JPWO2002081619A1 - グリコサミノグリカン類とコラーゲンの複合体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グリコサミノグリカン類とコラーゲン等の細胞接着性タンパク質とを組み合わせてなる複合材料に関する。特に、グリコサミノグリカン類が有する細胞成長を制御する機能、あるいは、それらの中でもヘパリン/ヘパラン硫酸に特徴的である各種細胞成長因子やサイトカイン等と結合することで細胞増殖・分化等をコントロールする作用を強調したことを特徴とするグリコサミノグリカン構造を有するビニル系高分子とコラーゲン等の細胞接着性タンパク質とを組み合わせてなる複合材料及びその医療への応用に関する。
背景技術
ヘパリン/ヘパラン硫酸(HS)、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等を含むグリコサミノグリカン(GAG)類と呼ばれる酸性多糖類群は、コアタンパク質と共有結合的に集合化してプロテオグリカン(PG)を形成し、結合組織や細胞膜などに存在している。PGはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン等の細胞接着性のタンパク質とともに細胞外マトリックス(ECM)を構成し、細胞が生存し生物学的機能を果たすために広く分布している。特に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)はほとんどの動物組織に存在し、細胞の接着、形態形成、機能維持に極めて重要な役割を果たしている。
PGに含まれるヘパリン/HSは、様々な細胞成長因子と相互作用し、細胞の分化や増殖を制御することに深く関わっていることが明らかになってきた。例えば線維芽細胞成長因子(FGF)はヘパリン/HSと高親和性を有するFGFファミリー(現在FGF1〜FGF10程度まで報告されている)を構成しており、そのタイプによって血管内皮細胞、カポジ肉腫細胞、表皮角化細胞等に特異的に作用する。これらのFGFの活性は、細胞表面のFGF受容体(FGFR)と特異的に結合することにより起こるものと考えられている。膜を貫通して存在するヘパリン/HSは細胞の近傍で不安定なFGF分子を安定な状態で保持・蓄積し、タンパク質分解酵素や酸化的分解からFGFを保護しながら必要に応じてFGFRへの結合をサポートするものである。FGFがFGFRに結合することにより増殖シグナルが送られて細胞増殖が促進されることになる。このような作用は、ヘパリン/HSが存在しなければFGFとFGFRとが結合できないことを示唆した多くの研究によって証明されている(例えば、M.Ishihara,Glycobiology,4,817−824(1994)参照)。
一方、コンドロイチン硫酸は、軟骨組織中のヒアルロン酸リッチな巨大PG骨格の中に豊富に存在し、骨形成の制御に密接な関わりを持つ。このように、GAG類は、様々な組織中でその機能に応じた分布や構成を持ち、特徴的な細胞成長の制御を担っている。
本願発明者等は、このような多彩な機能を持つヘパリン/HSを含むGAG類の基礎研究や医療への応用等について研究を進めており、ビニル系高分子主鎖にGAG類の基本骨格を結合せしめたグリコサミノグリカン機能化高分子を合成し、その細胞培養基材や抗腫瘍剤等としての用途に関して特許出願した(国際特許出願公開WO00/59967号公報)。このような機能化によって、GAG類が有する細胞成長に対する基本的な活性を効率よく強調することが可能となった。
一方、PGとともに細胞外マトリクスを構成する主要成分である細胞接着性タンパク質、中でもコラーゲンは、その細胞接着特性に基づいて細胞培養基材や人工臓器等に広く応用されている。例えば、繊維芽細胞、内皮細胞、及び好中球を含む種々の細胞型が、コラーゲンのみからなるマトリクスに接着して成長、泳動することが示されている。また、これらの接着は、インテグリンファミリーのメンバーといった細胞表面レセプターの数に依存することが示されている(Myles,J.L.,等,J.Biomater Sci Polymer Edn.,11:69−86(2000))。
最近特に注目されている再生医療の分野では、生体外において様々な細胞の分化/増殖を制御する試みがなされている。一般に、分化は細胞増殖を抑制した状態で細胞特有の機能発現を優先するのに対し、増殖(脱分化)は機能よりも増えることを優先する。組織再生においては、増えること(脱分化)と分化によって特有の機能発現をすることのバランスが重要である。概して、in vitroでの細胞培養では、コラーゲンは脱分化を誘導しやすいとされている。
