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Die
vorliegende Erfindung betrifft wasserunlösliche, biokompatible Zusammensetzungen,
die aus einem oder mehreren chemisch veränderten, polyanionischen Polysacchariden
gebildet sind, und insbesondere Zusammensetzungen dieser chemisch
veränderten,
polyanionischen Polysaccharide und hydrophoben, bioabsorbierbaren
Polymere.
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Polyanionische
Polysaccharide sind Polysaccharide, auch Glykane genannt, die mehr
als eine negativ geladene Gruppe (z.B. Carboxylgruppen bei pH-Werten
oberhalb von 4,0) enthalten; sie bestehen aus langen Ketten mit
hunderten oder tausenden basischer Wiederholungseinheiten. Diese
Moleküle
können
sich in der Eigenschaft ihrer wiederkehrenden Wiederholungseinheiten,
in der Länge
ihrer Ketten und im Grad der Verzweigung unterscheiden. Es gibt
zwei hauptsächliche
Arten von polyanionischen Polysacchariden: Homopolysaccharide, die
nur eine einzige Art von monomerer Einheit enthalten, und Heteropolysaccharide,
die zwei oder mehrere unterschiedliche Arten von monomeren Einheiten
enthalten.
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Polysaccharide
treten natürlich
in einer Vielzahl von Geweben im Körper auf und assoziieren in
einigen Fällen
mit Proteinen in komplexen makromolekularen Strukturen. Beispiele
schließen
Proteoglykane, die in der gelartigen Grundsubstanz gefunden werden,
oder eine extrazelluläre
Matrix, die den Raum zwischen den Zellen der meisten Gewebe füllt, ein.
Proteoglykane liegen auch im Knorpel, den Sehnen, der Haut und in
der Gelenkflüssigkeit
vor. Ähnlich
sind Glucosaminoglykane wasserlösliche
Polysaccharide, die in der Grundsubstanz verbindenden Gewebes gefunden
werden, und die hoch geladene lineare Polyanione mit der allgemeinen
Formel (AB)n sind, wobei A ein Uronsäurerest
und B ein Hexosamin ist.
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Hyaluronsäure (HA)
und sein Salz Natriumhyaluronat ist ein Beispiel eines natürlich auftretenden
Glucosaminoglykans oder Mucopolysaccharids, das ein üblicher,
extrazellulärer
Matrixbestandteil ist. HA ist innerhalb des menschlichen Körpers allgegenwärtig und
existiert in einem großen
Spektrum von Formen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der
Gelenkflüssigkeit,
dem Glaskörper,
Blutgefäßwänden, der
Perikardialflüssigkeit
und der Nabelschnur.
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Hyaluronsäure in chemisch
modifizierter („derivatisierter") Form ist als eine
chirurgische Hilfe nützlich, um
Anhaftungen oder Ablagerungen von Körpergewebe während der
nachoperativen Zeit zu verhindern (z.B. US-Patent Nr. 5,017,229).
Die derivatisierte HA in Form eines Gels oder einer Membran wird über und
zwischen beschädigte
Gewebeoberflächen
gelegt, um Anhaftungsbildung zwischen gegenüberliegenden Oberflächen zu
verhindern. Um wirksam zu sein, muss das Gel oder der Film an Ort
und Stelle bleiben und Gewebekontakt über einen Zeitraum verhindern,
der lang genug ist, sodass, wenn das Gel schlussendlich sich verteilt
und die Gewebe in Kontakt kommen, diese keine Tendenz mehr besitzen,
aneinander zu kleben.
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Chemisch
modifizierte HA ist auch nützlich
für Arzneimittelgabe
mit kontrollierter Abgabe. Balazs et al., 1986, US-Patent Nr. 4,582,865,
sagen, dass „quervernetzte
Gele aus HA die Abgabe einer Substanz mit niedrigem Molekulargewicht,
die darin dispergiert, jedoch nicht kovalent an die makromolekulare
Gelmatrix gebunden ist, verlangsamen kann". Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten
107 bis 119, in Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems,
Marcel Dekker, Inc., New York, beschreibt die anhaltende Abgabe
von Chloramphenicol, das kovalent über eine Esterbindung entweder
direkt oder in einem Esterkomplex einschließlich einer Alaninbrücke als
dazwischenliegende Linkergruppe an Hyaluronsäure gebunden ist.
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Danishefsky
et al., 1971, Carbohydrate Res., Band 16, Seiten 199 bis 205, beschreiben
das Modifizieren eines Mucopolysaccharids durch Umwandeln der Carboxylgruppen
des Mucopolysaccharids in substituierte Amide durch Umsetzung des
Mucopolysaccharids mit einem Aminosäureester in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
(„EDC") in wässriger
Lösung.
Sie setzten Glycinmethylester mit einer Vielzahl von Polysacchariden
einschließlich
HA um. Die resultierenden Produkte sind wasserlöslich; das heißt, dass
sie schnell in Wasser oder in einer wässrigen Umgebung, wie sie zwischen
Körpergeweben
angetroffen wird, dispergieren.
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Vorschläge, um die
HA-Zusammensetzungen weniger wasserlöslich zu machen, schließen Quervernetzen
der HA ein. R.V. Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten 107 bis
119 beschreiben in T.J. Roseman et al., Controlled Release Delivery
Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, das Modifizieren von HA
durch Anbringen von Cysteinresten an die HA über Amidbindungen und anschließendes Quervernetzen
des cysteinmodifizierten HA durch Bilden von Disulfidbindungen zwischen
den angebrachten Cysteinresten. Die cysteinmodifizierte HA selbst
war wasserlöslich
und wurde nur durch Quervernetzen durch Oxidation zur Disulfidform
wasserunlöslich.
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De
Belder et al., PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 86/00912, beschreiben ein langsam abbaubares Gel zum Verhindern
von Gewebeadhäsionen
infolge von Operationen, hergestellt durch Quervernetzen eines Carboxyl
enthaltenden Polysaccharids mit einem bi- oder polyfunktionellen
Epoxid. Andere reaktive bi- oder polyfunktionelle Reagenzien, die
zur Herstellung von quervernetzten Gelen aus HA mit verminderter
Wasserlöslichkeit
vorgeschlagen wurden, schließen
ein: 1,2,3,4-Diepoxybutan in alkalischem Medium bei 50°C (Laurent et
al., 1964, Acta Chem. Scand., Band 18, Seite 274); Divinylsulfon
in alkalischem Medium (Balazs et al., US-Patent Nr. 4,582,865 (1986)); und eine
Vielzahl anderer Reagenzien einschließlich Formaldehyd, Dimethylolharnstoff
Dimethylolethylenharnstoff, Ethylenoxid, ein Polyaziridin und ein
Polyisocyanat (Balazs et al., Britische Patentanmeldung Nr. 84 20
560 (1984)). Mälson
et al., 1986, PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 86/00079, beschreiben die Herstellung eines quervernetzten
Gels aus HA für
die Verwendung als Glaskörperersatz
durch Umsetzung von HA mit einem bi- oder polyfunktionellen Quervernetzungsmittel,
wie z.B. di- oder polyfunktionellem Epoxid. Mälson et al., 1986,
EP 0 193 510 , beschreiben
die Herstellung eines geformten Gegenstands durch Vakuumtrocknen
oder Verdichten eines quervernetzten HA-Gels.
