DE2631909C2 - Synthetische Haut - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine synthetische Haut.

Berichte über Versuche, offene Wunden und starke Verbrennungen zu bedecken, reichen bis zum Jahre 1500 vor Christi Geburt zurück; vgl. J. H. Breasted: »Edwin Smith, Surgical Papyrus«, Band 1, Verlag University of Chicago Press, Chicago, Illinois (1930), Seite 83. Obwohl seitdem umfangreiche Forschungen zur Entwicklung eines brauchbaren Hautersatzes durchgeführt worden sind, ist bis jetzt keine brauchbare Alternative für die Autoplastik entwickelt worden, «edoch haben Beobachtungen, die aus den auf diesem Forschungsgebiet bereits durchgeführten Arbeiten angesammelt wurden, zur Entwicklung einer Anzahl von Grundvorstellungea geführt, die auf den Aufbau eines Systems zur Behandlung von offenen Wunden und Verbrennungen dritten Grades mit besserer Aussicht auf Erfolg angewandt werden können.

Die bisherigen Versuche zur Lösung dieses Problems, die angewandt warden, um einen Hautersatz zu entwickeln, können in vier große Kategorien eingeteilt werden, nämlich die Homoplastik, modifizierte Hautxeno transplantationen, synthetische polymere Gebilde und regenerierte (reconstituted) Kollagenfilme.
Die Anwendung der Homoplastik zur Behandlung von massiven Verbrennungen ist gegenwärtig eine übliche Methode. Als Quelle für das H _;attransplantat kann ein lebender Spender oder Haut dienen, die von Leichen entnommen und in einer Hautbank aufbewahrt worden ist. Die Rechtfertigung für die Anwendung der Homoplastik ist die Notwendigkeit, den Fiüssigkeitsveriust zu vermindern, Infektionen zu verhindern und den Bereich der Vernarbung zu verkleinern.
In Abwesenheit von eine Immunreaktion unterdrückenden Mitteln werden jedoch Homotransplantate imnrer abgestoßen. Die Abstoßung erfolgt anscheinend in erster Linie auf dem Wege über die Hemmung der Gefäßbil!- dung in dem Transplantat, die den Beginn der Immunreaktion begleitet; vgl. E. A. Guthy, J. B. Billotte, R. J. K. Koumans und J. F. Burke in »Research in Burns«, Herausgeber P. Matter, T. L. Barcley und Z. Konickova, Verlag Hans Huber, Stuttgart, 1971. hus der Verwendung von eine Immunreaktion unterdrückenden Mitteln, um die Abstoßung solcher Transplantate zu vermeiden, ergeben sich aber bekanntlich viele Pro-

Verschiedene Forscher haben Versuche unternommen, die Immunogenität (die Immunreaktionen erzeugende Natur) von Homotransplantaten durch Organkulturmethoden zu regulieren. Nach einer Anzahl von einander widersprechenden Berichten wurden die Ergebnisse einer endgültigen Untersuchung solcher Verfahrein von Ninnemann und Good veröffentlicht, die daraus den Schluß gezogen ha'Jen, daß die Modifizierung von Antigenen in Kulturgeweben bei diesen Versuchen nteht bewiesen worden war; vgl. J. L. Ninnemann und R. A. Good, »Transplantation«, 18, 1 (1974).

Ein anderer Versuch, die Homoplastik anzuwenden, war die Untersuchung der Möglichkeit der Modifizierung von tierischer Haut. Das Grundziel dieses Lösungsgedankens ist der Entzug derjenigen Bestandteile aus der Haut, die die Bildung von Wirtsantikörpern hervorrufen.

Oliver und Mitarbeiter verfolgten diesen Gedanken, indem sie Schweinehaut mit Trypsin behandelten, um zelluläres und nichtkoilagenartiges Material daraus zu entfernen; vgl. R. F. Oliver, R. A. Grant und C. M. Kent, »Brit. J. Exp. Path.«, 53,540 (1972). Dies führte zu einem Transplantationsmaterial, das vorwiegend aus unlöslichem Kollagen aus der ursprünglichen Morphologie der Dennis bestand und ein zu vernachlässigendes Ausmaß an Antigenität aufwies. Das so erhaltene modifizierte Hautkollagen wurde auf in voller Dicke ausgeschnittene Hautwunden des Schweins transplantiert und sein weiteres Schicksal mit demjenigen von Autotransplantaten und Homotransplantaten aus unbehandelter Haut verglichen. Die Autotransplantate verhielten sich normal, wie es zuvor von Henshaw und Miller beschrieben worden war; vgl. J. R. Henshaw und E. R. Miller, »Arch. Surg.«, 658 (1965). Die unbehandelten Homotransplantate waren am 5. Tag abgestorben, wobei einkernige Zellen vorhanden waren, und hatten am 10. Tag an der Basis zu degenerieren begonnen. Am 20. Tag war die Abstoßung der Homotransplantate praktisch vollständig. Bei den behandelten Hautkollagen-Transplantaten war der untere Teil des Transplantats am 5. Tag wieder mit Kapillaren und Bindegewebszellen ausgestattet, während eine epidermische Wanderung durch das Transplantat hindurch vor sich ging. Die basophile Lyse des Transplantatkollagens begann ungefähr am 5. Tag und war von der Bildung von Infiltrations- und Granulationsgewebe bc-

gleitet, welches das Kollagen in Gegenwart von vielkernigen Riesenzellen fortschreitend ersetzte. Am 20. Tag waren die Transplantate im wesentlichen durch Granulationsgewebe ersetzt und verhielten sich wie offene Wunden. Hierdurch wird die Notwendigkeit der Erhöhung des Widerstandes von nativem Kollagen gegen Lyse unterstrichen.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen verzeichneten Oliver und Mitarbeiter vier Anforderungen an ein erfolgreiches Transplantat:

1. Die Hautkollagenfasem sollen über einen langen Zeitraum hinweg unverändert bleiben und dadurch einen wesentlichen Struktanahmen für die Neubildung der Gefäß- und Zellelemente des Gewebes bilden;

2. das Transplantat soll keine Fremdkörperreaktion hervorrufen, die zur schließlichen Zerstörung des Transplantats führt, in dem sich frische Zellen gebildet haben;

3. das Transplantat soll ein für das Wachstum und die Entwicklung normaler Epidermis geeignetes Hautbett bilden; und

4. das Transplantat soll die Bildung von Granulationsgewebe unterdrücken.

Eine dritte Möglichkeit ist die Verwendung von synthetischen polymeren Gebilden. Im Schrifttum gibt es zahlreiche Berichte über die Untersuchung der Eignung von polymeren Stoffen für die verschiedensten biomedizinischen Anwendungszwecke, unter anderem auch als Hautersatzstoffe und provisorische Wundverbände. In Anbetracht der Fähigkeit der Wissenschaftler auf dem Gebiete der Polymeren, eine polymere Struktur an nahezu jede beliebige Kombination von physikalischen und chemischen (aber bisher nur wenigen biologischen) Anforderungen anzupassen, ist dies nicht überraschend. Bei den Untersuchungen über die Brauchbarkeit von Polymerfilmen als Hautersatz ist bisher eine beträchtliche Anzahl von geprüften Stoffen als umruglich verworfen worden, man hat aber wertvolle Erkenntnisse über die an einen zufriedenstellenden HautersaU zu stellenden Anforderungen gewonnen. Zum Beispiel hat die Verwendung einer Samtstruktur zu einer verbesserten Haftfestigkeit an dem Gewebe geführt, und durch die Entwicklung von Methoden zur Herstellung von sögenannten biologisch verträglichen Polymeren von gesteuerter Porengröße ist die Möglichkeit zur Synthese von Stoffen verbessert worden, die imstande sind, in dem Transplantat Zellenwanderung und -fortpflanzung hervorzurufen; vgl. C. W. Hall, D. Liotta. J. J. Chidoni. M. E. Debakey und D. P. Dressler, »J. Biomed. Mat. Res.«, 1,187 (1967) und G. L. Wilkes und S. L. Samuels, »J. Biomed. Mat. Res.«, 7,541 (1973). Ein anderer aussichtsreicher Gedanke war die Polymerisation von vernetzten Polymeren in Hydrogelform, um eine zusätzliche Fähigkeit zur Anregung für das Einwachsen von Zellen und die Gefäßbildung zur Verfugung zu stellen; vgl. J. Hubacek, K. Kliment, J. Dusek und Hubanek, »J. Biomed. Mat. Res.«, 1,387 (1967). Die Verwendung von synthetischen Polymeren zum Ersatz von Haut hat aber bisher nicht zur Lösung des Problems geführt, und zwar hauptsächlich wegen der Häufigkeit von Infektionen und der Unfähigkeit der bisher untersuchten Stoffe, Gefäß- und Epithelbildung anzuregen.

Da der Hauptbestandteil von normaler Haut Kollagen ist, wäre ein logischer Lösungsgedanke für die Entwicklung eines Hautersatzes die Untersuchung des Schicksals von regenerierten Kollagengebilden nach ihrem Inberührungbringen mit lebendem Gewebe.

Dieser Lösungsweg wurde von einer Anzahl von Forschern angewandt, deren allgemeines Arbeitsverfahren darin bestand, das Kollagen aus Tieren zu extrahieren, es zu verschiedenen Graden zu reinigen, und es in Folien oder sonsuge Gebilde überzuführen, die als Wundverbände verwendet oder in lebendes Gewebe implantiert wurden, um ihr Schicksal in vivo zu bestimmen. Frühere Arbeiten auf diesem Gebiet haben gezeigt, daß Kollagen als solches eine chronische Entzünduugsreaktion mit anschließender Resorption des Implantats hervorruft; vgl. B. D. Pullinger und A. Pirie, »J. Path. Bact.«, 34, 341 (1942). Grillo und Gross konnten zeigen, daß die Resorptionsgeschwindigkeit von Kollagen sich durch gesteuerte Vernetzung mit Formaldehyd vermindern läßt. Sie konnten ferner zeigen, daß die Immunreaktion auf Implantate aus regeneriertem Kollagen mini.nal war; vgl. H. C. Grille und J. Gross, »J. Sutg. Res.«, 2, 69 (1962).

Enzymatisch modifiziertes Kollagen ist von Rubin und Stenzel hergestellt und ausgewertet worden, die gezeigt haben, daß diese Behandlung nicht so viel zelluläre Reaktion hervorruft wie das unbehandelte Material. Die Erklärung für dieses unterschiedliche Verhalten ist die, daß das verwendete Enzym (Proctase) die Telopeptide in wirksamer Weise aus dem Kollagenmolekül entfernt, ohne die native Molekularstruktur zu zerstören; vgl. A. L. Rubin und K. H. Stenzel in »Biomaterials« (Herausgeber L. Stark und G. Aggarwal), Verlag Plenum Press, New Yotk (1969). Durcn die Verwendung von regenerierten Koliagenfolien sind die Probleme der Lyse, der Infektion und der Verhinderung des Einwachsens von Gewebe und der Gefäßbildung, die bei anderen Methoden auftritt, nicht gelöst worden.

Die DE-OS 23 17 081 betrifft eine künstliche Haut aus einer Wasser enthaltenden, hydrophilen Polymerschwammschicht und einer auf der körperfernen Seite befindlichen Filmschicht, die zur Verringerung von Feuchtigkeitsverlusten dient. Die körpernahe Polymerschwammschicht besteht aus bestimmten Polyacrylaten (vgl. Anspruch 4). Charakteristisch für die Schwammschicht ist, daß sie mit der Zeit nicht verhärtet und ein permanent flexibles System ergibt (vgl. S. 4,3. Absatz). Andererseits läßt sich hieraus schließen, daß die Schwammschicht permanent bestehen bleibt und zu einem späteren Zeitpunkt operativ entfernt werden muß.

Die DE-AS 12 36 720 betrifft eine von Durchgängen durchsetzte Hautprothese aus bestimmten Kunststoffen. Das besondere Merkmal hierbei ist, daß sich die Zahl und Größe der Durchgänge mit wachsendem Körperabstand verringern, so daß auch hier der Feuchtigkeitsdurchtritt durch die Hautprothese kontrolliert werden kann. Aus Spalte 2, Zeilen 26 bis 28 geht hervor, daß die Hautprothese zum gegebenen Zeitpunkt operativ entfernt und durch körpereigene Hauttransplantate ersetzt wird.

