DE60203264T2

DE60203264T2 - Mikrobieller Cellulose-Wundverband zur Behandlung chronischer Wunden

Info

Publication number: DE60203264T2
Application number: DE60203264T
Authority: DE
Inventors: C. Gonzalo SERAFICA; Richard Mormino; Gerry Ann Oster; E. Kevin Lentz; P. Kevin Koehler
Original assignee: Xylos Corp
Current assignee: Lohmann and Rauscher GmbH
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2002-06-24
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2022-06-25
Also published as: US20040161453A1; US7709021B2; US7390499B2; DE60203264D1; ATE290887T1; EP1356831B1; EP1356831A1; US20030203012A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Wundverband, der eine Cellulose mikrobiellen Ursprungs umfasst, für die Behandlung spezifischer Arten von chronischen Wunden, einschließlich Druckwunden, venöser und diabetischer Geschwüre.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt eine große Vielfalt von Materialien, die verwendet werden, um Wundverbände herzustellen, die verwendet werden, um eine Menge chirurgischer und nicht-chirurgischer Läsionen zu behandeln, wie z.B. Verbrennungen und Hautabschürfungen. Die Verbände reichen von einfachen Verbänden vom Gaze-Typ bis hin zu Verbänden vom Proteintyp tierischen Ursprungs, wie z.B. Collagenverbänden, die Zusammensetzung des jeweiligen Verbands hängt vom Typ der zu behandelnden Wunde ab. Jeder dieser Verbände besitzt Vorteile abhängig von der Art der Anwendung. Zum Beispiel sind Verbände vom Gaze-Typ ausreichend und hoch ökonomisch für einfache Schürfwunden und chirurgische Schnitte.
Auf der anderen Seite wurde festgestellt, dass im Fall chronischer Wunden Verbände auf Polymerbasis wirksamer sind. Der Definition nach sind chronische Wunden Wunden, die nicht durch den normalen Reparaturprozeß ablaufen, und typischerweise Manifestationen eines zugrundeliegenden Problems, wie z.B. Diabetes, Venenerkrankung oder beeinträchtigter Zirkulation, sind (Lazarus, G. S. et al., Definitions and Guidelines for Assessment of Wounds and Evaluation of Healing, Arch. Dermatology, Band 130, Seiten 489–493, 1994). Deshalb können chronische Wunden allgemein als Druckwunden (Decubitus), Venen- und Diabetesgeschwüre, je nach dem zugrundeliegenden Problem, klassifiziert werden. Abhängig von der Ursache werden verschiedene Arten von Wundenbehandlungsverfahren und Materialien verwendet, um das zugrundeliegende Problem zu adressieren und die Wundheilung zu fördern. Fortschrittliche polymere Materialien mit der Fähigkeit, die Wundenumgebung feucht zu halten, haben sich bei der Behandlung dieser schwer zu heilenden chronischen Wunden als wirksamer gezeigt im Vergleich zu Gaze.
Im Kontext der Verbände auf Polymerbasis sind verschiedene Arten polymerer Materialien bei der Behandlung von Hauterkrankungen verwendet worden. Im allgemeinen können sie in zwei Hauptklassen aufgeteilt werden, nämlich synthetische polymere Materialien und polymere Materialien natürlichen Ursprungs.
Synthetische Materialien schließen Polyurethane, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid (PEO), polyvinylalkohole (PVA) und Polyacrylnitrile (PAN) ein. Diese Materialien können in Verbindung mit anderen synthetischen oder natürlichen Polymeren verwendet werden, um Wundverbände mit speziellen Eigenschaften, wie z.B. Retention von Feuchtigkeit und hohe Flüssigkeitsabsorption, herzustellen. Diese beiden Eigenschaften, die im allgemeinen bei Verbunden vom Gaze-Typ nicht gefunden werden, fördern die Heilung durch den Schutz chronischer Wunden vor Infektion und durch das Aufrechterhalten des Feuchtigkeitslevels in der Wunde. Huang offenbart in US-Patent 6,238,691 einen dreidimensional vernetzten Polyurethanhydrogel-Wundverband, der absorptionsfähig ist, eine Wundstelle nachformt und die Wunde in einem feuchten Zustand hält, um die Heilung zu fördern.
Meyer-Ingold et. al. offenbart in US-Patent 6,156,334 Wundabdeckungen für die Entfernung von störenden Faktoren, wie z.B. von Antigenen, freien Radikalen, Ionen, Proteinen, Peptiden, Lipiden und freien Fettsäuren aus der Wundflüssigkeit chronischer Wunden. Diese Wundabdeckungen sind chemisch modifiziert mit "Fänger-Molekülen"("trapper molecules"), wie z.B. Antikörpern, Chelatoren, Enzyminhibitoren, Enzymen, Enzymmimitica, Peptiden und anderen Proteinen, sind Polyurethane oder Cellulose pflanzlichen Ursprungs.
Ähnlich wurden Polymere natürlichen Ursprungs oder Biopolymere, wie z.B. Collagen und Alginate, als Wundverbände verwendet, welche die gewünschten Eigenschaften der Polymere ausnutzen, wie z.B. hohe Absorptionskapazität von Alginat oder die biokompatible Natur von Collagen. Jeder dieser Verbände besitzt bestimmte Vorteile, abhängig von der Art der Wunde und der Menge des von ihr generierten Exsudats. Allerdings besitzen diese Verbände ebenfalls Nachteile, die höhere Kosten, Wundanhaftung, beschränkte Exsudatabsorption und Ablagerung von Rückstand an einer Wundstelle einschließen.
