DE3878909T2

DE3878909T2 - Vorrichtung und verfahren zur herstellung eines komposithautersatzes.

Info

Publication number: DE3878909T2
Application number: DE8888904813T
Authority: DE
Inventors: T Boyce
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1987-04-28
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2008-04-29
Also published as: WO1988008305A1; DE3878909D1; JP3050879B2; EP0363400B1; EP0363400A1; JPH03502049A; ATE86115T1; EP0363400A4

Description

Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter Grant Nr. GM-35068 der National Institutes of Health gemacht. Der Staat hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Diese Erfindung betrifft das Gebiet von Materialien, die geeignet sind zur Verwendung als Ersatz für menschliche Haut, und insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung eines zusammengesetzten Hautersatzes (composite skin replacement).
Die Behandlung von Wunden, insbesondere Brandwunden, erfordert eine frühe Bedeckung der Wunde, um Flüssigkeitsverlust, Schmerz und Infektion durch Mikroorganismen zu reduzieren. Zusätzlich erleichtert die Wundbedeckung die Reparatur von Wunden, die die Wiederherstellung von sowohl der Epidermis wie auch der Haut umfassen kann. Brandwunden schliessen Verbrennungen der Haut in nicht ihrer ganzen Tiefe ein, die einiges von, doch nicht die gesamte Epidermis zerstören und einen Teil, jedoch nicht die gesamte Lederhaut zerstören können. Die meisten Verbrennungen der Haut in nicht ihrer ganzen Tiefe werden spontan ausheilen, wenn sie richtig mit synthetischen Verbänden behandelt werden, die die Wunde schützen können und eine schnelle Epithelbildung bei minimaler Entzündung und Narbenbildung unterstützen. Verbrennungen in voller Tiefe der Haut zerstören die gesamte Epidermis und alle ihre anhängenden Strukturen (z.B. Haarfollikeln, Schweissdrüsen und Talgdrüsen) und normalerweise die gesamte Lederhaut. Verbrennungen in voller Hauttiefe können anfänglich durch vorübergehendes Abdecken behandelt werden, erfordern aber darauffolgend Transplantation. Andere Wunden schliessen Spenderstellen ein, die solche Stellen sind, von welchen unbeschädigte (gesunde) Haut für ein Hauttransplantat entfernt wird. Teile der epidermalen anhängenden Strukturen bleiben an der Spenderstelle, regenerieren die Epidermis und heilen die Spenderstelle spontan, wenn die Stelle mit geeigneten Verbänden behandelt wird.
Eine erfolgreiche Hauttransplantation erfordert, dass das Transplantat auf den gereinigten Wunden (Wunden, von welchen das tote Gewebe oder der Brandschorf entfernt wurde) des Empfängers angenommen wird, wodurch eine dauerhafte Wiederherstellung der dermalen und epidermalen Hautbestandteile erzielt wird. Das Transplantat sollte nicht eine Immunantwort hervorrufen, die das Transplantat zerstören kann, und sollte eine geeignete dermale Komponente vorsehen oder einschliessen, um das Wachstum und die Entwicklung einer normaler Epidermis zu unterstützen. Das Transplantat sollte die Bildung von Granulationsgewebe unterdrücken, die Narbenbildung verursacht.
Behandlung von Wunden ist typischerweise verbunden mit der Verwendung von Hauttransplantaten aus ex vivo-Hautquellen. Verschiedene Typen von Hauttransplantaten wurden verwendet, um beschädigte Haut zu bedecken und/oder zu reparieren, beispielsweise in der Verbrennungschirurgie. Autotransplantate sind die wirkungsvollsten Hauttransplantate und sind Gewebetransplantate, die von der verletzten Person stammen, gewöhnlich in Form von zweiteiligen (split-thickness) Hauttransplantaten, falls sie zur permanenten Hautreparatur verwendet werden. Ein zweiteiliges Hauttransplantat besteht aus Haut, die von einer Spenderstelle entfernt wurde und auf eine Wunde von voller Tiefe nach Ablösung des Brandschorfs zur Schliessung und Heilung der Wunde aufgebracht wird. Zweiteilige Hauttransplantate bestehen aus der Epidermis, einem Teil doch nicht den gesamten epidermalen, anhängenden Strukturen, und einem Teil der Lederhaut. Typischerweise ist ein zweiteiliges Hauttransplantat durchlöchert (kurze alternierende Einschnitte), was eine Expansion des transplantierten Gewebes von maximal 1:10 und gewöhnlich von 1:3 oder weniger erlaubt. Andere Typen von Hauttransplantaten schliessen Allotransplantate ein, welches Gewebetransplantate zwischen Individuen derselben Gattung, aber verschiedener Genotypen sind, und Homotransplantate, die Allotransplantate von Menschen sind. Xenotransplantate sind Gewebetransplantate zwischen Individuen verschiedener Spezies. Homotransplantate aus Haut können von lebenden Spendern kommen, oder aus Haut, die in Hautbanken aufbewahrt wird.
Eine permanente Reparatur ausgeschnittener Brandwunden in voller und/oder teilweiser Tiefe erfordert schliesslich die Wiederherstellung eines stabilen Gewebes als Schutz, der das Äussere des Körpers bedeckt. Idealerweise dupliziert das reparierte Gewebe die Struktur und Funktionen von unbeschädigter Haut, einschliesslich der Compartmentalisierung in normal organisierte epidermale und dermale Bestandteile. Durchlöcherte zweiteilige Autotransplantate erfüllen diese Kriterien, stehen aber oft nicht in genügenden Mengen für grosse Körperoberflächen-(BSA "body surface area")-Verbrennungen zur Verfügung. Zusätzlich fügen die gegenwärtigen Verfahren zur chirurgischen Applikation von durchlöcherten Autotransplantaten auch den Patienten weitere Verletzungen zu und erreichen normalerweise Gewebeexpansionsverhältnisse, die weniger als das 10-fache der Grösse des gespendeten Gewebes betragen. Diese Beschränkungen in der Verwendung von durchlöcherten Autotransplantaten zur Behandlung von grossen BSA- Verbrennungen resultieren in wiederholten chirurgischen Operationen, verlängertem Krankenhausaufenthalt und unerwünschten kosmetischen Ergebnissen. Somit bleibt der Hautersatz nach grossen BSA-Verbrennungen ein ungelöstes Problem.
Faktoren, die mit dem Transplantationserfolg zu tun haben, schliessen Charakteristika sowohl des Transplantats wie auch der Wunde ein. Ein undurchlöchertes zweiteiliges Autotransplantat weist die höchste Wahrscheinlichkeit für Akzeptanz und Verbleiben auf der Wunde auf, zusätzlich zu der hohen Reparaturqualität von Hautverlustverletzungen einschliesslich ausgeschnittener Verbrennungen in voller Tiefe, die durch solche Transplantate erreicht wird. Selbst ein optimales Transplantat dieser Art kann jedoch nur teilweise auf einem suboptimalen Wundbett angenommen werden, in Abhängigkeit von z.B. der Tiefe des Einschnitts, des Gewebetyps im Wundbett und des Vorliegens einer Infektion.
In ähnlicher Weise können Unterschiede in der Transplantatakzeptanz in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Transplantats erwartet werden, das auf ein optimales Wundbett aufgebracht wird. Im Vergleich zu zweiteiligen Autotransplantaten, kann man von biologischen Materialien, wie frischer oder eingefrorener Allotransplantat-Lederhaut, frischem oder verarbeitetem Schweine-Xenotransplantat, dermalen Implantaten auf Collagenbasis und gezüchteten Humankeratinocyten (HK)- Zellschichten erwarten, das sie auf Wunden akzeptiert werden, zum Teil aufgrund ihrer jeweiligen Fähigkeiten, das Einwachsen des fibrovaskulären Gewebes (Bindegewebe und Blutgefässe) zu unterstützen. Mann kann von kultivierten HK-Zellschichten aufgrund des intrinsischen Fehlens von vaskulärer Versorgung in der Epidermis erwarten, das sie auf Wunden entsprechend hauptsächlich dem Grad und der Qualität des vaskularisierten Bindegewebes im Wundbett akzeptiert werden. Akzeptanz von 60 bis 80 % der HK-Zellschichten auf Betten von Granulationsgewebe nach Allotransplantatentfernung ist berichtet worden (Gallico et al, New Eng. J. Med., 311(7) :448-451 (1984)) , doch die Akzeptanz von kultivierten HK-Transplantaten auf frisch ausgeschnittenen Verbrennungen in voller Tiefe hat wenig Erfolg erzielt. Ausserdem ist, obwohl Granulationsgewebe als hinreichendes Wundbett zur Akzeptanz von kultivierten HK- und anderen Transplantaten dienen kann, es auch mit der Bildung von vernarbtem Gewebe verbunden.
Nachteile von Hauttransplantaten, die von Autotransplantaten verschieden sind, schliessen Infektion und häufige Abstossung durch den Empfänger ein, was die Verwendung von immunosuppresiven Mitteln erfordert. Forschungsanstrengungen wurden darauf gerichtet, funktionelle synthetische Substitute zu entwickeln, die die Nachteile von Hautsubstituten, die aus tierischer Haut zusammengesetzt sind, überwinden, um permanente Wundschliessung zu erreichen.
Kriterien für synthetische Hautsubstitute schliessen ein: schnelles Anhaften an die Verbrennungswunde bald nach dem Verpflanzen; geeignete Dampfdurchlässigkeit zur Kontrolle des Flüssigkeitsverlustes durch Verdunstung von der Wunde und zur Vermeidung der Ansammlung von Flüssigkeit zwischen der Wunde und dem Verbandmaterial. Hautsubstitute sollten auch flexibel, haltbar und widerstandsfähig gegen Zerreissen sein und sollten ebenso als Barriere gegen Mikroorganismen wirken wie das Wachstum von in der Wunde bereits vorhandenen Mikroorganismen beschränken. Die Substitute sollten Gewebekompatibilität aufweisen, d.h. keine Entzündung oder Fremdkörperreaktion in der Wunde hervorrufen, die zur Bildung von Granulationsgewebe führen kann. Eine innere Oberflächenstruktur sollte vorliegen, die das Hineinwachsen von fibrovaskulärem Gewebe erlaubt. Hansbrough (Sprecher), J. of Trauma, 24:S31-S35 (1984).
Eine Reihe von Materialien, die entweder aus in vitro- oder ex vivo-Präparaten erhalten werden, ist vorgeschlagen worden. Diese Präparate können eingeteilt werden in vorübergehende Hautsubstitute, d.h. sie erfordern nachfolgende Autotransplantation, und permanente Hautsubstitute. Vorübergehende Hautsubstitute bestehen im allgemeinen aus Substituten, die aus biologischen Materialien gebildet werden, beispielsweise Allotransplantaten und Xenotransplantaten, und solchen Substituten, die aus Stoffen, wie synthetischen Polymeren, gebildet werden. Permanente Hautsubstitute für Wunden in voller Hauttiefe schliessen Autotransplantate und Dermal- Epidermal-Zusammensetzungen ein. Für teilweise Hautsubstitute sind dermale Ersatzstoffe, wie Implantate auf Collagenbasis oder epidermale Substitute, beispielsweise Schichten aus menschlichen Epidermalzellen, als Permanent-Hautsubstitute untersucht worden.
Die Verwendung von Synthetischen Polymerstoffen in verschiedenen Formen war vielversprechend für die Entwicklung von Hautstrukturen, die die Fähigkeit haben, zelluläre Wanderung und Proliferation in das Transplantat hinein zu induzieren, war jedoch beschränkt durch das häufige Auftreten von Infektionen und die Unmöglichkeit, Gefäss- und Epithelbildung voranzubringen. Epithelbildung des Membrantransplantats stellt eine Barriere gegen Infektionen zur Verfügung und trägt zur Kontrolle des Flüssigkeitsverlustes bei. Zusätzlich können Polymerstoffe beim Anhaften an die Wunde oder bei der Infektionskontrolle versagen.