発明の開示
本発明者等は、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質と上記GAG機能化高分子とを組み合わせて、コラーゲン及びPGからなる細胞外マトリクスに類似した環境を構成することにより、そこにおける細胞の分化/増殖をコントロールするというバイオミメティックな観点から研究を行った。このような、細胞外マトリクス構造を人工的な材料を用いて再現しようとする試みは、これまでに行われていない。その結果、上記GAG機能化高分子が天然ヘパリンより強固にコラーゲン等の細胞接着性タンパク質上に吸着されること、そしてGAG機能化高分子を吸着させたコラーゲン基質にFGF−2やVEGF165等のヘパリン結合性成長因子が有効に固定化されることを見出した。加えて、GAGの中でもコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸は軟骨組織中に多く含まれて骨形成の制御に深く関与していることが示唆されていることに鑑み、これを同様に機能化高分子としてコラーゲン等と複合化することにより軟骨形成が促進されることも見出し、本発明をなすに至った。
よって本発明は、ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子を、細胞接着性タンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体を提供する。
本発明のグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体(以下「GAGタンパク質複合体」とする)は、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質とプロテオグリカン(PG)からなる細胞外マトリクスに類似の構成を有し、成長因子やサイトカインの接着及び細胞増殖・分化のコントロールについてグリコサミノグリカン機能化高分子(以下「GAG高分子」とする)が天然PGと同等以上に作用し、複合体表面に種々の成長因子やサイトカインを濃縮し保持でき、さらに軟骨組織等の誘導を促進することができる。特に、ヘパリン/ヘパラン硫酸系のGAG高分子では、成長因子やサイトカインとの強化された相互作用によって細胞増殖・分化のコントロールを効率化し、軟骨組織等の誘導を促進することができる。
発明を実施するための好ましい形態
本発明のGAGタンパク質複合体は、ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン類の基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子(GAG高分子)を細胞接着性タンパク質に担持せしめてなる。
本発明のGAG高分子の主鎖として用いられるビニル系高分子は、重合性のモノマーから構成され、例えば、化学便覧(561頁、応用化学編I、日本化学会、丸善(昭和61年))に記載された付加重合系、縮重合系、重付加系、付加縮合系、開環重合系のモノマーから任意に選択したモノマーを含むホモポリマー又はコポリマーでよく、特に限定されない。好ましくは、少なくとも1つの不飽和結合を有する付加重合系のモノマー、例えばエチレン、プロピレン、スチレン、酢酸ビニル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド等の1又はそれ以上から形成されるポリマーが挙げられ、それらは任意に置換されていてもよい。
このような高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖が結合している本発明のGAG高分子は、下記一般式(1)で表される単位を少なくとも1つ含む。
−(CWX−CYZ)n− (1)
上記式中、Wは糖鎖を表し、X、Y及びZは、水素原子又は例えばメチル、エチル等のアルキル基、アセチル等のアシル基、アルコキシ基、アリール基、アラルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、シアノ基などの任意の置換基を表し、nは1以上、好ましくは2〜1000、より好ましくは5〜500、さらに好ましくは10〜300の繰り返し単位数を示す。