Hydrokolloidale Verbände absorbieren Wundexsudat und stellen eine feuchte Wundheilungsumgebung bereit, aber besitzen ebenfalls die erwünschte Eigenschaft der Rückstandsablagerung an einer Wundstelle. Zusätzlich fehlt hydrokolloidalen Verbänden im Gegensatz zu dem hierin beschriebenen Celluloseverband mikrobiellen Ursprungs eine für trockene chronische Wunden mit beschränktem Exsudat notwendige feuchtigkeitsspendende Eigenschaft. Ebenso sind Hydrokolloide dafür bekannt, am Wundbett anzuhaften, und können Wiederverletzung bei Entfernung verursachen. Hydrokolloide haben die Neigung, in das Wundbett einzubrechen, was möglicherweise den Wundheilungsprozess stört.
Als ein anderes Material besitzt Cellulose mikrobiellen Ursprungs inhärente Eigenschaften, die eine wirksame Förderung der Wundheilung ohne einige der inhärenten Nachteile erlaubt, die mit aktuellen Wundverbänden assoziiert sind. Diesbezüglich besitzt Cellulose mikrobiellen Ursprungs die folgenden physikalischen Eigenschaften, die sie von Cellulose pflanzlichen Ursprungs unterscheidet, wie z.B. extreme Hydrophilie und einzigartige vielschichtige dreidimensionale laminare Strukturen, die für ihre Feuchtigkeitshandhabungsfähigkeit sorgen. Mikrobielle Cellulose ist stark hydrophil mit einer Wasseraufnahmekapazität im Bereich von 60 bis 700mal ihr Eigengewicht, wie in US-Patent 4,942,128 beschrieben ist. Mikrobielle Cellulose zeigt ebenso ausgezeichnete Nassfestigkeit und bricht nicht unter Druck zusammen. Letztlich kann mikrobielle Cellulose aufgrund ihrer laminaren vielschichtigen Struktur verarbeitet werden, um eine Folie mit neuer Flüssigkeitshandhabungsfähigkeit herzustellen. Durch Einstellen des Cellulose-zu-Flüssigkeit-Verhältnisses ist verarbeitete mikrobielle Cellulose in der Lage, sowohl Flüssigkeit abzugeben oder Flüssigkeit zu absorbieren, abhängig von der Oberfläche, mit der die Folie in Kontakt gebracht wird.
Wegen ihrer herausragenden Eigenschaften wurde die Verwendung von mikrobieller Cellulose in der medizinischen Industrie zuvor untersucht. Zum Beispiel offenbaren US-Patente 4,588,400, 4,655,758 und 4,788,146 von Ring et al. die mögliche Verwendung von Cellulose mikrobiellen Ursprungs in flüssigkeitsbeladenen medizinischen Pads (Kissen, Kompressen). Die Patente von Ring et al. konzentrieren sich auf die Verwendung statisch hergestellter mikrobieller Cellulosepads, die mit verschiedenen Flüssigkeiten und Medikamenten beladen sind. Verschiedene Arten von Flüssigkeiten, die in den mikrobiellen Cellulosepads enthalten sein können, sind beschrieben, sowie die Herstellung und Reinigungsverfahren, um das Ausgangs-Cellulosematerial herzustellen. Außerdem sind in diesen Patenten Beispiele beschrieben, die Verfahren zur Herstellung verschiedener Pads beschreiben, wobei das Verfahren eine Reihe von Druck- und Imprägnierschritten beinhaltet, um die physikalischen Eigenschaften einzustellen, hauptsächlich im Hinblick auf das Flüssigkeit-zu-Cellulose-Verhältnis, um ein gewünschtes Produkt zu ergeben. Als Beispiel beschreiben diese Patente ein stark hydratisiertes Pad (80:1 Flüssigkeit-zu-Cellulose-Verhältnis), welches in der Lage ist, eine Kühlleistung bereitzustellen, die ideal für Verbrennungsanwendungen ist. Im besonderen beschreibt das '146-Patent die Verwendung solcher flüssigkeitsbeladener Pads als nasse Verbände für die Verwendung als Geschwürverband, der in der Lage ist, eine Wunde über eine ausgedehnte Zeitdauer mit Flüssigkeit zu versorgen. Dasselbe '146-Patent erwähnt ebenfalls, dass die in den Beispielen beschriebenen Nassverbände außerdem die zusätzliche Fähigkeit haben, große Mengen an Flüssigkeit aus der Wundstelle zu absorbieren, wenn der Verband in einem weniger als gesättigten Zustand angewendet wird. Allerdings wird bei den Wundverbänden von Ring et al. kein einziger Verband erwähnt, der sowohl die Fähigkeit einer Feuchtigkeitsquelle für chronische Wunden aufweist, als auch die Fähigkeit, Flüssigkeit zu absorbieren. Die Patente von Ring et al. beschrieben ebenfalls nicht das wirksame Flüssigkeit-zu-Cellulose-Verhältnis, um einen Verband mit der zweifachen Flüssigkeitshandhabungsfähigkeit herzustellen.
US-Patent 4,912,049 von Farah et al. offenbart die Verwendung einer statisch hergestellten dehydratisierten mikrobiellen Cellulose als künstliches Hauttransplantat, Trennmembran oder künstliches Leder. Das '049-Patent trägt die Verwendung einer von Acebacter xylinum gebildeten Cellulosefolie vor, die dehydratisiert wird, während sie gestreckt wird. Obwohl das '049-Patent die potenzielle Verwendung ihrer Erfindung als künstliche Haut für die Behandlung von Wunden oder Verletzungen beschreibt, gibt es keine Andeutung, dass das Material für chronische Wunden verwendet werden könnte. Darüber hinaus hat die getrocknete Folie von Farah keine feuchtigkeitsspendende Fähigkeit und minimale Absorptionsfähigkeit.