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Es
kann auch auf das Folgende verwiesen werden: K. Herrmann et al.,
Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 5 (1994), Seiten
728 bis 731, das heparinmodifiziertes Polylactid als bioabbaubares, haemokompatibles
Biomaterial betrifft; WO-A-94/01468, die ein Biomaterial betrifft,
das ein durchdringendes Polymernetzwerk umfasst, worin eines der
Polymerbestandteile ein saures Polysaccharid oder ein Derivat davon
ist; WO-A-94/21299, die eine biokompatible Zusammensetzung für die Gewebevermehrung
betrifft; und WO-A-96/02286, die Zusammensetzungen und Verfahren
für eine
bioartifizielle, extrazelluläre
Matrix betrifft.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine wasserunlösliche,
biokompatible Zusammensetzung bereit, die dadurch gekennzeichnet
ist, dass sie eine Kombination von Folgendem umfasst:
- (a) ein wasserunlösliches,
polyanionisches Polysaccharidderivat in Form eines Gels, das keine
kovalenten Quervernetzungen zwischen den polyanionischen Polysaccharidmolekülen enthält, wobei
das Gel durch Kombinieren von Hyaluronsäure, einem polyanionischen
Polysaccharid und einem Carbodiimidaktivierungsmittel hergestellt
wird; mit
- (b) einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer, ausgewählt aus
Polyglykolid, Polylactid (D, L, DL), Polydioxanonen, Polyestercarbonaten,
Polyhydroxyalkanoaten, Polylactonen und Copolymeren davon.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das polyanionische Polysaccharid ausgewählt aus Carboxymethylcellulose
(CMC), Carboxymethylamylose (CMA), Chondroitin-6-sulfat, Dermatinsulfat,
Heparin, Heparinsulfat, Heparansulfat oder Dermatin-6-sulfat. Bevorzugter
ist das polyanionische Polysaccharid CMC oder CMA. In bevorzugten
Ausführungsformen
umfasst die biokompatible Zusammensetzung auch zwei oder mehr polyanionische
Polysaccharidderivate, z.B. HA und CMC oder HA und Heparin. Bevorzugte
hydrophobe, bioabsorbierbare Polymere schließen Polyglykolid oder Polylactid
oder ein Copolymer oder Polyglykolid-Caprolacton oder Polyglykolid
und Polylactid, Polylactid-Polycaprolacton ein. Die Zusammensetzungen
der Erfindung können
in Form einer adhäsionvermeidenden
Zusammensetzung bereitgestellt werden, z.B. in einer Membran, einem
Schaum, einem Film oder einer für
die Extrusion geeigneten Zusammensetzung. Die Zusammensetzung, die
ein wasserunlösliches,
polyanionisches Polysaccharidderivat enthält, kann auch in Form von Fasern
oder gestricktem oder gewebtem Stoff hergestellt werden.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung, die ein wasserunlösliches,
polyanionisches Polysaccharidderivat enthalten, können auch
als eine Verbundmatrix bereitgestellt werden, um Zell- und Gewebewachstum und
-proliferation zu unterstützen.
Z.B. kann jeder gewünschte
Zelltyp in vitro kultiviert werden in Gegenwart einer der wasserunlöslichen
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, um eine wasserunlösliche Matrix
zu bilden, die mit den Zellen beschichtet, imprägniert oder infiltriert ist.
Bevorzugt stammen die Zellen aus einem Säugetier und am bevorzugtesten
von einem Menschen. In einem Beispiel können Fibroblast infiltrierte Matrizen
auf die Stelle einer Hautläsion
(z.B. Wunde oder Ulkus) gelegt werden, um die Heilung der Läsion zu beschleunigen.
Andere Zelltypen, die auf den Matrizen dieser Erfindung kultiviert
werden können,
schließen Osteozyten,
Chondrozyten, Keratinozyten und Tenozyten ein, sind jedoch nicht
darauf beschränkt.
Mit diesen Zellen imprägnierte
Matrizen können
verwendet werden, um bei der Heilung von Knochen, Knorpel, Haut
bzw. Sehnen bzw. Bändern
zu helfen. Es können
auch Matrizen hergestellt werden, die eine Mischung von Zelltypen enthalten,
z.B. um den Zellaufbau eines gewünschten
Gewebes nachzuahmen. Die Matrizen dieser Erfindung können auch
mit nicht differenzierten Mesenchymzellen, die zu einer Vielzahl
von gewebespezifischen Arten nach ihrer Implantierung differenzieren
können,
oder mit Fötus-
oder Neonatalzellen des gewünschten
Typs beimpft werden. Ein Vorteil, der mit der Verwendung der wasserunlöslichen
Zusammensetzungen als zelluläre Matrizen
in vivo verbunden ist, ist der, dass die Matrix vollständig biokompatibel
ist und durch den Körper
reabsorbiert wird. Alternativ sind mit unterschiedlichen Zelltypen
imprägnierte
Matrizen hilfreich für
in vitro diagnostische Anwendungen. Z.B. können Matrizen, die mit Fibroblasten
infiltriert sind, verwendet werden, um die Wirksamkeit und/oder
Toxizität
unterschiedlicher pharmazeutischer oder kosmetischer Verbindungen
zu testen.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können des Weiteren ein Arzneimittel
für die
Verwendung als Arzneimittelabgabesystem einschließen. Das
spezielle Arzneimittel, das verwendet wird, ist eine Frage der Auswahl
in Abhängigkeit
von der vorgesehenen Verwendung der Zusammensetzung. Bevorzugte
Arzneimittel schließen
Proteine (z.B. Wachstumsfaktoren, Enzyme), Steroide, nicht steroidale,
entzündungshemmende Arzneimittel,
cytotoxische Mittel (z.B. Antitumorarzneimittel), Antibiotika, Oligonukleotide
(z.B. Antisense) und Biopolymere ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die
Zusammensetzungen der Erfindung können des Weiteren Wachstumsfaktoren
und Zellanhaftungsproteine oder -peptide einschließen, wenn
sie für
Zell- und Gewebewachstum und -proliferation bereitgestellt werden.