Die US-PS 35 26 224 betrifft einen Verband in Form 'jiner synthetischen Haut, bestehend aus einer körpernahen hydrophilen Schicat, z. B. aus Nylonvelour, und einer körperfernen, den Feuchtigkeitsdurchtritt regulieren-

zo ^

den Schicht, ζ. B. aus Polyurethan. Gemäß Spalte 2, Zeilen 53 bis SS stellt diese synthetische Haut einen zeitweisen Ersatz für die beschädigte Haut dar, was bedeutet, daß sie nach einer bestimmten Zeit ersetzt werden muß. Sämtlichen Druckschriften ist also gemeinsam, daß es sich um Hautprothesen aus bestimmten Kunststoffen handelt. Alle in Frage kommenden Kunststoffe nehmen an den Stoffwechselvorgängen der heilenden Wunde nicht teil, sondern stellen nur eine Schutzschicht dar, die über die Wunde gelegt wird und eine Beeinträchtigung des Heilungsvorgangs von außen verhindern soll. Aus allen Druckschriften geht hervor, daß die verwendeten Kunststoffe dauerhaft sind und demnach zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden müssen.

Die erfindungsgemäße synthetische Haut unterscheidet sich von diesen bekannten Produkten grundlegend darin, daß sie am Stoffwechsel der heilenden Wunde teilnimmt und dabei selbst abgebaut wird.

ίο Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Die erste Schicht der erfindungsgemäßen synthetischen Haut ist nicht-immunogen, in Gegenwart von Körperflüssigkeiten un'öslich und in Gegenwart von Körperenzymen nicht-abbaubar. Das hierfür verwendete vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt wird durch inniges Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und anschließendes Vernetzen des dabei entstehenden Produktes synthetisiert. Geeignetes Kollagen kann aus einer Anzahl von tierischen Quellen gewonnen werden, und zu den geeigneten Mucopolysacchariden gehören z. B. Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparansulfat, Heparin und Hyaluronsäure.

Das Vernetzen kann auf chemischem Wege, durch Bestrahlung, dehydrothermisch oder nach einem sonstigen geeigneten Verfahren erfolgen. Eine geeignete chemische Methode ist die Aldehydvernetzung; jedoch sind andere chemische Vernetzungsmittel ebenso geeignet. Die dehydrothermische Vernetzung, die bevorzugt wird, erfolgt durch Herabsetzung des Feuchtigkeitsgehalts der Verbundprodukte auf einen sehr niedrigen Wert, z. B. indem man das Verbundprodukt der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und Hochvakuum aussetzt. Die dehydrothermische Vernetzung vermeidet die Notwendigkeit, Vernetzungsmittel zuzusetzen und im Falle von toxischen Stoffen, wie Aldehyden, das nicht-umgesetzte Vernetzungsmittel nachträglich zu entfernen; durch dehydrothermische Vernetzung entstehen auch Verbundprodukte, deren Mucopolysaccharidgehalt in einem weiteren Bereich liegt.

Es wird angenommen, daß die Produkte dieser Synthesen ?us Kollagenmolekülen oder Kollagenfibrillen bestehen, an die lange Mucopolysaccharidketten gebunden sind. Offenbar werden die Mucopolysaccharidketten durch das Vernetzen so fest an das Kollagen gebunden, daß sie sich nicht eluieren oder anderweitig von ihnen trennen lassen. Mechanisch können diese Stoffe als Analoge von faserverstärkten Verbundstoffen aufgefaßt werden, in denen das Kollagen die Faser und das Mucopolysaccharid die Einbettungsmasse bildet, weswegen diese Stoffe hier auch als polymere Verbundprodukte bezeichnet werden.

Es wurde gefunden, daß vernetzte Verbundprodukte aus Kollagen und Mucopolysaccharid die vorteilhaften Eigenschaften des nativen Kollagens beibehalten. Außerdem lassen sich solche Stoffe so synthetisieren, daß sie nicht-antigen sind, durch Kollagenase und andere Enzyme nicht abgebaut werden und in Gegenwart von Körperflüssigkeiten unlöslich sind. Ferner können solche Verbundprodukte so synthetisiert werden, daß sie die für künstliche Hauttransplantate und Wundverbände geeigneten Bruchfestigkeiten, Bruchdehnungen und sonstigen mechanischen Eigenschaften aufweisen.
An die erste Schicht ist durch Haftbindung eine die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht gebunden. Diese Steuerungsschicht besteht aus einem nicht-toxischen Werkstoff, der der gesamten Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von etwa 0,1 bis 1 mg/cm²/h verleiht, die ungefähr der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von normaler Haut entspricht. Beispiele für Werkstoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht sind synthetische Polymere, wie Siliconharze, Polyacrylsäure- und Polymethacrylsäureester und deren Copolymere, Polyurethane, sowie natürliche Polymere.

Die hier beschriebenen Membranen erfüllen wegen ihrer besonderen Kombination von Schichten die Aufgaben von künstlicher Haut oder Wundverbänden. Die Geschwindigkeiten des Körperfeuchtigkeitsverlustes und des Wärmeverlustes aus dem verletzten Hautbereich werden so gesteuert, daß sie ähnliche Größen wie bei normaler Haut haben. Außerdem wird durch diese Membranen bakterielle Infektion vermieden und der Wundbereich gegen mechanischen Abrieb oder sonstige Abnutzung geschützt. Wesentlich ist, daß Membranen, die mit einer ersten Schicht aus einem vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt hergestellt sind, eine Schablone für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Zellen aus dem unter derr verletzten Hautbereich liegenden subkutanen Gewebe oder avis dem dem verletzten Hautbereich benachbarten Gewebe der Epidermis, für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Kapillaren und anderen mit darunterliegendem subkutanem Gewebe in Verbindung stehenden Blutgefäßen oder von anderem, an den Bereich der Verletzung angrenzendem Gewebe und für die Entwicklung von neuem dermischem und epidermischem Gewebe darstellt Diese Membranen sind auch imstande, die Intensität, Richtung und Geschwindigkeit von Kontrakturen, zu denen es im Verlaufe des Heiäungsprozesses kommt, unter Kontrolle zu halten. In der Zeichnung ist die mehrschichtige Membran gemäß der Erfindung schematisch dargestellt
Die mehrschichtigen Membranen gemäß der Erfindung bestehen aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Werkstoffen. Wie die Abbildung zeigt, ist eine erste Schicht 10 vorhanden. Da die Schicht 10 in unmittelbare Berührung mit dem subkutanen Gewebe oder Wundbett kommt, muß sie drei wesentliche Merkmale aufweisen, nämlich Unlöslichkeit in Korperflüssigkeiten, Unabbaubarkeit bei Berührung mit Körperenzymen und Nicht-Immunogenität. Diese mehrschichtigen Membranen weisen ferner mindestens eine zusätzliche Schicht auf, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit der Gesamtmembran zu steuern. Die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht 12 ist in der Abbildung als unmittelbar an die erste Schicht gebunden dargestellt. Es muß jedoch daraufhingewiesen werden, daß auf der Oberseite der Schicht 12 oder zwischen der ersten Schicht 10 und der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht 12 weitere Schichten hinzugefügt werden können, sofern diese die wesentlichen Funktionen dieser Schichten nicht stören.

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Außer den oben erwähnten wesentlichen Eigenschaften für die erste Schicht gibt es noch andere Eigenschaften, die diese Schicht nach Möglichkeit aufweisen soll.

Eine solche vorteilhafte Eigenschaft bezieht sich auf die Benetzungs- und Haftfähigkeit. Es ist wünschenswert, daß die erste Schicht aus einem Wirkstoff besteht, der anfänglich von dem Wundbett benetzt wird und an ihm anhaftet. Dieses sind Vorbedingungen für die Vermeidung der Bildung von Lufteinschlüssen, die sich später zu Stellen des Bakterienwachstums entwickeln können. Die sofortige Ausbildung einer mäßig starken Bindung zwischen dem Membrantransplantat und dem Wirtsgewebe schützt das Transplantat gegen Verschiebung über dem Wundbett auf Grund von Scherkräften beim Verbinden und Heilen und verhindert daher die Bildung von Lufkinschlüssen. Daher verwendet man vorzugsweise für die erste Schicht einen Werkstoff, der schnell mit dem Wirtsgewebe eine Bindung bildet, die eine Scherfestigkeit von mindestens etwa 0,7 kg/cm² und vorzugsweise von mindestens etwa 7 kg/cm² aufweist.

Ferner ist es wünschenswert, daß die ei &te Schicht aus einem Stoff besteht, dessen mechanische Eigenschaften es der Membran gestatten, sich der Wunde wie ein Textilstoff anzuschmiegen, und der trotzdem bei der Verwendung nicht reißt. Daher werden Werkstoffe mit einem Young'schen Modul zwischen etwa 7 und 70 kg/cnr und einer Bruchfestigkeit von mindestens 7 kg/cm² bevorzugt.

Die Epithelbildung an der Grenze zwischen dem Membrantransplantat und dem Gewebe der Epidermis fuhrt zur Bildung einer natürlichen Sperrschicht gegen Infektion. Eine solche Sperrschicht kann sich dadurch bilden, daß eine Epithelschicht über oder durch das Transplantat vorrückt, wie es in der Abbildung dargestellt ist. Aus diesem Grunde ist es zweckmäßig, für die erste Schicht einen Werkstoff zu verwenden, der Epithelbildungsgeschwindigkcitcn von mindestens etwa 0,1 rnrr. pro Tag ermöglicht.

Die Infiltration des mehrschichtigen Transplantats mit Epithelzellen, Bitidegewebszellen und anderen Zellen, wie es in der Abbildung dargestellt ist, ist eine Voraussetzung dafür, daß das Transplantat als Schablone für die Neubildung von Hautgewebe wirkt. Daher werden Werkstoffe bevorzugt, die eine Infiltrationsgeschwindigkeit solcher Zellen von mindestens etwa 0,1 mm pro Tag gestatten. Dies ermöglicht den Zellen, in 10 Tagen oder weniger die Hälfte der Dicke einer Transplantatmembran mit einer typischen Dicke von 2 mm zu durchsetzen.

Die Werkstoffe für die erste Schicht sind vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte. Diese werden durch Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und anschließendes Vernetzen des so erhaltenen Kollagen-Mucopolysaccharidprodukts erhalten.

Kollagen ist ein Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. Es kommt oft in Form makroskopischer Fasern vor, die sich chemisch und mechanisch von den nicht aus Kollagen bestehenden Gewebekomponenten trennen lassen. Es eignet sich Kollagen beliebiger Herkunft, das unlöslich od„r in sauren, neutralen oder basischen wäßrigen Lösungen löslich ist, sowie die im Handel erhältlichen KoIIagene. Typisches Ausgangsgut zur Gewinnung von Kollagen sind Kalbsfell, Rinder-Achillessehne und Rinderknochen.

Der Ausdruck »Mucopolysaccharid« bezeichnet hexosaminhaltige Polysaccharide tierischen Ursprungs. Diese Klasse von Verbindungen wird auch oft als »Glycosaminoglykane« bezeichnet. Chemisch sind Mucopolysaccharide in abwechselnder Reihenfolge aufgebaute Copolymere aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die sich in mehr oder weniger regelmäßiger Weise entweder mit Hexuronsäureresten oder mit Hexoseresten abwechseln; vgl. »Carbohydrate Metabolism and its Disorders« von K. S. Dodgson und A. G. Lloyd, herausgegeben von F. Dickens und Mitarbeitern, Band 1, Verlag Academic Press (1968).

Einige der besser bekannten Mucopolysaccharide tierischen Ursprungs entsprechen den folgenden Strukturformeln:

CH₂OH

COOH

Hyaluronsäure

NHAc

OH

COOH HO₃SO

CH₂OH

Chondroitin-4-sulfat

NHAc

zu Ji y\jy

IO :o

■to 50

H₂COSO₃H

COOH

Chondroitin-6-sulfat

NHAc

OH

CH₂OH

HO₃SO

-O

Dermatansulfat

COOH
OH

O-

o—

NHAc

OH

Keratansulfat

HO₃SO

60

Heparin

Heparansulfat

O —

OH

NHSO₃H

Zu; Herstellung aer hier beschriebenen Verbundprodukte eignen sich auch andere Mucopolysaccharide, rtie der Fachmann entweder kennt oder durch Routinever«uche ermitteln kann. Eine eingehendere Beschreibung von Mucopolysacchariden findet sich in dem Werk »Polysaccharides« von G. O. Aspinall, Verlag Pergamon Press, Oxford (1970).

Typische Ausgangsstoffe für Heparin sind Schweinedarm, Rinderlunge, Rinderleberkapsel und Mäusefell. Hyaluronsäure kann aus Hahnenkamm und menschlicher Nabelschnur gewonnen werden, während Chondroitin-4-sulfat und Chondroitin-6-sulfat aus Rinderknorpel und Haifischknorpel gewonnen werden können. Dermatansulfat und Heparansulfat können aus Schweineschleimhautgewebe gewonnen werden, während Keratansulfat aus Rinderhornhaut gewonnen werden kann.