Es wurde von verschiedenen Materialien gezeigt, dass sie als volle (epidermale und dermale) oder teilweise (epidermale oder dermale) permanente Substitute für durchlöchertes zweiteiliges Autotransplantat fungieren. Die Verwendung von Gewebekulturtechniken für normale HK kann Expansionsverhältnisse (Verhältnis der Originalgrösse der Donorhaut zur Fläche der gezüchteten Zellen zum Zeitpunkt der Transplantation) erreichen, die das 1000- fache der Originalgrösse in einem Zeitraum von 3 bis 4 Wochen übersteigen können. Boyce and Ham, J. Tiss. Cult. Meth. 9(2):83-93 (1985); J. Invest. Dermatol. 81(1), Supp. 335-405 (1983). HK-Kulturen dieser Art werden Multischichten bilden, und es wurde gezeigt, dass sie Wundschliessung nach der Applikation auf ausgeschnittene Brandwunden in voller Hauttiefe als Schichten über allogener Lederhaut erzielen können. Cuono et al, The Lancet 1:1123-1124 (1986). Die hohen Expansionsverhältnisse von HK und ihre Fähigkeit, Schichten zu bilden, trägt sowohl zur Vorhersagbarkeit wie auch zur Geschwindigkeit der Transplantatakzeptanz auf Wunden bei. Einige permanente Hautvollsubstitute werden in zwei Stufen aufgebracht, wobei de-epidermisiertes Allotransplantat zunächst auf das Wundbett aufgebracht wird, gefolgt von entweder autologen epidermalen Ansaugpflastern (Heck et al, J. Trauma 25(2):106-112 (1985)) oder von autologen HK-Kulturen (Cuono et al, siehe oben). Obwohl solche Vorgehensweisen bestimmte Vorteile gegenüber durchlöcherten zweiteiligen Autoransplantaten haben können, bleiben sie von der Verfügbarkeit und Variabilität von menschlichem Allotransplantat abhängig. Ausserdem erforden diese Vorgehensweisen, dass zur vollständigen Wundschliessung zweimal Transplantat akzeptiert wird, wohingegen zweiteiliges Autotransplantat dies nur einmal erfordert.
Der Wunsch, biologische Materialien zu verwenden, führte zur Entwicklung von Hautsubstituten, bei denen Collagen verwendet wird, das eine Hauptkomponente des normalen Bindegewebes ist. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Verwendung von Collagen alleine, beispielsweise als wiederhergestellten Collagenfilm oder -blatt, nicht zur effektiven Wundbedeckung dient, weil es die Entwicklung von Granulationsgewebe stimuliert und eine chronische Entzündungsantwort hervorruft, bevor es resorbiert (biologisch abgebaut) wird. Zudem ist Collagen in Form von Blättern unelastisch und ist nicht in der Lage, das Wachstum von Mikroorganismen in der Wunde zu kontrollieren. Eine Arbeit mit Schwämmen auf Collagenbasis als Wundverbänden zeigt, dass strukturelle Charakteristika des Schwammes, wie Porengrösse und Faserstruktur, beeinflusst werden können durch die Regulation von Gefriertemperatur, Viskosität und pH der Collagendispersion7 die zur Bildung des Schwammes verwendet wird. Doillon et al, J. Biomed. Materials Res., 20:1219-1228 (1986).
Dermale-epidermale Composite sind eine brauchbare Alternative für Wundbedeckungen. Diese Materialien bestehen im allgemeinen aus zwei Komponenten: einer Komponente zur Haftung an die Wunde, mit einer semipermeablen Membran als äussere Komponente. Beispiele schliessen ein: das Material Biobrane (Tavis et al, Burns, 7:123-130 (1981)) als temporäre Wundbedeckung. Biobrane besteht aus einem zusammengewachsenen Nylonsieb, das mit einer dünnen Siliconmembran bedeckt ist, wobei die Schichten mit Collagenpeptiden gebunden sind.
Ein permanenter dermaler Hautersatz wurde durch Verwendung von resorbierbaren synthetischen Compositen demonstriert, die aus Collagen und Chondroitin-6-sulfat (Glycosaminoglycan (GAG))-dermalen Membranen bestehen, wie beschrieben von Burke et al, Ann. Surg. 194(4):413-428 (1981); Yannas et al, Science 214:174-176 (1982), Yannas et al, US-PS 4 060 081; und Boyce et al, Program of the Amer. Burn Assoc., 18. Jahrestreffen, Abst. Nr. 30 (1986). Zusätzlich dazu wurden allogene Lederhäute (Cuono et al, siehe oben, und Heck et al, siehe oben) und Fibroblasten- Collagen-Gelmischungen (Bell et al, J. Invest. Dermatol. 81(1), Supplement: 2s-10s (1983)) verwendet. Leider kann es schwierig sein, allogene Lederhaut in grossen Mengen zu erhalten, und sie kann dazu dienen, Krankheiten zwischen dem Spender und Empfänger zu übertragen. Fibroblastenmischungen sind instabil über längere Aufbewahrungszeiten und können übermässig dick zur Verwendung als bestimmte Transplantate, etwa als zweiteilige Hauttransplantate, sein.
Die Compositmembran, die von Yannas et al in US-PS 4 060 081 beschrieben wurde und aus einer dermalen Schicht aus Collagen und einem Mucopolysaccharid, wie Chondroitin- 6-sulfat (ein Glycosaminoglycan (GAG)), besteht, ist bedeckt mit einer Silastic (medizinisch reiner Siliconkautschuk) "epidermalen" Komponente. Während dieses Hautsubstitut biologisch abbaubar ist und nicht entzündend oder immunogen wirkt, erfordert es, das die Silastic - Epidermis zu einem späteren Zeitpunkt entfernt wird und dass die dermale Schicht mit einem dünnen Autotransplantat überdeckt wird, um die epidermale Komponente zu dauerhaftem Wundverschluss zur Verfügung zu stellen. Das Material ist auch durch vorzeitigen Verlust der Silastic - Schicht beschränkt, was zur Beschädigung der Neodermis führt, die durch Vaskularisierung des Collagengerüsts gebildet wird. Dies kann von Entwicklung von Granulationsgewebe gefolgt sein, was zu Vernarbung und unerwünschten funktionellen und kosmetischen Ergebnissen führt.
Verbesserte Verfahren zur Kultivierung von Epidermalzellen, wie HK, wurden entwickelt und Versuche wurden unternommen, die Zellen auf künstlichen Membranen zu züchten, wie der, die von Yannas et al, siehe oben, entwickelt wurde. Insbesondere wurden Verbesserungen erzielt beim Kulturmedium, beispielsweise unter Verwendung des Kulturmediums MCDB 153, beschrieben von Boyce and Ham, in In Vitro Models for Cancer Research, Bd. II (Herausgeber: Webber and Sekely, Boca Raton, CRC Press, S. 245-274 (1986); J. Tiss. Cult. Meth. 9(2):83-93 (1985); und J. Invest. Dermatol. 81(1) Supplement: 33s-40s (1983), verwendet wurde. Vor kurzem wurde dieses Medium noch weiter modifiziert, dahingehend, das es erhöhte Mengen an ausgewählten Aminosäuren enthält. Pittelkov et al, Mayo Clin. Proc. 61:771-777 (1986).
Obwohl vorhergehende Versuche ein Wachstum der Zellen auf einer künstlichen Membran erreicht haben, bleiben gewisse Probleme ungelöst. Beispielsweise, wenn HK-Zellen auf der Collagen-GAG-Membran, beschrieben von Yannas et al, aufgeimpft werden, tendieren die Zellen dazu, in die Zwischenräume der Membran hineinzuwandern, was in einem Material resultiert, das nicht strukturell in epidermale und dermale Komponenten nach der Art von normaler Haut abgeteilt ist.
Es besteht ein anhaltendes Bedürfnis nach einem Composit- Hautersatz zur permanenten Wundbedeckung und -reparatur, der diskrete epidermale und dermale Komponenten zur Verfügung stellt, Wundheilung vorantreibt und Infektionen verringert, und der das fibrovaskuläre Einwachsen vom Wundbett in die dermale Komponente optimiert. Zusätzlich werden effiziente und preiswerte Verfahren zur Herstellung solcher Composite benötigt.
Demgemäss stellt die Erfindung ein Material, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Herstellung zur Verfügung, das ein permanenter Composit-Hautersatz ist, bestehend aus menschlichen Epidermiszellen, wie etwa Keratinocyten, in Kombination mit einer biosynthetischen, azellulären dermalen Membrankomponente, die unter Verwendung von Collagen und Mucopolysaccharid gebildet werden kann. Die dermale Membrankomponente wird unter Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung ausgebildet und kann zur Lokalisierung der Epidermiszellen an die Oberfläche der Membrankomponente oberflächenbeschichtet werden. Das Verfahren schliesst die Gewebekultur der Epidermiszellen und die Herstellung der dermalen Membran unter Verwendung der Vorrichtung, die die Regulation der Bildung der Membran zur Optimierung der Porosität und Dicke für das vaskuläre Hineinwachsen erlaubt, ein. Die kultivierten Epidermiszellen haften an der dermalen Membran in vitro an, so dass der Composit-Hautersatz gebildet wird. Die oberflächenlaminierte dermale Membrankomponente des Composit-Hautersatzes bewahrt diskrete dermale und epidermale Kompartmente und kann auf Wunden mit einer einzigen Applikation transplantiert werden. Die dermale Komponente kann biologisch aktive Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, zur Verstärkung der Wundreparatur einschliessen. Biologisch spezifische Verbindungen, wie Avidin oder Biotin, die kovalent an die biologisch aktiven Moleküle gebunden sind, werden mit der biotinylierten dermalen Komponente umgesetzt, wodurch die aktiven Moleküle in die dermale Komponente eingefügt werden. Die so modifizierte dermale Komponente wird dann mit den Epidermiszellen kombiniert, wodurch der erfindungsgemässe Composit-Hautersatz gebildet wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Die Details typischer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen beschrieben, worin:
Fig. 1 eine diagrammartige Darstellung des Verfahrens ist, das zur Herstellung des Composit- Hautersatzes (A) und der Transplantation des Hautersatzes auf eine Wunde (B) verwendet wird.
Fig. 2 ist ein Foto eines Composit-Hautersatzes, der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt ist.
Fig. 3 ist ein Satz Fotomikrografien von Composit- Hautersatz in vitro (A-D) und von zweigeteilter Haut (E). A: Composit-Hautersatz nach 5 Tagen Inkubation in Kulturmedium mit 20 % (V/V) FBS. B: Composit-Hautersatz nach 5 Tagen Inkubation in serumfreiem Kulturmedium. C, D: mitotische Zellen in Composittransplantaten. E: zweigeteiltes (split-thickness) Hauttransplantat.
Fig. 4 ist ein Satz transmissionselektronenmikroskopischer Aufnahmen eines Composit-Hautersatzes nach 11 Tagen in Kultur. A: zeigt von unten nach oben Poren (P) im Collagensubstrat (CS). Die Zahlen rechts identifizieren 10 HK-Schichten. B: Oberste HK-Strata mit verhornten Zellwänden (cornified cell envelopes (CCE)) und unverhornter Plasmamembran (PM) , Skalenstrich = 10 um.
Fig. 5 zeigt transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Desmosomen, die HK-Zellen in Kultur verbinden. Das Fenster zeigt eine Vergrösserung der desmosomalen Verbindungen zwischen den Zellen. Skalenstrich = 10 um.
Fig. 6 ist ein Satz transmissionselektronenmikroskopischer Aufnahmen, der biologische Anlagerungen zwischen HK-Zellen und dem Collagensubstrat zeigt. A: HK-Zellen, die an das CS durch Hemidesmosomen (HD) anhängen und Bildung einer extrazellulären Matrix (ecm). (V) = Vesikeln in der Plasmamembran (pm). B: HD, pm und ecm. C: Pfeile bezeichnen streifiges Collagensubstrat. A, B: Skalenstrich = 1 um; C: Skalenstrich = 10 um.
Fig. 7 ist eine Fotomikrografie eines Hautdefekts in voller Tiefe, der 6 Wochen zuvor behandelt wurde, wobei der Composit-Hautersatz der Erfindung verwendet wurde. Pfeile bezeichnen netzartige Räume, die durch noch nicht resorbierte dermale Membran gebildet werden. Skalenstrich = 100 um.
Fig 8 ist eine auseinandergezogene isometrische Ansicht der Vorrichtung zur Herstellung der dermalen Membran der Erfindung.
Fig. 9 ist eine isometrische Ansicht der zusammengesetzten Vorrichtung.
Fig. 10 ist eine Querschnittsansicht, aufgenommen entlang der Linie 10-10 von Fig. 9.
Fig. 11 ist eine teilweise auseinandergezogene Querschnittsansicht, aufgenommen entlang der Linie 10-10 von Fig. 9.
Fig. 12 ist ein schematisches Diagramm, das die verschiedenen Verfahren zur Anlagerung von biologisch aktiven Verbindungen an ein Substrat abbildet, wie beschrieben in den Beispielen 5 und 6 unten.
Fig. 13 ist eine Fotografie von Hauttestfleck- Resultaten zur Bindung von Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase HRP), das kovalent an Avidin mit biotinyliertem Collagen (A-C) und nichtbiotinyliertem Collagen (D-F) auf Nitrocellulosepapier, wie in Beispiel 4 unten beschrieben, kovalent gebunden ist.