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In
einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer solchen biokompatiblen Zusammensetzung durch Kombinieren eines
oder mehrerer polyanionischer Polysaccharide mit einem hydrophoben,
bioabsorbierbaren Polymer unter Bedingungen bereit, die ausreichend
sind, um die biokompatible Zusammensetzung zu bilden. Bevorzugt
liegt das polyanionische Polysaccharid in Form eines Films oder Schaums
vor.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung schließen Verfahren zum Kombinieren
des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers und des polyanionischen
Polysaccharids die Beschichtung des polyanionischen Polysaccharids
mit dem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer ein, z.B. durch Besprühen oder
Bebürsten
des polyanionischen Polysaccharids mit einer hydrophoben, bioabsorbierbaren
Polymerlösung;
die Anwendung einer hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymerbeschichtung
nur auf einer Seite der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung;
Vermischen des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers mit einer
Lösung
der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung; Dispergieren von
Fasern des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers in einer Lösung der
polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung; und Verpressen eines
Films des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers auf die polyanionische
Polysaccharidzusammensetzung, z.B. durch Hitzeverpressen bei erhöhter Temperatur,
um sicherzustellen, dass das hydrophobe Polymer auf die polyanionische
Polysaccharidzusammensetzung fließt. Das Verfahren der Erfindung
kann auch das Eintauchen der unlöslichen
Zusammensetzung in eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerlösung unter
Verwendung eines wasserunlöslichen
Derivats eines polyanionischen Polysaccharids einschließen, um
beide Seiten der unlöslichen,
polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung gleichzeitig zu beschichten.
Nach Anwendung des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers wird
die Zusammensetzung getrocknet, um Lösungsmittel zu entfernen, wobei
eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymermatrix aus polyanionischem
Polysaccharid zurückbleibt.
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Die
hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerlösung wird durch Auflösen des
Polymers, der Polymere oder der Copolymere in einem flüchtigen
Lösungsmittel,
wie z.B. Methylenchlorid, bei einer Konzentration von 0,1 bis 50
Gew.-% hergestellt; bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%; bevorzugter 0,5
bis 5 Gew.-%; und am bevorzugtesten 1,0 bis 3,0 Gew.-%.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Fördern von
Zellwachstum und -proliferation in vitro bereit. In diesem Aspekt
schließt
das Verfahren die Schritte des Nehmens einer Zellprobe, Vermischen
der Zellen mit der wasserunlöslichen,
biokompatiblen Matrix, die ein wasserunlösliches Derivat eines polyanionischen
Polysaccharids kombiniert mit einem hydrophoben bioabsorbierbaren
Polymer enthält, und
anschließendes
Kultivieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind,
um Wachstum und Eindringen der Zellen in die Matrix zu fördern. Zellen,
die gemäß dem Verfahren
der Erfindung gezüchtet
werden können,
schließen
jeglichen Zelltyp ein, der in vitro kultiviert werden kann; bevorzugt
handelt es sich um Säugetierzellen;
und am bevorzugtesten stammen sie von einem Menschen.
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In
noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren
zum Fördern
von Zellwachstum und -proliferation in vivo an einer Verletzungsstelle
ein, z.B. in einem Säugetier,
bevorzugt einem Menschen. Dieses Verfahren schließt die Schritte
des Nehmens einer Zellprobe, die in der Lage ist, die Heilung der
Verletzung zu fördern,
Vermischen der Zellen mit einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix,
die ein wasserunlösliches
Derivat eines polyanionischen Polysaccharids kombiniert mit einem
hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer, enthält, und Aufbringen der Mischung
auf die Stelle der Verletzung in dem Säugetier, um Wachstum und Proliferation
der Zellen an der Stelle zu fördern,
um die Heilung der Verletzung zu vereinfachen.
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Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung schließen das Nehmen der Zellprobe
direkt aus dem gewünschten
Gewebe und Vermischen der Probe mit der wasserunlöslichen,
biokompatiblen Matrix ein; Nehmen der Zellprobe aus dem gewünschten
Gewebe und Kultivieren der Zelle in vitro vor dem Vermischen mit
der wasserunlöslichen,
biokompatiblen Matrix; und Nehmen der Zellprobe aus einer etablierten
Zelllinie und Vermischen der Zellen mit der wasserunlöslichen,
biokompatiblen Matrix. Bevorzugt wird die Beimischung, die die Zellprobe
und die wasserunlösliche,
biokompatible Matrix enthält,
in vitro unter Bedingungen kultiviert, die ausreichend sind, um
Proliferation und das Eindringen der Zellen in die Matrix vor dem
Aufbringen auf die Stelle der Verletzung zu fördern.
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Die
Zellen, die mit der biokompatiblen Matrix für diesen Aspekt der Erfindung
vermischt wurden, können
von jedem beliebigen Zelltyp sein, der in der Lage ist, Zellwachstum
und -proliferation an der Stelle der Verletzung zu unterstützen. Z.B.
kann die Quelle der Zellen für
das Säugetier
xenogen sein, bevorzugt sind die Zellen jedoch allogen, und am bevorzugtesten
sind die Zellen immunologisch kompatibel mit dem Säugetier. Des
Weiteren kann die infiltrierte Matrix Zellen desselben Zelltyps
enthalten, wie die Zellen, die an der Stelle der Verletzung (z.B.
von demselben Gewebe) gefunden werden, oder die Zellmatrix kann
Zellen enthalten, die von einem unterschiedlichen Zelltyp sind,
die jedoch extrazelluläre
Matrixbestandteile innerhalb der biokompatiblen Matrix deponieren,
um als Gerüst
für das
Zellwachstum in vivo zu dienen.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
dieses Aspektes der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass die
Zellen Fibroblasten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle
einer Hautläsion
(z.B. eine Wunde, Verbrennung, klinischer Schnitt oder Hautulkus)
gelegt wird; dass die Zellen Osteozyten sind und die infiltrierte
Matrix auf die Stelle einer Knochenverletzung gelegt wird; dass
die Zellen Chondrozyten sind und die infiltrierte Matrix auf die
Stelle einer Verletzung an Knorpelgewebe gelegt wird; dass die Zellen
Keratinozyten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle einer
Hautläsion
gelegt wird; dass die Zellen Tenozyten sind und die infiltrierte
Matrix an die Stelle der Verletzung einer Sehne gelegt wird; oder
dass die Zellen nicht differenzierende Mesenchymzellen sind.
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Die
biokompatible Matrix, die in den Verfahren der Erfindung verwendet
wird, kann des Weiteren eines oder mehrere Arzneimittel, z.B. ein
Wachstumsfaktor, um das Wachstum der Zellen weiter zu fördern, und/oder ein
Antibiotikum, um das Risiko einer Infektion an der Auflegestelle
zu vermindern, enthalten.
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Durch
den Begriff „immunologisch
kompatibel", wie
er hierin verwendet wird, wird verstanden, dass die Zellen aus einem
histokompatiblen Donor erhalten werden, um die Wahrscheinlichkeit
einer Abstoßung
durch das Immunsystem des behandelten Säugetieres zu minimieren. Bevorzugt
sind die Zellen aus einem Individuum, das denselben oder einen kompatiblen
HLA-Phenotyp besitzt. Am bevorzugtesten werden die Zellen direkt
aus dem zu behandelnden Säugetier
erhalten.
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Ein „polyanionisches
Polysaccharid" (PAS),
wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein Polysaccharid, einschließlich sowohl
nicht modifizierte als auch chemische Derivate davon, das mehr als
eine negativ geladene Gruppe (z.B. Carboxylgruppe bei einem pH-Wert
oberhalb ungefähr
4,0) enthält,
und schließt
Salze davon ein, wie z.B. Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze,
wie z.B. Calcium- oder Magnesiumsalze.