Kollagen läßt sich mit einem Mucopolysaccharid in wäßrigen Lösungen umsetzen, die sauer, basisch oder neu- ι^A tral sein können. Diese Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. In typischer Weise werden geringe Mengen von Kollagen, z. B. 0,3 Gewichtsprozent, in verdünnter Essigsäure dispergiert und die Dispersion gründlich gerührt. Dann setzt man langsam, z. B. tropfenweise, das Polysaccharid zu der wäßrigen Kollagendispersion zu, was zur gemeinsamen Ausfällung von Kollagen und Mucopolysaccharid führt. Der gemeinsam ausgefällte Niederschlag ist eine verschlungene Masse von Kollagenfibrillen, die mit Mucopolysaccharid überzogen sind, und ähnelt etwas einem Garnknäuel. Diese verschlungene Fasermasse kann durch Homogenisieren in eine homogene Dispersion von feinen Fasern übergeführt werden, die dann abfiltriert und getrocknet werden. Gemeinsam ausgefällte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte sind von V. Podrazky, F. S. Steven, D. S. Jackson, J. B. Weiss und S. J. Leibovich untersucht worden; vgl. »Biochim. Biophys. Acta.«, 229, 690 (!971).

Obwohl Gas Reaktionsprodukt aus Kollagen und Mucopolysaccharid aus dem wäßrigen Medium, in dem es sich bildet, gemeinsam ausfällt, wurde gefunden, daß die Mucopolysaccharidkomponente in anderen wäßrigen Lösungen in Lösung gehen kann. Dies trifft besonders auf konzentriertere wäßrige Salzlösungen, wie Körperflüssigkeiten, zu. Es ist z. B. bekannt, daß gemeinsame Ausfallungen von Kollagen und Mucopolysaccharid in 0,01molarer Kochsalzlösung unlöslich, in O.lmolarer Kochsalzlösung etwas löslich und in 0,4molarer Kochsalzlösung recht löslich sind - die physiologische Konzentration beträgt etwa 0,14molar NaCl. Diese Reaktionsprodukte haben daher nur eine begrenzte Unlöslichkeit und kommen als solche nicht für die erste Schicht der als synthetische Haut verwendbaren mehrschichtigen Membranen in Betracht.

Während die oben beschriebene Mitfällungsmethode bevorzugt wird, können Kollagen und Mucopolysaccharide auch in anderer Weise umgesetzt werden. Das wesentliche Erfordernis ist, daß die beiden Stoffe unter solchen Bedingungen innig miteinander in Berührung gebracht werden, daß sich die Mucopolysaccharide an die Kollagenketten binden können. Eine andere geeignete Methode ist das Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid, indem man z. B. aus Kollagen hergestellte Erzeugnisse, wie Blätter, Folien und Röhren, in eine Lösung des Mucopolysaccharids eintaucht. Eine geeignete Abänderung des letztgenannten Verfahrens besteht darin, daß man zuerst ein Erzeugnis, wie ein Blatt, eine Folie oder eine Röhre, das aus einem anderen Material als Kollagen, wie z. B. aus einem synthetischen, natürlichen oder modifizierten natürlichen Polymeren, besteht, mit Kollagen beschichtet und das mit Kollagen beschichtete Erzeugnis (Blatt, Folie, Röhre usw.) dann in die Mucopolysaccharidlösung eintaucht. Eine noch andere geeignete Methode besteht darin, das Kollagen mit den Mucopolysacchariden, beide in Form von trockenem Pulver, innig zu mischen.

Der Fachmann auf dem Gebiete der Herstellung von Folien, Filmen, Röhren und anderen Formkörpern nach Methoden, die in der Kunststoff-, Elastomer- und Textilindustrie bekannt sind, versteht ohne weiteres, daß das, wie oben beschrieben, hergestellte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt sich nach diesen Methoden ebenfalls zu Folien, Filmen, Röhren und sonstigen Formkörpern verformen läßt.

Um eine bedeutende Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen die Kollagenresorption zu erzielen, müssen mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid an die Kollagenketten gebunden sein. Die u'jere Grenze richtet sich nach den an dem Kollagen fur die Bindung des Muccpolysaccharids zur Verfugung stehenden Stellen. Für Verbundprodukte, bei denen das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist, sind Mucopolysaccharidgehalte von etwa 28 Gewichtsprozent erzielt worden; mit Hyaluronsäure andererseits ist als obere Grenze etwa 25% erzielt worden.

Die Umsetzung mit den Mucopolysacchariden verleiht dem Kollagen auch eine weitere wertvolle Eigenschaft, nämlich die Unfähigkeit, bei einem Wirtstier eine Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) hervorzurufen. Um Kollagen in ein Material überzufuhren, welches nach dem Implantieren nicht als Fremdkörper erkannt wird, muß das Kollagen mit mindestens etwa 1 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid umgesetzt werden.

Der Unlöslichkeitsgrad der Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte kann durch Vernetzung nach Wunsch erhöht werden. Allgemein eignet sich für die Vernetzung dieser Verbundprodukte jede Vernetzungsmethode, die sich auch zum Vernetzen von Kollagen eignet. Durch die Vernetzung wird die Auflösung des Mucopolysaccharids in wäßrigen Lösungen verhindert, wodurch diese Stoffe für chirurgische Prothesen usw. geeignet werden.

Die Vernetzung hat auch noch eine andere wichtige Aufgabe, indem sie die Widerstandsfähigkeit dieser Stoffe gegen Resorption erhöht. Die genaue Funktion der Vernetzung in dieser Beziehung ist noch nicht bekannt; es M) kann jedoch sein, daß die Mucopolysaccharideinheiten durch die Vernetzung fest an Stellen auf der Kallagenkette gebunden werden, die normalerweise von Kollagenase angegriffen werden.

Es wurde gefunden, daß die vernetzten Verbundprodukte ein M_c (Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen Vemetzungsstellen) zwischen etwa 800 und 60 000 aufweisen sollen. Stoffe mit M,.-Werten unter etwa 800 oder über 60 000 zeigen eine bedeutende Verschlechterung ihrer mechanischen Eigenschaften. Verbundprodukte mit einem M_c zwischen etwa 5000 und 10 000 haben offenbar die beste Kombination von mechanischen Eigenschaften und werden daher bevorzugt.

Die Vernetzung kann nach vielen Methoden erfolgen, die in die allgemeinen Kategorien der chemischen Ver-

netzung, der Strahlungsvernetzung und der dehydrothennischen Vernetzung fallen. Eiu Vorteil der meisten, hier in Betracht gezogenen Vernetzungsmethoden einschließlich der Vernetzung durch Glutaraldehyd und der dehydrothennischen Vernetzung ist der, daß dabei auch das Bakterienwachstum auf diesen Stoffen vernichtet wird. Die Verbundprodukte werden also bei ihrer Vernetzung gleichzeitig sterilisiert,

Eine geeignete chemische Vernetzungsmethode für Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte ist die Aldehydvemetrung. Bei diesem Verfahren werden die Stoffe in wäßriger Lösung mit Aldehyden behandelt, die als Vernetzungsmittel wirken. Geeignete Aldehyde sind z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal. Der bevorzugte Aldehyd ist Glutaraldehyd, weil er die gewünschte Vernetzungsdichte schneller liefert als andere Aldehyde und außerdem imstande ist, die Vernetzungsdichte auf einen verhältnismäßig hohen Wert zu erhöhen.

Nicht-umgesetzte Aldehyde sollen aus den Kollagen-Mucopolysaccharidprodukten entfernt werden, da restliche Aldehydmengen recht toxisch wirken. Wenn man die Verbundprodukte in Aldehydlösungen taucht, kommt es, wie gefunden wurde, zum teilweisen Entzug der Polysaccharidkomponente durch Auflösung, wodurch der Gehalt des Endprodukts an Polysaccharid vermindert wird. Andere geeignete chemische Methoden sind die Carbodiimidkupplung, die Azidkupplung und die Diisocya natvernetzung.

Die bevorzugte Vernetzungsmethode wird hier als dehydrothermisches Verfahren bezeichnet Bei der dehydrothennischen Vernetzung braucht kein besonderes Vernetzungsmittel zugesetzt zu werden. Das Verfahren beruht auf dem Entzug eines großen Prozentsatzes des Wassers aus dem zu vernetzenden Produkt Die Menge an Wasser, die entzogen werden muß, richtet sich nach vielen Faktoren; allgemein muß jedoch eine ausrei chende Menge Wasser entzogen werden, um die gewünschte Vernetzungsdichte zu erreichen. So kann man das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt der Einwirkung erhöhter Temperatur und/oder von Vakuum unterwerfen, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf äußerst geringe Werte vermindert worden ist Wenn kein Vakuum zu Hilfe genommen wird, können Temperaturen über gtwa 80⁰C und vorzugsweise über 90⁰C angewandt werden. Bei 23°C eignet sich ein Vakuum von mindestens etwa 10~⁵ mm Quecksilbersäule und vorzugsweise weniger als 1CT⁶ mm Quecksilbersäule. Erhöhte Temperatur und Vakuum können auch gemeinsam angewandt werden, und dies ist die vorteilhafteste und daher bevorzugte Methode. Bei einem Vakuum von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule arbeitet man vorzugsweise bei Temperaturen von mindestens etwa 35°C. Im allgemeinen werden die Stoffe der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und Vakuum ausgesetzt, bis der gewünschte Grad von Unlöslichkeit erreicht ist Je höher die Temperatur ist, desto geringer ist das Vakuum, das erforderlich ist, um eine gegebene Vernetzungsdichte zu erzielen, und umgekehrt Ein typisches Vernetzungsverfahren zur Erreichung eines M_c zwischen etwa 5000 und 10 000 besteht darin, daß man das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt 24 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 95°C und eines Vakuum von 0,01 mm Hg unterwirft. Dieses dehydrothermische Vernetzungsverfahren vermeidet gewisse Nachteile der Aldehydvernetzungsmethode und führt zur Bildung von Verb'judprodukten, bei denen verhältnismäßig große Mengen von

Mucopolysaccharid fest an die Kollagenkette gebunden sind.

Der Mechanismus, nach dem die dehydrothermische Vernetzung verläuft, ist noch nicht genau bekannt. Es kann sich um eine Ämidkondensation handein, an der ^Aminogruppen des Küüägens und Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt sind, es kann sich um eine Veresterung handeln, an der Carboxylgruppen des Kollagens und Hydroxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt sind, oder es kann sich um eine Veresterung der Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids mit den Hydroxylgruppen des Kollagens handeln. Möglicherweise finden alle drei Arten von Reaktionen zu einem gewissen Ausmaß statt Eine genauere Beschreibung der dehydrothennischen Vernetzung geben I. V. Yannas und A. V. Tobolsky in der Arbeit »Crosslinking of Gelatin by Dehydration«, »Nature«, Band 215, Nr. 5100, Seite 509-510, 29. Juli 1967. Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte sind im einzelnen in der DE-OS 26 31908 beschrieben.

Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte können derart synthetisiert werden, daß sie alle Eigenschaften, die für die erste Schicht wesentlich sind, und außerdem viele, wenn nicht alle derjenigen Eigenschaften aufweisen, die für die erste Schicht erwünscht sind. Die Immunogenität von, wie oben beschrieben, hergestellten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundproduk ten ist zu vernachlässigen, was aus den nachstehend beschriebenen Implantations- und Transplantationsversu chen an Meerschweinchen hervorgeht. Wenn diese Stoffe subkutan implantiert oder anstelle von Hauttransplantaten verwendet werden, verursachen sie in dem Wirtsgewebe eine gelinde Entzündungsreaktion, die sich in einigen polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten äußert. Typischerweise werden Lymphozyten weder im Inneren dieser Implantate oder Transplantate noch in dem sie umgebenden Gewebe festgestellt. Häufig ist beobachtet worden, daß eine Kollagenfasersynthese an der Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Wirtsgewebe stattfindet, wobei es zur Bildung von Faserbrücken zwischen den benachbarten Oberflächen und einer sich daraus ergebenden mechanischen Verankerung des Implantats an dem Wirtsgewebe kommt. Die KoI-lagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte besitzen daher nicht nur eine sehr schwache Immunogenität, sondern scheinen außerdem Medien zu sein, die die Bindegewebszellenwanderung und Kollagensynthese begün- stigen.