Schließlich offenbart US-Patent 5,846,213 von Wan et al. Verfahren für die Herstellung mikrobieller Cellulosefolien unter Verwendung von Rohmaterial, das in einem Biorührfermenter hergestellt wird, statt durch ein statisches Verfahren. Das '213-Patent beschreibt weiterhin die Verwendung eines solchen Cellulosematerials, das in Lösungsmitteln gelöst ist, um Membranen herzustellen, die als Wundverbände verwendet werden können. Wegen der trockenen Beschaffenheit der resultierenden Folie fehlt dem Gussmaterial jede feuchtigkeitsspendende Eigenschaft und begrenzte Flüssigkeitsabsorptionsfähigkeit. Ebenso besitzt die resultierende Cellulosemembran nicht die dreidimensionale vielschichtige Struktur, die nur in wie zuvor beschriebener statisch gewachsener mikrobieller Cellulose gefunden wird.
Obwohl die obigen Patente die potenzielle Verwendung von mikrobieller Cellulose in medizinischen Anwendungen erkennen, hat der Stand der Technik kein Verfahren zur Entwicklung eines Wundverbandes bereitgestellt, der wirksame Wundheilung, Feuchtigkeitshandhabungsfähigkeit und adäquate Biokompatibilität aufweist. Entsprechend ist ein wirksamer Wundverband, der mikrobielle Cellulose für die Behandlung chronischer Wunden umfasst, der hoch biokompatibel ist, wünschenswert. Darüber hinaus ist ebenfalls ein Wundverband mit hohen Feuchtigkeitsabgabe- und Absorptionsfähigkeiten für optimale Wundheilung besonders gewünscht. Diese zweifache Feuchtigkeitshandhabungsfähigkeit des Verbandes der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine feuchte Wundumgebung aufrechtzuerhalten, die für die Heilung chronischer Wunden notwendig ist. Ebenso ist die hohe feuchtigkeitsspendende Eigenschaft besonders nützlich für die Behandlung von trockenem nekrotischem Gewebe und für die Förderung autolytischen Debridements, das wünschenswert ist, um jegliche Wundschließung möglich zu machen. Schließlich zeigt die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Wundverbands in der Unterstützung autologer Heilung durch die Förderung von Granulation und dadurch, dass Epithelialzellen erlaubt wird, zu migrieren, die ausgeprägte Fähigkeit des Wundverbands, Wundschließung zu bewirken.
Deshalb haben die vorliegenden Erfinder einen Wundverband entwickelt, der diese neue Flüssigkeitshandhabungsfähigkeit von Absorption und Abgabe besitzt. Diese Flüssigkeitshandhabungsfähigkeit ist ein Endresultat der Verarbeitung mikrobieller Cellulose, um den geeigneten Cellulosegehalt für den gewünschten Zweck zu enthalten. Der resultierende Wundverband kann Flüssigkeit abgeben, wenn die Wundenoberfläche trocken ist, und es wurde festgestellt, dass er besonders geeignet ist für trockene chronische Wunden, die mit trockenem nekrotischem Gewebe oder Schorf bedeckt sind. Derselbe Verband ist ebenso in der Lage, Flüssigkeit aus dem exsudierenden Wundbett zu absorbieren. Zusätzlich wird der in dieser Erfindung beschriebene mikrobielle Cellulose-Wundverband sich nicht abbauen und Rückstände in der Wundstelle hinterlassen, im Gegensatz zu hydrokolloidalen Verbänden. Entfernung des mikrobiellen Celluloseverbands von der Wunde beschädigt nicht das Gewebe, da es nicht an der Wundenoberfläche anhaftet.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls mikrobielle Cellulosefolien vor, die direkt in fast jeder Gestalt oder Größe hergestellt werden können. Fermentationsverfahren ergeben eine extrem dünne und faltbare Form, die bemerkenswert fest, jedoch gas- und flüssigkeitsdurchlässig ist. Die Form wird intakt bleiben, selbst wenn sie extremen äußeren Bedingungen, wie z.B. Autoklavieren oder γ-Sterilisation, unterworfen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Celluloseverbände mikrobiellen Ursprungs bereitzustellen mit 1,5 bis 9 % Cellulose pro Gewicht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Cellulose mikrobiellen Ursprungs biokompatibel und nicht-pyrogen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen wirksamen Wundverband bereitzustellen, der mikrobielle Cellulose umfasst, für die Verwendung in der Behandlung chronischer Wunden, der in der Lage ist, für optimale Wundheilung Feuchtigkeit abzugeben und aufzunehmen.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich. Allerdings ist zu verstehen, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, welche bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zur Illustration gegeben werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung für den Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung offensichtlich sein werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Die Absorptions- und Abgabefähigkeiten mikrobieller Cellulose-Wundverbände sind gegen den prozentualen Celluloseanteil in diesen Materialien aufgetragen. Alle Materialien hatten eine identische Fläche und ähnliche Dicke. Der Bereich der Überschneidung der beiden Kurven zeigt den idealen Cellulosegehalt, um beide Eigenschaften zu maximieren.
2: Die Menge an Flüssigkeit, die an eine trockene Oberfläche aus mikrobiellem XCell-Cellulose-Wundverband und aus Hydrogel-Wundverbänden abgegeben wird, ist gezeigt. Abgabemengen sind in Prozent des ursprünglichen Probengewichts ausgedrückt. Die Abgabe des XCell-Wundverbands ist der der Hydrogele deutlich überlegen.
3: Die Absorptions- und Abgabefähigkeiten von einem mikrobiellen XCell-Cellulose-Wundverband wird zu der von Clearsite (NDM) Hydrogel-Wundverband verglichen. Die Absorptionskapazität ist nahezu identisch für beide, aber der XCell-Wundverband kann 6mal mehr abgeben als das Hydrogel.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung macht Verfahren möglich, um perforierende oder oberflächliche chronische Wunden mit Cellulosefolie mikrobiellen Ursprungs zu behandeln. Die Erfindung stellt ebenfalls biokompatible, nicht-pyrogene Wundverbandfolien mit einem geeigneten Cellulose-zu-Flüssigkeits-Verhältnis sowie Flüssigkeitsabgabe und Absorptionsfähigkeit für optimale Wundheilung bereit. Im Gegensatz zu Hydrokolloiden, Hydrogel-, Alginat-, Collagen- oder Gazeverbänden kann die hierin beschriebene Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs eine optimale feuchte Heilungsumgebung durch Abgabe von Flüssigkeit an eine trockene Oberfläche oder Absorption überflüssiger Flüssigkeit aus exsudierenden Wunden bereitstellen.