Fig. 14 ist eine Fotografie von biotinyliertem HRP, das mit biotinyliertem Collagen verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung schliesst ein Verfahren zur Herstellung eines permanenten Composit-Hautersatzes ein, bestehend aus einer biologischen epidermalen Komponente und einer azellulären, biosynthetischen (biologisches Material, hergestellt durch synthetische Verfahren), porösen, resorbierbaren dermalen Membrankomponente. Vorzugsweise schliesst die epidermale Komponente kultivierte menschliche Epithelzellen, wie normale menschliche Keratinocyten (HK), ein, welche auf der dermalen Membran gezüchtet werden und an die Membran anhängen, wodurch nachfolgendes Transplantieren des gebildeten Composits auf eine Wunde gestattet wird. Zur Verwendung im Composit können die Epidermiszellen aus Epidermisgewebe abgeleitet sein, das genetisch identisch zu dem Gewebe des Compositempfängers ist (autogene Zellen), oder abgeleitet sein von isospezifischem (dieselbe Spezies), jedoch genetisch unterschiedlichem (allogenem) Gewebe.
Die dermale Membrankomponente kann unter Verwendung der Vorrichtung der Erfindung hergestellt werden. Die dermale Membran wird vorzugsweise hergestellt aus Collagen, beispielsweise Rindercollagen, und einem Mucopolysaccharid, beispielsweise einem Glycosaminoglycan (GAG), wie Chondroitin-6-sulfat. Um den Composit- Hautersatz in einer compartmentalisierten Form, ähnlich zu menschlicher Haut zu erhalten, wird die dermale Membran vorzugsweise oberflächenlaminiert, wofür ein biopolymeres Material verwendet wird, beispielsweise eine Schicht einer Lösung, die Collagen und GAG enthält.
Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren werden proliferierende normale menschliche Epidermiszellen, vorzugsweise Keratinocyten, exponentiell in ihrer Anzahl vermehrt, um die Fläche der dermalen Membran, die von den kultivierten HK bedeckt ist, zu erhöhen, im Vergleich zu der Fläche des Hautgewebes, von welchem die HK-Kultur ursprünglich stammte. Diese Expansion kann das 1000-fache der Fläche des Epithelgewebes übersteigen, von welchem die Zellen isoliert wurden. Die Zellen werden unter optimalen Bedingungen kultiviert, was einschliesst, dass ein wachstumsförderndes Kulturmedium, wie MCDB 153, das erhöhte Mengen an ausgewählten Aminosäuren, epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin, Hydrocortison, Ethanolamin und Phosphoethanolamin enthält und Transferrin und Progesteron nicht enthält, umfasst, wie beschrieben von Boyce and Ham, siehe oben, und Pittelkov et al, siehe oben. Die Zellen werden kultiviert, bis das Expansionsverhältnis mehr als das 10-fache beträgt, wonach ein Teil der Zellen auf dermale Membranen übertragen wird. Die verbleibenden Zellen dürfen weiterwachsen und werden nachfolgend auf dermale Membranen vor der Transplantation des Composits auf die beschädigte Haut übertragen.
Die Membranlösung wird eingefroren, vorzugsweise in der Gefrierkammer der membranbildenden Vorrichtung der Erfindung, die unten beschrieben wird, unter sorgfältig regulierten Temperaturbedingungen, wird dann lyophilisiert (gefriergetrocknet) und vernetzt durch physikalische oder chemische Mittel. Die Oberfläche der gebildeten trockenen Membran kann mit einer zusätzlichen Schicht eines biopolymeren Materials, wie einer Lösung von Collagen und GAG, die ein flüchtiges Gefrierschutzmittel, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält, beschichtet werden. Die Laminierschicht schränkt die Epidermiszellen, die nachfolgend auf der Membran kultiviert werden, auf die Oberfläche des Composits ein und hindert die Zellen daran, in das Innere der porösen Membran hineinzuwandern. Nach der Laminierung werden die trockenen Membranen rehydratisiert, physikalisch vernetzt, beispielsweise unter Verwendung von hohen Temperaturen und eines Vakuums oder von ultraviolettem Licht, oder chemisch vernetzt mit Glutaraldehyd. Die vernetzten Membranen werden dann gründlich gewaschen und aufbewahrt.
Dermale Membranen, die eine optimale Porosität und Dicke für das fibrovaskuläre Hineinwachsen aufweisen, können hergestellt werden, indem die oben beschriebene Membranlösung in die membranbildende Vorrichtung der Erfindung eingebracht wird.
Wie in den Fig. 8 bis 11 gezeigt, besteht die Vorrichtung (12) aus drei Rahmen, welche von rechteckiger Gestalt sein können; einem unteren Rahmen (13), der aus Aluminium oder Stahl oder einem anderen nicht-biegsamen Material, wie Holz oder Hartkunststoff, bestehen kann, und der eine elastische Dichtung (14) hat, die Siliconkautschuk oder ein anderes synthetisches Material sein kann und auf seiner oberen Oberfläche fixiert ist. Der untere Rahmen (13) hat Löcher (15) zur Aufnahme von Verbindungsschrauben (16). Ein äusserer Rahmen (17), hergestellt aus einem Material ähnlich wie das des unteren Rahmens (13), ist ausgekleidet mit einer elastischen Dichtung (18), die aus Siliconkautschuk oder einem anderen synthetischen Material besteht. Der äussere Rahmen (17) hat Wände (19), welche vertikal nach oben reichen, und hat ebenfalls Löcher (nicht gezeigt) zur Aufnahme von Verbindungsschrauben (16) . Eine Abstandshalterdichtung (20), hergestellt aus Siliconkautschuk oder einem anderen synthetischen Material, wird während der Verwendung zwischen dem unteren Rahmen (13) und den äusseren Rahmen (17) eingefügt und ragt in das Zentrum der Vorrichtung hinein, wie in den Fig. 10 und 11 klar gezeigt. Die Abstandshalterdichtung (20) hat auch Löcher (21) zur Aufnahme von Verbindungsschrauben (16). Ein innerer Rahmen (22) hat innere Abmessungen, welche erlauben, das er eng in den äusseren Rahmen (17) einpasst, und kann vertikale Wände (23) haben, welche nach innen von oben nach unten spitz zulaufen, wodurch das Einfügen in den äusseren Rahmen (17) erleichtert wird. Der innere Rahmen (22) hat ebenfalls eine elastische Dichtung (24), die an seiner unteren Fläche fixiert ist. Zusätzlich kann der innere Rahmen mit einem Querbalken (25) ausgestattet sein, um das Durchbiegen der Seiten des inneren Rahmens zu verringern, und Handgriffe (26) zur Entfernung des inneren Rahmens vom äusseren Rahmen. Blätter aus flexiblem, nicht-klebenden Material, wie Teflon (Polytetrafluorethylen) werden vorzugsweise bei der Vorrichtung verwendet. Ein unteres Blatt (27) wird während des Zusammensetzens der Vorrichtung zwischen den unteren Rahmen (13) und die Abstandshalterdichtung (20) eingefügt und ein oberes Blatt (28) wird zwischen den äusseren Rahmen (17) und den inneren Rahmen (22) eingefügt, wie in Fig. 8 gezeigt.
Wie in Fig. 10 gezeigt, stellt die zusammengesetzte Vorrichtung eine Gefrierkammer (29) zur Verfügung, die an den oberen und unteren Seiten durch das untere (27) und obere (28) Teflonblatt und in ihrem Umfang durch die Abstandshalterdichtung (20) begrenzt ist, vor, um die Membranlösung (durch schraffierte Linien in der Kammer (29) in Fig. 10 bezeichnet) während des Einfrierens zu enthalten.
Der untere Rahmen (13) kann mit Leitungen (30) ausgestattet sein, welche mit einem Kanal (31) verbunden sind (Fig. 8). Luftblasen, die sich im Gefrierbad unter dem unteren Teflonblatt (27) bilden, können durch die Leitungen entfernt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Spritze, die in den Kanal (31) eingefügt wird, um ein Absaugen zu erreichen.
Unter Bezugnahme auf Fig. 8, 9, 10 und 11 wird zur Zusammensetzung der Vorrichtung (12) das untere Teflonblatt (27) auf die elastische Dichtung (14) des unteren Rahmens (13) gesetzt. Die Abstandshalterdichtung (20) wird dann oben auf das untere Blatt (27) aufgebracht. Als nächstes wird der äussere Rahmen (17) auf die Abstandshalterdichtung (20) gestellt, und Schrauben (16) werden in die Löcher (15) im unteren Rahmen (13), dann durch das untere Blatt (27) in die Löcher (21) in der Abstandshalterdichtung (20) und in Löcher (nicht gezeigt) im äusseren Rahmen (17) eingefügt, so dass ein Teil der Abstandshalterdichtung (20) über den inneren Rand des äusseren Rahmens (17) in die Gefrierkammer (29) hinausreicht (Fig. 10 und 11). Das obere Teflonblatt (28) wird über dem äusseren Rahmen (17) angebracht. Der innere Rahmen (22) wird dann eng in den äusseren Rahmen (17) eingepasst, indem man nach unten drückt, so dass das obere Teflonblatt (28) sich um den inneren Rahmen (22) und zwischen dem inneren (22) und äusseren Rahmen (17), wie in Fig. 10 und 11 gezeigt, faltet. Die äusseren Ränder des inneren Rahmens (22) stehen mit der elastischen Dichtungsauskleidung (18) des äusseren Rahmens (17) in Kontakt, wenn der innere Rahmen sich im äusseren Rahmen befindet, und bilden eine Versiegelung. Die Abstandshalterdichtung (20) ragt nicht über den Rand des inneren Rahmens (22) hinaus, wenn die Vorrichtung zusammengesetzt ist.
Die Vorrichtung kann verwendet werden, um eine Membran mit vorherbestimmter Struktur wie folgt zu bilden. Eine geeignete Membranlösung, beispielsweise eine Lösung, die Collagen und GAG enthält, wie oben beschrieben, wird zur Bildung einer synthetischen dermalen Membran auf das obere Teflonblatt (27) und den vorspringenden Teil der Abstandshalterdichtung, die den Umfang der Gefrierkammer (29) bildet, gegossen. Das obere Blatt (28) wird dann über der Lösung und dem äusseren Rahmen angebracht. Der innere Rahmen (22) wird dann in den äusseren Rahmen (17) gedrückt. Die Membranlösung wird so in der Gefrierkammer (29) die sich zwischen den zwei Teflonblättern (27, 28) und der Abstandshalterdichtung (20) bildet, lokalisiert. Die Abmessungen der Gefrierkammer (29), die von der Lösung besetzt wird, sind bestimmt durch die Dicke der Abstandshalterdichtung (20), welche zu diesem Zweck in einem Bereich von verschiedenen Dicken gefertigt werden kann. Diese Dimensionen definieren das Volumen der Membranlösung, welche in die Gefrierkammer (29) eingebracht werden kann.
Die Membranlösung kann in der Vorrichtung wie folgt eingefroren werden. Nachdem die Lösung in die Gefrierkammer (29) zwischen die Teflonblätter (27, 28) eingegossen wurde, wird die Vorrichtung (12) in ein Gefrierbad, beispielsweise eine flache Pfanne mit Isopropanol, bei einer gewählten Temperatur eingebracht. Vorzugsweise ist das Gefrierbad von genügender Tiefe, um mit dem unteren Teflonblatt in Kontakt zu stehen, und hat ein ausreichendes Volumen und spezifische Wärme, um die Wärme aus der Membranlösung mit optimaler Gefriergeschwindigkeit zu absorbieren. Das Isopropanol wird auch auf das obere Teflonblatt gegossen, sofort nach Kontaktierung des unteren Teflonblattes mit dem Gefrierbad, um eine einheitliche Gefriergeschwindigkeit zu erzielen. Luftblasen, welche sich unter dem unteren Teflonblatt bilden können, können durch Absaugen durch den Kanal (31), der die Leitungen (30) verbindet, wie in Fig. 8 dargestellt, entfernt werden. Andere Verfahren zum Einfrieren der Membranlösung in der Gefrierkammer können verwendet werden, beispielsweise Kontaktierung der Kammer mit Aceton, das mit Trockeneis gekühlt wurde oder mit verflüssigten Gasen, wie etwa Stickstoff, Propan oder Luft. Der innere Rahmen (22) und das obere Blatt (28) werden vor der Lyophilisierung entfernt. Die eingefrorene Membran wird dann in einem Standard-Gefriertrockengerät lyophilisiert, worin die Temperatur sorgfältig mitverfolgt und reguliert wird, beispielsweise unter Verwendung eines digitalen Temperaturkontrollgeräts und einer Temperatursonde. Die lyophilisierte Membran wird dann thermisch dehydratisiert (in einem Ofen unter Verwendung eines Vakuums), wodurch das GAG an das Collagen und die individuellen Verbindungen miteinander physikalisch vernetzt werden. Die trockenen Membranen werden aus der Vorrichtung vor der weiteren Behandlung entfernt. Einmal getrocknet, kann die Membran aufbewahrt oder weiterbearbeitet werden.
