DE3240909A1 - Zubereitung zur wundheilung und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Zubereitung zur wundheilung und verfahren zu ihrer herstellung

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DE3240909A1 DE19823240909 DE3240909A DE3240909A1 DE 3240909 A1 DE3240909 A1 DE 3240909A1 DE 19823240909 DE19823240909 DE 19823240909 DE 3240909 A DE3240909 A DE 3240909A DE 3240909 A1 DE3240909 A1 DE 3240909A1
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Description

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Gegenstand der Erfindung sind Zubereitungen, die sich zur Beschleunigung der Wundheilung eignen, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Zubereitungen aus Ämnion, beispielsweise menschlichem Amnion.
Die Wundheilung wird durch einen schlechten Allgemeinzustand sowie durch verschiedene lokale Faktoren, wie ungenügende Blutzufuhr und chronische Infektionen, ungünstig beeinflußt. Wenn ein direktes Verschließen der Wunde nicht durchführbar ist, ist ein gesundes granulierendes Wundbett wünschenswert, das sich entweder durch Randepithelialisierung oder durch Transplantation körpereigenen Gewebes schließt. Die Überfülle an Salben, Pulvern, Lösungen und Verbänden, die zur Beschleunigung der Wundheilung verwendet werden, weist auf den ungenügenden Wissensstand auf diesem Fachgebiet hin.
Menschliches Amnion wird mindestens seit dem Jahr I9I0 hin und wieder zur Förderung der Entstehung von Granulationsgewebe und in jüngerer Zeit auch als biologischer Verband für offene Wunden, einschließlich Verbrennungen und chronischen Geschwüren an den Beinen verwendet. Beispielsweise ist in einem Aufsatz von R.N. Matthews u.Mitarb, in British Journal of Plastic Surgery, Bd. 34- (1981), S. 76-78 die Verwendung von menschlichem Amnion bei der Behandlung von ernsten Verbrennungen am Kopf beschrieben.
Eine Schwierigkeit bei der Verwendung von Amnion zur Förderung der Wundheilung besteht darin, daß die Menge an verfügbarem sterilem Amnion notwendigerweise begrenzt ist, da es gewöhnlich nur bei Kaiserschnitten anfällt. Gelagerte und getrocknete Membranen haben sich nicht als nennenswerte
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Verbesserung im Vergleich, zu herkömmlichen keimfreien Verbänden erwiesen. Dagegen scheint die Anwendung von frischem Amnion oder nach einer Konservierung in normaler Kochsalzlösung Vorteile im Vergleich..zu anderen Verbandarten zu bieten.
In einem Aufsatz von H. Burgos und W„ Page Faulk in British Journal of Obstetrics and Gynaecology Bd. 88 (1981), S. 294-300 ist ein Verfahren zum Halten von menschlichem Amnion in Kultur beschrieben mit dem Zweck der Einrichtung einer Amnion-Bank für anschließende therapeutische Verwendung.
Es wurden auch Versuche unternommen, zellfreie Extrakte zu erhalten, die die Fähigkeit der Stimulierung des Blutgefäß-Wachstums (Angiogenese) in Modellsystemen be sitzen«, Beispielsweise wird von Iblbert und. Mitarb, in der ÜS-PS 4 273 871 die Untersuchung zahlreicher normaler itenschlicher Zellinien-auf die Produktion von Ängiogenesefaktoren- beschrieben. Die meisten dieser Zellinien besitzen jedoch nur geringe angeiogenetische Aktivität, was beispielsweise durch den Essay an der chorioallantοimembran gemäß Auerback u. Mitarb., Devel. Biol. Bd. 41 (1974), S. 391-394 sowie Folkman, Cancer Res. Bd. 34, S. 2109-13 und Bd. 36 (1976), S. 110-114 bestimmt wurde. Außerdem wurde festgestellt, daß solche Zellinien kaum in Kultur zu halten sind.
Es wurde aber festgestellt, daß Zellinien von menschlichen Vorhautfibroblasten in der Lage sind, die gewünschten Angio--gene se faktor en in geeigneten Mengen zu synthetisieren. Tolbert u. Mitarb, beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von zellfreien Extrakten, die solche Faktoren enthalten. Bei diesem Verfahren werden die kultivierten Zellen geerntet und danach mechanisch aufgebrochen.