本発明のGAG高分子を構成する糖鎖は、ヘパリン/HS、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸などのGAG類を構成する基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を有し、その構成二糖体の数が2〜50個以上、より好ましくは4〜25個の二糖類以上のオリゴ糖類もしくは多糖類である。例えば、ヘパリン/HSに含まれる3−O−硫酸基を有する特徴的な構造ドメインに相当する5糖配列以上からなる糖鎖は、血液凝固を阻害するアンチトロンビンIIIと特異的に結合し、2−O−硫酸基と6−O−硫酸基を豊富に含む10糖配列以上の構造ドメインに相当する糖鎖はFGF−1及びFGF−4の活性発現に関与する。一方、成長因子結合に重要であることが知られた硫酸基を有するGAG類のみならず、硫酸基を持たないヒアルロン酸構造を有するGAG高分子も好ましく用いられる。
前記糖鎖は、例えばN−硫酸基を持つ場合にはそれを選択的に脱硫酸化したものを含む修飾体、あるいは化学的に合成したものでも天然のものでもよい。ただし、天然グリコサミノグリカンの化学分解によって得られる分解糖鎖であり、当該分解糖鎖が、その化学分解によって生じた官能基を介して高分子主鎖に結合するものが製造上好ましい。
硫酸基を有する天然GAG類としては、ヘパリン/HS、コンドロイチン硫酸(例えば、生化学工業(株)から市販されているコンドロイチン硫酸A〜E等の、様々な4−硫酸/6−硫酸構造比率を有するもの、二糖二硫酸構造を有するものを含む)、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などが挙げられるが、特に構成糖の硫酸化のパターンが豊富なヘパリン/HSがより好適に用いられるが、他のGAG類でも何ら支障はなく、例えばコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸は軟骨組織の再生に適している。また、セルロース、アミロース、ラミナラン、アガロース、カラゲナン、イヌリン、レバン、キシラン、マンナン、キチン、ペクチン、アミロペクチン、ガラクタン、トリチシン、アラビナン、コロミン酸などのホモ多糖類や、グルコマンノグリカン、ガラクトグルコマンノグリカン、グアゴム、アラビノガラクトグリカン、アラビアゴム、トラガント酸、アルギン酸などのヘテロ多糖類に対し酵素的あるいは化学合成的に硫酸基を導入したものを用いてもよい。
前記天然グリコサミノグリカンの化学分解は、例えば、上記の多糖類を、pH6.5〜8.0以外の非生理的な条件、好ましくはpH5以下またはpH10以上の酸及び/またはアルカリ性領域で、亜硝酸や過ヨウ素酸などを用いて糖鎖結合を切断して分画糖鎖を得ることによって好ましく調製される。また、ヘパラナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼなどの選択的な糖鎖分解酵素や、場合によっては、熱、プラズマ放電、あるいはラジカル反応性試薬に基づく化学的な分解等で得られた分画糖鎖を用いることもできる。
本発明のGAG高分子における糖鎖は、共有結合によって高分子主鎖に結合している。その結合は特に限定されることはなく、高分子主鎖及び糖鎖が有する官能基の組み合わせに従って、適当な反応条件で、任意に触媒などを用いて両者の官能基同士をカップリングさせる。また、高分子主鎖を構成するモノマーと糖鎖とを結合させて糖鎖誘導モノマーとし、そのモノマーを重合させても、反応性基を有する高分子に糖鎖を結合させてもよいが一分子中の糖鎖含有量を調節できることから、糖鎖誘導モノマーを重合するのが好ましい。中でも、分画された親水性の糖鎖を疎水性のモノマー単位に導入し、それを重合して得られたGAG高分子(ホモポリマー)は、一つの分子中に高密度の糖鎖を有するのに加えて、水溶性のポリマーでありながら疎水性の樹脂製品に容易に吸着できる特性を有する。
一実施態様として、本発明のGAG高分子における糖鎖の導入は、ビニルベンジルアミン等のアミノ基を有するモノマーに対して、例えば、化学的に分解されたGAG類に生成したアルデヒド基やカルボニル基を介したシッフ結合により行うことができる。他の実施態様としては、酸クロリド基、N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、あるいはエポキシ基などを有するカップリング剤を使用してビニルモノマーと糖鎖の官能基とを結合する方法等も好適に用いられ得る。特に、化学的な分解によってGAG類に生成したアルデヒド基を用いる方法は、簡便でGAG類の活性を保存しやすいという点で好ましく用いることができる。
