponenten, findet keine Heilung statt, die Haut wird nicht wiederhergestellt, und die Wunde bleibt offen. Diese offenen Wunden können sich leicht infizieren, wodurch der Heilungsvorgang weiter verzögert wird und Geschwüre und Wundstellen auf der Haut gebildet werden. Bei vielen Patienten ist der Vorgang der Wundheilung durch erschwerende Bedingungen, wie Diabetes oder hohes Alter, zusätzlich erschwert. Patienten, die unter diesen Zuständen leiden, weisen häufig Hautwunden auf, die sich entzünden und nicht heilen, oder die nur langsam heilen, nachdem eine längere Zeit vergangen ist.
Es wurden verschiedene Behandlungen angewendet, um die Geschwindigkeit der Wundheilung zu beschleunigen. Die US-Patentschrift 4,772,591 offenbart z.B. ein Verfahren zur Beschleunigung der Wundheilungsgeschwindigkeit, bei welchem eine Kombination aus Ascorbinsäure, Calcium, Tyrosin oder Phenylalanin und entzündungshemmenden Substanzen auf die Wunde aufgetragen wird. Die US-Patentschrift 4,590,212 offenbart ein ähnliches Verfahren, bei welchem Acetaminophen auf die Wunde aufgetragen wird. Viele andere Patentschriften beziehen sich auf andere Verfahren zur Beschleunigung der Wundheilungsgeschwindigkeit. Jedoch hat sich keines dieser Verfahren als allgemein wirksam erwiesen.
Zur Verbesserung der Wundbehandlung wurden verschiedene pharmazeutische Träger eingesetzt, welche chemotherapeutische Mittel an die Wunde abgeben. Solche Träger sind insbesondere bei Hautwunden notwendig, da diese im Allgemeinen entweder der Luft ausgesetzt oder von Verbänden oder Kleidung bedeckt sind. In jedem Fall kann das therapeutische Mittel beispielsweise durch Reiben leicht entfernt werden. Es wurden daher verschiedene Cremes, Gele und Puder als pharmazeutische Träger verwendet, um dieses Problem zu lösen.
Bei einer interessanten Gruppe von pharmazeutischen Trägern werden Mikorsphären verwendet, die kleine, mikroskopische Teilchen aus verschiedenen Materialien sein können, einschließlich Kunststoffen und langkettigen Kohlenwasserstoffen. Im Stand der Technik sind viele Anwendungen bekannt, bei welchen Mikrosphären als Träger für verschiedene therapeutische Mittel verwendet werden. Die US-Patentschrift 5,264,207 offenbart z.B. Mikrosphären als Träger für eine pharmazeutische oder kosmetische Substanz. Eine Zusammensetzung, welche die Mikrosphären und die aktive Substanz enthält, wird auf die Haut aufgetragen, wobei die Mikrosphären tatsächlich eine solche Art der Verabrei chung der aktiven Substanz ermöglichen. In dieser Druckschrift wird jedoch die Verwendung der Mikrosphären selbst als therapeutische Substanz weder gelehrt noch nahegelegt.
In ähnlicher Weise offenbaren die beiden internationalen Anmeldungen WO 96/13164 und WO 94/13333 Mikrosphären aus einem Material, das die Erzeugung oder Freisetzung bestimmter therapeutischer Substanzen katalysiert. Die internationale Anmeldung WO 96/13164 beschreibt polymere Stickoxid-Addukte, die Salpetersäure freisetzen, wenn sie direkt auf beschädigtes Gewebe aufgetragen werden. Die internationale Anmeldung WO 94/13333 beschreibt Teilchen, die chemisch modifiziert sind, um eine freie radikalische Aktivität in der Wundumgebung zu entwickeln. Wiederum wird jedoch in beiden Schriften die Verwendung der Mikrosphären selbst als therapeutische Substanz, ohne chemische Modifikation des Mikrosphären-Materials, weder gelehrt noch nahegelegt.
Es wurde jedoch gezeigt, dass bestimmte Eigenschaften der als pharmazeutische Träger verwendeten Mikrosphären die Wirkung der eigentlichen therapeutischen Substanz beeinflussen.
Beispielsweise wurde die Aktivierung der cytotoxischen T-Lymphocyten durch auf Latex-Mikrosphären immobilisiertes Klasse I-Alloantigen untersucht. Obwohl das Klasse I-Alloantigen eindeutig den eigentlichen Stimulus erzeugt, wurde das Ausmaß der Zellstimulation durch Verwendung von Teilchengrößen von 4 bis 5 Mikron gesteigert [M.F. Mescher, J. Immunol., 149:2402-2405, 1992]. Diese gesteigerte Stimulation kann auf die Notwendigkeit eines Oberflächenkontaktes der cytotoxischen T-Lymphocyten hinweisen. Mit anderen Worten kann eine optimale Teilchengröße die Wirkung des Klasse I-Alloantigens durch Bereitstellung einer optimalen Oberfläche für den Zellkontakt steigern. Es sei jedoch betont, dass diese Perlen lediglich einen Träger für die aktive Substanz darstellten.
Ritter, V.G. et al., "The influence of protamine sulfate poly-N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide and polystyrene latex on myoblast fusion in culture", Biologicheskie Membrany, Bd. 7, Nr. 5, 1990, S. 521-533, beschreiben den Einfluss von Polykationen, Protaminsulfat, Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid und Latexperlen auf die Fusion von Skelett-Myoblasten von Hühnerembryonen in vitro.
Ritter, V.G. et al., "Substances that intensify endocytosis sharply accelerate myoblast fusion", Doklady Akademii Nauk SSSR, Bd. 303, Nr. 1, 1988, S. 239-240, beschreiben die Fusionsfähigkeit von Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid und Polystyrol-Latexteilchen in einer Kultur von Muskelzellen von Hühnerembryonen.
Tawil, N. et al., "Positively charged beads create an enhancing environment for wound healing", Molecular Biology of the Cell, Bd. 7, Suppl., 1996, S. 419A, geben an, dass positiv geladene Perlen die Wundfestigkeit erhöhen.
Die US-A-5,092,883 betrifft ein Verfahren zur Steigerung des Wachstums und der Wiederherstellung von weichem Bindegewebe bei Säugetieren unter Verwendung von geladenen Perlen.
Es wurden Versuche unternommen, um die offensichtliche Fähigkeit bestimmter Teilchen, die Wirkung aktiver Substanzen auf die Wundheilung zu steigern, auszunützen. Die US-Patentschrift 3,842,830 offenbart z.B. Glas-Mikroteilchen, welche die Wundheilung unterstützen, wenn sie direkt auf geschädigtes Gewebe aufgetragen werden. Die US-Patentschrift 5,092,883 offenbart biodegradierbare (biologisch abbaubare), positiv geladene Dextran-Perlen mit einer ähnlichen Fähigkeit zur Steigerung der Osteogenese und Heilung von Verletzungen von Weichteilen. In keiner dieser Druckschriften wird jedoch die Förderung einer Muskelregeneration durch die Verabreichung von Mikrosphären in die Wunde gelehrt oder nahegelegt. Weiterhin beschreibt keine dieser Druckschriften Mikrosphären, die zwar zunächst einen schnelleren Zellmetabolismus und eine schnellere Zellproliferation bewirken, die aber eine zeitlich begrenzte Wirkung aufweisen, so dass keine) dauerhafter) schneller) Zellmetabolismus und Zellproliferation bewirkt werden.
Diese begrenzte Wirkung ist bei der Förderung der Wundheilung besonders wichtig, welche eine anfängliche Steigerung von Zellmetabolismus und -proliferation erfordert, wobei die Zellaktivierung nach erfolgter Heilung aufhört. Ohne die Induktion dieser Aktivierung tritt keine Wundheilung auf. Hört die Zellaktivierung nach im Wesentlichen beendeter Heilung jedoch nicht auf, entsteht eine abnormale Narbenbildung, wie bei der Bildung von Keloiden. Daher muss während der Wundheilung ein Gleichgewicht zwischen Förderung und Inhibierung von Zellmetabolismus und -proliferation gegeben sein.
Es besteht daher ein ungelöstes medizinisches Bedürfnis nach einer teilchenförmigen Substanz, die direkt auf geschädigtes Gewebe aufgetragen werden kann, um die Wundheilung zu fördern, die aber eine selbst-begrenzende Wirkung aufweist und im Wesentlichen nicht-toxisch ist, und die auch die Muskelregeneration fördern kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung sind im Detail in der nachstehenden Beschreibung, den Figuren und den Ansprüchen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung durch Verwendung von Mikrosphären. Überraschenderweise sind die Mikrosphären in dem hier beschriebenen Teilchengrößenbereich in der Lage, die Wundheilung ohne weitere Zugabe oder Aufnahme eines Arzneimittels oder einer anderen therapeutischen Substanz zu fördern. Wie nachstehend beschrieben ist, müssen die Mikrosphären nicht abgebaut oder chemisch verändert werden, um ihre therapeutische Wirkung zu entfalten. Diese Mikrosphären sind daher der aktive Bestandteil in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, und wirken nicht nur als Träger für einen anderen, unterschiedlichen, aktiven Bestandteil.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Behandlung einer Wunde eines Patienten bereitgestellt. Die Zusammensetzung besteht im Wesentlichen aus einem Mittel, das in der Lage ist, einen Mehrpunkt-Kontakt mit einer Zellmembran zu bilden, wobei das Mittel während des Behandlungszeitraums im Wesentlichen nicht biodegradierbar ist. Das Mittel umfasst Mikrosphären mit geladenen Oberflächengruppen. Nach einer Ausführungsform besteht die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einem Mittel mit geladenen Oberflächengruppen, wobei die Ladung negativ oder positiv sein kann.