Nun wurde gefunden, daß die Kultur von Amnion in einem Kulturmedium zur Freisetzung von das Wachstum fördernden Faktoren
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in das Kulturmedium fuhrt und daß diese Faktoren ein wertvolles Hilfsmittel für die Wundheilung darstellen. In dem vorstehend erwähnten Aufsatz von Burgos und Faulk wird an keiner Stelle der Vorschlag gemacht, daß das gebrauchte Wachstumsmedium für Amnion, das in ihrem Verfahren als Abfallprodukt erhalten wird, bei der Behandlung von Wunden verwendet werden kann. In gleicher Weise wird in keinem der Beispiele der US-PS 4 273 871 vorgeschlagen, daß das für die Kultur von Vorhautfibroblasten verwendete Medium eine wertvolle Quelle von extracellulären Angiogenesefaktoren sein könnte. Vielmehr wird ausdrücklich festgestellt, daß das Kulturmedium verworfen wurde.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Stoff bereitzustellen, der sich für die Verwendung bei der Behandlung von Wunden eignet. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß die im wesentlichen amnionfreie StoffZusammensetzung, welche ein Kulturmedium umfaßt oder sich davon ableitet, in dem Amnion, vorzugsweise menschliches Amnion,kultiviert wurde, wertvolle Eigenschaften für die Behandlung von Wunden aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine im wesentlichen amnionfreie Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden, welche ein Kulturmedium darstellt oder von einem Kulturmedium stammt, in dem Amnion kultiviert worden ist.
Es wurde festgestellt, daß die amnionfreien Zubereitungen der Erfindung eine überraschende Stabilität bei der Lyophilisierung und bei langer Lagerung in lyophilisiertem Zustand aufweisen. Diese Stabilität macht solche Zubereitungen besonders wertvoll im Vergleich mit intaktem Amnion, da sie in günstiger Weise für sehr lange Zeit gelagert werden können, bis sie benötigt werden. Außerdem sind Verfahren zur Herstellung solcher Zubereitungen viel einfacher als Verfahren, bei denen die Zellen aufgebrochen werden müssen, bei-
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spielsweise die in der US-PS 4- 27$ 871 beschriebenen.
Das verwendete Amnion ist vorzugsweise die keimfreie Amnion-Membran, die beispielsweise bei Geburten durch Kaiserschnitt erhalten wird.
Das Amnion kann in jedem geeigneten Gewebekulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7»2 bis 7»^ gepuffert ist. Beispiele für geeignete Gewebekulturmedien sind die von H.J. Morton, In Vitro Bd. 6 (1970), S. 89-ΊΟ8 beschriebenen Medien» Diese Medien enthalten in verschiedenen Kombinationen bekannte essentielle Aminosäuren, Mineralsalze, Kohlenstoffquellen, wie Kohlehydrate, beispielsweise Glucose, und Vitamine»
Das Amnion wird in einer Sauerstoff enthaltenen Atmosphäre inkubiert, die vorzugsweise auch eine verhältnismäßig kleine Kohlendioxidkonzentration aufweist, welche vorzugsweise geringer als 5%» beispielsweise 2,5% ist.
Die Membran kann in einem oder mehreren Kulturmedien kultiviert werden. Beispielsweise kann sie anfänglich 4 bis 6 Tage in einem ersten Medium, wie Medium A gemäß nachstehender Beschreibung kultiviert werden und daran anschließend in einem zweiten Medium, wie Medium B, ebenfalls gemäß nachstehender Beschreibung. Da Verunreinigungen während der ersten paar Tage der Kultur durch das Kulturmedium aus dem Amnion ausgewaschen werden können, sind für die Wundbehandlung anschließende Wechsel des Kulturmediums bevorzugt. In ähnlicher Weise wird bei der Verwendung von zwei Medien vorzugsweise das zweite Medium für die Verwendung gemäß vorliegender Erfindung benutzt.
iiaeh der Abtrennung von dem intakten Amnion wird das Kulturmedium vorzugsweise zentrifugiert, um freie Zellen zu entfernen. Danach wird es vorzugsweise lyophilisiert, um in
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günstiger Weise gelagert zu werden. Das erhaltene Lyophilisat kann keimfrei gemacht werden, beispielsweise durch Bestrahlung mit Gamma-Strahlen, die z.B. von einer Cäsium-90-Quelle stammen können. Für den Gebrauch kann das Lyophilisat in Form eines trockenen oder im wesentlichen trockenen Pulvers durch Zugabe von keimfreiem destilliertem Wasser rekonstituiert werden.