Die Beschichtungung der Oberfläche einer dermalen Membran, die, wie oben beschrieben, gebildet wird, fördert die Lokalisierung der Epidermiszellen an der Oberfläche der Membran, statt der Penetration in die Membran hinein. Die Beschichtung der Oberflächen der dermalen Membran kann bewirkt werden durch Überziehen oder Aufsprühen einer Lösung aus biopolymeren Stoffen und einem flüchtigen Gefrierschutzmittel, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), auf eine nicht-klebende Oberfläche, beispielsweise ein Teflonblatt. Eine brauchbare Laminierzusammensetzung kann hergestellt werden aus Collagen, GAG und DMSO. Das DMSO kann in Konzentrationen verwendet werden, die von etwa 0,1 bis etwa 10 % reichen, und vorzugsweise bei etwa 3 %. Wenn das Aufbringen der Laminierungszusammensetzung auf die Teflonoberfläche vollständig ist, wird eine dermale Membran, hergestellt wie oben beschrieben, auf die besprühte Oberfläche in Kontakt mit der Laminierzusammensetzung aufgelegt. Das Teflon wird dann auf eine gekühlte Metalloberfläche gelegt, wie eine Messingplatte, die mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird, und die Membran und Laminierschicht lässt man einfrieren. Die laminierte Membran wird dann lyophilisiert, unter Hitze und Vakuum dehydratisiert, und kann im trockenen Zustand aufbewahrt werden. Vor der Gewebekultivierung werden die laminierten Membranen rehydratisiert, beispielsweise 0,05 M Essigsäure, dann ausführlich mit Wasser und dann mit einem geeigneten Kulturmedium gewaschen.
Die dermale Komponente des Hautersatzes der vorliegenden Erfindung kann so modifiziert werden, dass sie biologisch aktive Moleküle beinhaltet, wie Wachstumsfaktoren, beispielsweise um die Wundheilungsfähigkeiten des Hautersatzes zu steigern und/oder Wundinfektionen zu verringern.
Der Einbau von biologisch aktiven Molekülen wird durch Einführung zweier biochemischer Mechanismen erreicht, nämlich kovalenter Bindung und Konjugatbildung. Fig. 12 stellt die verschiedenen Mechanismen zur Einfügung von aktiven Molekülen in den Hautersatz der vorliegenden Erfindung dar. "Kovalente Bindung" ist die Bildung von nicht-ionischen chemischen Bindungen durch gemeinsame Teilhabe an Elektronen zwischen Atomen des Moleküls. Kovalente Bindungen sind in Fig. 12 als kurze Linien diagrammartig dargestellt, die Moleküle verbinden oder Moleküle mit einem Substrat verbinden. "Konjugatbildung" bezieht sich auf die sehr hohe Affinitätsassoziation zwischen Molekülen, welche keine chemisch kovalente Anlagerung ist. Die gemeinsame Konjugatbildung von zwei oder mehr Molekülen ist in Fig. 12 diagrammartig als enge Annäherung von Molekülen oder einem Molekül an ein Substrat in Fig. 12 dargestellt. Verschiedene biospezifische Anlagerungsmechanismen können verwendet werden, wie Antikörper/Antigen- oder Avidin/Biotin-Paare. Beispielsweise kann Biotin kovalent an ein Biopolymer der dermalen Komponente des Hautersatzes, wie Collagen, gebunden werden, so dass das Collagen "biotinyliert" wird. Das biotinylierte Collagen wird dann mit einem polykonjugierenden Protein, Avidin, konjugiert, welches wiederum kovalent an ein biologisch aktives Molekül, wie einen Wachstumsfaktor, beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor, den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), den Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor, insulinartigen Wachstumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktoren (α und β) und andere Wachstumsfaktoren, Hormone, Antibiotika oder entzündungshemmende Verbindungen gebunden wurde. Avidin wirkt somit als ein Adhäsivum zwischen den biotinylierten Verbindungen, wie Collagen, und dem biologisch aktiven Molekül. In den folgenden Beispielen wurde Biotin an solubilisiertes Collagen zur Konjugation mit Avidin gebunden, wodurch spezifische Mengen an biologisch aktiven Molekülen in die dermale Membran eingefügt wurden. Unter einem weiteren Bindungsmechanismus kann Biotin kovalent an biologisch aktive Moleküle gebunden werden und an das biotinylierte Collagen unter Verwendung von Avidin konjugiert werden, wie schematisch in Fig. 12E gezeigt.
Ein Composit-Hautersatz gemäss der Erfindung kann hergestellt werdend, indem man Epidermiszellen, wie normale menschliche epidermale Keratinocyten, im log-Phasen- Wachstum in einem wachstumsfördernden Medium züchtet, wie in MCDB 153, das wie oben beschrieben modifiziert wurde. Die Zellen werden in hinreichender Dichte auf die oberflächenlaminierten dermalen Membranen, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, aufgeimpft, und werden inkubiert, bis die Zellen eine zusammenfliessende Epithelschicht oder blattartige Schicht bilden, die an die dermale Membran anhängt.
Die biologische Akzeptanz einer synthetischen Membran in einer Wunde hängt teilweise von der Fähigkeit von nichtentzündungsverursachenden Bindegewebszellen ab, in die Membran aus dem Wundbett einzudringen. Daher müssen die Strukturen und biochemischen Charakteristika der Membran reproduzierbar und daraufhin optimiert sein, das fibrovaskuläre Eindringen zu beschleunigen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schliesst die Kontrolle von strukturellen Charakteristika, wie der Porosität und der Dicke der dermalen Membrankomponente eines Composit- Hautersatzes durch Regulierung spezieller Variablen während der Herstellung der Membrankomponente des Composits ein. Diese Variablen schliessen ein: die Temperatur, die verwendet wird, um die Membranlösung einzufrieren, das Volumen der eingefrorenen Lösung und die Konzentration [Gewichtsprozent/Volumen (Gew.%/Vol.)] der Verbindungen, die zur Membranbildung verwendet werden.
Die Membranporengrösse resultiert aus der Geschwindigkeit des Eiskristallwachstums während des Gefrierprozesses, welche invers proportional zu der Gefriergeschwindigkeit ist. Die Gefriergeschwindigkeit ist umgekehrt proportional zur Gefriertemperatur und direkt proportional zur Wärmeleitfähigkeit und spezifischen Wärme der Materialien, die mit der Membranlösung während des Gefriervorgangs in Kontakt stehen, beispielsweise der Teflonblätter der Vorrichtung. Daher kann die externe Porengrösse und Porengrössenvariabilität durch die Gefriertemperatur der zur Bildung der Membran verwendeten Verbindungen reguliert werden. Die Porengrösse ist umgekehrt proportional zur Konzentration der Verbindungen (direkt proportional zur Wasserkonzentration) in der Membranlösung und zur Gefriergeschwindigkeit der Membranlösung.
Die Dicke der Membran ist direkt proportional zur Konzentration der Verbindungen in der Lösung, die zur Bildung der Membran verwendet wird, und ist direkt proportional zur Dicke der Abstandshalterdichtung, die in der membranbildenden Vorrichtung verwendet wird.
In der erfindungsgemässen Vorrichtung, die zur Bildung einer dermalen Membran verwendet wird, erlaubt die verschlossene Gefrierkammer die Regulierung verschiedener Variablen während des Einfrierens der Membranlösung. Diese schliessen ein: die Temperatur, die Wärmeleitfähigkeit des Gefrierbades, das Volumen der eingefrorenen Lösung, die Konzentration der Verbindungen, die zur Bildung der Membran verwendet werden, und die Wärmeleitfähigkeit und spezifische Wärme der Materialien, welche mit der Lösung in Kontakt stehen, d.h. die nicht-klebenden Blätter der Vorrichtung. Die Kontrolle der Gefriergeschwindigkeit kann erreicht werden, indem ein schneller Wärmeübergang von der flüssigen Membranlösung an die Umgebung unterstützt wird. Daher schliesst die Vorrichtung vorzugsweise eine Gefrierkammer ein, die einen maximalen Wärmeübergang erlaubt, beispielsweise durch Verwendung von nichtklebenden Materialien mit einer hohen Wärmeleitfähigkeit, wie Teflonblätter mit ausgewählten Charakteristika (beispielsweise etwa 0,008 bis 0,025 cm dick bei einer Leitfähigkeit von 6 x 10&supmin;&sup4; cal cm/sek cm² ºC) zur Bildung der oberen und unteren Oberflächen der Kammer. Zusätzlich ist die Dicke der gebildeten Membran direkt proportional zur Dicke der Abstandshalterdichtung, die zur Verwendung in der Vorrichtung ausgewählt wird.
Die Wirkung der Gefriertemperaturen auf die Porengrösse der Membranen, die unter Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung dieser Erfindung hergestellt wurden, kann durch Messung von rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der trockenen Membranen bestimmt werden. Bevorzugte Temperaturen des Gefrierbades liegen zwischen 0 und -200ºC, stärker bevorzugt zwischen -20 und -50ºC, und besonders bevorzugt zwischen -40 und -50ºC. Diese Temperaturen minimieren die durchschnittliche Porengrösse und die Variabilität der Porengrösse in der Membran. Die Konzentration der membranbildenden Verbindungen, d.h. des Collagens und der Mucopolysaccharide, kann variiert werden, so dass eine kombinierte Gew.%/Vol.-Konzentration erzielt wird, welche die durchschnittliche externe Porengrösse herabsetzt und die Dicke der Membran erhöht. Konzentrationen in Kombination von 0,10 bis 2,0 Gew.%/Vol Membranverbindung können verwendet werden, während 0,50 bis 1,80 Gew.%/Vol bevorzugt werden.
Funktionelle dermale Membranen wurden unter Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung erhalten, indem eine 1 mm dicke Silicon-Abstandshalterdichtung, 0,52 Gew.%/Vol Collagen-GAG-Lösung und eine Einfriertemperatur von -40ºC gewählt wurden.
Die Beispiele, welche nun folgen, demonstrieren die biologische Anlagerung und das Wachstum in vitro von epidermalen Zellkulturen auf porösen resorbierbaren Collagen-GAG-dermalen Membranen, wodurch ein Composit- Hautersatz mit Vorteilen gegenüber vorhergehenden biosynthetischen Hautsubstituten gebildet wird. Die Composit-Hautersatzstoffe, die, wie hierin beschrieben, hergestellt wurden, wiesen im Vergleich zu HK-Kulturen alleine eine überlegene Transplantat-Anhaftung in vivo an Wunden auf. Die Keratinocyten wuchsen und breiteten sich aus, wodurch eine kontinuierliche Epithelschicht über der Oberfläche der dermalen Membranen gebildet wurde. Die gezüchtete Epidermis kann eine kontinuierliche epidermale Bedeckung wiederherstellen, die eine Wunde permanent schützen konnte. Die Composite waren histologisch ähnlich wie natürliche Haut compartmentalisiert, wobei die HK auf die äussere Oberfläche der porösen dermalen Membran durch die laminierte Collagen-GAG-Schicht beschränkt waren. Zusätzlich dazu, dass sie als mechanische Unterstützung für epidermale Zellschichten diente, beschleunigte die dermale Membran auch das Hineinwachsen von vaskulärem und nicht-entzündlichem Gewebe aus einer Wunde, wie durch Verwendung des Mausmodells demonstriert wurde. Die resultierende wiederherstellung des Bindegewebes und der Epidermis kann die Nachfrage nach einem stabilen Gewebe zur Wundreparatur erfüllen. Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung erfüllen den Bedarf an einem reproduzierbaren Verfahren zur Herstellung eines funktionellen Composit-Hautersatzes, der synthetische dermale Membranen enthält.
Von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung wird erkannt werden, dass zahlreiche Abweichungen bei der Gefriertemperatur, der Dicke der Abstandshalterdichtung (Volumen der Einfrierkammer) und der Konzentrationen der zur Bildung der Membran verwendeten Verbindungen gemacht werden können, um zu einer dermalen Membran mit optimaler Struktur und Porosität zur Verwendung bei Wundreparatur zu gelangen. Eine Variation der verwendeten Parameter zur Bildung der dermalen Membran wurde untersucht, und die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in den folgenden Beispielen dargelegt.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung von Composit-Hautersatzstoffen gemäss dem Verfahren und der Vorrichtung der Erfindung. Die Beispiele werden angeführt, um die vorliegende Erfindung zu demonstrieren und um einen Durchschnittsfachmann bei der Herstellung und Verwendung derselben zu unterstützen. Die Beispiele sollen in keiner Weise anderweitig den Umfang der Offenbarung oder den Schutz, der durch ein darauf gewährtes Patent gewährt wird, beschränken.