Das Material der Mikrosphären ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polystyrol, derivatisiertem Polystyrol, Polymethylacrylat, Silikon, Polylysin, und Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid. Bei bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die geladenen Oberflächengruppen ausgewählt aus Gruppen, bestehend aus Polystyrol, derivatisiertem Polystyrol, Sulfat, Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid, Protamin, Protaminsulfat, Protaminsalzen, Polylysin und Carboxyl. Ebenfalls bevorzugt weisen die Mikrosphären einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,01 Mikron bis etwa 200 Mikron, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Mikron, und ganz besonders bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 20 Mikron auf.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für die Mikrosphären. Vorzugsweise ist der pharmazeutisch akzeptable Träger eine wässrige Lösung. Alternativ und bevorzugt ist der pharmazeutisch akzeptable Träger ein gelbildendes Material. Besonders bevorzugt enthält das gelbildende Material Methylcellulose.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Mikrosphären in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,0001 bis 1,5 Gew.-% vorhanden. Besonders bevorzugt sind die Mikrosphären in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,001 bis 1,0 Gew.-% vorhanden. Ganz besonders bevorzugt sind die Mikrosphären in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,2 Gew.-% vorhanden.
Nach einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Zusammensetzung zur Förderung der Muskelregeneration bei einem Patienten bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung ein Mittel umfasst, welches in der Lage ist, einen Mehrpunkt-Kontakt mit einer Muskelzelle zu bilden; vorzugsweise eine Mikrosphäre mit einer Oberflächengruppe mit einer starken Ladung, welche entweder positiv oder negativ sein kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft eine Vorrichtung zur Behandlung einer Wunde, umfassend: (a) eine Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, welches in der Lage ist, einen Mehrpunkt-Kontakt mit einer Zellmembran zu bilden, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, in welchem das Mittel im Wesentlichen unlöslich ist; und (b) einen Behälter, der die Zusammensetzung enthält. Wie beispielhaft angegeben ist, ist der Träger vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem wässrigen Medium, einem Aerosolträger, einer Salbe und einem Verband.
Nach weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist der pharmazeutische Träger ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer wässrigen Lösung, einem gelbildenden Material, einem Aerosolträger und einer Salbe. Vorzugsweise ist der pharmazeutische Träger ein gelbildendes Material. Besonders bevorzugt umfasst das gelbildende Material Methylcellulose. Ganz besonders bevorzugt ist der Behälter eine ausdrückbare Tube. Alternativ und bevorzugt ist der pharmazeutische Träger eine wässrige Lösung. Besonders bevorzugt ist der Behälter ein praktisch dichtschließender, steriler Behälter. Besonders bevorzugt ist der praktisch dichtschließende, sterile Behälter eine Aerosol-Spraydose.
Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft eine Vorrichtung zur Förderung der Muskelregeneration, umfassend: (a) eine Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, welches in der Lage ist, einen Mehrpunkt-Kontakt mit einer Zellmembran zu bilden, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, in welchem das Mittel im Wesentlichen unlöslich ist; und (b) einen Behälter, der die Zusammensetzung enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch kosmetisch angewendet werden, um eine übermäßige Narbenbildung nach einem Schnitt oder einer anderen Hautwunde beispielsweise der Gesichtshaut zu vermeiden, sowie zur Behandlung von Akne.
DETAILBESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung unter Verwendung von Mikrosphären. Überraschenderweise sind Mikrosphären im hier beschriebenen Teilchengrößenbereich in der Lage, die Wundheilung ohne weiteren Zusatz oder Aufnahme eines beliebigen Arzneimittels oder einer anderen therapeutischen Substanz zu fördern. Wie nachstehend beschrieben ist, werden die Mikrosphären nicht abgebaut oder chemisch verändert, um ihre therapeutische Wirkung zu entfalten.
Die Struktur dieser Mikrosphären umfasst einen Kern und mindestens eine Art einer geladenen Oberflächengruppe, die zumindest auf dem Äußeren des Kerns der Mikrosphäre vorhanden ist. Beispiele geeigneter Materialien für den Kern umfassen langkettige Polymere, wie Polystyrol, derivatisiertes Polystyrol, Polylysin, Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid, Polymethylacrylat (PMMA) und Silikon. Vorzugsweise ist das Material ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polystyrol und derivatisiertem Polystyrol.
Beispiele für Oberflächengruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Sulfat, Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid, Protamin, Protaminsulfat, Protaminsalze, Polylysin, Carboxyl, Polystyrol und derivatisiertes Polystyrol. Besonders bevorzugt ist die Oberflächengruppe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polylysin, Polystyrol, derivatisiertem Polystyrol und Carboxyl. Diese Oberflächengruppen können als Teil des Kerns der Mikrosphäre vorhanden sein oder sie können später durch chemische Verfahren hinzugefügt werden, z.B. durch Derivatisierung des langkettigen Polymers. Nachstehend bezieht sich der Ausdruck "Derivatisierung" auf das Verfahren einer chemischen Veränderung, Modifizierung oder Umwandlung eines Moleküls oder eines Teils davon.
Die Struktur der Mikrosphäre umfasst daher einen "Kern" und eine "Oberflächengruppe", welche zwei getrennte Elemente darstellen, obwohl sich die Liste möglicher Bestandteile beider dieser Elemente überlappt. Beispielsweise kann Polystyrol sowohl als Oberflächengruppe als auch als Kernmaterial der Mikrosphäre dienen.
Die aus dem Polymer hergestellten Mikrosphären sollen in wässrigen Medien im Wesentlichen unlöslich sein und sollen in diesen Medien eine Suspension oder Dispersion bilden.
Um die Parameter der vorliegenden Erfindung deutlicher darzustellen, wird eine Anzahl von Ausdrücken näher definiert. Nachstehend bezeichnet der Ausdruck "Wunde" jegliche Verletzung an jeglichem Körperteil eines Patienten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, akute Zustände wie Verbrennungen durch Hitze, chemische Verbrennungen, Verbrennungen durch Strahlen, durch übermäßige UV-Strahlung hervorgerufene Verbrennungen, wie beispielsweise Sonnenbrand, Verletzungen von Körpergeweben, wie beispielsweise des Perineums durch Wehen und Geburt, einschließlich Verletzungen bei medizinischen Eingriffen wie Episiotomien, traumatische Verletzungen, einschließlich Schnittwunden, Verletzungen bei Auto- und anderen mechanischen Unfällen, und Verletzungen durch Kugeln, Messer und andere Waffen, und Verletzungen nach chirurgischen Eingriffen, sowie chronische Zustände, wie beispielsweise Druckwunden, Dekubitus, bei Diabetes und schlechter Blutzirkulation auftretende Zustände, und alle Arten von Akne. Körperteile, die erfindungsgemäß behandelt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Haut, Muskel und innere Organe. Nachstehend bezeichnet der Ausdruck "Patient" Mensch oder Tier, die erfindungsgemäß behandelt werden.
Der Ausdruck "fördernd" umfasst nachstehend beschleunigend und verstärkend. Der Ausdruck "verminderte Narbenbildung" umfasst nachstehend die Verhinderung oder Verminderung übermäßiger Narbenbildung, wie Keloide und hypertrophe Narben, sowie auch die Verminderung des Ausmaßes einer Narbenbildung sowohl extern auf der Haut des Patienten als auch intern, wie bei spielsweise Adhäsionen. Schließlich sei angemerkt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch kosmetisch angewendet werden kann, um eine übermäßige Narbenbildung bei einer Schnitt- oder sonstigen Wunde der Haut, wie z.B. der Gesichtshaut, zu vermeiden, und zur Behandlung von Akne. Im kosmetischen Bereich umfasst der Ausdruck "übermäßige Narbenbildung" jegliche Narbenbildung, die kosmetisch unerwünscht oder nicht akzeptabel ist.
Obwohl sich die nachstehende Beschreibung auf bestimmte Typen von Mikrosphären bezieht, ist dies in keiner Weise beschränkend. Der Fachmann weiß, dass diese Mikrosphären, allgemein als "Mittel" beschrieben, Perlen, Teilchen oder Kugeln darstellen können, die entweder kompakt oder hohl sind. Bei bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind diese Mittel in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermedium dispergiert, in welchem die Mittel im Wesentlichen unlöslich sind, wie beispielsweise eine Suspension in einem wässrigen Medium oder in einem nicht-wässrigen Medium, wie einer Salbe oder einem Aerosol-Spray. Die Form der Mittel kann gleichmäßig sein, wie z.B. kugelförmig oder elliptisch, oder eine gleichmäßige nichtkugelförmige Form haben; oder die Form der Teilchen kann ungleichmäßig sein, so dass die Oberfläche keine einheitliche kontinuierliche Rundung aufweist oder nicht glatt ist.
Weiterhin können die Mittel eine Mischung unterschiedlicher Polymere sowie eine Mischung unterschiedlicher Teilchen, Perlen oder Kugeln unterschiedlicher Größen darstellen. Die Mittel können auch Poren unterschiedlicher Größen aufweisen.
Beispielsweise kann das die Mittel bildende langkettige Polymer vernetzt sein, wodurch eine kugelförmige Gestalt der Mikrosphäre besonders begünstigt wird, obwohl diese Form auch ohne Vernetzung erhalten werden kann.
Alternativ können die Teilchen chaotische unregelmäßige Formen haben, besonders, wenn das Polymer nicht vernetzt ist. Die Teilchen können jede Form aufweisen, wie z.B. gewunden, kugelförmig, länglich oder unregelmäßig gewunden. Vorzugsweise soll das Polymer biochemisch nicht reaktiv und nicht biodegradierbar sein. Besonders bevorzugt ist das Polymer während der Behandlungsdauer im Wesentlichen nicht biodegradierbar, so dass es während des für die Wundheilung erforderlichen Zeitraumes nicht abgebaut wird. Nachstehend bezieht sich der Ausdruck "nicht biodegradierbar" auf Mittel, die während des Behandlungszeitraumes, also des für die Behandlung der Wunde erforderlichen Zeitraums, nicht biodegradierbar sind.