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Ein „polyanionisches
Polysaccharidderivat",
wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein oder mehrere polyanionische
Polysaccharide (PAS), das chemisch aus der natürlichen Form modifiziert wurde.
Solche Modifikationen können
die Addition von funktionellen Gruppen (z.B. substituierten Amidgruppen,
Esterkupplungen und Amingruppen) einschließen; Reaktionen, die die Wasserunlöslichkeit
des PAS durch kovalentes quervernetzen der PAS-Moleküle erhöhen; und
Reaktionen, die die Wasserunlöslichkeit
des PAS durch nicht kovalente Interaktionen, wie hierin beschrieben,
erhöhen.
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Mit „nicht
modifiziertem, polyanionischen Polysaccharid" ist ein polyanionisches Polysaccharid
mit seiner intakten, natürlichen
chemischen Struktur gemeint.
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Der
Begriff „Film", wie er hierin verwendet
wird, meint eine Substanz, die durch Verdichten eines Schaums zu
einer dünnen
Membran gebildet wird, durch Gießen in eine flache Gussform
und Lufttrocknen zu einer dünnen
Membran, oder durch Verdichten eines Gels oder von Fasern oder durch
Trocknenlassen, oder durch Trocknen eines Gels oder von Fasern.
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Der
Begriff „Schaum", wie er hierin verwendet
wird, meint Substanzen mit einer porösen Struktur, gebildet z.B.
durch Lyophilisieren von polyanionischen Polysaccharidlösungen,
-suspensionen, -gelen oder -fasern gemäß der Erfindung.
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Der
Begriff „hydrophob", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf Verbindungen oder Zusammensetzungen, denen
eine Affinität
für Wasser
fehlt.
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Der
Begriff „bioabsorbierbar", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Fähigkeit
eines gewebekompatiblen Materials, sich im Körper nach der Implantierung
zu nicht toxischen Produkten abzubauen, die aus dem Körper eliminiert
werden oder metabolisieren (Barrows, „Synthetic Bioabsorbable Polymers", Seite 243 in High
Performance Biomaterials – A
Comprehensive Guide to Medical and Pharmaceutical Applications, Michael
Szycher, Hrsg., Technomic Publishing: Lancaster, PA, 1991).
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Der
Begriff „Polymer", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf ein Molekül,
das durch wiederholtes Binden von mindestens zwei, und bevorzugt
mehr als zwei, kleinerer, monomerer Wiederholungseinheiten (z.B.
Monosaccharid, Aminosäure,
Nukleotide, Alkene oder organische Säureeinheiten) hergestellt wird.
Demgemäß bezieht
sich der Begriff Copolymer auf ein Polymer, das durch Kombinieren
von zwei oder mehr copolymerisierten monomeren oder polymeren Spezies
gebildet wird.
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Eine „biokompatible" Substenz, wie der
Begriff hierin verwendet wird, ist eine, die keine medizinisch nicht
akzeptable, toxische oder verletzende Wirkungen auf eine biologische
Funktionen besitzt.
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Ein „wasserlöslicher" Film oder Schaum,
wie der Begriff hierin verwendet wird, ist einer, der durch Trocknen
einer wässrigen
Lösung
eines 1%igen Gewicht/Gewicht („Gew./Gew.") nicht modifizierten,
polyanionischen Polysaccharids in Wasser hergestellt wird, und der
Ausmessungen von 3 cm × 3
cm × 0,3
mm besitzt, der, wenn er in ein Becherglas von 50 ml destilliertem
Wasser bei 20°C
gegeben wird, und ohne Rühren
stehengelassen wird, seine strukturelle Integrität als ein Film nach 3 min verliert
und innerhalb von 20 min vollständig
aufgelöst
wird. Ein „wasserunlöslicher" Film gemäß der Erfindung,
wie er hierin verwendet wird, sowie dieser Ausdruck und ähnliche
Begriffe, die hierin verwendet werden, wird unter Verwendung einer
1%igen wässrigen
Lösung
eines polyanionischen Polysaccharids, das wie oben beschrieben modifiziert
ist, gebildet und besitzt dieselben Größenabmessungen und wird ähnlich in
einem Becherglas von 50 ml destilliertem Wasser bei 20°C ohne Rühren stehengelassen
und ist nach 20 min strukturell intakt; die Ränder und Kanten des Files sind
nach 24 h nach wie vor vorhanden.
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Die
Schäume,
Filme oder andere Formen der Erfindung können in gefärbter Form hergestellt werden durch
Einschließen
eines Farbstoffs oder eines Färbemittels
in die Reaktionsmischung. Solche gefärbten Filme und Gele können leichter
gesehen werden, wenn sie eingebracht werden oder an Ort und Stelle,
wodurch sie leichter während
des Operationsverfahrens zu handhaben sind als farblose.
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Im
Allgemeinen besitzen die Zusammensetzungen der Erfindung verbesserte
biokompatible und physikalische Eigenschaften gegenüber herkömmlichen
Verbindungen. Daher sind die Zusammensetzungen der Erfindung besonders
nützlich
bei Verfahren zum Verhindern von Verklebungsbildung zwischen verletzten
Geweben. Eine oder mehrere der Zusammensetzungen der Erfindung können zwischen
oder unter die verletzten Gewebe, die dazu neigen Verklebungen zu
bilden (z.B. chirurgische Einschnitte oder eine Verletzung) in einer Menge
eingebracht werden, die ausreichend ist, um Verklebung der Gewebe
während
des Heilungsprozesses zu verhindern. Die Zusammensetzungen agieren
als zeitlich begrenzte Grenzschicht zwischen den Geweben und bleiben
lange genug dort, sodass, sobald die Zusammensetzung wieder absorbiert
wurde und die Gewebe miteinander in Kontakt kommen, die Gewebe nicht
mehr die Neigung haben zu verkleben.
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Zusätzliche
Verwendungen schließen
Nervenführungen
durch Formen des Schaums, Films oder Gels zu Röhren oder Matrizen für die Führung von
Axonen infolge von Nervenverletzung ein, um die Wachstumszäpfchenverlängerung
zu fördern,
während
das Risiko einer Neuromabildung vermindert wird. Sie sind auch nützlich als
Gerüst
für Zellproliferation
und -migration, z.B. zur Hautregenerierung, wie auch zur Sehnen-, Band-
und Knorpelregeneration. Diese Substanzen sind auch als Vehikel
für die
Arzneimittelgabe geeignet, da das Arzneimittel entweder vor oder
nachdem die biokompatible Zusammensetzung gebildet wurde, eingeführt werden
kann, wodurch eine kontrollierte Abgabe des zu verabreichenden Arzneimittels
gestattet wird.