Eine Zubereitung, die in dem vorstehend erwähnten Chorioallantoismembran-Essay besonders aktiv ist, kann durch Gelfiltrationschromatographie des rekonstituierten Lyophilisats an einem Molekularsieb mit verhältnismäßig großer Porengröße, wie Sephacryl 300, hergestellt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein chirurgisches Ver- . bandsmaterial, das die im wesentlichen amnionf re ien,das Wachstum fördernden Faktoren umfaßt, die aus der Amnion-Kultur stammen, beispielsweise ein chirurgischer Verband, der mit der vorstehend erläuterten, im wesentlichen amnionfreien Zubereitung behandelt wurde. Ein derartiges Verbandsmaterial kann rait der Zubemtung in einem flüssigen Medium imprägniert und danach getrocknet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Zubereitung beispielsweise auch an der an der Wunde anliegenden Schicht eines chirurgischen Verbandes adsorbiert werden. Das. Verbandsmaterial kann ferner ein antiseptisches Mittel enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Salbe, beispielsweise eine Creme auf Wasserbasis, welche die amnionfreien,das Wachstum fördernden Faktoren enthält, die aus der Amnion-Kultur stammen. Die Salbe kann auf bekannten Rezepturen beruhen, wie sie in British Pharmacopoeia 1980, S. 696-702 beschrieben sind, beispielsweise Emulgiersalben, Makrogo1salbeη oder Paraffinsalben. Sie kann auch als wäßrige Lösung in ein hydrophiles Gel adsorbiert sein, das beispielsweise Poly-2-hydroxyäthylacrylat, Gelatine oder die in der
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GB-PS 1 524 899 beschriebenen Polymerisate zur Grundlage hat.
Die Salbe kann auch andere Wirkstoffe, wie Antiseptika, enthalten. Der Einschluß von Antiseptika in der Salbe kann die Dosis der Gamma-Bestrahlung vermindern, die erforderlich ist, um die Keimfreiheit der formulierten Salbe aufrecht zu erhalten.
to Die Salbe kann direkt auf das Wundbett aufgebracht werden und wird dann vorzugsweise durch einen nichthaftenden Wundverband, wie Tüll, abgedeckt. Wenn der gewählte nichthaftende Verband keine Adsorptionswirkung hat, kann er günstigerweise mit einem üblichen adsorbierenden Stoff, wie Zellulosepulpe, abgedeckt werden. Dieser kann seinerseits mit einer üblichen Verschlußfolie bedeckt werden. Die Folie kann dann durch ein Klebeband gesichert werden.
■Ein Verbandsmaterial, das eine nichthaftende Schicht umfaßt, auf der sich die Salbe, eine adsorbierende Schicht und eine abschließende Folie befinden, kann in einem keimfreien Umschlag verpackt werden.
Die im wesentlichen amnionfreie Zubereitung der Erfindung wird zur Behandlung einer Wunde als Hilfsmittel für die Heilung der Wunde auf diese aufgebracht. Die Zubereitung kann beispielsweise allein verwendet werden oder in oder auf einem geeigneten Träger. Beispiele für geeignete Träger sind die vorstehend beschriebenen Verbände und Salben. In einer anderen Ausführungsform kann die Wunde auch kontinuierlich oder absatzweise mit der Zubereitung in Form einer wäßrigen Lösung besprüht werden, wie das beispielsweise von Westabj u. Mitarb, in Annals R.C.S. Eng., Bd. 63 (1981), S. 353-356 beschrieben ist.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch ein Verfahren
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zur Herstellung einer Zubereitung zur Wundheilung, bei dem Amnion in einem Kulturmedium kultiviert, das Medium vom Amnion abgetrennt, anschließend das Medium von allen freien Anriionzellen getrennt und/ode.r lyophilisiert wird.
Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel Menschliche Amnions werden in keimfreier Weise von ausgewählten gesunden Kaiserschnitt-Patientinnen gesammelt. Die Membranen werden in " eisgekühltem Minimalmedium mit Hank's Salzlösung, das mit 5prozentigem fötalem Kälberserum (FCS) oder Serum von neugeborenen Kälbern (NBCS) ergänzt und mit HEPES auf den pH-Wert 7,4 gepuffert ist, transportiert und gelangen 1 bis 2 Stunden nach der Entnahme in das Labor. Sie werden sofort mit viermal gewechselter Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7»35 gewaschen und mit Gazetüchern und Pinzetten, wie sie zur Entfernung von Teilchen aus der Lunge verwendet werden, von Blutgerinseln und Dezidua gereinigt, die an der chorialen Oberfläche verblieben sind. Durch vorsichtige Handhabung wird dabei die Ablösung des Amnions vom anhaftenden Chorion verhindert. Dann werden große Stücke des Aranions (zwischen 120 χ 120 und 240 χ 240 mm) mit einer Schere ausgeschnitten und mit der Chorionseite nach unten in Schalen aus Polystyrol mit den Abmessungen 243 x 243 x 18 mm ausgebreitet, wobei das vom Chorion getragene Amnion in 150 bis 200 ml Kulturmedium belassen wird. Gewebekulturmedium 199 mit Hank1S-SaIz, ergänzt mit 10% FCS oder KBCS, gepuffert mit 4 mM Natriumbicarbonatlösung auf den pH-Wert 7»2 bis 7»^» und 20 mM HEPES (Medium A) wird für die ersten 4 bis 6 lage verwendet. Dieses wird anschließend gegen Earle's-Salzlösung mit 10 mM Natriumbicarbonatlösung und 20 mM HEPES (Medium B) ausgetauscht. Antibiotika werden zugesetzt (Penicillin G 100 Einheiten/ml und Streptomycin 100 Die Kulturen werden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre (98% Feuchtigkeit) mit 0,5% und 2,5% CO2 in Luft bei dem
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Medium,das Hank's bzw. Earle"s-Salzlösung enthält, inkubiert. Diese C02-Konzentrationen reichen aus, um das Medium auf einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4..zu halten. Nach 24 Stunden und dann zwei- oder dreimal pro Woche wird das Medium gewechselt.
Das abgetrennte Medium B wird gesammelt und dann bei 30.000 g und 40C zur Entfernung aller freien Amnionzellen zentrifugiert. Der klare Überstand wird hierauf lyophilisiert und durch Bestrahlung mit Gamma-Strahlen aus einer Cäsium-90-Quelle keimfrei gemacht.
Das Lyophilisat wird bei -20°0 gelagert, bis es zur Verwendung benötigt wird. Dazu wird es durch Zusatz von keimfreiem destilliertem Wasser rekonstituiert.
Die Wundbehandlung mit der Zubereitung der Erfindung sowie chirurgische Verbände, die sich zur Verwendung bei der Wundbehandlung eignen, werden nachstehend beispielhaft anhand der Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Aufsicht auf ein?Verbandsna.terial
Fig., 2 einen Schnitt längs der Linie A-A von Fig. 1; und
Fig. 3 einen Querschnitt durch eine andere Ausführungsform
des Verbandes.
In der Darstellung gemäß Fig. 1 befindet sich eine Schicht aus Tüll 1 über dem Geschwürbett eines jeden von einer Anzahl von Patienten, die an chronischen Geschwüren leiden.
Eine Schicht aus chirurgischer Gaze 3, die mit dem rekonstituierten Lyophilisat gesättigt ist, befindet sich über der Tüllschicht 1. Die Gaze 3 ist zusammen mit einer kleinen Fläche umgebenden Gewebes mit einer Plastikschicht 5 abgedeckt. Ein Rohr 7 mit einem Endbereich 9, der eine Anzahl von Perforationen 11 aufweist, ist zwischen der Tüllschicht 1 und der Gazeschicht 3 eingeführt. Das freie Ende 13 des
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Rohres 7 ragt aus der Kante der Kunststoffschicht heraus. Die Kanten der Kunststoffschicht sind mit dem Klebeband 15 an der Haut des Patienten befestigt, um eine .flüssigkeitsdichte Versiegelung zwischen-dem Kunststoff und der Haut zu bewirken. Auf diese Weise wird das Geschwür von einem Verband umschlossen, in den Flüssigkeit nur über das Röhrchen 7 Zugang hat. Zu Beginn der Behandlung werden mit einer Spritze 17, die mit dem Rohr 7 verbunden ist, 50 ml rekonstituiertes Lyophilisat in das Innere des Verbandes gebracht. Danach wird das Rohr verschlossen. Alle 6 Stunden während der ersten 48 Stunden und alle 12 Stunden während 3 Tagen danach wird der Inhalt des Verbandes mit Hilfe der Spritze entfernt und durch 50 ml frisches rekonstituiertes Lyophilisat ersetzt.
Eine Vergleichsgruppe von Patienten wird in gleicher Weise behandelt, wobei jedoch das rekonstituierte Lyophilisat aus Medium B hergestellt wurde, das ohne Amnion inkubiert wurde.