Die Mittel sollen mindestens die nachstehenden Eigenschaften aufweisen:

1. Sie sollen in der Lage sein, Mehrpunkt-Kontakte mit Zellen oder Teilen davon zu bilden, wie z.B. der äußeren Zellmembran und Molekülen auf dieser Membran;
2. Sie sollen in der Lage sein, die Wundheilung ohne eine signifikante chemische Änderung oder Abbau zu fördern; und
3. Sie sollen in wässrigen Medien, wie den Körperflüssigkeiten, im Wesentlichen unlöslich sein, sondern eine Suspension bilden.

Diese Eigenschaften sind wichtig, da, wie nachstehend näher beschrieben wird, die Wirkung der erfindungsgemäßen Mittel direkt auf die Bildung von Mehrpunkt-Kontakten zwischen dem Material der Mittel und einem Teil der Zelle, wie der äußeren Zellmembran, zurückgeführt werden kann, wodurch eine Haftfläche gebildet wird, an welche die Zellen sich anheften können. Diese Mehrpunkt-Kontakte werden durch viele unterschiedliche Polymere ermöglicht, welche geladene Gruppen für eine Interaktion mit Molekülen und Anteilen der äußeren Zellmembran zugänglich machen. Obwohl die nachstehende Beschreibung sich auf einen Typ von Mittel, die Mikrosphären, bezieht, umfasst die vorliegende Erfindung alle Materialien, welche solche Mehrpunkt-Kontakte bilden können.
Wie vorstehend erwähnt, weisen die Mikrosphären vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 200 Mikron auf, besonders bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Mikron, und ganz besonders bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 20 Mikron. Ohne auf einen bestimmten Mechanismus beschränkt zu sein, stellen diese bevorzugten Bereiche die geeignetste Größe dar, damit die Mikrosphären von den Wundbereich infiltrierenden Makrophagen aufgenommen werden können. Die Mikrosphären scheinen die Makrophagen durch Kontakt mit zumindest einem Teil der Makrophagen, wahrscheinlich den Molekülen auf der äußeren Zellmembran der Makrophagen, aktiv anzuziehen und zu aktivieren. Die entzündungshemmenden und antibakteriellen Wirkungen, die bei den Mikrosphären beobachtet werden, sind daher wahrscheinlich indirekte Wirkungen, die durch die Aktivierung von Makrophagen oder von anderen Zellen erzielt werden.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Mikrosphären ist die Ladung der Oberflächengruppen. Die Gesamtladung bestimmter bevorzugter Beispiele der Mikrosphären wurde als Z oder Zeta-Potential durch die elektrophoretische Mobilität (mV) mit einem ZetaMaster (von Malvern Instruments, Großbritannien) gemessen. Der bei bestimmten beispielhaften Ausführungsformen gemessene Bereich des Z-Potentials betrug -29,58 mV bis -79,76 mV. Der Ausdruck "geladen" bezeichnet nachstehend ein Z-Potential mit einem absoluten Wert von mindestens etwa 1 mV, und vorzugsweise von mindestens etwa 10 mV, entweder negativ oder positiv.
Die Mikrosphären in den getesteten Suspensionen zeigten keine Aggregation, Verschmelzung, Verklumpung oder irrever sible Kuchenbildung. Obwohl die Mikrosphären mit der Zeit zum Absetzen neigen, konnten sie durch geringes Schütteln leicht resuspendiert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird nun beispielhaft unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin bedeuten:
1 einen Graphen, der die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Mikrosphären zeigt, die Kreatinphosphokinase-Aktivität zu erhöhen;
2 eine Darstellung, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Kollagensynthese veranschaulicht;
3A-3C veranschaulichen die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Form der Myoblasten;
4A-4D veranschaulichen die Fähigkeit der Mikrosphären, die Wundheilung bei Ratten zu fördern;
5 einen Graphen, der zeigt, mit welcher Geschwindigkeit die Wundfläche von 4 abnimmt;
6A und 6B vergleichen die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Wundheilung in Gewebekulturmedien und Kochsalzlösung bei Ratten;
7A-7D zeigen die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Mikrosphären zur Förderung der Wundheilung in einer ersten Beobachtungsstudie am Menschen;
8A und 8B zeigen weiter die erfindungsgemäße Wirkung bei der Beobachtungsstudie am Menschen nach den 7A bis 7D;
9A und 9B zeigen die Wirkung der Erfindung bei einer zweiten Beobachtungsstudie am Menschen;
10A-10D zeigen die Wirkung der Erfindung bei einer dritten Beobachtungsstudie am Menschen;
11A und 11B zeigen die Wirkung der Erfindung bei einer vierten Beobachtungsstudie am Menschen; und
12 zeigt die Wirkung einer erfindungsgemäßen Gelformulierung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft anhand der Verwendung von Mikrosphären beschrieben, welche dazu verwendet werden können, um eine allgemeine Wundheilung und Muskelregeneration zu fördern. Wundheilung und Muskelregeneration umfassen die Wiederherstellung von beschädigtem Gewebe und den Ersatz von fehlendem Gewebe. Die Migration und Proliferation von bestimmten Zelltypen muss in geregelter und strukturierter Weise erfolgen, und kann von dem ungehemmten Wachstum maligner Gewebe, wie fester Tumoren, leicht unterschieden werden. Insbesondere müssen zuerst die an der Wundheilung und Muskelregeneration beteiligten Zellen aktiviert werden, um ihre erforderlichen Funktionen bei dem Heilungsprozess auszuführen. Obwohl der genaue Mechanismus nicht bekannt ist, weist das geregelte, strukturierte Zellwachstum bei der Proliferation, welches bei der Wundheilung auftritt, auf die Anwesenheit eines hochorganisierten, regulatorischen Prozesses hin.
Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, stören die erfindungsgemäßen Mikrosphären anscheinend nicht diesen komplexen, organisierten und strukturierten Prozess, da die Mikrosphären lediglich die Geschwindigkeit des gesamten Hei lungsprozesses und bestimmte Schritte innerhalb dieses Prozesses beschleunigen. Überraschenderweise bewirken die erfindungsgemäßen Mikrosphären jedoch keine kontinuierliche, ungehemmte metabolische Aktivierung der Zellen, so dass die normalen regulatorischen Prozesse offenbar nicht beeinflusst werden. Die erfindungsgemäßen Mikrosphären bewirken daher keine ungehemmte zelluläre Aktivierung.
Ohne dass die Erfindung auf einen bestimmten Mechanismus beschränkt wird, wird angenommen, dass der Zusatz von Mikrosphären mit negativ geladenen Gruppen eine therapeutische Wirkung auf die Wundheilung hat, indem sie als zusätzliche Oberfläche für die Anheftung und Bedeckung von Zellen dienen. Eine Hypothese über die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären ist, dass die negativ geladenen Gruppen die Ausbildung einer Vielzahl von Bindungen zwischen der festen Oberfläche der Mikrosphären und den Zellmembranen ermöglichen, also von Mehrpunkt-Kontakten zwischen dem Material der Mikrosphären und den Zellmembranen. Die Ausbildung dieser Bindungen bewirkt Änderungen in der Verteilung und dem Zustand von Membranliganden, eine cytoskeletale Reorganisation, die Aktivierung der intrazellulärer Signalübertragung und andere biochemische Veränderungen, welche schließlich eine Aktivierung der Zelle bewirken. Die Zellaktivierung führt dann zu einer Zellproliferation und der Produktion von Wachstumsfaktoren, sowie von Kollagen und anderen Bestandteilen der extrazellulären Matrix. Natürlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf einen bestimmten Mechanismus beschränkt, da, wie nachstehend gezeigt, die Mikrosphären deutlich eine positive Wirkung auf die Wundheilung und die Heilung in vivo zeigten.
In den nachstehenden Beispielen wurde eine Anzahl unterschiedlicher Typen von Mikrosphären untersucht. Diese Mikrosphären wurden aus Polystyrol hergestellt, entweder mit Carboxyl- oder Amino-Oberflächengruppen oder ohne zusätzliche Ober flächengruppen. Der Durchmesser der Mikrosphären lag im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 Mikron. Das Zeta-Potential bestimmter Mikrosphären wurde ebenfalls untersucht und es wurde gezeigt, dass die Größe der Sphäre und die Art der Oberflächengruppen deutlich eine Wirkung auf die Größe der von jeder Mikrosphäre getragenen Gesamtladung hat, welche einen wichtigen Effekt auf die Fähigkeit der Mikrosphäre zur Förderung der Wundheilung haben kann.
Obwohl bestimmte Typen von Mikrosphären erläutert sind, können natürlich auch viele andere verwandte Arten von Mikrosphären verwendet werden, wenn die nachstehenden Eigenschaften vorhanden sind:

1. Sie sollen in der Lage sein, Mehrpunkt-Kontakte mit Zellen oder Teilen davon zu bilden;
2. Ihr Wirkmechanismus soll keine chemische Änderung oder Degradierung erfordern; und
3. Sie sollen in wässrigen Medien, wie den Körperflüssigkeiten, im Wesentlichen unlöslich sein, sondern eine Suspension bilden.