Der Gehalt an Cellulose mikrobiellen Ursprungs in dem Verband kann abhängig von dem Herstellungsverfahren und der schließlichen Endverwendung des Wundverbands schwanken. In der vorliegenden Erfindung ist die Menge an Cellulose mikrobiellen Ursprungs in dem Wundverband 1,5 % bis 9 %, bevorzugt ungefähr 3 % bis ungefähr 7 %, besonders bevorzugt ungefähr 4 bis ungefähr 6 Gew.%.
Die Wundverbandfolie der vorliegenden Erfindung kann für Feuchtigkeitsabgabe verwendet werden. Typischerweise kann der Wundverband ungefähr 50 % bis ungefähr 90 % seines Flüssiggewichts an ein trockenes Substrat abgeben. Das bedeutet, dass eine Wunde, die trockenes nekrotisches Gewebe aufweist, wirksam durch Anwendung eines flüssigkeitshaltigen Wundverbands behandelt werden kann. Die meisten chronischen Wunden bilden, wenn sie anfangs auftauchen, eine trockene Oberfläche, die aus totem (nekrotischem) Gewebe besteht, aufgrund eines zugrundeliegenden Problems, wie z.B. venöser Insuffizienz. Der Mangel an frischem Blutfluss zu den speziellen Bereichen (gewöhnlich um die Knöchel) bewirkt ein Absterben der Dermis und Epidermis unterhalb der Haut und tritt möglicherweise als Geschwür zu Tage. Im Wundverbandpad enthaltene Flüssigkeit kann auf die trockene nekrotische Wunde aufgetragen werden, um autolytisches Debridement zu fördern, welches die erste Voraussetzung für die Heilung chronischer Wunden ist. Flüssigmaterialien, mit denen das Pad beladen werden kann, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Wasser, isotonische Saline (0,9 Gew.%), Glycerin, synthetische Polymere, wie z.B. Polyethylenoxid und wässrige Lösungen biologischer Moleküle, einschließlich Proteinen, Blutplättchenwachstumsfaktor (PDGF) und epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Enzymen, wie z.B. Kollagenase.
Der erfindungsgemäße Wundverband kann ebenfalls für Feuchtigkeitsabsorption verwendet werden. Typischerweise kann die Wundverbandfolie ungefähr 35 % bis ungefähr 140 % ihres Gewichts absorbieren. Das bedeutet, dass eine exsudierende Wunde wirksam durch Anwendung eines erfindungsgemäßen Wundverbandes, welcher überflüssige Flüssigkeit aus der Wunde absorbieren wird, behandelt werden kann. Typischerweise neigen chronische Wunden, wie z.B. venöse Geschwüre, dazu, große Flüssigkeitsmengen während des Heilungsprozesses zu exsudieren. Der Exsudationszustand tritt gewöhnlicherweise auf, wenn die Wunde anfängt, Granulationsgewebe zu bilden, um den Raum auszufüllen, den das tote Hautgewebe vorher in Anspruch nahm. In diesem Zustand ist der erfindungsgemäße Verband in der Lage, das Flüssigkeitsexsudat zu absorbieren, während eine feuchte Oberfläche für die Migration von Epithelialzellen aufrechterhalten wird. Die Epithelialmigration ist essenziell, um schließlich die Wunde zu schließen. Deshalb ist die erfindungsgemäße Wundverbandfolie aufgrund ihrer zweifachen Fähigkeit, Feuchtigkeit zu absorbieren und abzugeben, in der Lage, optimale Bedingungen für die Wundheilung bereitzustellen.
1. Herstellung mikrobieller Cellulose unter statischen
Bedingungen für die Erprobung von Verfahren
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen mikrobiellen Cellulose werden Mikroorganismen, wie z.B. Acetobacter xylinum, in einem Bioreaktor gezüchtet, der ein flüssiges Nährmedium bei 30°C bei einem Anfangs-pH von 3 bis 6 enthält.
Das Medium basiert auf Saccharose oder anderen Kohlenhydraten. Bevorzugt wird eine effiziente Folienherstellung durch Verwendung von Saccharose als Kohlenstoffquelle, Ammoniumsalzen als Stickstoffquelle und Maisquellwasser als Nährstoffquelle, gekoppelt mit einem eigenen Spurenelementzusatz, erreicht, der von dem ursprünglichen Schramm & Hestrin-Medium (1954) abweicht, das von Fachleuten verwendet wird. Der eigene Spurenelementzusatz ist in der folgenden Tabelle quantifiziert: Spurenelementlösung Zusammensetzung pro Liter

EDTA Tetranatriumsalz 570 mg

FeSO₄·7H₂O 200 mg

ZnSO₄·7H₂O 10 mg

MnSO₄·H₂O 26 mg

H₃BO₃ 30 mg

CoCl₃·6H₂O 20 mg

NiCl₂·6H₂O 3,2 mg

(N₄H)₆Mo₇O₁₄·4H₂O 2,4 mg

2 ml dieser Lösung werden zu 1 1 Medium zugegeben.