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Bei der Abnahme der Verbände wird bei den mit dem-mit Amnion konditionierten Medium behandelten Patienten eine Gefäßneu-* bildung (oder Granulierung) beobachtet. Danach wird eine erfolgreiche Gewebetransplantation an all diesen Patienten durchge führt.
Im Gegensatz dazu zeigen die Geschwüre der Kontrollpatienten eine für eine erfolgreiche Gewebetransplantation nicht ausreichende Granulierung.
Ein Verband, der sich zur Verwendung bei der Verabreichung der Zubereitung zur Wundheilung in Form einer Salbe eignet, ist in Fig. 3 dargestellt. Ein Wundbett 21 ist mit einer Salbe 23 bedeckt, die das vorstehend beschriebene rekonstituierte Lyophilisat in einer Matrix zur verzögerten Freisetzung enthält. Ein nichthaftender Verband 25 liegt über
der Salbe 23. Der nichthaftende Verband ist seinerseits mit einer Schicht aus adsorbierender Gellulosepulpe 27 bedeckt. Der gesamte Verbandaufbau ist mit Hilfe eines verschließenden Kunststoffilms 29, der durch ein Klebeband 31 an der Haut des Patienten befestigt ist, gegen das Eindringen von Entzündungsstoffen geschützt.
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Claims (20)

VOSSIUS · VOSSIUS -TAUCH NER- H E U N E M A N>N ? R§VtrH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O 75 CABLE! BENZOLPATENT MDNCHEN -TELEX 5-29 453 VOPAT D u.Z.: S 141 Case: SiEG 195 JOHNSON & JOHNSON PHODUCTS9 INC« New Brunswick, N.J., 7.St.A. "Zubereitung zur Wundheilung und Verfahren zu ihrer Herstellung" Patentansprüche
1. Eine im wesentlichen amnionfreie Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Kulturmedium darstellt oder von einem Kulturmedium stammt, in dem Amnion kultiviert wurde.
2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Amnion menschliches Amnion ist.
3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zur Entfernung freier Zellen zentrifugiert wurde.
4. Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium in lyophilisiertem Zustand vorliegt.
5· Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch y-Bestrahlung keimfrei gemacht wurde.
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6. Zubereitung nach den vorangehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß ihre aktive Fraktion einer Reinigung durch Gelfiltrationschronatographie unterzogen wurde.
7. Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium während der Kultur, des Amnions auf den pH-Wert 7j2 bis 7»4 gepuffert wurde.
8. Zubereitung nach den vorangehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium während der Kultur des Amnions Kohlendioxid in einer Konzentration unter 5 Gewichtsprozent enthalten hat.
9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium das Kohlendioxid in einer Konzentration von etwa 2,5 Gewichtsprozent enthalten hat.
10. Zubereitung nach den vorangehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß das Amnion zunächst 4 bis 6 Tage in einem vorangehenden Kulturmedium kultiviert wurde und daß die Zubereitung aus einem anschließend verwendeten Kulturmedium besteht oder von diesem stammt.
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11. Zubereitung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das vorangehende Kulturmedium Medium A und das anschließend verwendete Kulturmedium Medium B ist.
12. Chirurgisches Verbandsmaterial, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Zubereitung gemäß Anspruch 1 bis 11,
13- Verbandsmaterial nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Zubereitung in flüssiger Form imprägniert und danach getrocknet wurde.
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14. Verbandsmaterial nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung in der der Wunde gegenüberliegenden Schicht des Materials adsorbiert ist.
15· Verbandsmaterial nach Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen antimikrobiell wirkenden Stoff enthält.
16. Salbe, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
17· Salbe* nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Emulgiersalbe, eine Makrogolsalbe oder eine Paraffinsalbe ist, oder daß sie als wäßrige Lösung in ein hydrophiles Gel adsorbiert ist«,
18. Salbe nach Anspruch 16 oder I7, dadurch gekennzeichnet, daß sie noch mindestens einen weiteren Wirkstoff enthält.
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19· Salbe nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß einer der weiteren Wirkstoffe ein antimikrobielles Mittel darstellt oder einschließt,,
20. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung zur Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß man Amnion in einem Kulturmedium kultiviert, das Medium vom Amnion abtrennt, danach alle freien Amnionzellen vom Medium trennt und/oder das Medium lyophilisiert.
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