Weitere bevorzugte Eigenschaften sind nachstehend angegeben. Erstens sollen die Mikrosphären bevorzugt aus einem Material hergestellt sein, welches während des Behandlungszeitraums nicht biodegradierbar ist, besonders bevorzugt aus Polystyrol. Zweitens sollen die Mikrosphären vorzugsweise eine starke Ladung tragen, besonders bevorzugt eine insgesamt negative Ladung. Obwohl die Größe der Mikrosphären nicht besonders kritisch ist, sollen die Mikrosphären vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,1 bis etwa 20 Mikron haben. Vorzugsweise sollen die Mikrosphären mit oberflächlichen Carboxylgruppen derivatisiert sein, obwohl auch andere negativ geladene Gruppen verwendet werden können. Die Arten der Mikrosphären sind daher nur zur Erläuterung angegeben und sollen in keiner Weise beschränkend sein.
Die Prinzipien und die Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Mikrosphären können unter Bezugnahme auf die Beispiele, die Zeichnungen und die Beschreibung besser verstanden werden.
Beispiel 1
Wirkung der Mikrosphären auf Kreatinphosphokinase
Die erfindungsgemäßen Mikrosphären bewirken eine deutliche anfängliche Steigerung der Kreatinphosphokinase-(CPK)-Aktivität von Myoblasten in Kultur, wie es in 1 dargestellt ist. Nach 8 Tagen zeigten jedoch die unbehandelten und die behandelten Zellen das gleiche Ausmaß an CPK-Aktivität, was anzeigt, dass die Induktion der gesteigerten CPK-Aktivität durch die erfindungsgemäßen Mikrosphären zeitlich begrenzt ist. Das experimentelle Verfahren ist nachstehend angegeben.
Es wurde eine Primärkultur von embryonalen Skelettmuskelzellen von Ratten hergestellt, wie bei Freshney beschrieben [R.J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey, 1986, S. 117, 170-172]. Kurz gesagt, wurden die Muskeln von Haut und Knochen freipräpariert und durch warme Trypsination (0,25% Trypsin bei 36,5°C) abgetrennt. Eine Kontaminierung mit Fibroblasten wurde durch einstündiges Vorplattieren der Zellen in einem Inkubator unter 5% CO₂ bei 37°C vermindert, da sich Fibroblasten zuerst an Gewebekulturplatten anheften. Anschließend wurden die Myoblasten auf 35 mm-Petrischalen mit einer Konzentration von 50.000 Zellen pro ml mit 2 ml Medium (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium : Medium 199 in einem Verhältnis von 1:4) geimpft, welches mit Antibiotika, 10 Vol.-% Pferdeserum und 4 Vol.-% Hühnerembryonenextrakt angereichert war. Der Hühnerembryonenextrakt wurde nach R.J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey, 1986, aus 10 Tage alten Hühnerembryonen hergestellt. Die Antibiotika waren Amphotericin und Gentamicin, aus einer ursprünglichen Standardkonzentration von 2,5 mg/ml im Verhältnis 1:1000 verdünnt. Nach 24 Stunden wurde das Medium dekantiert und durch neues Medium ersetzt, welches 20 Vol.-% fötales Pferdeserum und 1 Vol.-% Hühnerembryonenextrakt enthielt.
Die kultivierten Zellen wurden dann entweder von Anfang des Ausplattierens an mit Mikrosphären im Medium über 4 bis 8 Tage oder nur mit Medium behandelt. Die Mikrosphären waren entweder carboxyliertes Polystyrol mit einem Durchmesser von 1, 2 oder 4,5 Mikron, oder nur Polystyrol mit einem Durchmesser von 4,5 Mikron. Die Konzentration der Mikrosphären betrug entweder 10⁶ oder 10⁷ pro ml Medium, wobei ähnliche Ergebnisse für beide Konzentrationen erhalten wurden (nicht dargestellt). Nach 4, 5, 6, 7 oder 8 Tagen Behandlungsdauer wurde die Kreatinphosphokinase-Aktivität nach einem Standardassay gemessen ("Creatine Kinase", Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., USA, 1972, S. 54-55). Die Ergebnisse sind in 1 als Einheiten CPK-Aktivität pro mg Gesamt-Zellprotein angegeben.
1 verdeutlicht im Vergleich mit Kontrollzellen die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Mikrosphären, im eine anfängliche Steigerung der Kreatinphosphokinase-Aktivität zu induzieren. Nach 4 Tagen Behandlungsdauer zeigen die mit Mikrosphären behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen eine anfängliche Steigerung der CPK-Aktivität. Diese Steigerung ist nach 5 und 6 Tagen Behandlung besonders ausgeprägt. Ab dem siebten Tag jedoch gleicht sich die CPK-Aktivität der Kontrollzellen derjenigen der mit Mikrosphären behandelten Zellen an. Am achten Tag zeigen sowohl die Kontroll- als auch die mit Mikrosphären behandelten Zellen ähnliche Aktivitätsniveaus. Es ist offensichtlich, dass die Mikrosphären eine anfängliche Steigerung der CPK-Aktivität in Myoblasten fördern, die nach 8 Tagen Behandlungsdauer erlischt. Diese gesteigerte CPK-Aktivität ist mit der biochemischen Reifung von myogenen Zellen korreliert. Die Mikrosphären fördern daher die biochemische Reifung von kultivierten Myoblasten.
Beispiel 2
Wirkung der Mikrosphären auf die Zellproliferation und Fusion
Es wurde gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Mikrosphären im Vergleich zu (unbehandelten) Kontrollzellen eine anfängliche Steigerung sowohl der Zellproliferation als auch der Myoblastenfusion induzieren, wie es nachstehend dargestellt ist.
Es wurden, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, Primärkulturen von Rattenmyoblasten hergestellt, außer dass die Zellen auf Deckplättchen gezogen wurden. Die behandelten Zellen wurden, wie nachstehend näher beschrieben, mit Mikrosphären im Medium inkubiert, während bei den Kontrollzellen nur Medium eingesetzt wurde.
Zur Bestimmung des Ausmaßes der Zellproliferation wurden die Zellen in Ethanol/Essigsäure (3:1) fixiert und anschließend mit Hämatoxilin-Eosin angefärbt. Die angefärbten Zellen wurden in einem Lichtmikroskop gezählt. Der mitotische Index wurde als Anteil der mitotischen Zellen pro 1000 gezählte Zellen berechnet.
Zur Untersuchung der Zellproliferation wurden Polystyrol-Mikrosphären mit Oberflächen-Sulfatgruppen und einem Durchmesser von 0,18 Mikron in einer Konzentration von 10⁷ Mikrosphären/ml Medium verwendet. Es wurde eine 20fache Steigerung des mitotischen Index nach einer 24stündigen Behandlung mit Mik rosphären im Vergleich zu Kontrollzellen beobachtet. Im Einzelnen betrug der mitotische Index der Kontrollzellen 1,25 ± 0,7%, während er für mit Mikrosphären behandelte Zellen 24,6 ± 1,0% betrug. Die Mikrosphären fördern daher deutlich eine große Steigerung des mitotischen Index der Myoblasten.
Es wurde auch die Wirkung der Mikrosphären auf die Myoblastenfusion untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Allgemein zeigen mit Mikrosphären behandelte Zellen etwa 150% der Fusionsrate im Vergleich zu Kontrollzellen. Das Ausmaß dieser Wirkung hängt jedoch von dem Typ der Mikrosphären und der Dauer der Behandlung ab.
Die untersuchten Typen von Mikrosphären sind in Tabelle 1 angegeben. Der Durchmesser der Mikrosphären ist in Mikron unter "Durchmesser" angegeben. Die Oberflächengruppen auf den Polystyrol-Perlen sind unter "Oberflächengruppe" angegeben. Polystyrol-Perlen ohne weitere Derivatisierung sind mit "Polystyrol" bezeichnet. Mit Carboxyl- bzw. Amino-Oberflächengruppen derivatisierte Perlen sind mit "Carboxy" bzw. "Amino" bezeichnet. Die Konzentration der Perlen ist als Zahl der Perlen pro ml Medium unter "Konz." angegeben.
Die Zellen wurden präpariert, fixiert und gefärbt, wie vorstehend bei der Bestimmung der Proliferationsrate von Myoblasten beschrieben. Die Zellen wurden anfänglich mit der in Tabelle 1 angegebenen Dichte als Zellen pro ml Medium plattiert, siehe Spalte "Anfängliche Zellen". Die Messungen der Myoblastenfusion erfolgten nach der angegebenen Anzahl von Tagen nach Behandlung unter "Tage nach Behandlung".
Das Ausmaß der Fusion ist als Anteil der Kerne in den multinuklearen Zellen, oder Myosimplasten, bezogen auf die Gesamtzahl der Kerne im mikroskopischen Feld, angegeben und als "Anteil der Fusion" für mit Mikrosphären behandelte Zellen, und "Kontrolle Fusion" für unbehandelte Kontrollzellen, bezeichnet. Für jede experimentale Bedingung wurden mindesten 400 Kerne gezählt. Das Verhältnis des Ausmaßes der Fusion in mit Mikrosphären behandelten und unbehandelten Kontrollzellen ist als "Relativer Effekt" angegeben. Ist an einer bestimmten Stelle in der Tabelle 1 kein Wert angegeben, so ist der Wert der Gleiche wie in der vorstehenden Zeile.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, fördern alle unterschiedlichen Arten von Mikrosphären die Myoblasten-Zellfusion, obwohl das Ausmaß der Wirkung von dem Durchmesser der Mikrosphären, der Oberflächengruppe auf den Mikrosphären, der Zahl von Tagen nach Behandlung und der Konzentration abhängt. Eine Myoblastenfusion tritt auf, wenn Muskelgewebe während der Embryogenese gebildet wird, und sie ist auch ein sehr wichtiger Schritt bei der Muskelregeneration und der Wiederherstellung von geschädigtem Muskelgewebe. Die Fähigkeit der Mikrosphären, eine derartige Fusion zu fördern, zeigt daher deutlich das Potential dieser Mikrosphären, die Muskelregeneration zu fördern, wie es im nachstehenden Beispiel 5 dargestellt ist.