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Die
wasserunlöslichen,
polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen, die mit den hydrophoben,
bioabsorbierbaren Polymeren kombiniert wurden, besitzen die folgenden
zusätzlichen
Vorteile gegenüber unbeschichteten,
chemisch modifizierten oder unmodifizierten, polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen:
verbesserte mechanische Eigenschaften sowohl im trockenen als auch
im nassen Zustand, wodurch das Produkt stärker und leichter zu handhaben
wird und zu einer längeren
Widerstandszeit in vivo führt;
langsamere Hydratation des polyanionischen Polysaccharidbestandteils,
um die anhaftenden Eigenschaften und die Lage der Zusammensetzungen
beizubehalten; und verbesserte Wirksamkeit bei der Verhinderung
postchirurgischer Verklebungen aufgrund der Zugabe des hydrophoben,
bioabsorbierbaren Polymerbestandteils. Die Zusammensetzungen können mit
einer hydrophilen Seite, die an Gewebe anhaftet, und einer nicht
anhaftenden, hydrophoben Seite verarbeitet werden. Die hydrophobe
Seite wird die Hydratation der hydrophilen Seite verlangsamen, die
an dem Gewebe anhaften wird, während
die hydrophobe Seite andere Gewebe, chirurgische Instrumente und
Handschuhe daran hindert, an der Zusammensetzung anzuhaften.
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Polyanionische
Polysaccharide und ihre Salze können
aus einer Vielzahl kommerzieller Standardquellen erhalten werden.
Wasserunlösliche,
polyanionische Polysaccharidgele, -filme und -schäume können nach irgendeinem
Verfahren für
die Verwendung in dieser Erfindung hergestellt werden. Die Gele
können über die Bildung
kovalenter Intra- und Interkettenquervernetzungen, wie vorher beschrieben,
hergestellt werden (siehe beispielsweise Sparer et al., supra; De
Belder et al., supra; Balazs et al., supra; Mälson et al., supra; und Prestwich
et al., EP-Veröffentlichung
Nr. 0 416 250 A2, 1991). Alternativ können wasserunlösliche Gele,
die keine kovalenten Quervernetzungen zwischen den polyanionischen
Polysaccharidmolekülen
enthalten, unter Verwendung der Verfahren, beschrieben in Hamilton
et al., US-Patent Nr. 4,937,270; Burns et al., US-Patent Nr. 5,017,229,
siehe insbesondere Spalte 5, hergestellt werden.
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Wie
in dem letztgenannten Literaturhinweis offenbart, werden polyanionische,
polysaccharidmodifizierte HA-Gele und -Filme im Allgemeinen hergestellt
durch Vermischen von HA mit einem polyanionischen Polysaccharid
und einem Aktivierungsmittel aus einem wasserunlöslichen Niederschlag. Schäume und
Filme von Zusammensetzungen, die lösliche, polyanionische Polysaccharide
und ihre Derivate enthalten, können durch
Lyophilisieren oder Gefriertrocknen der Lösung erhalten werden. Zusammensetzungen,
die wasserunlösliche,
polyanionische Polysaccharidzusammensetzungen enthalten, können auch
behandelt werden, um den gewünschten
Film, Schaum, Pulver oder Fasern zu erzeugen. Um z.B. Filme zu erhalten,
wird die Reaktionsmischung üblicherweise
in ein Gefäß, z.B.
eine Wanne, mit der gewünschten
Größe und Form
geschüttet und
an der Luft trocknen gelassen.
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Alternativ
kann ein Film durch Verdichten eines wasserunlöslichen Gels unter Bedingungen,
die das Entrinnen von Wasser ermöglichen,
wie z.B. durch Verdichten des wasserunlöslichen Gels zwischen zwei Oberflächen, von
denen mindestens eine porös
ist, wie z.B. in
EP 0 193 510 beschrieben,
hergestellt werden.
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Ein
anderes alternatives Verfahren zur Herstellung von Blättern des
Materials ist es, es dem Gefriertrocknen zu unterwerfen. Die Porengröße des endgültigen Produktes
kann durch Anpassen der anfänglichen Gefriertemperatur
unter Trocknungsbedingungen gesteuert werden. Gewölbte Oberflächen und
andere Formen können
in ähnlicher
Art und Weise durch anfängliches
Gießen
des wasserunlöslichen
Gels auf eine Negativabbildoberfläche und anschließendes Verarbeiten
wie beschrieben hergestellt werden. Das getrocknete Blatt kann weiter
verarbeitet werden, wenn gewünscht,
durch Pressen zu einer bestimmten Dicke, z.B. in einer Carver-Laborpresse.
Dies ist besonders hilfreich für
Anwendungen, die das Einbringen eines dünnen Films zwischen anatomische
Strukturen verlangt, wo der Platz beschränkt ist, und um zusätzliche
mechanische Festigkeit zu verleihen.
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Die
Bildung von Schäumen,
Fasern und anderen Formen oder Gegenständen kann auch durch Verwenden
altbekannter Methoden in der Plastik- und Textilindustrie erreicht
werden.
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Z.B.
können
Schäume
der wasserunlöslichen
Polysaccharidderivate durch Gefriertrocknungsverfahren erzeugt werden,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, z.B. beschreiben Yannas
et al., (US-Patent Nr. 4,280,954) und Dagalakis et al. (1980, J.
Biomed. Mater. Res., Band 14, Seiten 511 bis 528), Verfahren zum Gefriertrocknen
von Collagen-Mucopolysaccharidverbundstoffen
und Steuern der Porenstruktur. Übliche
Bedingungen sind Temperaturen unter –20°C und ein Vakuum unter 250 mTorr.
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Fasern
der wasserunlöslichen
Polysaccharidderivate können
durch Nassspinnverfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind,
hergestellt werden. Z.B. beschreibt Rupprecht (1979, Acta Chem.
Scand., Band 33, Seiten 779 bis 780) das Nassspinnen von wässrigen
Hyaluronsäurelösungen in
einem Ethanolkoagulationsbad, um Fasern zu bilden. Alternativ können Fasern
des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers durch herkömmlichere
Schmelzspinnmethoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind,
hergestellt werden. Z.B. beschreiben Wassermann et al. (US-Patent
Nr. 3,792,010 und 3,839,297) das Herstellen von Monofilament und
umsponnenen Polyesternähten
aus Lactid-Glykolid-Copolymeren. Die Fasern können durch Knüpf- oder Webmethoden,
die im Stand der Technik bekannt sind, zu Stoffen verarbeitet werden.