BEISPIEL 1

Regulation der letztendlichen dermalen Membranstruktur:
Dermale Collagen-Chondroitin-6-sulfat-Membranen wurden zur Untersuchung der Effekte der Einfriertemperatur und der Konzentration der Membranausgangsmaterialien auf die Membranstruktur wie folgt hergestellt.
1,2 g zerkleinertes Rindercollagen (USDA) wurden teilweise in 215 ml gekühlter (4ºC) 0,05 M Essigsäure solubilisiert und 1 Stunde homogenisiert. 35 ml gekühlte 0,05 M Essigsäure wurden zu 0,11 g Chondroitin-6-sulfat zugegeben (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und dann gerührt. Das Chondroitin-6-sulfat wurde mit dem Collagen durch tropfenweise Zugabe zum Collagen in einem gekühlten (4ºC) Homogenisator copräzipitiert, während etwa 2 Stunden lang homogenisiert wurde. Als das gesamte Chondroitin-6-sulfat zugegeben worden war, wurde die Mischung etwa 5 Minuten weiter homogenisiert. Blasen wurden aus der Collagen- Chondroitin-6-sulfat-Mischung unter Anlegen eines Vakuums entfernt. Die Mischung enthielt eine Konzentration von Collagen und Chondroitin-6-sulfat in Kombination von 0,52 Gew.%/Vol.
Die Lösung des Copräzipitats wurde unter Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung mit einer 1 mm- Abstandshalterdichtung zu Membranen geformt. Die Membranlösung wurde in die Einfrierkammer der Vorrichtung (ungefähres Volumen: 80 ml), die in den Fig. 8 bis 11 gezeigt ist, eingegossen, und die gesamte Vorrichtung wurde in ein 70 % Isopropanol-Gefrierbad in einem Virtis Unitop 800-Lyophilisator (Virtis Co., Gardiner, NY) (verwendet zum Einfrieren und nachfolgender Lyophilisierung) bei -40ºC 60 Minuten eingestellt. Die Bodentemperatur wurde während des Einfrierens auf innerhalb ± 1ºC durch ein digitales Temperaturkontrollgerät eng eingestellt und wurde unter Verwendung einer metallenen Temperatursonde, die an jedem Boden angefroren war, mitverfolgt. Die Temperatursonden wurden durch Wasser, das geschmolzenes Eis enthielt, kalibriert.
Nach dem Einfrieren wurden der innere Rahmen und das obere Teflonblatt entfernt, wodurch die eingefrorene Membranlösung zu weiterer Behandlung exponiert wurde. Die Vorrichtung wurde dann auf die Böden des Lyophilisators zur Gefriertrocknung bei 30ºC bei 1 x 10&supmin;&sup4; Pa über Nacht zurückgestellt.
Die Lyophilisierung wurde ausgeführt, bis die Membranen vollständig trocken waren. Nach der Lyophilisierung wurden die Membranen vorsichtig aus der Gefrierkammer herausgehoben und auf eine Aluminiumfolie gelegt. Die getrocknete Membran wurde dann in einen Vakuumofen zur Vernetzung durch thermische Dehydratisierung bei 105ºC und 1 x 10&supmin;&sup4; Pa während 24 Stunden gelegt.
Die getrocknete Membran wurde wie folgt oberflächenbeschichtet. Ein 8 x 8 cm-Quadrat der dermalen Membran, die, wie oben beschrieben, gebildet wurde, wurde unter Verwendung von 2,4 ml einer Mischung aus 0,52 Gew.%/Vol Collagen-Chondroitin-6-sulfat und 3 % Vol/Vol DMS0 laminiert. Die Mischung (0,060 ml/cm²) wurde gleichmässig auf ein Mylarblatt gesprüht, welches dann 2 bis 3 Minuten auf eine Messingplatte, die mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, gelegt wurde. Das Mylar wurde dann entfernt und auf den gekühlten Lyophilisatorboden (-40ºC) gelegt und, wie oben dargestellte, lyophilisiert. Die Membran wurde sorgfältig in Plastik verpackt und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Vor der Gewebezüchtung von HK- Zellen auf den dermalen Membranen wurden die Membranen, die, wie oben beschrieben, hergestellt worden waren, in 0,05 M Essigsäure 24 Stunden rehydratisiert, dann chemisch unter Verwendung von 0,25 % Glutaraldehyd in 0,05 M Essigsäure 24 Stunden fixiert. Die Membran wurde dann dreimal in sterilem destillierten Wasser abgewaschen, eingebracht in 70 % Isopropanol (Raumtemperatur) und eingefroren. Das Isopropanol wurde weitere drei Mal durch steriles Wasser und dreimal durch Kulturmedium vor der Beimpfung mit HK-Zellen ausgetauscht.
Die wie oben beschrieben hergestellte Membranlösung wurde in einem Gefrierbad in Temperaturbereichen von -50 bis -20ºC unter Verwendung der Vorrichtung der Erfindung eingefroren. Die Materialien wurden in der Vorrichtung eingefroren, dann in einem Vakuumofen (105ºC, 1 x 10&supmin;&sup4; Pa) 24 Stunden getrocknet. Zur Bestimmung der Membranporengrösse wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (40-fache und 200-fache Vergrösserung) von jeder der beiden trockenen Membranen für jede Einfriertemperatur hergestellt. Drei Längenmessungen der Porengrösse wurden in zueinander senkrecht stehenden Achsen entlang der mikroskopischen Aufnahmen vorgenommen, und der durchschnittliche Porendurchmesser wurde als die mittlere Anzahl von Schnitten pro Einheitslänge ausgewertet. Die Porengrösse wurde für Messungen auf den jeweiligen Achsen als mittlerer Porendurchmesser über Gefriertemperatur ausgedrückt.
Die Daten, die aus den Längenmessungen des Porendurchmessers über die Gefriertemperatur gesammelt wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. TABELLE 1 Effekt der Gefriertemperatur auf die Porengrösse Gefriertemperatur Porendurchmesser* X-Achse Y-Achse * mittlerer Durchmesser (um) + SEM
Tabelle 1 zeigt, dass die Porosität der dermalen Membran, die aus einem wässrigen Copräzipitat von Rindercollagen und GAG hergestellt wurde, ausgedrückt als mittlerer Porendurchmesser, durch die Einfriertemperatur des Copräzipitats reguliert werden kann. Der durchschnittliche Porendurchmesser stieg mit einem Anstieg der Temperatur des Gefrierbades an. Der Porengrössenanstieg geschah asymmetrisch, was nahelegt, dass ein vektorieller Prozess (beispielsweise Eiskristallbildung) den Anstieg verursachte. Die Variabilität der Porengrösse stieg ebenfalls als Funktion der gestiegenen Gefriertemperaturen vor dem Gefriertrocknen an. Eine Verringerung der Porengrössenvariabilität auf ein Minimum durch strenge Regulierung der Gefriertemperatur während der Synthese der dermalen Membran kann zu höheren biologischen Akzeptanzraten der Membran durch Wunden beitragen.
Dermale Membranen mit kontrollierter Porengrösse und Dicke als Funktion der vereinigten Konzentrationen (Gew.%/Vol) der Membranausgangsmaterialien wurden ebenfalls erhalten. 10 Membranen (zwei bei jeweils fünf Konzentrationen der Ausgangsmaterialien) wurden wie in Beispiel 1 hergestellt unter Verwendung von 0,38; 0,67; 1,20; 2,15 und 3,72 g Rindercollagen, dispergiert in 215 ml 0,05 M Essigsäure in einem gekühlten (4ºC) Homogenisator.
Die Collagendispersionen wurden mit 35 ml Volumina 0,05 M Essigsäure, die 35, 56, 185, 189 bzw. 326 mg Chondroitin- 6-sulfat (GAG) enthielt, ausgefällt. Die resultierenden Copräzipitate hatten Gew.%/Vol-Konzentrationen von 0,17; 0,29; 0,52; 0,94 und 1,62. Jedes Copräzipitat wurde in der Vorrichtung der Erfindung in einem Gefrierbad bei -40ºC eingefroren, lyophilisiert und durch thermische Dehydratisierung bei 105ºC und 1 x 10&supmin;&sup4; Pa behandelt. Drei trockene Proben der jeweiligen Membran wurden hergestellt zur und überprüft durch Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der externen Porengrösse. Um die Porengrösse zu bestimmen, wurden drei Längenmessungen in senkrecht zueinander stehenden Achsen entlang der mikroskopischen Aufnahmen (100-fache Vergrösserung) durchgeführt und der durchschnittliche Porendurchmesser wurde als die mittlere Anzahl von Durchschneidungen pro Einheitslänge ausgewertet. Zwei nasse Proben der jeweiligen Membran wurden in 2 % Glutaraldehyd fixiert, zur Histologie vorbereitet, rechteckig zu den externen Oberflächen geschnitten und auf Glasträger montiert. Die Membrandicken wurden auf einem Inversmikroskop gemessen. Die Daten werden in Tabelle 2 gezeigt und ausgedrückt als mittlerer Porendurchmesser über die vereinigten Konzentrationen der Ausgangsmaterialien. TABELLE 2 Konzentrationseffekt bezüglich Porengrösse Konzentrationen (Gew. %/Vol) Porendurchmesser* X-Achse (±SEM) Y-Achse (±SEM) * Werte gelten für den mittleren Durchmesser (um) + SEM (mittlerer Standardfehler)
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde eine minimale Porengrösse bei Verwendung einer Konzentration von 0,94 bis 1,62 Gew. %/Vol erhalten.
Daten, die aus Längenmessungen der Membrandicke über die Konzentration der Ausgangsmaterialien erhalten wurden, werden in Tabelle 3 zusammengefasst. TABELLE 3 Konzentrationseffekt auf die Membrandicke Konzentration (Gew. %/Vol) Dicke (±SEM)
Tabellen 2 und 3 zeigen, dass ein Anstieg in der Konzentration der Ausgangsstoffe in einer Collagen- und GAG-dermalen Membran eine Abnahme in der durchschnittlichen externen Porengrösse der trockenen Membran und einen Anstieg in der Dicke der nassen Membran herbeiführte. Die optimale Dicke wurde bei einer Konzentration von 0,52 Gew.%/Vol erreicht.
Die Verfahren zur Herstellung der dermalen Membranen, die hierin beschrieben wurden, sind hoch reproduzierbar und können somit einfach innerhalb enger Grenzen zur Erzeugung von dermalen Membranen mit vorhersagbaren Charakteristika bezüglich Dicke und Porengrösse reguliert werden.