Um ein Maß für die Widerstandsfähigkeit der Verbundprodukte gegen enzymatischen Abbau in vitro zu gewinnen, wurde eine mechanochemische Methode angewandt. Nach dieser Methode wird das Verbundprodukt in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase bis zu einem bestimmten Grad gedehnt und die Entspannungsgeschwindigkeit der auf das Material einwirkenden Kraft gemessen. Bei Verwendung von bakterieller KoI- lagenase wurde immer eine Abnahme der Kraft mit der Zeit beobachtet. Die negative Steigung der linearen Kurve, die den Logarithmus der Kraft in Abhängigkeit von der Zeit (l/r) darstellt, dient als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues. Die Methode liefert Daten für Kollagenfasern, die mit anderen, durch subkutane Implantation in Meerschweinchen erhaltenen bekannten Daten übereinstimmen; vgl.

I. V. Yannas, J. F. Burke, C. Huang und P. L. Gordon: »Correlation of In Vivo Collagen Degradation Rate With In Vivo Measurements«, »J. Biomed. Materials Research«, im Druck, 1975. Nach dieser Methode wurde gefunden, daß der enzymatische Abbau von Kollagen durch vernetzte Verbundprodukte, bei denen das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe enthält, stark gehemmt wird. Dieser Befund stimmt sehr gut mit in vivo-Untersuchungen an Meerschweinchen überein.

Für die erste Schicht besonders bevorzugte Werkstoffe sind vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die etwa 6 bis 15% sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthalten und bis auf einen Af₁.-Wert zwischen etwa 5000 und 10 000 vernetzt sind. Chondroitin-6-sulfat bildet besonders hervorragende Verbundstoffe.

Wie oben erwähnt, enthalten die mehrschichtigen Membranen noch eine zweite Schicht, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeil der Gesamtmembran zu steuern, wie es in der Abbildung dargestellt ist. to

Aus normaler, unverletzter menschlicher Haut (Unterarm) fließt Feuchtigkeit mit Geschwindigkeiten in der Größenordnung von 0,5 mg/cm'/h; vgl. D. Spruit und K E. Malten, »Dermatologica«, 132,115 (1966). Nach dem Entfernen des Stratum corneum (und möglicherweise eines Teils des Stratum granulosum) durch »Abziehen« mit Klebband steigt der Feuchtigkeitsverlust um das 100- bis 200fache auf 60 bis 100 mg/cm²/h an. Dieser Wert ist der Verdampfungsgeschwindigkeit aus einer freien Wasseroberfläche vergleichbar, die unter den obigen Bedingungen gleichwertigen Versuchsbedingungen 85 mg/cm²/h beträgt; vgl. D. Spruit, »Dermatologica«, 141, 54 (1970).

Offensichtlich ist also das Stratum corneum die Hauptsperrschicht der Haut gegen Wasserverlust, da ihr? y.ntfernung zu einer Wasserverlustgeschwindigkeit fuhrt, die nahezu ebenso groß ist wie diejenige von einer freien Wasseroberfläche. Der Wirkungsgrad dieser Feuchtigkeitssperrschicht ist unabhängig von der Richtung der Wasserströmung; denn es wurde (unter Verwendung von tritiumhaltigem Wasser) bewiesen, daß die Geschwindigkeit des Durchdringens von flüssigem Wasser durch die Unterarmhaut 0,6 mg/cm²/h beträgt, wenn das Wasser auf die Außenseite der Haut aufgebracht wird; vgl. A. M. Downes, T. M. Sweeney und A. G. Matoltsy, »J. Invest. Derm.«, 49,230 (1967).

Zum Aufbau einer als künstliche Haut verwendbaren Membran muß man sich bemühen, in Material zu fmden, das den gleichen Feuchtigkeitsdurchlässigkeitswert hat wie normale Haut. Wenn die normalen Durchlässigkeitsgeschwindigkeitswerte überschritten werden, wird das Wirtsgewebe in der Nachbarschaft des Transplantats sowie das Transplantat selbst dehydratisiert; wenn andererseits viel geringere Durchlässigkeitsgeschwindigkeiten vorherrschen, kann es zum Ödem kommen. Diese Erwägungen gelten natürlich nur unter Bedingungen des innigen Kontakts zwischen Transplantat und Wirtsgewebe; sollten sich an der Grenzfläche wesentliche Lufteinschlösse bilden, so können bedeutende Feuchtigkeitsmengen von dem Wirtsgewebe an die Atmosphäre entweichen, ohne durch das Transplantat hindurchzugehen.

Daher wird die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem Werkstoff hergestellt, der eine Feurhtigkeitsdurchlässigkeitje Flächeneinheit der Gesamtmembran von mindestens etwa 0,1 bis 1 mg/cm²/h ergibt Vorzugsweise beträgt die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit je Flächeneinheit etwa 0,3 bis 0,5 mg/cm²/h, was ungefähr dem Bereich der Durchlässigkeit menschlicher Unterarmhaut entspricht. Diese Werte erzielt man durch entsprechende Kombination von Dicke und WäSscfdiifchmssigkeii.

Die andere wesentliche Eigenschaft dieser Schicht ist die, daß sie nicht-toxisch sein muß. Der Werkstoff soll keine toxischen Stoffe enthalten, die aus der Schicht in die mit dem mehrschichtigen Membrantransplantat in Berührung stehenden Gewebe diffundieren oder aus der Schicht extrahiert werden können. Ferner soll der Werkstoff gegen den enzymatischen Abbau oder sonstigen auf einer Berührung mit anderen Schichten der Membran oder mit Gewebe beruhenden Abbau widerstandsfähig sein, der zur Bildung von Stoffen führen könnte, die für das benachbarte Gewebe toxisch sind.

Ebenso wie die erste Schicht soll auch die Schicht, die in erster Linie die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuert, noch andere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen. So ist es wünschenswert, daß die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht an der nassen Oberfläche der ersten Schicht mit einer Bindungsscherfestigkeit von mindestens etwa 0,7 und vorzugsweise etwa 7 kg/cm² anhaftet. Ebenso ist es wünschenswert, daß sie einen Young'schen Modul im Bereich von etwa 7 bis 70 kg/cm², eine Bruchfestigkeit von etwa 7 bis 70 kg/cm² und eine Bruchdehnung von etwa 20 bis 100% aufweist.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht sterilisationi/ähig ist, d. h. physikalischen oder chemischen Behandlungen unterworfen werden kann, durch die Bakterien oder Bakteriensporen an der Oberfläche abgetötet werden. Geeignete Steriiisierungsmetnoden sind trockene Wärme, Einwirkung von Äthylenoxid, Bestrahlung, Eintauchen in Glutaraldehydlösung usw.

Es isi auch wünschenswert, daß der Werkstoff der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht, wenn er in flüssiger oder halbflüssiger Form auf die erste Schicht aufgetragen wird, in die erste Schicht zu nicht mehr als etwa 20 Gewichtsprozent der fertigen, halbfesten oder festen gehärteten Form der ersten Schicht eindringt. Ein weiteres Eindringen ist schädlich, weil die Porosität der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht dadurch beträchtlich abnehmen und infolgedessen der Feuchtigkeitsdurchtritt durch die letztgenannte Schicht und die sich in ihr abspielenden Wiederherstellungsvorgänge, wie das Einwachsen von Gewebe, Gefäßbildung usw., behindert werden würden. t>o

Schließlich ist es auch erwünscht, daß die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht Widerstandsfähigkeit gegen jeden Abbauprozeß aufweist, der durch die Nähe oder den Kontakt dieser Schicht mit angrenzenden Schichten oder Gewebe hervorgerufen wird und zu einer bedeutenden Beeinträchtigung der oben erwähnten biologischen, mechanischen und chemischen Eigenschaften führen würde.

Gewisse synthetische polymere Stoffe genügen den wesentlichen und auch vielen der erwünschten Eigenschäften der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht. Zu diesen gehören Siliconpolymere, wie »Silastic Medical Adhesive« (Dow Corning), ein Gemisch aus einem Siliconpolymeren mit endständigen Hydroxylgruppen und Methyltriäthoxysilan, das unter dem Einfluß von Feuchtigkeit zu einer biegsamen, zähen

Schicht erhärtet, die sehr gut an den Werkstoffen der ersten Schicht, wie vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten, anhaftet, Polyacrylsäure- oder Polymethacrylsäureester oder deren Copolymere, wie der aus einem Copolymerisat aus Acrylsäureäthylester und Acrylsäure gebildete Acrylkautschuklatex, der auf den Werkstoffen der ersten Schicht einen biegsamen Film bildet und Carboxylgruppen enthält, die mit den Hydroxylgruppen der vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte unter Bildung starker Bindungen reagieren, Polyurethane, wie ein Reaktionsprodukt von überschüssigem Toluylendiisocyanat mit einem Gemisch aus Diolen und Triolen, welches ein reaktionsfreudiges, unter der Einwirkung von Feuchtigkeit aushärtendes Prepolymeres darstellt, das imstande ist, auf vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten eine elastomere Schicht zu bilden, und das chemische Gruppen aufweist, die niit Aminogruppen oder Hydroxylgruppen

ίο solcher Verbundprodukte reagieren. Der Fachmann ist imstande, durch Routineversuche andere StoJe zu ermitteln, die sich als Werkstoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht eignen.

Ein Siliconpolymeres wird für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht bevorzugt. Es ist als nicht-toxisches Produkt in einem sorgfältig gesteuerten medizinischen Gütegrad erhältlich. Sein Fließvermögen ist von thixotroper Art, so daß es sich gleichmäßig mit der Rakel auf die Oberfläche der Schicht aus dem KoI- lagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt mit einer gesteuerten Eindringtiefe in die letztgenannte Schicht auftragen läßt. Die Härtung kann bei 100% relativer Feuchte erfolgen, wodurch die Dehydratisierung der unteren, aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehenden Schicht und die Verformung des mehrschichtigen Gebildes verhindert wird. Das Siliconpolymere erhärtet durch Umsetzung mit Hydroxylgruppen, und da die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehende Schicht Hydroxylgruppen enthält, können sich genügend kovalente Bindungen zwischen den Schichten bilden, so daß diese zufriedenstellend aneinander anhaften und kein Klebstoff erforderlich ist, um die Siliconpolymerschicht an die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehende Schicht zu binden.

Mehrschichtige Membranen können auch unter Verwendung eines unter der Einwirkung von Feuchtigkeit aushärtenden Siliconelastomeren als Bindemittel zwischen der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht und einem anderen Material hergestellt werden. Durch Aufbringen eines dünnen (0,025 bis 0,05 mm dicken) Films auf einen Film aus synthetischen Polymeren, wie den segmentierten Polyurethanen, Methacrylsäurehydroxyäthylester oder anderen »Hydrogelen«, Polyethylenterephthalat oder Polytetrafluoräthylen, oder aus modifizierten natürlichen Polymeren, wie Celluloseacetat, oder aus natürlichen Polymeren, wie Elastin (dem faserförmigen, unlöslichen, nicht-kollagenartigen Protein, das in Bindegewebe, wie der Brustaorta und dem Nackenband, vorkommt), kann man ein mehrschichtiges Verbundprodukt durch 16- bis 24stündiges Aushärten bei Raumtemperatur und 100% relativer Feuchte erhalten.

Wenn eine aechanische Verstärkung erwünscht ist, kann man eine Schicht aus Gaze oder anderem Textilstoff oder Netzwerk verwenden. Baumwolle oder ein sonstiges Textilnetzwerk kann als Verstärkungsmaterial eingelagert werden, indem man den Textilstoff über das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt legt und über dem Textilnetzwerk auf die Obe-rfläche der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht mit der Rakel das »Silastic«- Silicon aufträgt. Durch Aushärten über Nacht (16 bis 24 Stunden) bei Raumtemperatur und 100% relativer Feuchte kann man einen verstärkten Schichtstoff erhalten, der etwas steifer ist als ein Schichtstoff ohne das Textilnetzwerk, aber eine wesentlich verbesserte Zugfestigkeit aufweist.
Die Dicke der synthetischen Haut steht zu den folgenden Parametern in Beziehung:

(1) der Dicke der zu ersetzenden Haut,

(2) der Art und den Abmessungen der Wunde,

(3) der Dicke der zur Steuerung der Feuchtigkeit^durchlässigkeit erforderlichen Deckschicht und

(4) der Beziehung zwischen Nähbarkeit und Dicke.