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Die
Film- und Schaumderivate der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen
können
durch dehydrothermale Bearbeitung (DHT: 95 bis 105°C bei 200
bis 760 mm Hg über
6 bis 24 h) gestärkt
werden und mit hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymeren kombiniert
werden. Z.B. werden bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. Polyglykolid
(PGA), Polylactid (PLA) und Copolymere von PGA/PLA in leicht flüchtigen
Lösungsmitteln,
wie z.B. Methylenchlorid, Aceton, Ethylacetat, Tetrahydrofuran,
n-Methylpyrrolidon, bei Konzentrationen von 0,5 bis 50,0 Gew.-%
mit einem bevorzugten Bereich von 1 bis 3 Gew.-% gelöst. Unterschiedliche
Verhältnisse
von PGA und PLA können
verwendet werden, einschließlich
100% PGA, 85% PGA:15% PLA, 50% PGA:50% PLA und 100% PLA; 1:1 PGA:PLA
ist bevorzugt. Zusätzlich
können
andere hydrophobe, bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. Polydioxanone,
Polyorthoester, Polyestercarbonate, Polylactone (insbesondere Polycaprolacton)
und Polyhdroxybutyrat/Valerat, einzeln oder als Copolymere, insbesondere
Copolymere von PLA und Polycaprolacton, verwendet werden. Diese
Lösungen
werden dann auf die auf polyanionischem Polysaccharid basierte Vorrichtung
unter Verwendung von Sprühgeräten, wie
z.B. einem kleinen Chromatographiesprüher, mit Druckluft oder Argongas
bei 2 bis 20 psi gesprüht,
um einen 5%igen bis 100%igen Gewichtsgewinn zu erzielen. Beschichtete
Schäume
können
zu dünnen
Membranen bei 1,0 bis 5,0 metrischen Tonnen unter Anwendung einer
Carver-Laborpresse mit 1 bis 50 mm Abstandshaltern gepresst werden
oder ungepresst als dicke Schäume
bestehen bleiben.
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In
einem alternativen Verfahren werden die polysaccharidbasierten Materialien
und die hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymere zusammen durch Wärmepressen
einer Form des Polymers (Film, Schaum, Gitter, etc.) auf einen polyanionischen
Polysaccharidschaum oder – film
laminiert. Die bevorzugten Bedingungen der Laminierung hängen von
den Wärmeeigenschaften
der unterschiedlichen hydrophoben Polymere ab, fallen jedoch im
allgemeinen in die folgenden Bereiche: 40 bis 230°C bei 0 bis
8 metrischen Tonnen Druck über
0 bis 5 min. Zusätzlich
kann das hydrophobe Polymer durch Plasmabehandlung im Anschluss
an die Laminierung hydrophiler gestaltet werden.
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In
einem zweiten alternativen Verfahren werden die bioabsorbierbaren
Polymerfasern in die polysaccharidbasierten Materialien durch Zerschneiden
oder Zerhacken der Fasern auf bestimmte Größen und Dispergieren dieser
in polysaccharidbasierten Lösungen,
bevor diese zu Filmen oder Schäumen
gegossen oder lyophilisiert werden, eingearbeitet. Die bioabsorbierbaren Polymerfasern
können
auch auf ein Substrat als Gitter oder Matte gelegt werden und anschließend können die
polysaccharidbasierten Lösungen
darauf gegossen werden.
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In
einem dritten Verfahren werden die polysaccharidbasierten Filme
und Schäume
mit hydrophobe Polymeren mittels anderer Verfahren als dem oben
beschriebenen Sprühbeschichtungsverfahren
beschichtet. Z.B. können
bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. PGA, PLA und Copolymere von
PGA/PLA, PLA/Polycaprolacton, und PGA/Polycaprolacton in organischen
Lösungsmitteln
bei Konzentrationen von 0,5 bis 50%, bevorzugt 1,0 bis 3,0%, aufgelöst werden.
Die Polymerlösung
kann dann auf die Oberfläche
eines polysaccharidbasierten Films oder Schaums mit einem Abziehmesser
(drawdown knife) verteilt oder gegossen und anschließend getrocknet
werden. Alternativ können
die wasserunlöslichen,
polysaccharidbasierten Geräte
in die Polymerlösung
getaucht oder eingeweicht werden und anschließend an der Luft trocknen gelassen
werden, um die Einarbeitung zu erzielen.
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In
noch einem anderen Verfahren können
Verbundfasern hergestellt werden, die einen wasserunlöslichen
Polysaccharidderivatkern und eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerbeschichtung
enthalten. Wässrige
Lösungen,
die Polysaccharidderivate enthalten, werden durch eine Spinndüse oder
Spritzennadel in ein Koagulationsbad extrudiert, das eine bioabsorbierbare
Polymerlösung,
wie z.B. PGA/PLA, PLA/Polycaprolacton, enthält, oder PGA/Polycaprolacton
aufgelöst
in organischem Lösungsmittel.
Das wasserunlösliche,
polysaccharidbasierte Material fällt
in dem Koagulationsbad aus und wird gleichzeitig mit dem bioabsorbierbaren Polymer
beschichtet. Alternativ kann die wasserunlösliche, polysaccharidbasierte
Faser mit polyabsorbierbarem, hydrophobem Polymer nach dem Koagulationsschritt
des Nassspinnverfahrens durch Ziehen der Polysaccharidderivatfaser
durch eine Lösung
von bioabsorbierbarem, hydrophobem Polymer beschichtet werden.
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Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben.
Diese Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben und sind nicht
dazu gedacht, die Erfindung zu beschränken, mit Ausnahme davon, wie
sie in den Patentansprüchen
dargelegt ist.
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Beispiel 1
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Eine
Lösung
aus HA (5,5 g, 13,7 mol, MW 2.350.000) und CMC (2,5 g, 9,7 mol,
MW 250.000) in Wasser (1 l) wurde mit 0,1 M HCl auf einen pH-Wert
von 4,74 eingestellt, wonach 1-(-3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümid (10,6
g, 55,5 mol) zugegeben wurde. Der pH-Wert wurde zwischen 4,6 bis
5,1 über
1 h durch Zugabe von 0,1 M HCl beibehalten. Die umgesetzte Lösung wurde
in Membranröhren
(MW Rückhaltevermögen (cut
off) 12 bis 14.000) über
24 h gegenüber
entionisiertem Wasser, pH 4,0, dialysiert. Die gereinigte, chemisch
modifizierte HA/CMC-Lösung
wurde in Edelstahlbehälter
gegossen und zu festen Schaumbahnen lyophilisiert. Insbesondere
wurde die Temperatur des Produktes mit einer Geschwindigkeit von 0,1°C/min auf –20°C erniedrigt.
Dann wurde der Trockenzyklus mit einem auf 150 mTorr gesetzten Vakuum ausgeführt und
die Ablagetemperatur wurde mit 0,1°C/min auf 0°C erhöht. Die Temperatur wurde bei
0°C über 900
min beibehalten und dann mit 0,1°C/min
auf 27°C
erhöht.
Die Schäume
wurden dann durch hydrothermale Behandlung (150°C bei 200 μm Hg über 24 h) gehärtet. Die
Schäume
wurden dann gewogen und vor der Beschichtung in einen Polypropylenrahmen
gesetzt.
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Ein
Lactid/Glykolidcopolymer (2,0 g, 50% PGA:50% PLA, Medisorb Corporation)
wurde in Methylenchlorid (100 ml) aufgelöst. Diese Beschichtungslösung wurde
dann bei 5 psi auf die Schäume
unter Verwendung einer kleinen Chromatographiesprüheinrichtung
mit Druckluft gesprüht.