Beispiel 3
Wirkung der Mikrosphären auf die Kollagensynthese und -abscheidung
Wie vorstehend im Hintergrund-Abschnitt angemerkt, sind Kollagensynthese und -abscheidung ein wichtiger Schritt bei dem Prozess der Wundheilung. Die Menge von in der Wunde abgeschiedenem Kollagen ist weiterhin ein wichtiger Faktor für die Wundfestigkeit. Obwohl die erfindungsgemäßen Mikrosphären daher deutlich unterschiedliche Wirkungen auf unterschiedliche Zelltypen haben, wie in den vorstehenden und den nachstehenden Beispielen gezeigt ist, ist ein wichtiger Bestimmungsfaktor der Fähigkeit einer Zusammensetzung, die Wundheilung zu fördern, deren Wirkung auf die Kollagensynthese und -abscheidung.
Wie in den 2A und 2B dargestellt ist, fördern die erfindungsgemäßen Mikrosphären deutlich die Kollagensynthese bei kultivierten Fibroblasten. Die größte Wirkung wird bei Mikrosphären vom Typ I und Typ II erhalten. Mikrosphären vom Typ I haben einen Durchmesser von 4,5 Mikron, sind aus carboxyliertem Polystyrol hergestellt und haben ein Z-Potential von etwa -29,96 mV. Mikrosphären vom Typ II haben einen Durchmesser von 0,49 Mikron, sind nur aus Polystyrol hergestellt und haben ein Z-Potential von etwa -34,5 mV. Mikrosphären vom Typ III haben einen Durchmesser von 0,49 Mikron, sind nur aus Polystyrol hergestellt und haben ein Z-Potential von etwa -53,5 mV. Das experimentelle Verfahren ist nachstehend angegeben.
Fibroblastenkulturen aus Vorhaut wurden in 75 cm³-Kunststoffkolben (Corning Glass Works, Corning, NY) in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 4,5 mg/ml Glucose, angereichert mit 10 Vol.-% fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamycinsulfat und 2,5 mg/ml Amphotericin B, gezüchtet. Die Kulturen wurden in 5% CO₂ bei 37°C bis zum Verlaufen inkubiert. Die Fibroblasten wurden unter Verwendung von 0,25 Trypsin/0,05 EDTA-Lösung geerntet und in Platten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 200,000 Zellen/Vertiefung mit dem gleichen Medium 24 Stunden inkubiert, wobei die behandelten Zellen mit Mikrosphären vom Typ I, II oder III inkubiert wurden. Kontrollzellen wurden nur mit dem Medium inkubiert.
Die Kollagensynthese wurde wie folgt gemessen. Die kultivierten Fibroblasten wurden in mit 0,5% dialysiertem fötalem Kalbsserum angereichertem DMEM 24 Stunden vorinkubiert. Die Zellen wurden mit einer β-Aminopropionitrilfumarat (BAPN) enthaltenden 3 μCi 2,3-³H-Prolin- oder 3,4-³H-Prolin-Lösung mit einer Endkonzentration von 100 μM markiert, entweder in Anwesenheit (2A) oder Abwesenheit (2B) von 10 μM Ascorbinsäure, wie angegeben. Ascorbinsäure fördert die Kollagensynthese in Fibroblasten und ist ein wichtiger Stimulationsfaktor.
Nach 24 Stunden Inkubation war die Reaktion beendet, worauf das Kollagen von jeder Vertiefung durch Zugabe von 30 μl Pepsin (Endkonzentration 0,5 mg/ml) enthaltender kalter Essigsäure (0,5 M) extrahiert wurde, gefolgt von leichtem Schütteln über 4 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Zentrifugieren wurde das zelluläre Sediment verworfen, worauf 80 μl Kollagenlösung in 0,5 M Essigsäure zu jedem Überstand gegeben wurden, wobei die Endkonzentration an Kollagen etwa 200 mg/ml betrug. Das Kollagen wurde aus jedem Überstand durch Zugabe von 0,4 ml einer 5,2 M NaCl-Lösung in 0,5 M Essigsäure ausgefällt. Nach dem Stehenlassen über 2 Stunden wurde das ausgefällte Kollagen durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 15.000 U/min abgetrennt. Anschließend wurde das Pellet in 750 μl 10 mM TRIS-Puffer, enthaltend 1 M NaCl, bei einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert. Kollagen wurde durch Zugabe von 750 μl TRIS-Puffer, enthaltend 5 M NaCl, bei einem pH-Wert von 7,4 ausgefällt. Nach 2 Stunden wurde das Kollagen durch Zentrifugieren abgetrennt, in 0,5 M Essigsäure aufgenommen und jede Probe in einem Szintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse sind in den 2A und 2B als cpm pro Vertiefung dargestellt. Die dargestellten Daten sind ein Mittel über vier Proben.
Die Mikrosphären sowohl vom Typ I als auch vom Typ II waren in der Lage, die Kollagensynthese über das bei (unbehandelten) Kontroll-Fibroblasten beobachtete Niveau zu stimulieren, sowohl in Anwesenheit (2A) als auch in Abwesenheit ( 2B) von Ascorbinsäure. Die Mikrosphären vom Typ I hatten im Vergleich zu den Mikrosphären vom Typ II eine größeren Effekt in Anwesenheit von Ascorbinsäure, obwohl beide Typen eine ähnliche Wirkung in Abwesenheit von Ascorbinsäure aufweisen. Die Mikrosphären vom Typ III hatten weder in Anwesenheit noch in Abwesenheit von Ascorbinsäure eine nachweisbare Wirkung auf die Kollagensynthese.
Ein besonders interessantes Ergebnis ist, dass sowohl die Mikrosphären vom Typ I als auch vom Typ II eine Wirkung haben, während die Mikrosphären vom Typ III dies nicht tun, was anzeigt, dass die bestimmte Größe und das Material der Mikrosphären wichtig ist. Weiterhin haben die Mikrosphären sowohl vom Typ I als auch vom Typ II eine Wirkung auch in Abwesenheit von Ascorbinsäure, was anzeigt, dass diese beiden Typen von Mikrosphären die Kollagensynthese sogar in Abwesenheit anderer stimulierender Faktoren verstärken können. Sowohl die Mikrosphären vom Typ I als auch vom Typ II haben daher eine ausgeprägte Wirkung auf die Kollagensynthese.
Beispiel 4
Wirkung der Mikrosphären auf die Form von Myoblasten
Es wurden primäre Zellkulturen von Rattenmyoblasten wie vorstehend unter Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Zellen wurden anschließend mit (behandelte Zellen) oder ohne (Kontrollzellen) Polystyrol-Mikrosphären 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann in 1% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung 1 bis 4 Tage fixiert, und in PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 Stunde in eine Lösung von 1% Gerbsäure und 1% Guanidin-HCl (Verhältnis 1:1) in PBS überführt. Die Proben wurden in 1% OsO₄ 1 Stunde nachfixiert und in abgestuftem Ethanol und Freon 113 bei Raumtemperatur entwässert. Die Proben wurden auf Plättchen aufgebracht, mit Gold beschichtet und in einem JEOL T-300 Rasterelektronenmikroskop bei 2 kV untersucht.
Die 3A bis 3C zeigen die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Form der Myoblasten. In 3A ist die Zelle über die Mikrosphäre gewachsen, so dass ein Teil der Zelloberfläche konvex und nicht flach ist. Die 3B und 3C zeigen, wie sich Pseudopodien von dem Teil der Zelle, auf dem sich die Mikrosphäre befindet, erstrecken. Das Pseudopodium der Zelle von 3C ist besonders ausgeprägt und zeigt, dass die Mikrosphären einen deutlichen Einfluss auf die Form der Myoblasten haben. Weiterhin sind die Bildung und Ausdehnung von Pseudopodien durch Änderungen der cytoskelettalen Struktur bedingt, woraus sich ergibt, dass die Mikrosphären auch einen Ein fluss auf das Cytoskelett der Zelle haben. Die Bildung der Pseudopodien kann für die Migration von Zellen in den Wundbereich wichtig sein. Die Stimulation der Pseudopodien durch die Mikrosphären ist daher ein Hinweis auf deren Fähigkeit, einen weiteren wichtigen Schritt im Wundheilungsprozess zu fördern.
Beispiel 5
Vorrichtung und Anwendungsverfahren
Die nachstehende Beschreibung bezieht sich auf eine allgemeine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anwendung der Mittel bei der Wundheilung. Die Mittel, z.B. die Mikrosphären, werden vorzugsweise mehrmals auf die zu behandelnde Wunde aufgetragen. Die Häufigkeit der Anwendung und die aufgetragene Konzentration hängt von der Schwere der Symptome und dem Ansprechen des Patienten auf die Behandlung ab. Der Fachmann kann die optimale Konzentration, das Verfahren zur Dosierung und die Häufigkeit leicht bestimmen. Bei der vorliegenden Studie wurden die Mikrosphären etwa ein- bis zweimal täglich auf die zu behandelnde Wunde aufgetragen, obwohl natürlich auch andere Anwendungshäufigkeiten möglich sind.