Geeignete Bioreaktoren werden ausgewählt, welche Verdampfen minimieren und geeignete Sauerstoff-limitierende Bedingungen bereitstellen. Sauerstoff-limitierende Bedingungen können abhängig von dem gewünschten Wassergehalt und der Dicke der Cellulosefolie variiert werden. Im allgemeinen ist unter Sauerstoff limitierenden Bedingungen Sauerstoff in einer Menge von 5 % bis 21 % des gesamten Gases vorhanden, das sich an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche befindet. Der Bioreaktor besteht aus einer Plastikbox, die mit einer luftdichten Abdeckung oder einer beschränkt gasdurchlässigen Abdeckung versehen ist. Die Dimensionen des Bioreaktors können in der Form (Würfel oder Zylinder) abhängig von der Form und Größe der zu produzierenden Cellulosefolie variieren. Zum Beispiel wird ein Zylinder mit einem Durchmesser von 6 inch einen Verband produzieren mit einem Durchmesser von 6 inch, der so wie er ist verwendet werden kann oder vor der Anwendung zugeschnitten werden kann, um der zu behandelnden Wunde zu entsprechen. Es wird angenommen, dass durch die Beschränkung des Sauerstoffgehalts in dem Fermentationsmedium das Acetobacter den in dem Medium vorhandenen Kohlenstoff verwendet, um mehr Cellulose zu produzieren, anstatt es für die Reproduktion zu verwenden, wodurch die Gesamtausbeute an Cellulose gesteigert wird.
Das Fortschreiten des Fermentationsprozesses unter statischen Bedingungen wurde für eine Dauer von ungefähr 7 bis 30 Tagen erlaubt fortzuschreiten, währenddessen die Bakterien in dem Kultivierungsmedium eine den Mikroorganismus enthaltende intakte Cellulosepellikula produzierten. Abhängig von der gewünschten Dicke, die einem gewissen Cellulosegehalt pro Flächengewicht entspricht, wird die Fermentation gestoppt und die Pellikula aus dem Bioreaktor entfernt. Das überschüssige Medium, das in der Pellikula enthalten ist, wird dann durch Standard-Trennverfahren, wie z.B. Kompression oder Zentrifugation, vor der chemischen Reinigung und anschließenden Verarbeitung der Pellikula entfernt, um einen Wundverband mit einem Cellulose-zu-Flüssigkeits-Verhältnis von ungefähr 1:10 bis ungefähr 1:65 zu ergeben. Die rohe Cellulosepellikula besitzt eine gesteigerte Zucker:Celluloseausbeute von ungefähr 35 % im Vergleich zu Literaturwerten von 10 %. Diese gesteigerte Ausbeute, gekoppelt mit einer günstigen Stickstoffquelle, resultierten in einer 40fachen Reduktion der Produktionskosten für die rohe Cellulosefolie im Vergleich zu Cellulosefolien, die gemäß dem ursprünglichen Schramm & Hestrin-Medium hergestellt werden [1954, J. Gen. Micro, 11:123–129].
2. Verarbeitungs- und Entpyrogenisierungsverfahren
Nachdem die Cellulosefolie hergestellt wurde, müssen die Zellen von der Cellulosepellikula für die Reinigung entfernt werden. Fontana et al. (1990, Appl. Biochem. Biotech, 24:253–264) haben die Zellen als apyrogen beschrieben, allerdings wurden die nicht aufgereinigten Cellulosepellikula unter Verwendung des Limulus Amebocytenlysat (LAL)-Testkits positiv auf Pyrogene getestet. Dieses Ergebnis machte die Entfernung der Zellen durch hier beschriebene chemische Verarbeitung erforderlich, um den Standard-Pyrogenitätstest zu bestehen, und den mikrobiellen Cellulose-Wundverband als nicht-pyrogen zu qualifizieren.
Die Cellulosepellikula wird einer Reihe von chemischen Waschschritten unterzogen, um die rohe Cellulosefolie in ein nicht-pyrogenes Wundverbandmaterial von medizinischem Grad zu konvertieren. Typische Verarbeitung verwendet Hydroxidlösungen mit Konzentrationen von 1 bis 20 Gew.%. Bevorzugt wird Natriumhydroxid mit einer Konzentration von nicht weniger als 3 % und bevorzugt von ungefähr 3 % bis ungefähr 5 % verwendet, um die Zellen zu lösen. Zusätzlich sieht die vorliegende Erfindung bevorzugt Wasserstoffperoxidwaschung vor, die in der Lage ist, die pyrogenfreien Folien zu bleichen und zu sterilisieren. Konzentrationen von ungefähr 0,05 % bis ungefähr 10 % Peroxid pro Gewicht sind nützlich, um ein Bleichen der Folie zu bewirken. Bevorzugt wird Peroxid in einer Menge von ungefähr 0,1 % bis ungefähr 0,5 % verwendet. Andere Bleichmittel, wie z.B. Hypochlorit, Hypobromit und Perborat können ebenfalls verwendet werden.
Reinigungsverfahren wurden unter Verwendung unterschiedlicher Exposionszeiten, Konzentrationen und Temperaturen auf das hohe Fermentationsprodukt angewendet. Verarbeitungszeiten von 1 bis 4 Stunden wurden im Zusammenhang mit Temperaturvariationen von 30 bis 100°C untersucht, um das Verfahren zu optimieren. Die aus den verschiedenen Betriebsbedingungen resultierenden Folien wurden auf ihren jeweiligen Pyrogenlevel und physikalischen Merkmale geprüft. Die Verfahrensbedingungen, die ein nicht-pyrogenes Produkt in der geringsten Zeit und bei geringster chemischer Konzentration ergaben, wurde dann aus ökonomischen Gründen ausgewählt. Die bei diesem Verfahren involvierte Zeit kann bis zu 4 Stunden bei ungefähr 90°C sein, bevorzugt ist die Zeit ungefähr 1 bis 2 Stunden bei ungefähr 60°C bis ungefähr 80°C.
Die Menge an Zellrückstand, die in dem Cellulosepad nach Verarbeitung verbleibt, kann durch den Limulus Amebocytenlysat (LAL)-Test gemessen werden, wie beschrieben von der U.S. Food und Drug Administration (FDA) in 21 CFR10.90. Das oben beschriebene anfängliche Reinigungsverfahren liefert ein nicht-pyrogenes Cellulosepad (<0,05 EU/ml). Der erlaubte Pyrogengehalt in Klasse I medizinischen Vorrichtungen ist 0,5 EU/ml (FDA LAL Testrichtlinie). Die Schritte des LAL-Tests werden durch den Testkithersteller definiert und können einfach befolgt werden, um den Pyrogenlevel in der Cellulosefolie zu bestimmen.