Im Falle von Meerschweinchenhaut von voller Dicke beträgt die mittlere Dicke der ausgeschnittenen Haut 0,64 bis 0,75 mm. Schichtstoffe zum Ersatz von Meerschweinchenhaut weisen eine Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat von einer Dicke von 0,38 mm und eine Schicht aus dem Siliconpolymeren von einer Dicke von 0,13 mm auf. Diese Kombination liefert die gleiche Feuchtigkeitsdurchtrittsgeschwindigkeit wie Meerschwein-

so chenhaut und läßt sich bei Transplantationsversuchen leicht an den Umfang des Wundbettes annähen.

Die niedrigste erreichbare Grenze der Dicke der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht hängt von der Teilchengröße der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte ab und liegt typischerweise im Bereich von 0,04 bis 0,05 mm. Die obere Grenze der Dicke richtet sich nach der beabsichtigten Anwendungsart, und in der Praxis sind unbegrenzt große Dicken verfügbar, deren Größe von der Menge der Dispersion abhängt, die auf einer gegebenen Filterfläche abfiltriert wird. Nach dem hier beschriebenen Verfahren lassen sich Dicken von 2,5 bis 5 mm leicht erreichen; jedoch werden für die Anwendung als Hautersatz Dicken im Bereich von 0,64 bis 2,5 mm bevorzugt.

Andererseits wird die Dicke der Deckschicht von der gewünschten Feuchtigkeitsdurchlässigkeit und Wasserdampfdurchlässigkeit des Polymeren bestimmt, das zur Herstellung der Deckschicht verwendet wird. Im Falle von »Silastic Medical Grade«-Silicon besteht eine typische mehrschichtige künstliche Haut von dem gewünschten Bereich der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit aus einem 0,13 mm dicken Siliconfilm, der auf eine 0,38 mm dicke Schicht aus Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt aufgetragen ist. Wenn man Polymere mit niedrigen Wasserdampfdurchtrittsgeschwindigkeiten verwendet, muß die Dicke der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht entsprechend verringert werden.

Die hier beschriebenen mehrschichtigen Membranen eignen sich als Verbände zur Behandlung von Brand-, Schnitt-, Riß-, Schürfwunden und anderen ähnlichen Zuständen, bei denen Verletzung oder Zerstörung von Haut durch mechanische, thermische, chemische oder sonstige äußere Schädigung durch örtliche oder allgemeine Krankheiten gegeben ist. Die Membranen selbst können auch als künstliche Transplantate verwendet

werden, in welchem Falle sie die Funktionen von normaler Haut ersetzen und eine Schablone für die Zsllenregenerierung bilden.

Beispiel 1

5 Herstellung von Kollagendispersionen und Mucopolysaccharidlösungen

Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen wurde hergestellt, indem gekalkte Kalbshäute in Streifen von 9,5 mm Breite und dann zu dünnen Stücken zerschnitten wurden. Diese dünnen Hautstüc!:e wurden mit 3 Teilen Wasser behandelt, die 0,3% Propionsäure und 0,1% Benzoesäure enthielten. Nach 4 Stunden hatte sich ein Gleichgewicht eingestellt, und die Lösung hatte einen pH-Wert von ungefähr 5,3. Die Kollagenaufschlämmung wurde von dem Wasser getrennt und mit Hilfe eines zentrifugal wirkenden Schneid- und Mahlgeräts zu Produkten von unterschiedlichen Teilchengrößen und Strukturen vermählen. Die Kalbshautkollagenaufschlämmung (Gewichtsverhältnis von Wasser zu Haut 1:1) hatte einen Gelatinegehait von etwa 2%. Ferner enthielt sie 0,41% Calcium und 0,041% Magnesium. Physikalisch bestand die Aufschlämmung aus hochgradig verschlungenen Fibrillenaggregaten.

Die Kalbshautkollagenaufscbläminung wurde durch wiederholte Ausfällung aus einer trüben Dispersion in 0,05molarer Essigsäure mit 0,2molarer Mononatriumphosphatlösung (NaH₂PO₄) gereinigt. Nach, dem Reinigen wurde das Kollagen in 0,05molarer Essigsäure oder in einer Citronensäure-Pufferlösung von einem pH-Wert von 3,2 (O.lmolare Citronensäure, O^molares Mononatriumphosphat) dispergiert Die Dispersion wurde gründl ich in einem Waring-Mischer homogenisiert, bis die Extinktion einer 0,3 g Kollagen je 100 ml enthaltenden Dispersion bei 440 πΐμ, bestimmt mit einem Spektrophotomete-r (Coleman Junior IIA, Maywood, Illinois), 0.5 betrug. Die so erhaltenen Kollagendispersionen w^den bis zur Weiterverarbeitung bei 4°C gelagert.

Mucopolysaccharidlösungen wurden aus Natriumheparin, Hyaluronsäure bzw. Chondroitin-6-sulfat hergestellt. Das Natriumheparin, aus Schweinedarmschleimhaut gewonnen, mit 143 U. S. P.-Aktivitätseinheiteu je mg wurde von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. Die Hyaluronsäure wurde aus Hahnenkamm nach der von D. A. Swann in »Biochim. Biophys. Acta«, ϊ56,17 (1968), beschriebenen Methode hergestellt. Die so erhaltene Hyaluronsäure enthielt 47,1% Hexuronsäure und 42,6% Hexosamin.

Chondroitin-4-sulfat aus Rindernasenknorpel wurde nach der Methode hergestellt, die von L. Roden, J. R. Baker, J. A. Cifonelli und M. B. Mathews in »Methods of Enzymology«, herausgegeben von V. Ginsburg, Band 28 B, Verlag Academic Press, New York, Seite 73, beschrieben ist. Heparansulfat und Dermatansulfat wurden aus Schweineschleimhautgewebe extrahiert und nach den Methoden gereinigt, die von J. A. Ciforelli und L. Roden in »Biochemical Preparations«, 12, 12 (196S), beschrieben sind.

Chondroitin-6-sulfat, gewonnen aus Haifischknorpel - Gütegrad B, wurde von Calbiochem, San Diego, California, erhalten. Es enthielt 2,66% Stickstoff, 37,2% Glucuronsäure und 5,61% Feuchtigkeit.

Heparin, Hyaluronsäure, Chondroitin-4-sulfat, Heparansulfat, Dermatansulfat und Chondroitin-6-sulfat wurden in einer Konzentration von 1 g je 100 ml in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) gelöst. Die _ Mucopolysaccharidlösungen wurden bei 4°C aufbewahrt. I

Beispiel 2

Herstellung von gemeinsamen Niederschlägen aus Kollagen und Heparin sowie aus Kollagen

und Hyaluronsäure

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml 0,05molarer Essigsäure wurde bei 23°C mit einem Polytttrafluoräthyienrührer gründlich gerührt. Während des Mischens der Dispersion wurde Heparin bzw. Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 g je 100 ml 0,05molarer Essigsäure aus einer Bürette mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/sec zugetropft. Beim Zusatz des Mucopolysaccharide wurde das Kollagen in Form einer verschlungenen Masse aus mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfibrillen mitgefällt, die einem Garnknäuel ähnelte. Sobald 90 Gewichtsprozent Kollagen mit 10 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid in dieser Weise gemeinsam ausgefällt worden waren, zeigte eine systematische Massenbilanz, daß 95% des ursprünglichen Mucopolysaccharids mitgefällt worden waren.

Nach der gemeinsamen Ausfällung wurde die verschlungene Fibrillenmasse im Waring-Mischer homogenisiert, bis die Fibrillen etwa 1 mm lang waren. Das Gemisch aus Fibrillen in 0,05molarer Essigsäure trennte sich, wenn es länger als 5 Minuten ruhig stehengelassen wurde, in zwei Phasen, weswegen es vor dem Filtrieren gemischt werden mußte. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Dispersion wurde durch eine Nutsche, auf der sich ein Filterpapier von Schleicher und Schuell (Keene, New Hampshire) Nr. 576 befand, abgesaugt. Der gemeinsame Niederschlag wurde unter atmosphärischen Bedingungen dehydratisieren gelassen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 20 Gewichtsprozent betrug. Mt

Beispiel 3
Herstellung von gemeinsamen Ausfällungen von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) wurde bei 23°C mit einer 1 g Chondrokin-6-sulfatje 100 ml Pufferlösung (pH 3,2) von 23°C gemeinsam ausgefällt. DerNiedcr-

zo ΰ ι y\jy

schlag wurde gemäß Beispiel 2 homogenisiert, nitriert und an der Atmosphäre trocknen gelassen.

Beispiel 4

Aldehydvernetzung eines KoIlagen-Chondroitin-6-sultat-Verbundprodukts

Die nach Beispiel 3 hergestellte gemeinsame Ausfällung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat wurde durch Eintauchen in eine 0,02molare Lösung von Glutaraldehyd vernetzt. Durch diese Behandlung wurde ein Bruchteil

ίο der Polysaccharidkomponente auf den Kollagenfibrillen oder -molekülen immobilisiert. Die Vernetzung machte sich darin bemerkbar, daß es nicht gelang, das Polysaccharid aus dem mit dem Aldehyd behandelten Film durch längeres Auswaschen mit einer Phosphatpufferlösung, die 0,4molar an Natriumchlorid war und einen pH-Wert von 7,4 aufwies, und die als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, zu entfernen. Nicht-umgesetzter Aldehyd wurde durch Behandeln mit einer Lösung von 5,5-Dimethylcyclohexandion-(l,3) (Dimedon) entfernt. Nach dem Verdampfen des Wassers hinterblieb ein Film, der bis etwa 10 Gewichtsprozent Polysaccharid enthielt.

Beispiel 5

Dehydrothermische Vernetzung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat

Das Produkt des Beispiels 3 wurde in einem Vakuumofen 48 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 115°C und eines Vakuums von mindestens 0,3 mm Hg ausgesetzt. Nach dieser Behandlung ließen sich weniger :5 als 10 Gewichtsprozent des ursprünglich in den Film eingelagerten Polysaccharide durch 48stündiges Eintauchen in destilliertes Wasser, welches als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, entfernen.

Beispiel 6

Hexosaminanalyse und Molekulargewicht zwischen den Vemetzungsstellen

Da Mucopolysaccharide hexosaminhaltige Polymere sind, steht der Hexosamingehalt in direkter Beziehung zu der Menge des jeweiligen Mucopolysaccharids in einem Verbundprodukt. Sobald erst einmal die Beziehung zwischen dem Hexosamingehalt und dem Gewicht für ein jedes Mucopolysaccharid festgestellt worden ist, ist die Bestimmung einfach. Die Analyse ist im einzelnen in der Doktorarbeit von C. Huang, Mech. Eng. Dept., M 1. T., Cambridge, Massachusetts, Kapitel 3,4 (1974), beschrieben. Die Methode kann folgendermaßen zusammengefaßt werden: Eine bekannte Gewichtsmenge des 48 Stunden bei i05⁼C im Vakuum geifockneten Verbundprodukts wird in eine 5 ml fassende Ampulle eingebracht und mit J ml 8molarer Salzsäure versetzt. Die Ampulle wird evakuiert, dann mit Stickstoff gespült und unter Vakuum zugeschmolzen. Die Hydrolyse beginnt, wenn die Ampulle in einen Ofen mit Luftumlauf bei 95⁰C eingesetzt wird. Nach 4stündigem Verweilen bei 95°C wird die Ampulle mit Leitungswasser auf 10⁰C gekühlt. Dann wird der Inhalt bei 40°C zur Trockne eingedampft, bis nur noch trockenes Hydrolysat hinterbleibt. Das Hydrolysat wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von etwa 50 bis 150 mg Mucopolysaccharid je ml Wasser gelöst. 1 ml der Hydrolysatlösung wird zu 1 ml einer 8volumprozentigen Lösung von Acetylaceton in 1 molarer Natriumcarbonatlösung zugesetzt. Bei lstündigem Erhitzen auf 95°C reagiert das in dem Hydrolysat enthaltene Hexosamin mit dem Acetylaceton in alkalischer Lösung unter Bildung von Pyrrolderivaten. Nach dem Kühlen der Lösung auf 10⁰C setzt man 5 ml 95prozentiges Äthanol und 1 ml Ehrlichsches Reagens [hergestellt durch Lösen von 1,33 g p-Dimethylaminobenzaldehyd (DAB) in 50 ml 6molarer Salzsäure und Zusatz von 50 ml 95prozentigem Äthanol] zu und mischt dann gründlich. Die Reaktion zwischen dem DAB und den Pyrrolderivaten führt zur Bildung eines Chromophors, welches dem Produkt eine intensive rote Farbe verleiht. Nach 2stündigem Stehenlassen der Mischung wirr* 4ie Extinktion bei 527 πΐμ gegen eine Reagens-Leerprobe mit Hilfe eines Coleman Junior II A-Spektrophotometers gemessen. Die Ergebnisse der Analyse werden mit genormten Eichkurven für ein jedes Mucopolysaccharid verglichen.