Das Verfahren umfasst den Schritt der Verabreichung der Mittel, z.B. der Mikrosphären, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, in welchem die Mittel im Wesentlichen unlöslich sind, an einen Patienten. Beispiele pharmazeutisch akzeptabler Träger umfassen wässrige Medien zum Suspendieren der Mittel, nicht-wässrige Mittel, wie Salben, Cremes und aerosolbildende Mittel, sowie Verbände, welche mit den die Mittel enthaltenden Medien getränkt sind oder diese anderweitig enthalten. Wie nachstehend und in Beispiel 9 näher beschrieben ist, ist ein besonders bevorzugter pharmazeutisch akzeptabler Träger ein gelbildendes Material, wie z.B. Methylcellulose, so dass die Mikrosphären in Gelform vorliegen. Obwohl Methylcellulose ein beson ders bevorzugtes Beispiel für ein gelbildendes Material darstellt, können natürlich auch andere gelbildende Materialien verwendet werden, insbesondere, wenn diese gelbildenden Materialien im Wesentlichen physiologisch inert sind. Die Verbände können okklusiv oder nicht-okklusiv sein. In jedem Fall können die sich in einem pharmazeutisch akzeptabeln Träger befindlichen Mittel als Dispersion der Mittel beschrieben werden.
Die Mittel werden nach einem wirksamen Dosierverfahren verabreicht, vorzugsweise, bis ein zuvor definierter Endzustand erreicht ist, z.B. der Wegfall klinischer Symptome bei dem Patienten. Ein Beispiel für einen Endzustand ist der Verschluss der zu behandelnden Wunde.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Zusammensetzung mit einem oder mehreren Mitteln und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger für die Mittel, und einen die Zusammensetzung enthaltenden Behälter. Vorzugsweise ist der Behälter ein im Wesentlichen verschlossener, steriler Behälter, z.B. eine ein Aerosol abgebende Pump- oder Sprühdose. Alternativ und bevorzugt ist der Behälter ein im Wesentlichen steriler Verband. Ebenfalls alternativ und bevorzugt ist der Behälter eine ausdrückbare Tube oder eine ein Gel abgebende Pumpe. Der Fachmann kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften des bevorzugten Trägers leicht geeignete Behälter für die Zusammensetzung auswählen.
Obwohl die erfindungsgemäßen Mikrosphären sogar ohne Träger verwendet werden können, indem sie direkt auf die Wunde aufgebracht werden, sind die extrem niedrigen Konzentrationen an Mikrosphären, die eine Wundheilung bewirken, viel leichter aufzutragen, wenn sie sich in einem pharmazeutischen Träger befinden. Vorzugsweise sind die Mikrosphären in Konzentrationen in einem Bereich zwischen etwa 0,0001 Gew.-% und 1,5 Gew.-% vorhanden. Besonders bevorzugt sind die Mikrosphären in Konzentrationen in einem Bereich zwischen etwa 0,001 Gew.-% und 1,0 Gew.-% vorhanden. Ganz besonders bevorzugt sind die Mikrosphären in Konzentrationen in einem Bereich zwischen etwa 0,01 Gew.-% und etwa 0,2 Gew.-% vorhanden. Derart niedrige Konzentrationen sind in einem geeigneten Träger, der sich in einem geeigneten Behälter befindet, am Besten zu lagern, zu transportieren und insbesondere aufzutragen.
Ein Beispiel für eine bevorzugte Kombination eines bevorzugten Trägers und eines Behälters ist eine wässrige oder andere flüssige Suspension, die in einer ein Aerosol abgebenden Pumpe enthalten ist. Ein anderes Beispiel für eine besonders bevorzugte Kombination eines Trägers und eines Behälters ist ein gelbildendes Material, z.B. Methylcellulose oder jede andere geeignete gelbildende Substanz, die in einer ausdrückbaren Tube enthalten ist. Die Gelform ist besonders bevorzugt, da sie den Verbleib der Mikrosphären im Wundbereich erhöht, wodurch eine geringere Menge der Gelformulierung die gleiche Wundheilung bewirken kann. Dieser Effekt ist im nachstehenden Beispiel 9 gezeigt. Besonders bevorzugte Kombinationen eines Trägers und eines Behälters sind also wirksam und gut anwendbar beim Transport, bei der Lagerung und Auftragung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, besonders bei den bevorzugten, äußerst niedrigen Konzentrationen der Mikrosphären.
Unabhängig von der konkret verwendeten Vorrichtung werden die Mittel, z.B. die Mikrosphären, vorzugsweise in einem zweistufigen Verfahren aufgetragen. Die Mikrosphären werden zuerst als Dispersion auf die Wunde aufgetragen, z.B. durch Auftropfen, Aufsprühen, Aufpinseln, Waschen oder nach jedem anderen geeigneten Verfahren zur topischen Anwendung. Vorzugsweise lässt man vor der zweiten Stufe 30 Sekunden bis zwei Minuten verstreichen, damit die Mikrosphären einen anfänglichen Kontakt mit der Wunde bilden können. Die zweite Stufe umfasst vorzugsweise das Anbringen eines okklusiven oder nicht-okklusiven Verbandes, oder jeder geeigneten Abdeckung, die mit der die Mikrosphären enthaltenden flüssigen Suspension getränkt ist, auf die Wunde. Dadurch wird eine Absorption der Mikrosphären durch den Verband oder die Abdeckung im Wesentlichen vermindert oder verhindert. Dieses Verfahren wurde bei der Wundheilung bei Ratten und Menschen angewendet, wie es in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist.
Die Mikrosphären in der Suspension zeigten keine Aggregation, Verschmelzung, Verklumpung oder irreversibles Zusammenbacken. Obwohl die Mikrosphären mit der Zeit zum Absetzen neigen, konnten sie durch geringes Schütteln leicht resuspendiert werden.
Beispiel 6
Förderung der Wundheilung bei Ratten durch Mikrosphären
Wie vorstehend in den Beispielen 1 bis 4 gezeigt wurde, fördern die erfindungsgemäßen Mikrosphären in vitro zelluläre Prozesse, die für die Wundheilung wichtig sind. Wirkungen in vitro und in vivo sind jedoch nicht immer gleich. Daher wurden in vivo-Experimente durchgeführt, um die Fähigkeit der Mikrosphären auf die Förderung der Wundheilung bei Ratten zu untersuchen. Wie in den 4A bis 4D dargestellt ist, bewirken die erfindungsgemäßen Mikrosphären eine deutliche Förderung der Wundheilung bei Ratten. 5 zeigt einen Graphen der Geschwindigkeit, mit welcher die Wundfläche abnimmt und zeigt, dass die erfindungsgemäßen Mikrosphären die Geschwindigkeit steigern, mit welcher diese Abnahme auftritt. Auch Tabelle 2 zeigt, dass die Mikrosphären die Muskelregeneration bei Ratten fördern. Das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.
Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 400 g wurden mit Nembutal (5 mg/kg Köpergewicht) anästhesiert. Es wurde eine Schnittwunde am lateralen Teil des vorderen Schienbeinmuskels, wie nachstehend beschrieben, gesetzt. Zuerst erfolgte ein Längsschnitt durch die Haut, um den vorderen Schienbeinmuskel freizulegen. Danach erfolgte eine teilweise Exzision dieses Muskels durch einen transversen Schnitt durch die Muskelfasern in etwa der halben Länge der Muskelbreite. Das exzisierte Stück wurde dann aus dem Muskel ausgeschnitten, wodurch ein Loch von etwa 5 × 5 mm im Muskel entstand. Bei allen Ratten wurde die gleiche Menge exzisierten Gewebes (80±10 mg) von genau der gleichen Stelle im Muskel entfernt. Die Wundfläche wurde dann bei den behandelten Ratten mit 2 Mikron Polystyrol-Mikrosphären in Kochsalzlösung und bei den Kontrollratten nur mit Kochsalzlösung abgedeckt. Die Wundfläche wurde zwischen 3 und 15 Tagen nach der Verletzung vermessen.
Die 4A bis 4D zeigen Bilder der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen Wundflächen. 4A zeigt die Wunde bei der Kontrollratte unmittelbar nach der Verletzung, während 4B die gleiche Wunde bei der zu behandelnden Ratte zeigt. Die 4C und 4D zeigen die gleichen Ratten 5 Tage nach der Verletzung. Die Wunde der Kontrollratte wurde nur mit Kochsalzlösung behandelt, und war noch nicht vollständig verheilt. Im Gegensatz dazu war die Wunde der mit Mikrosphären behandelten Ratte vollständig verheilt. Die erfindungsgemäßen Mikrosphären fördern daher deutlich eine schnellere Wundheilung.
5 veranschaulicht nochmals die Förderung der Wundheilung durch die erfindungsgemäßen Mikrosphären. Die Wunden der Kontrollratten heilten auch, aber mit einer viel langsameren Geschwindigkeit als die Wunden der behandelten Ratten. Die Mikrosphären steigern daher deutlich die Geschwindigkeit, mit der die Wundfläche abnimmt und die Wunde verheilt.
Zur histologischen Abklärung wurden Schnitte angefertigt, indem eine Biopsiestanzung der Wundfläche vorgenommen wurde. Die Ratten wurden 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13 und 14 Tage nach der Verletzung getötet, worauf Biopsien für eine histologische Untersuchung entnommen wurden. Es wurde die Zahl der spezialisierten myogenen Zellen, die in die neu gebildeten oder wiederhergestellten Muskelfasern eingebaut waren, durch Bestimmung der Anzahl "neuer" Kerne gezählt, welche aktive myogene Zellen darstellen. Die Kerne dieser Zellen sind große, basophile Kerne mit verteiltem Chromatin und können leicht von den Kernen bereits bestehender Myoblasten unterschieden werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, fördern die erfindungsgemäßen Mikrosphären deutlich die Muskelregeneration, gemessen anhand der Zahl der "neuen" oder eingebauten Kerne in Muskelfasern. Da diese Messungen aus histologischen Proben von in vivo behandelten Ratten stammen, zeigt ebenfalls, dass die Mikrosphären die Muskelregeneration sowohl in vivo als auch in vitro fördern.