BEISPIEL 2

In vivo-Applikation des Composit-Hautersatzes; Bildung der dermalen Membran:
Eine dermale Collagen-Chondroitin-6-sulfat-Membran wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer Gesamtkonzentration von 0,52 Gew.%/Vol Collagen und Chondroitin-6-sulfat, einer 1 mm-Abstandshalterdichtung und einem Gefrierbad bei -40ºC hergestellt.
HK-Kulturen wurden aus menschlichen chirurgischen Restproben herangezüchtet und kultiviert in Nährmedium MCDB 153, enthaltend 0,3 mM Calcium, erhöhte Mengen an ausgewählten Aminosäuren, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 5 ug/ml Insulin, 0,5 ug/ml Hydrocortison, 0,1 mM Ethanolamin und 0,1 mM Phosphoethanolamin, 0,5 % (V/V) Rinderhypophysenextrakt (BPE) und Penicillin-Streptomycin-Fungizon als Antibiotikum-Antimycotikum.
Dermale Membranen mit einem Durchmesser von 7 cm wurden steril aus 70 % Isopropanol in Petrischalen übertragen, die Hepes-gepufferte Kochsalzlösung (3 Wechsel) enthielt, gefolgt von Gewebekulturmedium (zweimaliger Wechsel, jeweiliges Minimum 1 Stunde), wie beschrieben, oder zusätzlich 20 % (V/V) fötales Rinderserum (FBS) (zur Transplantation des Composits an Tiere). Die Membranen wurden in das Kulturmedium in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO&sub2; eingetaucht. HK im log-Phasen-Wachstum wurden aus Kolben durch Trypsinisierung entfernt und auf die Membranen in einer Dichte von 0,5 bis 1,0 x 10&sup5;/cm² aufgeimpft. Nach 5 bis 11 Tagen Inkubation in den jeweiligen Medien bei täglichem Wechsel wurden die HK- Dermalmembran-Composite zur Transplantation präpariert oder wurden in gepuffertem Glutaraldehyd fixiert und zur mikroskopischen Überprüfung hergerichtet. Das Composit hatte eine Gesamtdicke von weniger als 0,5 mm (0,020 inches). Die in den Fig. 3A und B gezeigten Composite hatten einen Dickebereich von 0,2 bis 0,3 mm (0,008 bis 0,012 inches)
Dermalmembran-HK-Composite wurden in Glykolmethacrylat eingebettet (JB-4; Polysciences, Warrington, PA) , auf 5 um Dicke geschnitten und angefärbt mit 0,1 % Toluidin-Blau zur Lichtmikroskop-Histologie. Identische Proben wurden in Epon-Araldit (E.F. Fullam, Latham, NY) eingebettet, gefolgt von einer Präparation ultradünner Schnitte, Anfärbung mit Uranylacetat und Bleicitrat und Überprüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), wie beschrieben von Wolosewick et al in Practical Tissue Culture Applications (Herausgeber: Maramorosch and Himur), Academic Press, NY, S. 58-85 (1979).
Composite aus kultivierten HK und Collagen-Chondroitin-6- sulfat-Membranen konnten ohne Sekundärträger oder Transporthilfsmittel verwendet werden (Fig. 2). Die Ersatzstoffe wurden an ihre Stelle drapiert, angehoben und umgesetzt ohne Beschädigung der kultivierten epidermalen Oberfläche, und waren weniger fragil als kultivierte Epidermalschichten alleine.
Die porösen dermalen Collagen-Chondroitin-6-sulfat- Membranen allein hatten eine beschränkte Elastizität und Zugfestigkeit, wie durch subjektive Auswertung bestimmt wurde. Nach der Bildung einer partiell ausgebreiteten epidermalen Schicht auf der Membranoberfläche stieg die physikalische Festigkeit des Composit-Transplantats entsprechend dem Ausbreitungsgrad der epidermalen Schicht an. Im Gefolge der Bildung einer epidermalen Schicht in vitro hatte das Composit-Transplantat eine grössere physikalische Festigkeit als kultivierte epidermale Blattschichten allein oder als die dermale Membran allein, doch weniger als zweiteilige Haut.
Das histologische Aussehen des Composit-Hautersatzes wurde verglichen mit zweiteiliger Haut, wie in Fig. 3 gezeigt. 5 Tage nach Beimpfung mit kultivierten HK hatte sich eine kontinuierliche und teilweise mehrschichtige Epithelschicht gebildet. Die Zugabe von 20 % fötalem Rinderserum (FBS) während mindestens 48 Stunden beschleunigte die Bildung einer einheitlichen HK-Schicht, die kuboide Zellen enthielt, die an der Membran anhingen, und abgeflachte Zellen auf der äusseren Oberfläche (Fig. 3A). Eine identische Probe ohne FBS (Fig. 3B) wies ebenfalls kuboidartige Zellen auf, die an der dermalen Membran angelagert waren, doch etwas weniger gut organisierte "suprabasale" HK-Schichten. Die Histologien beider Zustände zeigten eine diskrete Trennung in epidermale und dermale Compartmente, und mitotische Zellen anhängend an die dermale Membran (Fig. 3C, D). Die diskreten dermalen und epidermalen Compartmente vergleichen sich günstig mit der histologischen Organisation zweiteiliger Haut (Fig. 3E).
HK-Kulturen auf dermalen Membranen bildeten mehrschichtige, teilweise verhornte Epidermisschichten nach 11 Tagen in Kultur (Fig. 4). Bei niedriger Vergrösserung wurden 10 Zellschichten gesehen (Fig. 4A). Zellen, die an die dermale Membran anhingen, waren viel weniger abgeflacht als Zellen in den Schichten, die nicht direkt an das Substrat angebunden waren. Nur die obersten Schichten weisen verhornte Zellhüllen auf (CCE; Fig. 4B). Desmosomen, die die Zellschichten verbanden und die epithelartige Natur der kultivierten Zellen bestätigten, traten häufig auf (Fig. 5). An der Grenzfläche der gezüchteten HK und der dermalen Membran wurden zelluläre Verbindungen zur Membran beobachtet. Hemidesmosomen (HD) (Fig. 6A, B) bildeten sich zwischen HK-Zellen und der dermalen Membran, wodurch eine zelluläre Adhäsion an den Träger erzielt wurde. Die extrazelluläre Matrix (ECM; Fig. 6A, B) war kontinuierlich zwischen HK und der Membran gelegen. Die Zusammensetzung der ECM wurde nicht bestimmt, aber es wurde gezeigt, dass HK-Zellen, die in diesen Kulturbedingungen gezüchtet wurden, Fibronectin auf dem Träger ablagern, an welchen sich die Zellen anlagern. Cubo et al, J. Invest. Dermatol., 82(b): 580-586 (1984). HD und ECM wurden einheitlich entlang der zelldermalen Membranverbindung sowohl in serumfreien Proben wie auch in solchen mit 20 % FBS verteilt. Zusätzlich wiesen Composite extrazelluläre Fasern in der dermalen Membran auf, die unmittelbar an die Zell-dermale Membran (Fig. 6C) anhingen. Das Wiederholungsmuster in den Fasern ist konsistent mit dem periodischen Muster von Collagen. Diese Fasern befanden sich nur innerhalb sehr kurzer Entfernungen von der Zell-dermalen Membranverbindung, was auf ihre Ablagerung durch HK in Kultur hinweist.
Athymische (nackte) balb/c weibliche Mäuse wurden mit Avertin (Tribromethanol in tert-Amylalkohol) anästhetisiert, und Hautdefekte von 2 x 2 cm wurden bis zur Tiefe des Panniculus carnosis an der dorsolateralen Ansicht des Körpers unmittelbar hinter dem Vorderschenkel präpariert.
Behandlungen, die an den Defekten vorgenommen wurden, schlossen ein: (A) 180º Drehung und Ersatz der ausgeschnittenen Haut (Autotransplantat); (B) Aufbringen eines frischen menschlichen Xenotransplantats; (C) Aufbringen des Collagen- und Chondroitin-6-sulfat-dermalen Hautersatzes, der oben beschrieben wurde; und (D) kein Transplantat. Im Gefolge der Behandlung wurden die Wunden mit Biobrane abgedeckt, die an die umgebende unbeschädigte Haut mit verschliessenden Klebeverbänden befestigt war (Op-Site , Bioclusiveö ) und bandagiert. Nach 1 Woche wurden Tiere, die den dermalen Hautersatz ((C), siehe oben) erhielten, nachfolgend mit einer Kombination von Zellsuspensionen von aktiv wachsenden menschlichen, epidermalen Keratinocyten (HK), die wie oben beschrieben gezüchtet worden waren, plus zusammenfliessenden Blättern aus HK transplantiert und wieder verbunden. Am 41. Tag wurden die Tiere getötet, die reparierten Wunden wurden exzisiert, fotografiert und durch computerisierte Planimetrie ausgemessen. Die Wiederherstellung der Hautfunktion nach Schliessung der Wunden in voller Tiefe mit kultivierten Hautsubstituten kann maximiert werden, wenn die Wundkontraktion minimiert wird.
Daten für die Wundkontraktion aus den verschiedenen Behandlungen werden in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Behandlung % ursprüngliche Wundgrösse 1) Autotransplantat 2) menschliches Xenotransplantat 3) Composittransplantat 4) kein Transplantat
Die Ergebnisse aus einem späteren Experiment, durchgeführt wie für die Daten in Tabelle 4 beschrieben, werden in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Behandlung % ursprüngliche Wundgrösse 1) Autotransplantat 2) menschliches Xenotransplantat 3) Composittransplantat 4) kein Transplantat
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Composit- Hautersatzstoffe, die aus Collagen- und Chondroitin-6- sulfat-dermaler Membran und kultivierten menschlichen epidermalen Keratinocyten bestehend, weniger wirksam zur Verkleinerung der Wundkontraktion waren als intaktes Maus- Autotransplantat oder menschliches Xenotransplantat, aber wirksamer als kein Transplantat. Die Hautersatzstoffe können somit als biologische Bedeckung dienen, um die Kontraktion von offenen Wunden zeitweise zu verzögern. Haut, die mit dem Composit-Transplantat repariert wurde, ähnelt histologisch unbeschädigter Haut, jedoch ohne dermale anhängende Strukturen. 6 Wochen nach der Anwendung auf Hautdefekte in voller Tiefe hatten die Composit- Ersatzstoffe die Wunden geschlossen und erlaubten die Wiederherstellung von Haut in voller Dicke (Fig. 7). Das netzartige Muster in der dermalen Komponente der reparierten Haut stellt Flächen dar, wo die dermale Membran noch nicht vollständig durch sich regenerierendes Bindegewebe ersetzt worden war. Die reparierte Epidermis war sehr gut organisiert, mehrschichtig ausgebreitet und differenziert, enthielt aber keine Netzzäpfchen oder epidermale anhängende Strukturen.
Der Erfolg von Transplantaten mit kultivierten HK hängt auch von der Fähigkeit der kultivierten Zellen ab, die Proliferation über unbestimmte Zeit in Analogie zu epidermalen Stammzellen fortzusetzen. Frühere Untersuchungen kombinierten gezüchtete HK-Blattschichten mit Collagen-GAG-dermalen Membranen in vitro, und ergeben keine Anlagerung der HK-Blattschichten an die dermalen Membranen bei einer Reihe von Kulturbedingungen. Unter Befolgung dieser Ergebnisse erbrachten Zellwachstumsuntersuchungen, dass zusammenfliessende Blattschichten von HK-Zellen ein stark reduziertes Wachstumspotential haben im Vergleich zu subconfluenten Kulturen. Dieser Befund ist konsistent mit der "Dichteinhibierung" zusammenfliessender (confluenter) HK- Kulturen, da diese von der exponentiellen Wachstumsphase (aktives Wachstum, subconfluent) in die stationäre Wachstumsphase (angehaltenes Wachstum, confluente Blattschichten) übergehen; Wille et al, J. Cell. Physiol., 121:31-44 (1984); Pittelkov et al, J. Invest. Dermatol. 86:401-417 (1986). Die Tatsache, dass sich HK- Zellschichten nicht an die Membran anlagern, reflektiert einen Verlust des Wachstumspotentials, verbunden mit Wachstumsstopp nach Übergang in die stationäre Wachstumsphase. Darauffolgend wurden HK-Kulturen in der exponentiellen Wachstumsphase direkt auf die dermale Membran aufgeimpft, und es wurde gefunden, dass sie sich bereitwillig anlagerten und unter Bildung kontinuierlicher Zellblattschichten weiter wuchsen. Die Verwendung von HK in der exponentiellen Wachstumsphase auf dermalen Membranen erhält nicht nur das Wachstumspotential, wie demonstriert wird durch das Vorliegen von mitotischen Zellen in den Composittransplantaten, sondern sie waren auch in der Lage, ihre eigenen Hemidesmosomen, extrazelluläre Matrix und Collagen zur Anlagerung an die Collagen-GAG-Membran herzustellen. Man darf erwarten, dass der Erhalt des Wachstumspotentials durch Herstellung von Composittransplantaten mit HK-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase den Anteil von Zellen im Transplantat erhöht, die zu Langzeitproliferation nach Applikation auf die Wunde in der Lage sind, in Analogie zu Keratinocyten- Stammzellen in der unbeschädigten Epidermis.
Obwohl die Langzeitproliferation von zentraler Wichtigkeit für die Permanenz des gezüchteten Transplantats ist, ist eine gewisse epidermale Schichtenbildung ebenfalls wünschenswert, um die Zerbrechlichkeit des Transplantats zu reduzieren und dazu beizutragen, die proliferierenden Zellen vor mechanischer Beschädigung zu schützen. Die Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) zu den Kulturbedingungen beschleunigte die epidermale Schichtbildung und Differenzierung, erlaubte jedoch auch anhaltende Zellteilung, wie demonstriert wurde durch das Vorliegen von mitotischen HK in der partiell mehrschichtigen, epidermalen Komponente des Composittransplantats. Es wurde jedoch gezeigt, dass FBS das Wachstum von HK in vitro stark inhibiert. Pittelkov et al, J. Invest. Dermatol. 86:410-417 (1986). Reduziertes Wachstum und erhöhte Differenzierung in Anwesenheit von FBS ist vergleichbar zur Regulierung der HK-Wachstumsrate und Differenzierung durch die Calciumionenkonzentration in serumfreien und in biochemisch definierten Kulturmedien. Boyce and Ham, J. Invest. Dermatol. 81(1), suppl.: 335-405 (1983); Wille et al, J. Cell Physiol. 121:31-44 (1984). Daher kann der Grad fortgesetzter HK-Proliferation und HK- Schichtbildung als Funktion der Konzentration von FBS und Calciumionen im Kulturmedium eingestellt werden. Der Effekt der Dichteinhibierung der HK-Proliferation nach Zusammenfliessen auf der dermalen Membran wird jedoch die zelluläre Wachstumsrate unabhängig von den Effekten der FBS- oder Calciumionenkonzentration reduzieren.