3. Physikalische Modifikation eines mikrobiellen Celluloseverbands
Wünschenswerte Merkmale eines Wundverbandmaterials schließen die Fähigkeit ein, eine feuchte Umgebung bereitzustellen, und zur selben Zeit die Fähigkeit, überschüssige Exsudatflüssigkeit aus einer Wunde zu absorbieren oder Feuchtigkeit abzugeben. Derzeit vertriebene Hydrogel-Wundverbandprodukte haben eine ungefähre Zusammensetzung von 90 bis 95 % Wasser und 5 bis 10 % Polymermaterial. Diese Produkte stellen einer Wunde allerdings keine adäquate Feuchtigkeit bereit und sind durch unzureichende Festigkeit gekennzeichnet. Darüber hinaus neigen diese Verbände dazu, an der Wundstelle anzuhaften. Diese Wundanhaftung resultiert in Wiederverletzung der Wunde bei Entfernen. Die Verbände der vorliegenden Erfindung hingegen zeigen bessere Feuchtigkeit und Absorptionsfähigkeit aufgrund einer laminaren vielschichtigen dreidimensionalen Struktur, die nicht in anderen Wundverbänden zu finden ist. Der Celluloseverband hat außerdem die Fähigkeit gezeigt, den Feuchtigkeitslevel an der Verband-Wundschnittstelle durch Absorption von überschüssiger Flüssigkeit oder Abgabe von Feuchtigkeit in Abhängigkeit von den Bedingungen an der Wundstelle einzustellen. Diese Feuchtigkeitshandhabungsfähigkeit hilft bei der Förderung der Heilung chronischer Wunden und ist eine neue Eigenschaft des Cellulose-Wundverbands.
Cellulosepellikulae haben typischerweise eine anfängliche Zusammensetzung von >90 % Wasser und 0,2 bis 1 % Cellulose oder ein Cellulose-zu-Wasser-Verhältnis von ungefähr 1:100 bis 1:500. Dieses Material wird einer Reihe von physikalischen Behandlungen unterzogen, um den endgültigen Wundverband zu erhalten. Der Wassergehalt eines gesättigten mikrobiellen Cellulosepads kann auf 98,5 % bis 0 % reduziert werden, was Folien mit einem Cellulose-zu-Wasser-Verhältnis von ungefähr 1:65 bis 1:0, d.h. ein komplett trockenes Material, ergibt. Dies kann durch Verwendung unterschiedlicher Trocknungsmethoden erreicht werden, einschließlich mechanischem Pressen, Zentrifugaldrainage, Lufttrocknung, Vakuumtrocknung und Gefriertrocknen.
Die resultierenden dehydrierten Pads wurden dann auf ihre Absorptionsfähigkeit getestet, indem sie komplett in Wasser eingetaucht wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass das komplett trockene Material eine reduzierte Fähigkeit hatte, Wasser zu reabsorbieren, im Vergleich zu dem nie getrockneten Material. Die komplett dehydrierten Pads absorbierten in 24 Stunden nur ein Maximum von 30 g Wasser pro 100 cm² Pad, während die nicht-dehydrierten Pads so viel wie 60 g/100 cm² über dieselbe Zeit absorbierten. Im Hinblick darauf enthalten Wundverbände der vorliegenden Erfindung ein Cellulose-zu-Wasser-Verhältnis von ungefähr 1:65 bis 1:10 und besonders bevorzugt ungefähr 1:24 bis ungefähr 1:16. Diese Wundverbände zeigen die Fähigkeit, eine feuchte Umgebung bereitzustellen, und haben außerdem die zweifache Fähigkeit, Feuchtigkeit abzugeben oder Exsudatflüssigkeit zu absorbieren für optimale Wundheilung.
4. Produktverpackung und Sterilisation
Das Verpackungsmaterial sollte wasserundurchlässig sein, um den feuchten Cellulose-Wundverband vom Austrocknen zu schützen, und in der Lage sein, dem Sterilisationsverfahren standzuhalten. Zum Beispiel sorgt ein plastikbeschichteter, heißversiegelbarer Aluminium-Chevron-Beutel für adäquate Undurchlässigkeit und Feuchtigkeitsretention.
Die zwei am meisten verwendeten Sterilisationsverfahren für medizinische Wundverbände, γ-Bestrahlung und Elektronenstrahlsterilisation, wurden beide untersucht. Die verpackten Cellulose-Wundverbände wurden verschiedenen Bestrahlungsleveln von 5 bis 50 KGy ausgesetzt. Die Sterilität jeden Verbandes wurde dann unter Verwendung von Standard-USP-Sterilitätstests bewertet. Außerdem wurde die allgemeine Erscheinung und mechanische Integrität des Verbands und des Verpackungsmaterials untersucht. Die Ergebnisse des Sterilitätstests zeigten, dass der Cellulose-Wundverband bei der 5 bis 40 KGy Bestrahlungsdosis stabil war und eine minimale Dosis von 15 KGray erforderlich war, um Produktsterilität sicherzustellen. Cellulose-Wundverbandprodukte, die für die Biokompatibilität-, Tier- und Menschenversuche verwendet wurden, wurden alle bei 30 KGy (zweifacher Sicherheitsfaktor) sterilisiert, um Produktsterilität sicherzustellen.
Biologische Beispiele
Beispiel 1 – Absorptions-/Abgabestudien
Cellulosepellikulae variierender Dicke wurden hergestellt und verarbeitet, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Pelikulae wurden auf eine einheitliche Dicke von 1,9 mm komprimiert und ergaben eine Reihe von Folien mit Cellulosegehalten im Bereich von 1,5 % bis 10 %. Diese Folien wurden auf die Fähigkeit getestet, Saline von einer gesättigten Oberfläche zu absorbieren und Feuchtigkeit an eine trockene Oberfläche abzugeben.