Eine Gewichtszunahme von 10 bis 15% wurde durch Verändern der
Sprühdauer
erzielt, basierend auf der Größe des Schaums
und der berechneten Flussrate des Sprühens. Das Verdampfen des Methylenchloridlösungsmittels
wurde durch direkt an das Besprühen
anschließendes
Bedecken des Schaums verlangsamt. Nach dem Trocknen wurden die Schäume zu dünnen Filmen
gepresst (1 metrische Tonne, 15 s, 0,25 mm Abstand), geschnitten,
abgepackt und bei 2,5 Mrad gammabestrahlt.
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Material,
das durch dieses Verfahren bereitgestellt wurde, wurde dann auf
ein Vorbeugen von postoperativen Anhaftungen in einem Ratten-Cecal-Abschürfungsmodell
untersucht (Goldberg et al. in Gynecologic Surgery and Adhesion
Prevention, Willey-Liss, Seiten 191 bis 204, 1993). HA/CMC-Membrane
oder -Schäume,
Interceed TC7-Membrane (Johnson & Johnson)
und HA/CMC-Film oder -Schäume,
die mit PGA:PLA-Polymer beschichtet waren, wurden um operativ abgeschürfte Ratten-Zäkum herum
angebracht und mit nicht behandelten Kontrollen verglichen (Tiere,
dessen Zäkum
abgeschürft
wurde, die aber keine Behandlung erhielten). Die Ergebnisse aus
zwei Studien sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass Filme und Schäume, die mit dem PGA:PLA-Polymer
beschichtet sind, durchwegs die Anhaftungsbildung, verglichen mit
der Kontrollgruppe, mit Tieren, die Interceed TC7 erhielten und
mit Tieren, die entweder HA/CMC-Filme oder -Schäume erhielten, reduzierten.
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Beispiel 2
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In
diesem Beispiel wurde modifiziertes HA/CMC-Pulver, das gemäß den Verfahren
des US-Patents Nr. 4,937,270
(4,5 g) hergestellt wurde, und in destilliertem Wasser (450 ml)
unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsvermischers (20 min bei
1.000 U/min) suspendiert. Die wieder suspendierte Lösung wurde
in teflonbeschichtete Edelstahlbehälter gegossen und zu festen
Schaumblättern
lyophilisiert. Die Lyophilisierung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt.
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Ein
dünner
Film von Polylactidcopolymer (90% PLA-L:10% PLA-DL) wurde von Medisorb
Corporation erhalten. Der HA/CMC-Schaum und der Polylactidfilm wurden
dann zusammen hitzeverschweißt
zu dünnen Blättern (155
bis 165°C,
15 bis 30 s, 1 metrische Tonne, 0,30 mm Abstand). Die nassen Dehneigenschaften der
Zusammensetzungen wurden mit einem InstronTM Universal
Testing System Modell 4201, das mit einer 500 g Beladezelle ausgestattet
ist, bestimmt. Eine Versuchskammer wurde speziell für das Messen
der mechanischen Eigenschaften der Proben gestaltet, während diese
in eine physiologische Umgebung eingetaucht sind. Die Ergebnisse,
die in Tabelle 2 gezeigt sind, zeigen, dass die Belastung beim Bruch
unter nassen Bedingungen für
die HA/CMC-Filme, die mit PLA laminiert wurden, wesentlich verbessert
wurde. In diesem Experiment wurden die Proben in einer speziell
gestalteten Umgebungskammer unterstützt, die eine physiologische
Umgebung (gepufferte Salzlösung
bei pH 7 und 25°C)
enthält.
Der anfängliche
Probenhalterabstand betrug 25 mm und die Traversegeschwindigkeit
betrug 5 mm/min.
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Beispiel 3
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In
diesem Beispiel wurde modifiziertes HA/CMC-Pulver (4,5 g) in destilliertem
Wasser (450 ml) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsvermischers
(20 min bei 1.000 U/min) suspendiert. Ein Teil eines 100%igen PGA-Gitters
wurde in eine mit Teflon beschichtete Edelstahlwanne gelegt. Die
wieder suspendierte HA/CMC-Lösung
wurde in die Wanne geschüttet
und zu einem festen Schaumblatt gemäß dem Verfahren, beschrieben
in Beispiel 1, lyophilisiert. Die Schaum- und die Gitterzusammensetzung
wurden zu dünnen
Blättern gepresst
(1 metrische Tonne, 15 s, 0,25 mm Abstand) und durch dehydrothermale
Behandlung (100°C über 6 h)
gehärtet.
Die nassen Dehneigenschaften der Zusammensetzung wurden bestimmt
und sind in Tabelle 2 dargestellt. Die nasse Stärke der Zusammensetzung war
viel größer als
die Stärke
des ursprünglichen HA/CMC-Schaums.
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Die
Ergebnisse aus den Beispielen 2 und 3 zeigen, dass die Zusammensetzung
des HA/CMC-Schaums
und der hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymere unter hydratisierten
Bedingungen (Nassbeladung) eine viel größere Stärke haben, als HA/CMC-Schaum
ohne das hydrophobe, bioabsorbierbare Polymer.
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Beispiel 4
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Hyaluronsäure (5,5
g, 13,7 mol, MW 2.350.000) und Carboxymethylcellulose (2,5 g, 9,7
mol, MW 250.000) wurden in 1 l Wasser aufgelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde
mit 0,1 M HCl auf 4,75 eingestellt. 1-(-3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümid (10,6
g, 55,5 mol) wurde dann zugegeben und die Lösung wurde über 1 h durch Zugabe von 0,1
M HCl bei einem pH-Wert von 4,6 bis 5,1 gehalten. Die umgesetzte
Lösung wurde
dann gegenüber
entionisiertem Wasser mit pH 4,0 dialysiert (MW Rückhaltevermögen (cut
off) 12 bis 14.000). Die gereinigte Reaktionsmischung wurde dann
in eine Polystyrolwanne bei einer Gussdichte von 2,2 g HA/CMC/ft2 gegossen.
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Polyglykolsäurefasern
wurden durch Zerschneiden von Dexon-Wundnahtfaden hergestellt. Die
Fasern wurden in Wasser beschallt, um ein mattenähnliches Material mit einem
hohen Grad von Faserverfilzung herzustellen. Dieses Material wurde
dann in Methylenchlorid hydratisiert, um den Fasern zu ermöglichen,
zu verschmelzen, wonach die Fasern luftgetrocknet wurden. Das resultierende
mattenähnliche
Material wurde auf die gegossene HA/CMC-Reaktionsmischung bei einer
Dichte von 0,1 g/ft2 gegeben. Die gesamte
Zusammensetzung wurde dann luftgetrocknet, um eine zweilagige Schicht
aus PGA-Fasern und modifiziertem HA/CMC zu bilden.