BEISPIEL 3

Die Leistungsfähigkeit von Composit-Hauttransplantaten, bestehend aus Collagen-Glycosaminoglycan-dermalen Substituten und gezüchteten menschlichen, epidermalen Keratinocyten wird getestet durch Applikation auf Hautwunden in voller Tiefe (2 x 2 cm bis zu einer Tiefe des Paniculus carnosis) bei gleichgeschlechtlichen athymischen balb/c-Mäusen. Die behandelten Wunden werden steril mit einer Kombination aus nicht-klebenden Materialien, wie Polypropylensieb, das mit den Transplantaten und der Wunde in Kontakt steht, verbunden. Die Transplantate werden dann auf der Oberfläche, die zur Umgebung hin exponiert ist, mit sterilen, dampfdurchlässigen Materialien abgedeckt, beispielsweise mit vasilinimprägnierter Gaze. Die Wundbehandlung mit Composittransplantaten wird verglichen mit der Behandlung mit Mäuse-Autotransplantat, menschlichem Xenotransplantat oder keinem Transplantat nach 6 Wochen Beobachtung. Die Persistenz von kultivierten menschlichen Epidermiszellen kann als Indikator für die Akzeptanz der Zellen verwendet werden und wird durch Anfärben von histologischen Schnitten reparierter Haut mit Antikörpern gegen menschliche Histokompatibilitäts-Antigene (HLA-ABC) verifiziert. Vorläufige Resultate zeigen, dass diese Anfärbung, wie erwartet, erhalten wird. Die Akzeptanzrate von kultivierten menschlichen Zellen wird bestimmt als:
reparierte Wunden positiv auf HLA-ABC/alle Wunden, die mit Composittransplantaten behandelt wurden x 100 =% Akzeptanz
Die Wundkontraktion liefert einen Vernarbungsindex und wird direkt durch rektilineare Planimetrie von Fotografien präparierter Wunden gemessen. Quantitative Daten aus Wundgrössenmessungen erlauben eine statistische Analyse der Wundkontraktion. Eine positive Korrelation der reduzierten Wundkontraktion mit erhöhter Akzeptanz der Compisittransplantate liefert einen Index, durch den die Leistungsfähigkeit von Composittransplantaten bei der Behandlung von Hautwunden in voller Tiefe bei minimaler Narbenbildung demonstriert werden kann.

BEISPIEL 4

Biotinylierung von Collagen:

Biotin-N-hydroxysuccinimid (BNHS) wurde kovalent an Collagen gebunden, indem Modifikationen des Verfahrens, beschrieben von Guesdon et al, J. Histochem. Cytochem., 27(8):1131-1139 (1979) verwendet wurden. Kurz gesagt wurde BNHS (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO; Cat. Nr. H1759) in einer Konzentration von 0,1 M in Dimethylformamid gelöst und gemischt mit solubilisiertem Collagen in einem ungefähren Molverhältnis von 10:1 und wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 4ºC gegen mehrfach gewechselte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert. Nach der Dialyse wurde das biotinylierte Collagen 1:1 mit Glycerin gemischt und bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.
Biotinyliertes Collagen oder nicht-biotinyliertes Collagen wurde 1:3, 1:5, 1:10 und 1:30 verdünnt, wofür 0,05 M Tris- Cl-Puffer, pH 7,6, verwendet wurde. Als nächstes wurden 3 ul einer jeden Verdünnung auf Nitrocellulose (NC)-Papier fleckartig aufgebracht und luftgetrocknet gemäss dem Flecktest zur Detektion von HRP, das kovalent an Avidin gebunden war (Avidin-HRP) , beschrieben von Boorsma et al, Histochemistry 84:333-3337 (1986). NC-Papier wurde mit 0,05 % Tween 20 in PBS (Tween-PBS) benetzt, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit derselben Lösung. Das NC- Papier wurde drainiert, 5 ul 0,1 bis 1,0 mg/ml Avidin-HRP wurden über jedem Fleck aufgebracht und 30 Minuten inkubiert. Das NC-Papier wurde dreimal 10 Minuten gewaschen, geflutet mit einer Färbelösung von 0,5 mg/ml Diaminobenzidin in 0,05 M Tris, pH 7,6, das 0,01 % H&sub2;O&sub2; enthielt (Graham et al, J. Histochem. Cytochem. 14(4):291- 302 (1966), und dann entwickelt. Die Reaktion wurde mit Tween-PBS gestoppt.
Fig. 13 stellt die Fleck-Testergebnisse für kovalent an Avidin, das mit solubilisiertem Collagen umgesetzt worden war, gebundenes HRP vor und nach der Biotinylierung dar. Avidin-HRP wurde konjugiert an und färbte biotinyliertes Collagen in Verdünnung 1:2, 1:3, 1:5 und 1:10 (Fig. 13A und 13B) aus einer Ausgangskonzentration von 0,15 Gew.% pro Vol. Eine 1:30-Verdünnung von biotinyliertem Collagen zeigte eine schwache Reaktion mit Avidin-HRP und demonstrierte die Verdünnung des Konjugationssubstrats (Fig. 13C). Keine Konjugatbildung von Avidin-HRP mit nicht-biotinyliertem Collagen trat auf (Fig. 13D, 13E und 13F), was die spezifische Konjugatbildung von Avidin-HRP an biotinyliertes Collagen demonstriert.

BEISPIEL 5

Um die Fähigkeit einer aktiven Verbindung zum Einbau in die dermale Membran zu demonstrieren, wurde solubilisiertes Collagen vor und nach der Biotinylierung an Avidin exponiert, gefolgt von Reaktion mit dem kovalent an Biotin gebundenen Enzym HRP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Fig. 12C und D). Biotin-HRP wurde konjugiert an und färbte biotinyliertes Collagen nach Reaktion mit Avidin, wurde jedoch nicht konjugiert an nicht- biotinyliertes Collagen, das mit Avidin umgesetzt worden war. Dies demonstriert wiederum die Spezifität der Konjugatbildung von Avidin an biotinyliertes Collagen. Dies demonstriert ebenso die Konjugatbildung von biotinylierten Proteinen an polykonjugatbildende Avidinmoleküle. Wenn eine der biotinylierten Verbindungen Collagen in Form eines Hautersatzes ist, können andere biotinylierte Verbindungen durch Avidin an den Hautersatz konjugiert werden.