Abgewogene Teststücke einheitlicher Fläche wurden auf die Oberfläche eines gesättigten Schwamms platziert. Saline wurde um den Schwamm gegossen, um die Sättigung aufrechtzuerhalten. Nach 24 Stunden wurden die Teststücke wieder gewogen, um die Absorption zu bestimmen, welche dann als Prozent des anfänglichen Teststückgewichts aufgetragen wurde. Um die Feuchtigkeitsabsorption zu bestimmen, wurden abgewogene Teststücke einheitlicher Fläche auf die Oberfläche eines weichen, trockenen Leders platziert. Das Leder wurde vor der Zugabe des Teststücks ausgewogen. Nach 2 Stunden wurde das Teststück entfernt und das Leder wieder gewogen, um die Menge an Feuchtigkeit zu bestimmen, die abgegeben wurde, welche wiederum als Prozent des anfänglichen Teststückgewichts aufgetragen wurde.
Sowohl Absorptions- als auch Abgabedaten wurden in einen Graphen eingezeichnet, um den optimalen Wassergehalt für beide Eigenschaften zu bestimmen. Diese Daten sind in 1 gezeigt. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass der Celluloseprozentsatz in dem Verband idealerweise im Bereich von 3 % bis 6 % sein sollte, damit er Absorptions- und Abgabefähigkeiten besitzt. Die Figur zeigt ebenfalls, dass man einen Verband machen kann, der sowohl verbesserte Absorption als auch verbesserte Abgabe aufweist auf Kosten der anderen Eigenschaft.
Um die Überlegenheit der Abgabefähigkeit des mikrobiellen Cellulose-Wundverbands (Xcell) zu zeigen, wurden Tests an herkömmlich vermarkteten Hydrogelen durchgeführt. Die getesteten Produkte waren Clearsite (NDM), Nugel (Johnson&Johnson) und Flexigel (Smith&Nephew). Dasselbe Verfahren, wie oben beschrieben, wurde für diese Produkte durchgeführt, die Daten sind in 2 gezeigt. Die verwendeten XCell-Daten waren für ein Material, das 4,3 Cellulose enthält. Wie klar ersichtlich ist, gab der XCell-Verband über 75 % seines anfänglichen Gewichts ab und übertraf alle Konkurrenzprodukte, die zwischen 9 % und 31 abgaben.
Obwohl Abgabe sehr wichtig für die Wundheilung ist, wäre ein Wundverband ideal, wenn er die Fähigkeit hätte, abzugeben und zu absorbieren. Das zuvor beschriebene Verfahren für die Absorption wurde verwendet, um Clearsite-Hydrogel-Wundverband zu testen. Die entsprechenden Daten sind in 3 gezeigt, zusammen mit Abgabedaten und XCell-Daten. Wie zu sehen ist, ist die Absorption beider Teststücke nahezu identisch, aber das XCell-Material gab sechsmal mehr Feuchtigkeit ab als das Hydrogel.
Beispiel 2
Biokompatibilitätsprüfung
Der sterile Cellulose-Wundverband wurde den folgenden Biokompatibilitätstests unterzogen: 1) Meerschweinchen-Sensibilisierung, 2) Primärreizung in Kaninchen und 3) Zytotoxizität. In den Empfindlichkeitstests wurden Extrakte des Produkts in 6 Meerschweinchen injiziert. Die Körpertemperaturen der Meerschweinchen wurden auf eine Sensibilisierungsreaktion während der 8- bis 10wöchigen Studiendauer kontrolliert. Die Ergebnisse zeigten keinen Hinweis auf verzögerte dermische Kontaktsensibilisierung in Meerschweinchen. Der Primärreiztest war eine zweiwöchige Studie unter Verwendung von Kaninchen. Bei diesem Test wurden Extrakte des Celluloseverbands subkutan injiziert und die Haut auf jegliche Hautreizungsreaktion beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen Hinweis auf signifikante Reizung oder Toxizität von der subkutanen Injektion des Extrakts in Kaninchen gab. Es wurde festgestellt, dass der primäre Reizungsindex des Celluloseverbandextrakts vernachlässigbar war. Schließlich wurde die Zytotoxizität des Verbands mit Säugetierzellen unter Verwendung von Mäuse-L929-Zellkulturen getestet. Die Ergebnisse zeigen an, dass ein Extrakt des Celluloseverbands nicht zytotoxisch war und das Zellwachstum nicht inhibierte. Der Cellulose-Wundverband, hergestellt durch die vorliegende Erfindung, passierte erfolgreich all diese Tests und garantiert so, dass das Produkt biokompatibel, sicher ist und Wundheilung nicht inhibiert wird.
Beispiel 3
Wundheilung in Tiermodellen
Aufgabe der vorklinischen Tierstudien war es, die Wundheilungsleistung des Cellulose-Wundverbands mikrobiellen Ursprungs in Tiermodellen am Schwein mit existierenden Wundverbandprodukten, wie z.B. Hydrokolloiden und Hydrogelen, zu vergleichen.
Der Test wurde unter Verwendung des Schweinemodellprotokolls der Abteilung für Dermatologie der Universität von Miami für Medizin in Übereinstimmung mit Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) durchgeführt.