このような本発明のGAG高分子は、天然のGAG類の活性ドメインを立体的構造をなす一分子中に複数個含有することにより、その活性ドメインが有する生理活性が一層強化される(クラスター効果)。例えば、ヘパリン/HS構造を持つGAG高分子では、特に各種細胞成長因子やサイトカインに対する相互作用が向上し、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸構造を有するGAG高分子では軟骨細胞誘導活性が一層強化される。一分子中の活性ドメイン数が最大となるのは糖鎖を導入したビニルモノマーを単独重合したホモポリマーであるが、目的や用途に応じて糖鎖を持たない他のモノマーと共重合したコポリマーとすることも可能であり、その調整は当業者の通常の技量の範囲内である。
一方、本発明のGAGタンパク質複合体を構成する細胞接着性タンパク質は、天然の細胞外マトリクスを構成するタンパク質類から好ましく選択され、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の糖タンパク質を含む。好ましくはコラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチン、中でもコラーゲンが入手の容易さや産業上の汎用性等から好ましく用いられる。
本発明のGAGタンパク質複合体は、前記細胞接着性タンパク質からなる基材に、前記GAG高分子を担持させることにより調製される。上述したように、本発明のGAG高分子はビニル系の疎水性高分子主鎖に親水性(水溶性)の糖鎖が複数結合しているため、水溶液中では高分子主鎖をコアとし、その周囲に糖鎖を広げた形で存在しているものと思われ、その結果、GAG高分子全体としては水溶性となりうる。従って、コラーゲン基質等にGAG高分子水溶液を適用し、必要ならば余分な水溶液を吸引などにより除去し、所定時間放置することにより容易に吸着固定化することができる。場合によっては、ウシ血清アルブミンを含むPBS(BSA−PBS)等で洗浄する。
本発明で使用するGAG高分子は、高分子主鎖に基づく疎水性により、医療用に広く用いられている合成樹脂製品、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエステル製品などの疎水的樹脂表面に吸着することを特徴とする。しかし驚くべきことに、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質表面にも極めて強固に吸着固定化されることが見出された。特に、ヘパリン/HS系GAG高分子では、その吸着力は水溶性の天然ヘパリン分子よりも強いことが実験的にも確認された。本発明者等は、この強固な吸着力は、本発明のGAG高分子が単なる静力学的吸着のみならず、GAG高分子の疎水性主鎖と細胞接着性タンパク質内に存在する疎水性部分との疎水性相互作用にも基づいているものと考えている。GAG高分子の吸着量は特に制限されず、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質の形態(フィルム状、厚みを持つ膜状あるいは立体的なスポンジ状など)にも依存するが、使用するGAG高分子水溶液の濃度や量、洗浄の有無や程度等によって容易に調節できる。例えば、1〜1000μg/100μl程度の濃度のGAG高分子水溶液を用いた場合には、細胞接着性タンパク質フィルムの表面1cm2当たりに担持されるヘパリン等のGAG分子の量は、約1〜100μg程度とすることができる。また、GAG高分子水溶液の濃度を10〜200μl/100μl程度とすれば、固定化されるGAG分子の量は、洗浄後に約5〜50μg程度となる。