BEISPIEL 6

Solubilisiertes Collagen wird, wie oben in Beispiel 4 beschrieben, biotinyliert. Avidin wird dann zugegeben, um mit den an das Collagen fixierten Biotingruppen zu konjugieren. Biotin, das kovalent an biologisch aktive Moleküle, wie Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), gebunden war, wird dann mit dem Avidin, das an das biotinylierte Collagen konjugiert war, konjugiert. HRP, das kovalent an einen Antikörper gebunden war, beispielsweise HRP, gebunden an einen Anti-FGF-Antikörper (Massoglia et al, J. Cell. Physiol. 132(3):531-537 (1987)) kann verwendet werden, um die Konjugatbildung von FGF an Collagen mittels der Biotin-Avidin-Biotin-Bindung (Fig. 12E) zu verifizieren. HRP-Antikörper wird unter Verwendung des Fleckentests, der oben in Beispiel 3 beschrieben wurde, detektiert oder kann spektrophotometrisch in einem Assay quantifiziert werden, der ähnlich ist zu einem Festphasen- Enzymimmunoassay (ELISA).
Die dermale Komponente, in die FGF eingefügt wurde, wird dann mit der epidermalen Komponente aus kultivierten menschlichen Hautzellen beimpft, wie beschrieben in Beispiel 2 oben, wodurch ein Composit-Hautersatz gebildet wird. Das Composit wird dann durch Transplantation auf eine Wunde in einem Tiermodell, beispielsweise athymische (nackte) balb/c-Mäuse, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, getestet, um die Fähigkeit des Composits, bei dem biologisch aktive Moleküle in die dermale Membran eingebaut wurden, zur Beschleunigung der Hautreparatur und/oder der Prävention von Wundinfektion zu bestimmen. Die für das Composit erhaltenen Ergebnisse werden mit den Ergebnissen verglichen, die mit menschlichem Xenotransplantat, Autotransplantat und keinem Transplantat erhalten wurden, wobei Wundkontraktionsmessungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet werden oder indem die Persistenz von kultivierten menschlichen Epidermiszellen im Compositersatz (Beispiel 3) bestimmt wird.
Die kovalente Bindung von Einheiten, wie Biotin, an die dermale Komponente des Ersatzstoffs stellt einen Mechanismus zur biochemischen Modifikation der dermalen Komponente zur Förderung des zellulären Wachstums in und auf den Biopolymerkern des Hautsubstituts zur Verfügung. Beispielsweise können biologisch aktive Moleküle, wie FGF, in die dermale Membran zur Förderung der Wundheilung, dem Wachstum von neuen Blutgefässen (Angiogenese) und/oder der Reduktion von Wundinfektion (Sepsis) eingebaut werden. Dies, kombiniert mit der oben beschriebenen Regulierung der Struktur der dermalen Membran, erlaubt eine strukturelle und biochemische Optimierung von dermalepidermalen Hautersatzstoffen zur Wundreparatur.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer biosynthetischen, porösen und resorbierbaren dermalen Membran, gekennzeichnet dadurch, dass es folgende Schritte enthält:

(a) Kombinieren von membranbildenden Verbindungen durch Kopräzipitation zur Herstellung einer Membranlösung mit einer vorgewählten Konzentration der Verbindungen zur Bereitstellung einer vorbestimmten Porengrösse und Dicke;

(b) Einfrieren dieser Membranlösung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit zur Bildung einer gefrorenen Membranlösung;

(c) Lyophilisierung der gefrorenen Membranlösung zur Bildung einer lyophilisierten Membran;

(d) Vernetzung dieser lyophilisierten Membran zur Bildung einer lyophilisierten und vernetzten Membran; und

(e) Oberflächenbeschichtung dieser lyophilisierten und vernetzten Membran zur Förderung der Lokalisation von Epidermiszellen auf der Oberfläche dieser dermalen Membran, wenn die Membran mit Epidermiszellen zur Bildung eines zusammengesetzten Hautersatzes kombiniert wird, wodurch eine dermale Membran mit einer vorbestimmten Struktur gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch, worin der Oberflächenbeschichtungsschritt (e) folgende Sub- Schritte umfasst:

(a) Beschichtung einer nicht klebenden planaren Oberfläche mit einer Schicht einer Beschichtungslösung, die membranbildende Verbindungen enthält;

(b) Kontaktieren der lyophilisierten und vernetzten Membran von Schritt d) in Anspruch 1 mit der Schicht der Beschichtungslösung;

(c) Einfrieren dieser Membran in Kontakt mit der Schicht der Beschichtungslösung zur Bildung einer gefrorenen Membran und Schicht der Beschichtungslösung;

(d) Lyophilisieren dieser gefrorenen Membran und Schicht der Beschichtungslösung zur Bildung einer lyophilisierten oberflächenbeschichteten Membran; und

(e) Vernetzung dieser lyophilisierten oberflächenbeschichteten Membran zur Bildung einer beschichteten porösen resorbierbaren dermalen Membran.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die membranbildenden Verbindungen Collagen und Mucopolysaccharid sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die membranbildenden Verbindungen Rindercollagen und Chondroitin-6-sulfat in einer Konzentration von zusammen 0,10 Gew.-%/vol. bis 2,0 Gew.-%/vol. sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Einfrierens der Membranlösung ein Einfrieren bei Temperaturen von 0ºC bis -200ºC umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 2, worin die membranbildenden Verbindungen Collagen und Mucopolysaccharid sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Beschichtungslösung weiterhin ein flüchtiges Gefrierschutzmittel umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Collagen Rindercollagen ist und das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat in einer Konzentration von zusammen von 0,10 Gew.-%/vol bis 2,0 Gew.-%/vol ist und das Gefrierschutzmittel DMSO in einer Konzentration von 0,1% bis 10% ist.

9. Dermale Membran, gebildet nach dem Verfahren von Anspruch 1 oder 2.

10. Verfahren zur Herstellung eines zusammengesetzten Hautersatzes mit einer epidermalen Komponente und einer dermalen Komponente, umfassend:

(a) Kultivieren von menschlichen Epidermiszellen in einem Kulturmedium, das wirksam für Zellwachstum ist;

(b) Herstellung einer oberflächenbeschichteten, biosynthetischen, porösen und resorbierbaren dermalen Membrankomponente gemäss Anspruch 1 mit einer im wesentlichen unporösen Schicht, mit der die Membranoberfläche unter Verwendung einer Lösung, die membranbildende Verbindungen enthält, beschichtet wird, wobei die Konzentration dieser membranbildenden Verbindungen so gewählt wird, dass Membrandicke und - porosität optimiert werden, und diese Lösung mit einer solchen Einfriergeschwindigkeit eingefroren wird, dass die dermale Membran mit einer vorherbestimmten Struktur für Wachstum und Anlagerung der Epidermiszellen und für fibro-vaskuläres Hineinwachsen in diese dermale Membran gebildet wird; und

(c) Züchtung der Epidermiszellen auf der unporösen Schicht der dermalen Membrankomponente durch Übertragung dieser Zellen auf besagte dermale Membrankomponente und Inkubierung unter Bedingungen, die wirksam zum Wachstum von Zellen sind, zur Bildung einer kontinuierlichen Epithelbedeckung, wodurch ein zusammengesetzter Hautersatz gebildet wird, der ähnlich wie normale menschliche Haut aufgeteilt ist und zu fibrovaskulärem Wachstum in den porösen Teil dieser dermalen Membrankomponente hinein in der Lage ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Kulturmedium ein MCDB 153-Medium ist, das zusätzliche Mengen an Calcium und Isoleucin, Histidin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin enthält, dem Epidermis-Wachstumsfaktor, Insulin, Hydrocortison, Ethanolamin, Phosphoethanolamin und Rinder- Hypophysenextrakt zugegeben wurde und dem Transferrin und Progesteron fehlen.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Epidermiszellen normale menschliche epidermale Keratinozyten sind.

13. Zusammengesetzter Hautersatz, gebildet durch das Verfahren nach Anspruch 10.

14. Verwendung des zusammengesetzten Hautersatzes, hergestellt gemäss dem Verfahren nach Anspruch 10, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Reparatur beschädigter Haut in einem Tier oder dem Menschen.

15. Vorrichtung zur Bildung einer porösen, resorbierbaren, biosynthetischen dermalen Membran mit einer vorbestimmten Struktur, umfassend:

(a) einen unteren Rahmen mit einer oberen Oberfläche;

(b) eine elastische Dichtung, verbunden mit dieser oberen Oberfläche des unteren Rahmens;

(c) einen äusseren Rahmen mit erhöhten vertikalen Wandteilen zur Verbindung mit diesem unteren Rahmen;

(d) eine elastische Auskleidung auf der Innenseite der erhöhten vertikalen Wandteile des äusseren Rahmens;

(e) eine elastische Abstandshalter-Dichtung zur Einfügung zwischen dem unteren Rahmen und dem äusseren Rahmen, wobei diese Dichtung über den inneren Rand dieses äusseren Rahmens in den inneren Bereich des äusseren Rahmens vorragt und die Dichtung von vorgewählter Dicke ist;

(f) einen inneren Rahmen mit Aussendimensionen, die etwas kleiner sind als der äussere Rahmen, so dass der innere Rahmen fest in den äusseren Rahmen einpasst, und der erhöhte vertikale Wandteile hat;

(g) eine elastische Dichtung, verbunden mit der unteren Oberfäche des inneren Rahmens; und

(h) eine Einfrierkammer zur Aufnahme einer membranbildenden Lösung, wobei die Einfrierkammer untere und obere flexible, nicht klebende, planare Blätter umfasst, die aus einem nicht klebenden Material mit einer Wärmeleitfähigkeit von mindestens 6 10&supmin;&sup4; cal cm/sec cm² ºC bestehen, ausreichend, eine Einfriergeschwindigkeit zuzulassen, die die Eiskristallbildung in der membranbildenden Lösung während des Einfrierens reguliert, wobei das untere Blatt zur Einfügung zwischen den unteren Rahmen und die Abstandshalter-Dichtung gedacht ist und das obere Blatt zur Einfügung zwischen den inneren Rahmen und den äusseren Rahmen gedacht ist, so dass, wenn die Vorrichtung zusammengesetzt wird, eine Einfrierkammer zwischen dem unteren und dem oberen Blatt gebildet wird, und, wenn die Einfrierkammer eine membranbildende Lösung enthält, das untere und das obere Blatt mit der Lösung in Kontakt gebracht werden.

16. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 10, das darüber hinaus den Schritt der Modifizierung der dermalen Membran unter Aufnahme biologisch aktiver Moleküle zur Verbesserung der Reparatur von beschädigter Haut und/oder zur Verringerung von Infektionen umfasst, wenn diese Membran zur Reparatur von beschädigter Haut verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die biologisch aktiven Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Hormonen und entzündungshemmenden Verbindungen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Membran Collagen und Chondrotin-6-sulfat umfasst und der Modifizierungsschritt der dermalen Membran folgende Sub-Schritte umfasst:

(a) Biotinylierung des Collagens, wodurch biotinyliertes Collagen gebildet wird;

(b) Umsetzung des biotinylierten Collagens mit Avidin, wodurch das Avidin an das biotinylierte Collagen angelagert wird;

(c) Umsetzung biotinylierter, biologisch aktiver Moleküle mit dem an das biotinylierte Collagen angelagerte Avidin, wodurch diese biologisch aktiven Moleküle in die dermale Membran eingefügt werden.