Die Ergebnisse der Hexosaminanalyse verschiedener vernetzter Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die nach den Verfahren der vorhergehenden Beispiele hergestellt worden sind, finden sich in Tabelle I. Der Mucopolysaccharidgehalt vor dem Vernetzen betrug fürjedes in Tabelle I aufgeführte Verbundprodukt etwa 10%. Offenbar sind während des Vernetzens mit Glutaraldehyd und beim nachfolgenden Waschen große Mengen an Mucopolysaccharid verlorengegangen. Dies bedeutet, daß die Löslichkeit der unvernetzten Mucopolysaccharide in der wäßrigen Glutaraldehydlösung, in die sie zum Zwecke der Vernetzung eingetaucht werden, hoch ist. Bei der dehydrothermischen Vernetzung wurden nur höchstens 10% Mucopolysaccharid ausgewaschen, während bei der Vernetzung mit Glutaraldehyd bis zu 61% ausgewaschen wurden.

Die mechanischen Eigenschaften der Verbundprodukte werden stark von der Anzahl der Vemetzungsstellen je Polymerkette beeinflußt. Das Molekulargewicht zwischen Vemetzungsstellen (M_c ) ist umgekehrt proportionai der Anzahl der Vemetzungsstellen je Volumeneinheit. Die Werte für M_c können durch Messen des Spannungs-Dehnungsverhaltens der thermisch denaturierten Koilagen-Mucopoiysaccharid-Verbundprodukte bestimmt werden. Diese Methode ist in dem Werk »The Physics of Rubber Elasticity« von L. R. G. Treloar, 2. Auflage, Verlag Clarendon Press (1958), beschrieben. Eine Zusammenfassung der Versuchsergebnisse für

j χ

verschiedene Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte findet sich in Tabelle I. Tabelle I

Material	Vernetzung	% MPS	Λ/,(±10%)
Kollagen	G (24, 7,4)	0,0	1500
Kollagen-Η	G (24, 3,2)	5,7 ± 1,2	9400
Kollagen-Η	G (48, 7,4)	5,5 ± 1,3	1200
Kollagen-Η	G (24, 3,2	4,0 ±1,0	1800
	24, 7.4)
Kollagen-H	D (48, 900C)	9,7 ± 1,0	2800
Kollagen-CS-6	G (24, 3,2)	3,9 ± 0,3	6800
Kollagen-CS-6	D (48, 9O0C)	9,6 ± 1,1	1200
Kollagen-HA	G (24, 7,4)	2,3 ± 0,4	2200
Kollagen-HA	D (48, 9O0C)	9,0 ± 0,5	2500
G = Glutaraldehyd bei	23°C (Stunden, pH)
D = dehydrothermisch	(Stunden, Temperatur)
H = Heparin
CS-6 = Chondroitin-6-sulfat
HA = Hyalutonsäure
MPS = Mucopolysaccharid

Beispiel 7
Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharide!! hergestellte Verbundprodukte Jo

Lj wurden Mucopolysaccharidlösungen durch Lösen von 40 mg des betreffenden Mucopolysaccharids in 20 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH 3,2) hergestellt. Ein Stück einer unlöslichen Kollagenfolie wurde dann zu jeder der Mucopolysaccharidlösungen zugesetzt und das Ganze auf einer konstanten Temperatur von 37°C gehalten und 24 Stunden inkubieren gelassen. Dann wurde zu der Lösung Glutaraldehyd bis zu einer Aldehyd- J5 konzentration von 0,025 Mol/l zugesetzt. Das Kollagen wurde weitere 24 Stunden in dieser Lösung belassen und dann in eine auf einem pH-Wert von 7,4 gehaltene, 0,025molare Lösung von Glutaraldehyd überfuhrt. Die letztere Verfahrensstufe wurde durchgeführt um eine wirksame Vernetzung des Kollagens zu gewährleisten. Nach 24stündigem Verbleiben in der Glutaraldehydlösung wurden die Kollagenfasern zweimal mit destilliertem Wasser gespült und in eine 0,2gewichtsprozentige Lösung von Dimedon überführt, um den Überschuß von nichtumgesetztem Aldehyd zu entfernen. Nach weiterem 24stündigem Verbleiben in der Dimedonlösung wurden die Fasern fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4°C in Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 aufgehoben. Die gewichtsprozentuale Menge von Mucopolysaccharid, die sich an das Kollagen gebunden hatte, wurde durch Hexosaminanalyse bestimmt. Das Molekulargewicht M₁. zwischen den Vernetzungsstellen wurde nach dem von R. L. G. Treloar in »The Physics of Rubber Elasticity«, 2. Auflage, Clarendon Press (1958), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle II.

Tabelle II	% MPS (±0,5)	Mc (±500)
Material	0	3800
Kollagen	11,3	4100
Kollagen-CS-6	8,7	4000
Kollagen-CS-4	8,2	4200
Kollagen-HA	8,2	3900
Kollagen-DS	8,7	3800
Kollagen-H	10,5	3800
Kollagen-KS	CS-6 = Chondroitin-6-sulfat
	CS-4 = Chondroitin-4-sulfat
HA = Hyaluronsäure
MPS = Mucopolysaccharid
DS = Dermatansulfat
H = Heparin
KS = Keratansulfat

ί.\3 J

Beispiel 8

Enzymatischer Abbau von durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid hergestellten

Verbundprodukten
5

Es wurde eine Untersuchung des enzymatischen Abbaues von nach Beispiel 7 durch Beschichten von Kollagenfasern mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbundprodukten durchgerührt. Die mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfolien wurden in Bandform in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase (40 Einheiten je ml) um 4,0 n: 0,5% gedehnt, und die auf das Band ausgeübte Kraft als Funktion der Zeit registriert. Es wurde gefunden, daß die Kraft durch eine einzige negative Exponentialgröße der Zeit dargestellt werden kann und daher ein Diagramm der Abhängigkeit des Logarithmus der Kraft von der Zeit eine gerade Linie ergibt. Die Steigung der Geraden ergibt l/r, einen Wert, der als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues des Kollagens durch Kollagenase verwendet wird. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle III.

Tabelle 111

Material % MPS (±0,5) l/r x 10⁴ (±0,07)

(min"¹)

Kollagen	0	8,48
Kollagen-CS-6	11,3	1,46
Kollagen-CS-4	8,7	0,88
Kollagen-HA	8,2	5,38
Kollagen-DS	8,2	0,90
Kollagen-H	8,7	0,98
Kollagen-KS	10,5	1,10

Beispiel 9

Enzymatischer Abbau von durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat

hergestellten Verbundprodukten

Nach dem Verfahren des Beispiels 4 aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte wurden auf ihre Anfälligkeit für den Abbau durch Kollagenase untersucht. Hierbei wurde die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Methode mit dem Unterschied angewandt, daß der Dehnungsgrad 20 ± 2% betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Beispiel 10
Mechanische Eigenschaften von vernetzten KoUagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten

Die mechanische Untersuchung erfolgte mit einem Instron-Zugfestigkeitsprüfgerät unter Verwendung einer Belastungszelle vom Typ B. Von jedem zu untersuchenden Material wurden hanteiförmige Proben von 6,35 mm Breite und 0,25 mm Dicke hergestellt. Das obere Ende einer jeden Probe wurde an der Belastungszelle des Zugfestigkeitsprüfgerätes befestigt, während das untere Ende durch eine Klemmvorrichtung an der Gleitbacke befestigt wurde. Die Dehnung der Probe wurde aus der Bewegung der Gleitbacke berechnet Alle Messungen wurden bei konstanter Dehnungsgeschwindigkeit von 50%/min unter Spannung bei 37°C in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt.

% CS-6 (±0,2)	Mc(±l000)	l/r x 102 (±0,009)
		(min"1)
0	15 000	0,255
1,8	14 000	0,149
3,0	12 000	0,153
4,8	13 000	0,093
6,5	11 000	0,084
8,6	9 000	0,049
11,2	10 000	0,052
13,3	12 000	0,047
14,9	11000	0,064
16,0	14 000	0,067

rüi jedes Material wurden aus der experimentellen Spannungs-Dehnungskurve die Werte fur die Kraft je Flächeneinheit beim Bruch oder die Bruchfestigkeit (U. T. S.), die Tangente an der Spannungs-Dehnungskurve bei lprozentiger Dehnung (1%-Tangentenmodul), die Bruchdehnung (E. B.) und die zum Bruch erforderliche Arbeit (Bnicharbeit) berechnet.

Die Ergebnisse finden sich in Tabelle V.

Tabelle V	% MPS	Mc	Z (Stunden, pH)	1% Tangenten	U. T. S.,	E. B.,	Bruch
Material Vernetzung			D = dehydrothermisch (Stunden, Temperatur)	modul,			arbeit,
			MPS = Mucopolysaccharid				kg/cnr-%
			H = Heparin	kg/cm2	kg/cm2	%	±10%
	_	—	HA = Hyaluronsäure	3,5	25,2	85	14"7O
Brust-Aorta	0,0	9200	CS-6 - Chondroitin-6-sulfat	16,45 ± 3,5	26,6 ± 0,7	40 ± 10	616
Kollagen D (24, 900C	0,0	6500	Ü.T. S. = Bruchfestigkeit	35 ± 4,55	36,75 ± 4,55	45 ±5	756
Kollagen D (48, 90°C)	0,0	3800	E. B. = Bruchdehnung	66,5 ± 7	23,4 ± 3,57	15 ±2	350
Kollagen G (0,25, 7,4)	0,0	1200		126 ±14	25,13 ± 0,77	10 ± 1	133
Koilagen G (24, 7,4)	5,7 ± 1,2	9400		14,2 ± 2,1	9,1 ± 1,4	23 ±2	84
Kollagen-Η G (24, 3,2)	5,7 ± 1,2	6800		33,25 ± 4,9	11,2 + 1,4	16±2	77
Kollagen-R G (48, 3,2)	9,7 ± 1,0	2800		21 ±0,7	30,1 ± 2,8	35 ±1	371
Kollagen-Η D (48, 900C)	5,5 ± 1,2	1800		133+42	26,6 ± 3,5	14 ±3	224
Kollagen-Η G (24, 7,4)	3,9 ± 0,3	6800		24 ± 8,4	9,1 ± 0,7	21 ±2	77
Kollagen-CS-6 G (24, 3,2)	3,7 ± 0,3	5500		15,8 ± 0,7	6,44 ± 2,8	16 ±2	57,4
Kollagen-CS-6 G (48, 3,2)	3,5 ± 0,3	2500		17,7 ± 6,44	9,31 ±2,1	11 dz 3	45,5
Kollagen-CS-6 G (24, 7,4)	9,6 ±1,1	1200		49 ± 4,55	44,17 ± 1,96	20 ±1	497
Kollagen-CS-6 D (48, 900C)	9,0 ± 0,5	2500		30,1 ± 2,8	34,3 ± 4,9	20 ±1	266
Kollagen-HA D (48, 900C)
G = Glutaraldehyd bei 23°<
Beispiel 11

Erhöhte Zähigkeit auf Grund der Einlagerung von Mucopolysacchariden

Ein Vergleich von Proben aus Kollagen und aus vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten bei ähnlichem Vernetzungsgrad führt zu der Schlußfolgerung, daß die Anwesenheit des Mucopolysaccharids die Zähigkeit des Kollagens bedeutend erhöht. Beispielsweise ist die Brucharbeit für aus der vorhergehenden Tabelle ausgewählte Stoffe bei ähnlichen Vernetzungsdichten in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI	% MPS	Mc	Bruch arbeit, kg/cm2-% ±10%
Material	0,0 9,6 ± 1,1	1200 1200	133 497
Kollagen Kollagen-CS-6

Wie sich aus der Tabelle ergibt, wird durch die Einlagerung von etwa 10 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat in Kollagen die Brucharbeit von 133 auf 497 kg/cm²-% erhöht. Da die Brucharbeit bei einem Af_r-Wert von etwa 6500 maximal ist, ist es wahrscheinlich, daß ein Verbundprodukt aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat mit einem Mucopolysaccharidgehalt von 10 Gewichtsprozent und einem M_c von 6500 eine Bruchenergie von mehr als etwa 770 kg/cm²-%, der höchsten Brachenergie aufweisen könnte, die für reines Kollagen unter den Bedingungen dieser Versuche festgestellt worden ist.