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Beispiel 5
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Verfahren
zum Impfen und Züchten
von Säugetierzellen
auf physikalischen Matrizen sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Der Zweck der Matrix ist es, den Zellen Halt zu geben, den Zellen
zu erlauben, durch die Matrix zu migrieren, eine einfache Handhabung
der Zellen für
die Implantation zu ermöglichen
und zu Unterstützen,
dass die Zellen, sobald sie implantiert sind, an Ort und Stelle
bleiben. Die neuen PSA-Verbundstoffe der vorliegenden Erfindung
können
als Matrix für
diesen Zweck verwendet werden. In einem Beispiel wird die hydrophobe,
bioabsorbierbare Matrix aus PSA-Derivat, die wie in Beispiel 2 beschrieben
hergestellt wurde, auf die Größe und die
Form einer Zellkulturschale zurechtgeschnitten. Säugetierfibroblasten,
die aus der Haut durch Trypsinisierung isoliert oder aus einer Standardzelllinie
(z.B. von der ATCC erhältlich)
erhalten wurden, wurden bei 37°C
in einer 5%igen CO2-Atmosphäre und ungefähr 95 bis
100% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. Sobald sie gewachsen
sind, wurden die Fibroblasten aus der Kulturflasche durch Trypsinisierung
entfernt und mit Kulturmedium, das fötales Kalbserum enthält, gewaschen.
Die Zelldichte wurde auf ungefähr
104 bis 106 Zellen/ml
angepasst.
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Die
Matrix wurde in die Kulturschale mit der hydrophoben Seite nach
unten gelegt. Die Zellsuspension wurde auf die Matrix in der Zellkulturschale
gegeben unter Sicherstellung der vollständigen Bedeckung der Matrix;
und diese Mischung wurde bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden
auf der Matrix gezüchtet
bis Zellproliferation durch die ganze Matrix hindurch auftrat. Die
mit den Fibroblasten infiltrierte Matrix kann dann auf dermale Geschwüre, Verbrennungen
und Wunden gelegt werde, um in der Wundheilung zu unterstützen oder
als Hautersatz zu dienen. Die bevorzugte Quelle für die Fibroblasten
ist autologes Gewebe. In Fällen
jedoch, in denen die Verwendung von autologem Gewebe nicht geeignet
ist oder das Gewebe nicht sofort zur Verfügung steht, können allogene
oder sogar xenogene Fibroblasten verwendet werden. Biokompatible
Matrizen, die xenogene oder allogene Zellen enthalten, sind für die Bereitstellung
von extrazellulärem
Gerüst
nützlich,
um die Migration und Etablierung von autologen Zellen während des
Heilungsprozesses zu unterstützen. Biokompatible
Matrizen, die nichtautologe Zellen enthalten, können auch mit standardimmunsuppressiven Therapien
(z.B. Steroiden, Azathioprin, Cyclosporin), wenn gewünscht, verabreicht
werden (z.B. zur selben Zeit oder direkt folgend auf die Anwendung
der Matrix).
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Des
Weiteren können
die biokompatiblen Matrizen auch mit Arzneimitteln oder Wachstumsfaktoren imprägniert werden,
um Infektion an der Auflegestelle zu verhindern bzw. das Wachstum
der Zellen zu verbessern. Z.B. wird erwartet, dass mit Fibroblasten
infiltrierte Matrizen, die TGFβ2 enthalten, besonders nützlich bei der Beschleunigung
von Wachstum von epidermalem Gewebe sind.
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Wir
haben gezeigt, dass diese Vorrichtungen gegenüber bestehenden Produkten die
Handhabungseigenschaften verbessert und das Vorkommen von postoperativen
Anhaftungen in experimentellen Tiermodellen erfolgreicher vermindert
haben. In diesen Experimenten haben HA/CMC:PGA/PLA Zusammensetzungen die
Anhaftungsbildung vermindert, verglichen mit Tieren, die HA/CMC-Vorrichtungen,
Interceed CT7-Filme (vermarktet von Johnson & Johnson zur Anhaftungsvorbeugung)
erhielten oder mit unbehandelten Kontrolltieren.
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Die
wasserunlöslichen
Zusammensetzungen der Erfindung können in Unterleibsoperationen,
Operationen des Urogenitaltraktes, der Neurochirurgie, Gelenkoperationen
und ophthalmologischen Operationen zu Zwecken verwendet werden,
die die Beibehaltung von Gewebestellungen ohne Anhaftungsbildung
verlangen. Sie können
auch als abschließende
Mittel an anastomotischen Stellen für Katheter, Darmanastomosen,
endoskopischen Operationsverfahren, Gefäßtransplantaten und beliebigen
prosthetischen Vorrichtungen, die das Zusammenkleben oder Abschließen von
potentiellen Leckstellen verlangen; als neue, biokompatible Faser
für die
Verarbeitung für
Fäden,
Schnüre,
gewobene oder nicht gewobene Netze, Bindungen und Matten und Fäden für den Wundverschluss;
Sklerosierungsmittel zur Krampfadernentfernung, für Tumore
und Aneurisma; künstliche,
extrazelluläre
Matrixmaterialien zum Zell- und Gewebeersatz für Haut, Sehne, Band, Knochen, Knorpel
oder andere Gewebe oder Organe, verwendet werden.
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Der
Zeitraum, der nötig
ist, um effektiv die Anhaftung zu verhindern, schwankt mit der vorliegenden
Art der Operation oder Verletzung. Im Allgemeinen sollten Gewebe über mindestens
48 h getrennt bleiben, bevorzugt über einen Zeitraum von mindestens
7 Tagen. Demgemäß kann die
Diffusionsgeschwindigkeit der Zusammensetzung, die in irgendeiner
speziellen Situation verwendet wird, variieren, z.B. durch Ändern des
Ausmaßes
der Löslichkeit
oder Unlöslichkeit
der Zusammensetzung, durch Ändern
der Dichte der verwendeten polyanionischen Polysaccharide oder durch
Verändern
der Dicke des Films, Schaums, Gels oder der verwendeten Fasern.
Diese Eigenschaften können
durch Routineverfahren verändert
werden und die für
irgendeine Art von Operation oder Trauma gewünschten Eigenschaften können durch
Routineexperimente unter Verwendung der Anleitung der hierin beschriebenen
Beispiele bestimmt werden.
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Filme,
Schäume
oder Gele der Erfindung können
des Weiteren für
die Gabe von Arzneimitteln verwendet werden. Z.B. kann in dem Fall,
in dem eine schnelle, lokale Gabe wünschenswert ist, wasserlösliche Zusammensetzungen
innerhalb der Erfindung verwendet werden. Alternativ sind Zusammensetzungen,
die wasserunlösliche,
polyanionische Polysaccharide enthalten, nützlich für die fortwährende Abgabe von Arzneimitteln.
Das zu gebende Arzneimittel kann innerhalb der Zusammensetzung dispergiert
sein oder kann konventionell an den Schaum, Film oder das Gel, wie
z.B. in R.V. Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten 107 bis 119,
in T.J. Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems, Marcel
Dekker, Inc., New York, beschrieben, gebunden sein; und der Schaum,
Film oder das Gel können
dann an der Stelle, wo die Gabe wünschenswert ist, implantiert
oder injiziert werden.