Schließlich vergleicht 6 die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären im Gewebekulturmedium und Kochsalzlösung auf die Wundheilung bei Ratten. Wunden wurden, wie vorstehend beschrieben, bei Ratten erzeugt, und die Ratten wurden mit Kochsalzlösung allein (6A, N), Gewebekulturmedium allein (6B, N), Kochsalzlösung plus Mikrosphären (6A, J) oder Gewebekulturmedium plus Mikrosphären (6B, J) behandelt. Die Ratten wurden dann 4 Tage nach der Verletzung fotografiert: Wie aus den 6A und 6B ersichtlich ist, konnten die Mikrosphären eine wesentlich schnellere Wundheilung induzieren, unabhängig davon, ob der Träger Kochsalzlösung oder Gewebekulturmedium war. Das Gewebekulturmedium war daher für keinen Teil der Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Wundheilung verantwortlich.
Beispiel 7
Toxizitätsstudien mit Mikrosphären
Es wurden keine toxische Wirkung einer Mikrosphären enthaltenden Zubereitung beobachtet. Eine vorläufige Untersuchung der behandelten Ratten 65 und 180 Tage nach der Verletzung ergab, dass keines der folgenden Organe Zeichen pathologischer Veränderungen aufwies: Herz, Leber, Lunge, Niere, Blutgefäße, Magen, Lymphknoten und Gehirn. Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Mikrosphären zeigten, dass keine pathologischen Anzeichen bei den behandelten Ratten beobachtet wurden. Die Mikro sphären drangen weiterhin in keines der vorstehend genannten Organe ein. Es wurde kein neues Wachstum der vorstehend genannten Organe beobachtet. Außerdem waren die Mikrosphären in der Wundfläche verteilt, drangen aber nicht in regenerierende Muskelfasern ein.
Beispiel 8
Wirkung der Mikrosphären auf die Wundheilung beim Menschen
Die vorstehend in Beispiel 6 beschriebenen in vivo Untersuchungen zeigen deutlich, dass die erfindungsgemäßen Mikrosphären die Wundheilung und Muskelregeneration bei Ratten fördern können. Die in Beispiel 7 beschriebenen Ergebnisse der Toxizitätsstudien bei Ratten zeigen weiterhin, dass die Mikrosphären im Wesentlichen nicht toxisch sind. Es wurden daher Studien durchgeführt, um die Wirkung der erfindungsgemäßen Mikrosphären auf die Wundheilung beim Menschen zu untersuchen. Wie nachstehend im Detail beschrieben ist, zeigen Fallstudien, dass die Mikrosphären die Wundheilung beim Menschen deutlich fördern. Vorzugsweise wurde eine Konzentration der Mikrosphären in einem Bereich zwischen etwa 0,0001 und 1,5 Gew.-% in wässriger Kochsalzlösung verwendet. Besonders bevorzugt lag die Konzentration der Mikrosphären im Bereich von etwa 0,001 bis 1,0 Gew.-%. Ganz besonders bevorzugt lag die Konzentration der Mikrosphären im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,2 Gew.-%.
Die erste Fallstudie betraf eine 66jährige Frau mit persistierenden Geschwüren im linken Bein. Die Patientin litt auch unter Cellulitis im linken Bein und varikösen Venen in beiden Beinen. Die Geschwüre an der linken Oberschenkelinnenseite der Patientin wurden mit 2%-igem Milton behandelt, einem korrosiven Chlorsalz in Wasser. Die Geschwüre an der linken Oberschenkelaußenseite wurden mit 4,5 Mikron großen erfindungsgemäßen Mikrosphären aus Polystyrol in Gewebekulturmedium behandelt.
7A zeigt die Kontrollwunde am Tag 0, während 7B die Kontrollwunde nach 4 Monaten Behandlung zeigt. 7C zeigt die behandelte Wunde am Tag 0, während 7D die behandelte Wunde nach 4 Monaten Behandlung zeigt.
Sowohl die mit den erfindungsgemäßen Mikrosphären behandelten Wunden als auch die mit Milton behandelten Wunden zeigten Anzeichen einer Infektion und andere Schwierigkeiten bei der Heilung während der folgenden 4 Monate. Am Ende des Behandlungszeitraums zeigten jedoch die mit den Mikrosphären behandelten Wunden eine signifikante Besserung. Die Wundgröße hatte abgenommen und die Wunden waren sauber, ohne Anzeichen einer Infektion. Sogar bei aufgrund von Komplikationen, wie einer Infektion, schwer heilenden Wunden zeigten daher die erfindungsgemäßen Mikrosphären eine größere Wirkung bei der Förderung der Wundheilung als derzeit bekannte Behandlungen.
Als weiterer Nachweis wurde die vorstehend als Kontrolle behandelte Wunde nach 7 (7A und 7B) mit den gleichen Mikrosphären, die zur Behandlung der Wunde nach den 7C und 7D verwendet wurden, behandelt. Die Ergebnisse sind in den 8A und 8B gezeigt. 8A zeigt die Wunde am Tag 0 der Behandlung mit Mikrosphären, während 8B die Wunde nach 21 Tagen Behandlung zeigt. Das Ausmaß der Wunde hat deutlich abgenommen, sogar nach einem so kurzen Behandlungszeitraum. Weiterhin war die Wunde auf die Oberfläche begrenzt und sauber, uns es trat kein Exudat mehr aus.
Die zweite Fallstudie betraf eine 52jährige Patientin mit einer ein Jahr alten Wunde an der Vorderseite des linken Oberschenkels. Die Wunde wurde eine Woche mit 1%-igem Milton behandelt, debridiert und anschließend 10 Tage mit den Mikrosphären nach den 7 und 8 behandelt. 9A zeigt die Wunde am Tag 0 der Behandlung, während 9B die Wunde nach 10 Tagen Behandlung zeigt.
Nach 10 Tagen zeigte sich eine deutliche Besserung der Wunde. Die Größe hatte abgenommen, sie war sauber und es trat kein Exudat mehr aus, wie aus 9B ersichtlich ist. Obwohl sich die Wunde während des relativ kurzen Behandlungszeitraumes nicht verschloss, war ihr Ausmaß deutlich vermindert.
Die dritte Fallstudie betraf einen 19jährigen männlichen Patienten, der bei einem Arbeitsunfall in der chemischen Industrie verletzt worden war. Die betreffenden Chemikalien, Sulfuride, verursachten schwere Verbrennungen und Blasenbildung auf der rechten Seite des Halses und der rechten Hand. Die beiden ersten Tage wurden alle Wunden mit Silverol behandelt, einem Hydrogel mit stark absorptiven Eigenschaften. Danach wurden die Wunden am rechten Unterarm mit den Mikrosphären aus den Fallstudien 1 und 2 behandelt, während die verbleibenden Wunden mit Silverol behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in den 10A und 10B (Kontrollwunde am Tag 0 bzw. Tag 5) und in den 10C und 10D (behandelte Wunde am Tag 0 bzw. Tag 5) gezeigt.
Nach 5tägiger Behandlung mit Mikrosphären hatte sich der Zustand der behandelten Wunde am Unterarm gegenüber dem der verbleibenden Wunden, die nicht mit Mikrosphären behandelt worden waren, signifikant verbessert. Die Wunde am Unterarm war nach 5-tägiger Behandlung mit den Mikrosphären vollständig verheilt. Im Gegensatz dazu waren die verbleibenden, mit Silverol behandelten Wunden nicht vollständig verheilt. Die Mikrosphären förderten daher deutlich die Wundheilung und zeigten eine bessere Wirkung als derzeit bekannte Behandlungen.
Die vierte Fallstudie betraf eine 52jährige Patientin mit Verbrennungen zweiten Grades im Glutealbereich von einem heißen Bad. Die Wunden im linken Glutealbereich wurden mit Silverol behandelt, während die Wunden im rechten Glutealbereich mit den Mikrosphären der vorgenannten Fallstudien behandelt wurden. Die Ergebnisse sind, nur für die mit Mikrosphären behandel ten Wunden, in den 11A (Tag 0) und 11B (Tag 7 der Behandlung) gezeigt.
Sieben Tage nach Behandlungsbeginn waren die mit den Mikrosphären behandelten Wunden im rechten Glutealbereich vollständig verheilt und zeigten ein gutes Wachstum des Epithels. Im Gegensatz dazu waren die mit Silverol behandelten Wunden im linken Glutealbereich nicht vollständig verheilt und schlossen sich relativ langsam. Die Mikrosphären konnten daher die Wundheilung schneller fördern als herkömmliche Behandlungen.
Die fünfte Fallstudie betraf eine 28jährige Patientin mit ausgedehntem schwerem Sonnenbrand (Daten nicht gezeigt). Sie wurde mit den Mikrosphären der vorstehenden Fallstudien behandelt. Die Patientin berichtete über eine signifikante Linderung der Beschwerden und eine schnelle Heilung des Sonnenbrandes. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Mikrosphären können daher Beschwerden lindern und die Wundheilung fördern, obwohl die Linderung der Beschwerden wahrscheinlich eine nur indirekte Wirkung der Mikrosphären ist und keine direkte Analgesie.
Es sollte erwähnt werden, dass aus dem vorstehenden Bericht der Patientin die offensichtliche Linderung der aufgetretenen Beschwerden nach dem Sonnenbrand nur abgeleitet werden kann. Die Linderung der Beschwerden zeigt wahrscheinlich nicht, dass die Mikrosphären eine direkte Wirkung auf die Übertragung von Nervenimpulsen, oder sogar eine direkte Veränderung eines der vielen Faktoren, die Beschwerden fühlbar machen, haben. Vielmehr ist diese Wirkung wahrscheinlich nur indirekt und tritt aufgrund der Aktivierung von Makrophagen auf, welche eine entzündungshemmende Wirkung haben, wodurch die Beschwerden von der Patientin weniger stark wahrgenommen werden.