Beispiel 12

Untersuchung der Widerstandsfähigkeit gegen Resorption und des Nichtauftretens von Fremdkörperreaktion

gegen die Verbundprodukte in vivo

In diesem ßeispiel wurden vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidmembranen, die einerseits durch Beschichten von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäß Beispiel 7 und andererseits durch gemeinsame Ausfallung von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäß Beispiel 2 und 3 hergestellt worden waren, subkutan in Meerschweinchen implantiert, wie nachstehend beschrieben.

ίο Die KoUagen-Mucopolysaccharidmembranen waren durch das Vernetzungsverfahren sterilisiert worden. Das Eintauchen in ein Aldehydbad (und insbesondere ein Glutaraldehydbad) für eine Zeitdauer von mehreren Stunden, wie in Beispiel 4 beschrieben, ist eine bekannte Methode zum chemischen Sterilisieren verschiedener Stoffe vor dem Implantieren oder sonstigen chirurgischen Verfahren. Ferner ist bekannt, daß die mehrstündige Einwirkung von Temperaturen über 100⁰C eine andere Methode zum Sterilisieren von Stoffen ist, die implan-

;5 tiert oder anderweitig in der Chirurgie verwendet werden sollen. Wenn andererseits die Stoffe längere Zeit vor dem Implantieren hergestellt worden sind, sollen sie vorzugsweise unmittelbar vor dem Implantieren durch 24StOnUSeS Eintauchen in ein Gemisch aus 70% Isopropanol und 30% Wasser bei 23°C desinfiziert werden. Durch das Eintauchen in diese Flüssigkeit werden weder die Vemetzungsdichte noch andere wichtige Strukturmerkmale der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte geändert.

Die subkutane Implantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Weiße weibliche Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von ungefähr 4QQ g wurden als Versuchstiere verwendet. Über 7 Tage vor der Implantation hinweg wurde eine Gewichtsänderungsgeschichte für jedes Tier aufgenommen. Kurz vor der Implantation wurde der Rücken eines jeden Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in einer Fläche von etwa 6 cm X 5 cm geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkung eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einem Gemisch aus 70% Isopropanol und 30% Wasser gewaschen.

Auf einer Seite des Rückens des Tieres wurde ein 2,5 cm langei Schnitt geführt Der Schnitt wurde so ausgeführt, daß zwischen der Dennis und dem Panniculus carnosus eine Tasche entstand. In diese Tasche wurde die Probe so eingesetzt, daß die ganze Probe flach in der Tasche lag. Dann wurde der Schnitt mit Nylon-Nahtmaterial zugenäht. Um den Schnitt zu schließen, wurden etwa 5 bis 6 Stiche ausgeführt. Auf der anderen Seite des Rückens des Meerschweinchens wurde das Verfahren mit einer gleichen Probe wiederholt Dann wurde die rechte Seite für histologische Untersuchungen verwendet, während Proben von der linken Seite nach dem Explantieren zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung verwendet wurden.

Am 4., 10. bzw. 20. Tag nach der Implantation wurden die Tiere getötet, indem sie in einen Äther enthaltenden Exsikkator eingebracht wurden. Sowohl von den linken als auch von den rechten Implantationsstellen wurden unter der subkutanen Schicht Gewebequadrate von 3.8 cm x 3,8 cm derart ausgeschnitten, daß sie implantierten Proben in dem Gewebe verblieben. Das Gewebe von der rechten Seite wurde in lOprozentige Formalinlösung eingelegt und dann, wie nachstehend beschrieben, für histologische Untersuchungen verwendet. Das Gewebe von der linken Seite wurde in 50 ml sterile Dulbeccosche Lösung eingetaucht, die einige Tropfen Chloroform (als Bactericid) enthielten, und nicht länger als 24 Stunden vor der Entfernung der Probe unter Kühlung gelagert.

Das Entfernen der Probe in dem Gewebe erfolgte, indem das Gewebe auf den Tisch eines schwach vergrößernden Mikroskops (das mit einer Kamern ausgerüstet war) gelegt und das subkutane Gewebe derart von der Dennis abgezogen wurde, daß der Zustand der Probe in dem Gewebe klar in dem Mikroskop untersucht werden konnte. Dies wurde ermöglicht, indem zuerst ein Schnitt zwischen der Dennis und dem subkutanen Gewebe geführt wurde und die beiden Teile dann vorsichtig mit einer Pinzette voneinander getrennt wurden. Bei Beobachtung im Mikroskop konnten an dem Gewebe und der darin eingebetteten Probe Merkmale, wie die Bindung von Geweben an das implantierte Material, festgestellt werden. Das Entfernen der Probe aus dem Gewebe erfolgte auf dem Mikroskoptisch mit Hilfe einer Pinzette. Nachdem das Material aus dem Gewebe entfernt worden war, wurde es bei 4°C in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt, bis es zur Bestimmung der folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften benötigt wurde:

1. Die bruchteilmäßige (anteilige) Gewichtsänderung der Probe Λ WIW₁. Dieser Wert wurde durch Bestimmung des Trockengewichts der Proben (nach 48stündigem Dehydratisieren bei 105⁰C unter einem Druck von 10"³ mm Hg) erhalten. Die anteilige Gewichtsänderung wurde dann aus der Gleichung

berechnet, in der W _f das Trockengewicht der explantierten Probe und W₁ das Trockengewicht der Probe vor dem Implantieren bedeutet (der letztgenannte Wert wurde unter Verwendung einer Kontrollprobe bestimmt).

2. Zugmodul E (in dyn/cm²). Dieser wurde nach der in Beispiel 10 beschriebenen Methode mit dem Unterschied erhalten, daß der Modul als die Steigung des geraden Teils der Spannungs-Dehnungskurve bestimmt wurde.

3. Molekulargewicht M_c zwischen Vernetzungsstellen. Dieses wurde gemäß Beispiel 4 bestimmt.

Die charakteristischen Eigenschaften von Kollagen-Mucopolysaccharidproben unmittelbar vor der Implanta-

tion sowie am 4., 10. und 20. Tag nach der Implantation sind für Produkte, die durch Beschichten von Kollagen mit verschiedenen Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle VII und für Produkte, die durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen mit Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VH

Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysacchariden hergestellte Verbundprodukte.

Eigenschaften vor und nach der Implantation.

Eigenschaften

Vor der Implantation

Verweilzeit in vivo 4 Tage

10 Tage

20 Tage

(1) Kollagen

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,16 ±0,04 -0,15 ±0,04 -0,31 ±0,04

E x 10"⁹ (dyn - cm"²) 3,3 ± 0,3 2,5 ± 0,3 1,4 ± 0,3 1,6 ± 0,;

M_e X ICi³ 3,8 ± 0,5 6,6 ± 0,5 6,1 ± 0,5 8,6 ± 0,5

(2) Kollagen-Hyaluronsäure

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,12 ±0,04 -0,30 ±0,04 -0,28 ±0,04

E x 10"⁹ (dyn · cm"²) 3,5 ± 0,3 2,3 ± 0,3 1,8 ± 0,3 -0,9 ± 0,3

M_c x 10"³ 4,2 ± 0,5 7,2 ± 0,5 6,7 ± 0,5 8,5 ± 0,5

(3) Kollagen-Heparansulfat

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,06 ±0,04 +0,04 ± 0,04

E X 10"⁹ (dyn · cm"²) 4,0 ± 0,3 3,5 ± 0,3 3,8 ± 0,5

M_c x 10"³ 3,8 ± 0,5 4,6 ± 0,5 4,7 ± 0,5

(4) Kollagen-Heparin

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,02 ±0,04 +0,08 ±0,04 +0,32 ±0,04

E x 10"^s (dyn · cm"²) 4,2 ± 0,3 3,9 ± 0,3 4,2 ± 0,3 4,3 ± 0,3

M_c x 10"³ 3,8 ± 0,5 4,3 ± 0,5 4,3 ± 0,5 3,6 ± 0,5

(5) Kullagen-Dermatansulfat

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,09 ±0,04 -0,05 ± 0,04

E x 10"' (dyn · cm"²) 3,9 ± 0,3 4,0 ± 0,3 3,0 ± 0,3

M_c x 10"³ 4,0 ± 0,5 4,9 ± 0,5 5,3 ± 0,5

(6) Kollagen-Chondroitin-6-sulfat

AWIW₁ 0,00 ±0,04 -0,02 ±0,04 -0,07 ±0,04 +0,40 ± 0,04

E X 10"' (dyn · cm"²) 4,0 ± 0,3 3,6 ± 0,3 3,2 ± 0,3 3,3 ± 0,3

M_c X 10"³ 4,1 ± 0,5 4,3 ± 0,5 5,7 ± 0,5 5,4 ± 0,5

+0,38 ± 0,04

3,6 ± 0,5

4,5 ± 0,5 30

+0,31 ± 0,04

3.1 ± 0,3 40

5.2 ±0,5

Tabelle VIII

Durch gemeinsames Ausfällen von Kollagen mit Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte;
Eigenschaften vor und nach der Implantation

Eigenschaften	Vor der Implan	Verweilzeit in vivo	10 Tage	20 Tage
	tation	4 Tage
(1) Kollagen			-0,52 ± 0,02	-0,60 ± 0,02
AWIW1	0,00 ± 0,02	-0,16 ± 0,02	1,4 ± 0,2	0,7 ± 0,2
E X 10"' (dyn · cm"2)	1,8 ±0,2	1,3 ± 0,2	3,5 ± 0,1	3,8 ±0,1
Mc X 10"4	1,5 ±0,1	2,4 ± 0,1

Fortsetzung

Eigenschaften

Vor der Implantation

Verweilzeit in vivo 4 Tage

10 Tage

(2) 1,8 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

AWIW, 0,00 ±0,02

E X 10 "⁸ (dyn - cm"²) 1,9 ± 0,2

M_c X 10"

1,4 ±0,1

(3) 4,8 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

AWIW, 0,00 ±0,02

E X 10"⁸ (dyn · cm"²) 1,8 ± 0,2

M_c x 10"⁴ 1,3 ±0,1

(4) 11,2 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

A Wl W₁ 0,00 ± 0,OZ

E x 10 ⁸ (dyn · cm"²) 1,9 ± 0,2

M_t. x 10"

1,0 ±0,1

-0,20 ± 0,02 1,5 ± 0,2 1,8 ±0,2

-0,04 ± 0,02 f.5 ±0,2

1.5 ± 0,2

-0,04 ± 0,02

1.6 ±0,2 1,4 ±0,1

-0,28 ± 0,02 1,0 ±0,2 2,9 ± 0,2

-0,08 ± 0,02

1.2 ± 0,2 2,0 ± 0,2

+0,18 ±0,2 1,6 ± 0,2

1.3 ±0,1

20 Tage

-0,39 ± 0,2 1,0 ±04 3,0 ± O^

+0,33 ± 0,2

1.3 ± 0,2

2.4 ± 0,2

+0,65 ± 0,2 1,7 ±0^ 1,6 ±0,1

Aus den Tabellen VII unrt VIII geht hervor, daß in fast allen Fällen, in denen Kollagen mit einem Mucopolysaccharid entweder nach dem Beschichten oder nach der gemeinsamen Ausfallung mit einem Mucopolysaccharid vernetzt wurde, der anteilige Gewichtsverlust unterdrückt wurde, woraus ss-:h ergibt, daß der Abbau des Kollagens durch die Umsetzung mit dem Mucopolysaccharid in wirksamer Weise verhindert wurde. Die einzigen Ausnahmen waren mit Hyaluronsäure (einem nicht-sulfatierten Mucopolysaccharid) beschichtetes Kollagen und mit nur 1,8 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat gemeinsam ausgefälltes Kollagen; im letzteren Falle wurde der anteilige Gewichtsverlust des Kollagens nicht vollständig verhindert, sondern nur verzögert In allen anderen Fällen kehrte sich ein gelegentlicher sehr geringer anfanglicher Gewichtsverlust, der möglicherweise auf die Entquellung der implafciierten Probe zurückzuführen war, gewöhnlich am 10. Tage um, bis das Implantat am 20. Tage schwerer aL· zur Zeit der Implantation war. Die Gewichtszunahme des Implantats war auf das Anhaften einer gewissen Mengt des umgebenden Gewebes an dem Implantat zurückzuführen, wenn das letztere aus dem Versuchstier entfernt wurde. Das an dem Implantat anhaftende Gewebe wurde analysiert, wobei sich herausstellte, daß es fast vollständig aus Kollagen bestand, eine Beobachtung, die zeigt, daß durch die Zellen in den umgebenden Geweben neues Kollagen synthetisiert worden war. Daher verhinderte die Reaktion mit sulfatierten Mucopolysacchariden nicht nur den Abbau des Kollagens, sondern führte auch ;:ιτ Bildung eines Verbundproduktes, welches imstande war, die Synthese von neuem Bindegewebe auf seiner Oberfläche durch die Zellen in dem umgebenden Gewebe hervorzurufen.