本発明のGAGタンパク質複合体は、実質的に基材となる細胞接着性タンパク質の形状に基づく形態をとり、その表面あるいは立体的形状の多孔体などではその内部にもGAG高分子が担持された構造をなす。基材となる細胞接着性タンパク質は、その目的や用途に応じて如何なる形状としてもよい。例えば、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質のみからなる材料を適宜成形して基材とすることもでき、他の材料表面に細胞接着性タンパク質を保持させて基材とすることもできる。例えば、実質的にコラーゲンのみからなるコラーゲン膜やコラーゲンスポンジ等は前者の例であり、シャーレ、プレート、ビーズなどの器具表面をコラーゲン等の細胞接着性タンパク質で被覆したものは後者の例である。言い換えれば、平面的なコラーゲン被覆プレートから幾分の厚みを持ったコラーゲン膜、さらには立体的なコラーゲンスポンジを基材とし、その表面にGAG高分子を担持させることにより、二次元に近い構造から三次元構造まで変化させることが可能である。
かくして得られたGAGタンパク質複合体は、そのまま様々な形状の細胞培養基材等として供することができる。よって本発明は、上記GAGタンパク質複合体を含んでなることを特徴とする細胞培養基材も提供する。このような細胞培養基材は、シャーレ、プレート、ビーズなどの器具表面に本発明のGAGタンパク質複合体を配したものでもGAGタンパク質複合体のみから構成されるものでもよい。これらの細胞培養基材表面には、高密度にGAG類が吸着固定化されている。従って、効率よく各種細胞成長因子又はサイトカインが接着、濃縮かつ保持されるとともに、組織特異性の高いコンドロイチン硫酸等の活性を強調することができる。
例えばヘパリン/HSを含むGAG類は、繊維芽成長因子(FGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、ヘパリン結合性上皮成長因子(HBEGF)、血小板誘導成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、顆粒球/マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン(IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−6、IL−7、及びIL−8)、インターフェロンγ、及びマクロファージ炎症タンパク質−1(MIP−1)等を含む様々な成長因子及びサイトカインに結合することは良く知られている。従って、これらのヘパリン結合性成長因子やサイトカインは本発明のGAGタンパク質複合体表面に有効に結合する。後述の実施例に記載するように、本発明のGAGタンパク質複合体表面には、FGF−2及びVEGF165に加えて、FGF−1、HGF、HBEGF、TGF−γ、GM−CSF、及びIL−3がHCPS結合コラーゲン表面に有効に濃縮固定化されることが観察された。即ち、本発明のGAGタンパク質複合体は、ヘパリン結合性のものを含む種々の成長因子及びサイトカインを固定化及び保持するための優れた生体材料を提供する。
本発明のGAGタンパク質複合体を細胞培養基材として使用する場合、上記の成長因子やサイトカインは、本発明のGAGタンパク質複合体及び対象とする細胞を含む系に遊離した状態で存在させてもよいし、当該GAGタンパク質複合体上に固定化してもよい。本発明者らは、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン又は本発明のGAGタンパク質複合体と遊離の繊維芽細胞成長因子FGF−2とが共存する系においては、GAGタンパク質複合体を用いた方がコラーゲンのみの基材を用いた場合に比較して、より低濃度の成長因子でヒト臍静脈内皮細胞等の細胞成長が促進されることを見出した。さらに、コラーゲンのみの基材にFGF−2等の成長因子を固定化した場合には、成長因子濃度を変化させても細胞増殖の促進効果に僅かな変化しか無いのに対し、本発明のGAGタンパク質複合体に成長因子を固定化した場合は、細胞増殖が成長因子の濃度依存的に促進され、いずれの成長因子濃度でもコラーゲンのみの基材を用いた場合より優れていることも見出した。よって、本発明のGAGタンパク質複合体の一態様では、当該複合体上に成長因子又はサイトカインが高密度で固定化されている。この態様のGAGタンパク質複合体も、そのまま上記のような細胞培養基材として使用できることは言うまでもない。
成長因子やサイトカインの使用量は特に限定されないが、一般に、系に遊離した状態で存在せしめる場合には、約0.01ng/ml〜約500ng/ml、好ましくは約0.05ng/ml〜約100ng/ml、より好ましくは約0.1ng/ml〜約20ng/ml程度とし、複合体に固定化する場合の濃度としては、少なくとも約0.01ng/ml以上、好ましくは約0.1ng/ml以上、より好ましくは約1ng/ml以上とする。複合体への固定化量は、使用する成長因子やサイトカインの濃度に依存して単純増加するが、固定化される飽和量は複合体の形状や表面積などによって簡単に増加させることができる。