Die sechste Fallstudie betraf einen 64jährigen Patienten mit Diabetes mellitus und einer postoperativen Wunde am linken Bein, die bei einer herkömmlicher Behandlung 8 Monate nach der Operation nicht verheilt war. Die Mikrosphären aus den vorstehenden Fallstudien wurden 17 Tage 2mal täglich aufgetragen. Vor der Behandlung mit den Mikrosphären maß die postoperative Wunde 7,5 cm mal 8 cm und war 6 cm tief, bei welcher Tiefe in diesem Teil des Beins der Knochen liegt, uns es lag eine Gangrän des Weichgewebes und des Knochens vor. Nach dreitägiger Behandlung mit den Mikrosphären war die Gangrän verbessert und nach 8 Tagen vollständig eliminiert (Daten nicht gezeigt). Eine Granulation des Muskels und des Knochens trat nach 3 Tagen Behandlung auf. Die Knochenregeneration war nach 10 Tagen Behandlung vollständig. Am Tag 14 hatte sich die Wunde noch nicht geschlossen, aber mit einer Granulation gesunder Farbe bedeckt. Die Tiefe der Wunde hatte sich auf fast 0,5 cm vermindert und bei dem Patienten konnte eine Hautverpflanzung durchgeführt werden. Die Schmerzen waren ferner fast unmittelbar nach Behandlungsbeginn gelindert, aber, wie bei Fallstudie 5 angemerkt, werden die verminderten Beschwerden wahrscheinlich durch eine indirekte Wirkung hervorgerufen, und nicht durch eine direkte Wirkung der Mikrosphären. Die Mikrosphären konnten daher die Wundheilung deutlich erfolgreich fördern, nachdem eine herkömmliche Behandlung versagt hatte, sogar in Anwesenheit von Komplikationen, wie einer bei Diabetes mellitus auftretenden schlechten Blutzirkulation.
Durch diese sechs Fallstudien in Verbindung mit den aus den Studien bei Ratten gewonnenen extensiven Nachweisen wurde deutlich gezeigt, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel, z.B. der Mikrosphären, eine größere Wirkung auf die Förderung der Wundheilung und Muskelregeneration hat als die derzeit bekannten Behandlungen nach dem Stand der Technik. Das Verfahren und die Vorrichtung fördern, beschleunigen und verstärken die Wundheilung, und vermindern die von den Patienten empfundenen Beschwerden.
Bezüglich der verminderten Beschwerden sei angemerkt, dass die Patienten bei den vorstehend genannten Fallstudien auch eine lokale Verminderung der Schmerzen und Beschwerden bei den behandelten Wunden angaben, insbesondere die Patientin mit dem Sonnenbrand, was wahrscheinlich einen indirekten Effekt der Mikrosphären durch die (gleichfalls indirekte) entzündungshemmende Wirkung darstellt.
Obgleich die Daten hier nicht angegeben sind, wurde schließlich auch eine indirekte bakteriostatische Wirkung auf Wundinfektionen durch Pseudomonas spec. beim Menschen beobachtet. Der Mechanismus sowohl der indirekten entzündungshemmenden Wirkung als auch der bakteriostatischen Wirkung ist nicht klar, stellt aber wahrscheinlich ein Ergebnis des zellulären Effekts auf die Anziehung und Aktivierung von Makrophagen dar. Unabhängig von dem genauen Mechanismus bedeutet die Verwendung der erfindungsgemäßen Mikrosphären aber eine signifikante Verbesserung bei der Behandlung von Wunden.
Zusätzlich zu den untersuchten Anwendungsmöglichkeiten wird eine Eignung der erfindungsgemäßen Mikrosphären für viele unterschiedliche kosmetische Anwendungen in Betracht gezogen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Mikrosphären, zusätzlich zu einer Anwendung bei Sonnenbrand, bei der Verminderung oder sogar praktisch vollständigen Heilung von Akne brauchbar sein. Die erfindungsgemäßen Mikrosphären können auch zur Behandlung kleiner Hautverletzungen, wie kleiner Schnitte beim Rasieren, in Rasierschaum oder -gel aufgenommen werden. Die erfindungsgemäßen Mikrosphären können auch bei der Verminderung oder sogar praktisch vollständigen Heilung von im Wesentlichen jeder Art von Hautverletzung brauchbar sein.
Die erfindungsgemäßen Mikrosphären können zusätzlich bei der Verminderung oder sogar praktisch vollständigen Heilung von Hämorrhoiden und intestinalen Geschwüren, wie Magengeschwiren, mit Colitis ulcerosa assoziierten Geschwüren sowie mit Heliobacter pylori assoziierten Geschwüren, brauchbar sein.
Beispiel 9
Mikrosphären in Gelform
Die flüssige Suspension der Mikrosphären in wässriger Lösung, wie vorstehend in Beispiel 8 untersucht, wurde durch Zusatz von Methylcellulose (Hoechst AG, Deutschland), eine ansonsten inerte Substanz, in eine Gelform überführt. Die Methylcellulose wurde in einer Konzentration im Bereich zwischen etwa 0,1 Gew.-% und etwa 5 Gew.-% verwendet. Die Mikrosphären in Gelform zeigten sich als besonders wirksam bei der Wundheilung, aber kleinere Mengen der Gelzusammensetzung konnten eine gleiche Heilwirkung erzielen, da durch die Gelzusammensetzung ein besserer Verbleib der Mikrosphären auf der Wundfläche erreicht wurde. Das experimentelle Verfahren ist nachstehend angegeben.
In dieser Studie wurden Hartley-stämmige Albinomeerschweinchen mit einem Gewicht von 300 bis 400 Gramm verwendet. Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Vollnarkose nach Verabreichung von Ketamin HCl (150 mg/kg, Parke-Davis, USA) durchgeführt. Nach der Narkotisierung wurden vier bilateral symmetrische Hautsegmente mit voller Dicke, in den Abmessungen 2 cm × 2 cm, vom Rücken jedes Tieres exzisiert, zwei vom Schulterbereich und zwei vom Lumbalbereich.
Die Mikrosphären in Gelform wurden nach dem Eingriff auf die Wunden aufgetragen. Anschließend wurden die Wunden verbunden. Die Verbände wurden alle 48 Stunden unter Vollnarkose gewechselt, wobei die Wunden mit warmer Kochsalzlösung gewaschen wurden, um allen Schorf und alles sich noch in der Wunde befindliche Gel zu entfernen. Alle Wunden wurden dann gemessen und fotografiert. Anschließend wurden die Mikrosphären in Gelform nochmals auf die Wunden aufgetragen und frische Verbände angelegt. Die Gelzusammensetzung wurde auch auf die Verbände aufgebracht. Alle vier Wunden bei jedem Tier wurden mit der gleichen Konzentration an Mikrosphären in Gelform behandelt. Die Konzentration der Mikrosphären betrug 0,0027 Gew.-% in 2,5% Methylcellulose. Die Mikrosphären selbst waren aus Polystyrol und hatten einen Durchmesser von 4,3 Mikron. Als Kontrolle wurden die Wunden bei einigen Tieren mit der gleichen Konzentration der gleichen Mikrosphären in flüssiger Suspension behandelt, die ebenfalls auf die Verbände aufgetragen wurde. In beiden Fällen wurden die Mikrosphären in flüssiger Suspension oder in der Gelzusammensetzung in einem ausreichenden Volumen aufgetragen, um die Wundfläche praktisch auszufüllen, so dass eine kleinere Menge Gelzusammensetzung als flüssige Suspension aufgetragen wurde.
Die Fotografien wurden nach dem ImageMeasure^®-Programm (Phoenix Corp., Seattle, Washington, USA) analysiert. Die Ergebnisse wurden als zeitliche Änderung der Wundfläche, oder als Wundverschlussgeschwindigkeit, im Vergleich zu den Kontrollen aufgetragen, und sind in 12 dargestellt. Die zeitliche Änderung der Wundfläche wurde als A₀-A_i/A₀ berechnet, wobei A₀ die Wundfläche am Tag 0 und A_i die Wundfläche am Tag i war. Sowohl die mit der flüssigen Suspension der Mikrosphären als auch die mit der Gelzusammensetzung der Mikrosphären behandelten Wunden heilten mit praktisch gleicher Geschwindigkeit, obgleich ein im Vergleich zur flüssigen Suspension kleineres Volumen der Gelzusammensetzung auf die Wunden aufgetragen wurde.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Wunde eines Patienten, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer Mikrosphäre besteht, die in der Lage ist, einen Mehrpunkt-Kontakt mit einer zellulären Membran zu bilden, wobei die Mikrosphäre während des Behandlungszeitraumes im Wesentlichen nicht biodegradierbar ist, und wobei die Mikrosphäre aus einem Material hergestellt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polystyrol, welches mit einer Gruppierung derivatisiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amino und Carboxyl, Polylysin, Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid, Polymethylacrylat und Silicon, und wobei das Material der Mikrosphäre eine geladene Oberflächengruppe aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat, Protamin, Protaminsulfat, Protaminsalzen und Carboxyl.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die Oberflächengruppe Carboxyl ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrosphäre einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,01 μm (Mikron) bis etwa 200 μm (Mikron) aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Mikrosphäre einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 μm (Mikron) bis etwa 100 μm (Mikron) aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für die Mikrosphäre enthält und wobei die Mikrosphäre in dem Träger im Wesentlichen unlöslich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Wunde aufgrund einer Verbrennung, eines Traumas, nach chirurgischem Eingriff, nach Geburt oder chronisch sein kann.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Wunde einen Haut- oder Muskelteil am Körper des Patienten betrifft.