Der Schutz gegen Resorption, den das Kollagen durch die Umsetzung mit sulfatierten Mucopolysacchariden erhält, äußert sich auch in der Verhinderung einer wesentlichen Abnahme des Moduls E und einer Abnahme der Vernetzungsdichte (Erhöhung von M₁.), die bei Kollagen selbst oder bei einem Verbundprodukt aus Kollagen und Hyaluronsäure beobachtet wird. Die Aufrechterhaltung von E und M_c auf verhältnismäßig konstanten Höhen (innerhalb der experimentellen Unsicherheitsgrenzen) bis zum 20. Tage nach der Implantation von Verbundprodukten aus Kollagen und einem der sulfatierten Mucopolysaccharide ist ein Anzeichen für ein vernetztes makromolekulares Netz, welches in dem Gewebe des lebenden Tieres mindestens 20 Tage intakt bleibt. An dem aus der rechten Seite des Versuchstieres am 4., 10. und 20. Tage entnommenen Gewebe-Implantatblock wurden histologische Untersuchungen durchgeführt. Zur Herstellung der Proben für die histologische Untersuchung wurde das folgende genormte Verfahren angewandt:

1. Das Gewebe wurde mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur in lOprozentigem Formalin (Fischer

Scientific Co., NJ) fixiert.

2. Dann wurde es durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von 50%, 70%, 85%, 95% bzw. 100% dehydratisiert, wobei die Dauer des Eintauchens in ein jedes Gemisch 1 Stunde betrug.

3. Dann wurde das Gewebe 2 Stunden in Dioxan getaucht, bevor es in ein Gewebe-Einbettungsmedium (Paraplast; F. 56-57°C; Curtin Scientific Co., Houston, Texas) eingebettet wurde. Das Einbetten erfolgte, indem das Gewebe zunächst 4 Stunden in das auf 58°C gehaltene geschmolzene Paraffin eingebracht wurde, wobei das Paraffin stündlich ausgewechselt wurde. Dann wurde das Gewebe in eine Form eingelegt und in einen frischen Ansatz von Paraffin eingebettet.

4. Der das Gewebe enthaltende Paraffinblock wurde dann 20 Minuten in einem zerkleinertes Eis enthaltenden Bad auf 0⁰C gekühlt und auf einem Mikrotom (Minot Custom Microtome; International Equipment

to Co., Needham Heights, MA) montiert. Scheiben des das Gewebe enthaltenden Paraffins wurden mit dem

Mikrotom auf Dicken von etwa 6 μ geschnitten.

5. Die mit dem Mikrotom geschnittene Probe wurde dann auf einem klaren Mikroskop-Objektträger montiert und durch je 3 Minuten langes Eintauchen der montierten Probe in zwei Ansätze von Xylol von Paraffin befreit.

6. Dann wurde die Probe durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus Wasser und Äthyialkohol mit Alkoholgehalten von 100%, 95%, 85%, 70%, 50% bzw. 0% dehydratisiert, wobei die Eintauchzeit in jedes Gemisch 1 Stunde betrug. Schließlich wurde die Probe gründlich mit destilliertem Wasser gespült.

7. Dann wurde die Probe 5 Minuten mit Hämatcxylin gefärbt und kurz mit destilliertem Wasser gespült. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Spülen der Probe mit 0,5prozentigem Säurealkohol (70% Äthylalkohol in konzentrierter Salzsäure) entfernt. Schließlich wurde der Säurealkohoi durch Spülen der Probe und V₂stündiges Eintauchen in Wasser ausgewaschen.

8. Die Probe wurde sodann 3 Minuten in 0,5prozentiger wäßriger Eosinlösung gefärbt und hierauf fünfmal mit frischem Wasser gespult

9. Die Probs wurde, wie für Stufe (2) beschrieben, dehydratisiert und dann einige Male mit Xylol gewaschen.

10. Hierauf wurde die Probe mit Hilfe eines bleibenden Montiermittels (Harleco Synthetic Resin; Hartman-Leddon Co., Philadelphia, PA) auf einem reinen Deckglas montiert.

11. Das die gefärbte Probe aufweisende Deckglas wurde unter dem Mikroskop untersucht.

Die histologischen Untersuchungen zeigten, daß das Ausmaß und die Stärke von chronischer Entzündung in dem das Kollagenimplantat umgebenden Gewebe stetig abnahm, wenn der Chondroitin-6-sulfatgehaIt einer Reihe von Implantaten auf der Basis von gemeinsam ausgefällten Koliagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukten im Bereich von 1,8 bis 11,2 Gewichtsprozent zunahm. Diese Ergebnisse zeigten, daß das in den Verbundprodukten verwendete Kollagen zwar für sich allein eine mäßige Immunreaktion hervorrief, die Umsetzung des Kollagens mit dem Chondroitin-6-sulfat jedoch zu einer praktisch vollständigen Unterdrückung dieser Immunreaktion führte. Gleiches wurde auch festgestellt, wenn das Implantat aus einem Verbundprodu.·.* bestand, welches durch Beschichten von Koiiagen mit einem der suifatierten Mucopolysaccharide erhalten wurchn war. Die histologischen Beobachtungen zeigten, daß die Fähigkeit von implantiertem Kollagen, bei dem Wirtstier eine Fremdkörperreaktion hervorzurufen, durch Umsetzung mit einem jeden der suifatierten Mucopolysaccharide gesteuert und unterdrückt werden konnte.

Beispie! 13

Herstellung eines zweischichtigen Schichtstoffs aus einer ersten Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-suIfat und einer zweiten Schicht aus einem »Silastic«-Siliconpolymeren

150 ml einer 0,67gewichtsprozentigen Kollagendispersion, hergestellt nach Beispiel 1, wurden unter schnellem Rühren mit 50 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH 3,2) gemischt, die 0,2 g Chondroitin-6-sulfat enthielten. Der Niederschlag wurde durch eine Nutsche auf ein Filterpapier von 11 cm Durchmesser (Schleicher und Schuell Nr. 589) abfiltriert. Die so erhaltene Verbundproduktfolie aus Kollagen-Mucopolysaccharid wurde von dem Filterpapier entfernt, in 0,02rnoiare Glutaraldehydlösung getaucht und nach Beispiel 4 verarbeitet. Die Dicke der entstandenen Folie betrug 0,38 bis 0,43 mm.

Die Verbundproduktfolie wurde dann mit Löschpapier getrocknet und mit Hilfe eines Spatels mit einem 0,13 mm dicken Überzug eines Siliconklebstoffs (»Medical Grade Silastic«, Typ A, der Dow Corning Co.) beschichtet. Das beschichtete Verbundprodukt wurde 16 Stunden bei 73°C und 100% relativer Feuchte in einem Exsikkator gehalten. Nach dem Sterilisieren in Isopropylalkohol und Auswaschen mit sterilem destilliertem Wasser und steriler Dulbeccoscher Lösung wurde die beschichtete Folie auf ihren Wert als synthetische Haut untersucht.

Beispiel 14
Transplantation von mehrschichtiger synthetischer Haut in vivo

Das nach Beispiel 13 hergestellte und mit Siliconharz beschichtete Kollagep-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukt wurde auf die gewünschten Abmessungen (4 cm x 6 cm) geschnitten und zum Desinfizieren 24 Stunden bei 23°C in ein Gemisch aus 70% Isopropanol und 30% Wasser getaucht. Die Hantierung der Proben erfolgte in einer sterilen Atmosphäre, die durch einen Abzug (Tenne> Relialab Laminar flow hood) zur Verfugung gestellt wurde. Während der Hantierung der Probe wurden chirurgische Handschuhe und Masken verwendet Nach dem Entfernen aus der Alkohollösung würden die Proben zweimal mit sterilem destilliertem Wassei'gewaschen und dann bis zur Verwendung bei 4°C in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt. Nach Beendigung dieses Verfahrens ergaben bakteriologische Untersuchungen der Kollagen-Chondroitin-6-sulfatproben auf gram-positive und gram-negative Bakterien und auf anaerobe Mikroorganismen nega*ive Resultate.

Die Transplantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Als Versuchstiere wurden weiße Mi weibliche Hartley-Meerschweinchen von ungefähr 400 g Körpergewicht verwendet. Für einen Zeitraum von 7 Tagen vor der Transplantation wurde für jedes Tier die Geschichte seiner Gewichtsänderung aufgenommen. Kurz vor der Transplantation wurde der Rücken eines jeden Tieres über eine Fläche von 6 cm x 5 cm hinweg mit der Haarschneidemaschine geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkenlassen eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einer Lösung von 70% Isopropanol und 30% Wasser gewaschen.

Über eine Fläche voi 4 cm X 6 cm hinweg wurden entsprechend einer mit Jodlösung markierten Kontur, die der Größe des Transplantats entsprach, Schnitte ausgeführt. Die Haut über dem Panniculus carnosus wurde aus-

geschnitten, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, nur ein minimales Bluten hervorzurufen. Alles Blut wurde aus der Wunde durch Abtupfen mit mit steriler Kochsalzlösung befeuchteten sterilen Gazebäuschen entfernt. Das Transplantat wurde dicht angrenzend an die Haut am Umfang der Wunde über das Wundbett gelegt. Dann wurde das Transplantat mit Nahtmaterial aus Nylon angenäht, wobei ungefähr 16 Nähte nahe der Wunde angewandt wurden. Das Tier wurde mit einem seinen Körper umgebenden Verband bedeckt, der um das Genick her um befestigt wurde, um Verschiebungen zu verhindern. Während der Dauer des Versuchs war jedes untersuchte Tier in einem gesonderten Käfig untergebracht.

Die untersuchten Tiere wurden täglich gewogen, und das Gewicht wurde verzeichnet. Nach 5 Tagen wurde dei Verband geöffnet und die Transplantatstelle untersucht. Die Tiere wurden nach unterschiedlichen Zeitspanner

ίο getötet, und das Transplantat sowie das Wundbett wurden ausgeschnitten und in zwei gleiche Abschnitte unterteilt. Ein Abschnitt wurde der histologischen Untersuchung unterworfen, und der andere Abschnitt wurde ohne weitere Behandlung unter einem schwach vergrößernden Mikroskop beobachtet. Durch Abheben des Trans· plantatmaterials von dem Gewebe mit einer Pinzette konnte der Zustand der Wundstelle und des Transplantat; untersucht werden. Für Zeiträume bis zu 10 Tagen war kein Anzeichen für Gewebewachstum in das Transplan-

! j tat hinein und kein Anzeichen von Wundkontraktion oder akuter Entzündung festzustellen. Die Epithelbildunj am Umfang des Wundbettes war minimal.

Beispiel !5 Mit Kollodium beschichtete mehrschichtige Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Membran

Ein nach Beispiel 5 hergestelltes Kollagen-Chondroitin-o-sulfat-Verbundprodukt wurde nach dem Verfahrer des Beispiels 14 auf ein Meerschweinchen transplantiert. Nach dem Einnähen wurde das gesamte Transplanta :5 zusammen mit etwa 3,2 mm der benachbarten Haut mit einer Kollodiumlösung (Celluloseester in einem geeig neten organischen Lösungsmittel) beschichtet und vor dem Anlegen eines Verbandes gründlich trocknen gelas sen. Das Verhalten des Transplantats und des Gewebes war ähniich wie in Beispiel 14, jedoch sprang der Ober zug am 10. Tag infolge Versprödung, und es erfolgte eine Dehydratisierung der Kollagen-Chondroitin-6-sulfat schicht unter Kontraktion der Wunde und Epithelbildung längs der Ränder der Wundstelle.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Synthetische Haut mit einer ersten hydrophilen Schicht und einer zweiten polymeren Schicht mit einer bestimmten Feuchtigkeitsdurchlässigkeit, gekennzeichnetdurcheine erste Schicht aus einem veraetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt, das mindestens 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.

2. Synthetische Haut nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt ein sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.

3. Synthetische Haut nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt etwa 6 bis 12 Gewichtsprozent sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.

4. Synthetische Haut nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-suifat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat oder Dermatansulfat ist.

5. Synthetische Haut nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bis zu einem Af_c-Wert (Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen Vernetzungsstellen) zwischen etwa 800 und 60 000 vernetzt ist.

6. Synthetische Haut nach Anspruch 1 bis, dadurcn gekennzeichnet, daß sie eine Gesamtdicke von etwa 0,64 bis 2,5 mm aufweist.