Kurz, der Versuch wurde an 2 pathogen-freien Schweinen über einen Zeitraum von 7 Tagen durchgeführt. Ungefähr 140 rechtwinkelige Wunden (10×7×0,3 mm) wurden in den paravertebralen Bereich und den Thoraxbereich von jedem Schwein mit einem speziellen Elektrokeratotom, das mit einer 7 mm-Klinge ausgestattet ist, gemacht. Diese Wunden sind voneinander durch 15 mm unverwundete Haut getrennt. Ungefähr 35 Wunden wurden den Wundverband-Behandlungsgruppen aus Cellulose, Hydrokolloid, Hydrogel und keinem Verband/Exposition gegenüber Luft, zufällig zugeteilt. Eine Beurteilung der epidermalen Migration wurde zwei Tage nach der Anwendung begonnen.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass der Cellulose-Wundverband die oberflächliche Wunden ebenso gut wie der Hydrokolloidverband und besser als der Hydrogelverband heilte. Bezeichnenderweise heilte der Cellulose-Wundverband am vierten Tag nach Verletzung 70 % der Wunden, im Vergleich zu jeweils 50 %, 20 % und 0 % für die Hydrokolloid, Hydrogel und der Luft ausgesetzten Wunden. Am fünften Tag hatten sowohl Cellulose- als auch Hydrokolloidverbände 100 % der Testwunden geheilt, während von dem Hydrogel und luftexponierten Teststücken jeweils nur 70 % und 50 heilten.
Beispiel 4
Klinische Wirksamkeitsstudie am Menschen bei der Behandlung chronischer wunden
Die Aufgabe des klinischen Versuchs am Menschen war es, die Effektivität des Cellulose-Wundverbands bei der Behandlung unterschiedlicher Arten chronischer Wunden zu beurteilen. Insgesamt 29 Patienten mit 31 unterschiedlichen Arten chronischer Wunden waren in diese Studie eingebunden. Die Patienten wurden mit dem Cellulose-Wundverband behandelt, nachdem sie die Eingangskriterien passiert haben, die in dem Versuchsprotokoll umrissen sind, das durch einen institutionellen Bewertungsausschuss (IRB) genehmigt wurde. Die Cellulose-Wundverband-Behandlung wurde für 8 Wochen durchgeführt oder bis die Wunde verheilt war. Wöchentliche Wundenbeobachtungen wurden durchgeführt. Nachdem die Beobachtungen durchgeführt wurden, wurden die Verbände ausgetauscht. Sowohl Wundzustand als auch Größe wurden während der wöchentlichen Untersuchungen aufgezeichnet und die Studie wurde beendet, nachdem die Wunden verheilt waren oder nach 8wöchiger Behandlung.
Die Ergebnisse für die Studie am Menschen können auf der Basis der Leistung des Cellulose-Wundverbands in drei beachtenswerte Indikationen eingeteilt werden. Der Cellulose-Wundverband zeigte Stärke in der Entfernung von wässriger Nekrose in tiefen Druckgeschwüren. Die Anwendung des Cellulose-Wundverbands reduzierte das Hypergranulationsgewebe bis auf den Level des umliegenden Epitheliums in zwei Wunden, die dieses Problem aufwiesen. Die dritte und interessanteste Reaktion auf den Cellulose-Wundverband wurde während der Behandlung von venösen Beingeschwüren beobachtet, besonders solchen mit Beteiligung von perforiertem Gewebe. Die Ergebnisse zeigten, dass sieben (54 %) aus dreizehn (13) venösen Beingeschwüren (zwei oberflächlichen und elf perforierenden Wunden) vollständig geheilt waren und der Rest (46 %) Verbesserung im Verlauf der 8wöchigen Studie zeigte.
Dem Fachmann ist offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen und Variationen an den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Deshalb ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung abdeckt, vorausgesetzt, dass sie in dem Umfang der anhängenden Ansprüche und ihrer Äquivalente fallen.

Claims

Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs, umfassend 1,5 bis 9 Gew.% Cellulose.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach Anspruch 1, umfassend 3 bis 7 Gew.% Cellulose.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach Anspruch 2, umfassend 4 bis 6 Gew.% Cellulose.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die in Form einer Wunde geformt ist.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die einen negativen Limulus Amebocytenlysat (LAL)-Test zeigt (< 0,5 EU/ml) und hierdurch nicht-pyrogen ist.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die einen negativen Primärreiztest in Kaninchen und einen negativen Cytotoxizitätstest unter Verwendung von Mäuse L929-Zellen zeigt, einem Meerschweinchen-Empfindlichkeitstest genügt und hierdurch biokompatibel ist.
Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die etwa 50 bis etwa 90 ihres flüssigen Gewichts an ein trockenes Substrat abgibt und etwa 35 bis etwa 140 Gew.% ihres Gewichts absorbiert.
Verfahren zur Herstellung einer Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs, umfassend: statisches Herstellen einer mikrobiellen Cellulosepellikula unter Verwendung von Acetobacter xylinum; Isolieren der Pellikula mit einem Cellulose-zu-Wasser-Verhältnis im Bereich von 1:100 bis 1:500; und Trocknen der isolierten Pellikula auf einen Cellulosegehalt von 1,5 bis 9 Gew.%.
Verwendung der Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von chronischen Wunden nützlich ist.
Verwendung der Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Wundverbands zur Behandlung chronischer Wunden.
Verwendung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei die chronische Wunde ein venöses Geschwür ist.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die chronische Wunde ein Druck (Decubitus)-Geschwür ist.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die chronische Wunde ein diabetisches Geschwür ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Celluloseverbandfolie zwischen zweimal täglich und wöchentlich zu wechseln ist.
Kit, umfassend: (a) eine Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs nach einem der Ansprüche 1 bis 7; (b) eine feuchtigkeitsbeständige Packung, enthaltend die Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs; und (c) Anweisungen zur Anwendung der Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs auf eine chronische Wunde.
Kit nach Anspruch 15, der durch γ-Bestrahlung sterilisiert ist.
Kit nach Anspruch 15, der durch Elektronenstrahlsterilisierung sterilisiert ist.
Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die feuchtigkeitsbeständige Packung, enthaltend die Celluloseverbandfolie mikrobiellen Ursprungs, einen Aluminium-Plastik-beschichteten, verschliessbaren Winkelmanschettenbeutel umfasst.