さらに本発明者等は、本発明のGAGタンパク質複合体が、驚くべきことに成長因子の不存在下でも細胞増殖や分化等を促進することを見出した。例えば、成長因子結合性のヘパリン/HSに基づくGAGタンパク質複合体にヘパリン結合性成長因子などが高度に濃縮され、繊維芽細胞や内皮細胞の増殖を促進するのは上述した通りであるが、成長因子を添加しない場合においても、細胞接着性タンパク質であるコラーゲンのみの基材上で培養した場合に比較して細胞増殖を有意に促進する。さらに、例えばコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸に基づくGAG高分子を用いて軟骨細胞を培養した場合も、コラーゲンのみの場合よりも成長因子の無い系における軟骨細胞の増殖性が顕著に向上した。
即ち、種々の成長因子及びサイトカインと組み合わせたGAGタンパク質複合体と同様に、成長因子やサイトカインを含まない本発明のGAGタンパク質複合体は、細胞及び組織工学分野において、増殖及び分化などの細胞成長をコントロールする新規な生体材料として提供されるものである。
このような材料は必要に応じて如何なる形態とすることもできる。即ち、例えばスポンジ又はシート状のコラーゲン基材にGAG高分子を吸着させたGAGタンパク質複合体は生体内に埋め込むのに適しており、生体内で人工的に再現されたPG類似構造体を実現できる。このような構造体においては、GAG結合性を有する成長因子が接着し、当該成長因子によって刺激される細胞増殖が促進される。例えば、FGFが高度に接着及び濃縮された環境においては、軟骨細胞等の分化・増殖が促進され、やがて軟骨組織等が再生される。よって本発明は、上記のGAGタンパク質複合体からなる組織再生治療材も提供するものである。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(実施例1)
1.ヘパリン担持ポリスチレンの調製
GAG高分子としてのヘパリン担持ポリスチレン(HCPS)を、Ishihara M.,等,J.Biomed.Mater.Res.,50:144−152(2000)に記載されているように調製した。簡潔に説明すると、ブタの腸からのヘパリン(25g)を、0.1MのNaIO4を含有する0.05Mの酢酸ナトリウムバッファー(pH5)400mlに溶解させ、4℃で3日間撹拌した。次いで、未反応のNaIO4をグリセロール(25ml)の添加により中和し、引き続いて反応混合物を透析して凍結乾燥させた。生成物(過ヨウ素酸酸化したヘパリン)をアルカリ溶液(pH12)中、室温で30分間分解させ、透析及び凍結乾燥の後、分解生成物を過ヨウ素酸酸化−アルカリ分解(IO4−LMW)−ヘパリンとして回収した。
このIO4−LMW−ヘパリン(500mg)及びN−p−ビニルベンジルアミン(250mg)を50mMのN,N,N’,N’,−テトラメチル−エチレンジアミン(pH4.75)20mlに溶解させ、その後1mlの0.8mMのNaCNBH3を添加した。反応混合物を室温で24時間撹拌し、透析及び凍結乾燥して、白色粉末(ヘパリン担持モノスチレン)を得た。この粉末(100mg)及び2mgの過酸化硫酸カリウムを1mlの蒸留水に溶解させて、乾燥N2下、60℃で24時間重合を行った。反応溶液を過剰量のエタノールに投入して、ポリマーを析出物として得た。水溶性の不純物は、析出物から限外濾過を用いて除去し、凍結乾燥の後にHCPSを白色粉末として得た。
2.コラーゲン被覆培養プレート及びコラーゲン膜へのHCPSの結合性
96ウェル及び24ウェルの懸濁培養プレート(住友ベークライト社製)を、各々50及び200μlの酸性水(pH3)中0.03重量%のI型コラーゲン(コウケン社製)で、4℃において終夜被覆した。残りのコラーゲン溶液を吸引によりウェルから除去し、プレートをリン酸塩バッファー(PBS)で2回洗浄した。次いで各コラーゲン被覆プレートを、50μl(96ウェルプレート)及び200μl(24ウェルプレート)のHCPS水溶液(例えば0.1重量%)で、4℃において終夜被覆した。続いて残りのHCPS溶液を吸引によりウェルから除去し、プレートを、1重量%ウシ血清アルブミンを含むPBS(BSA−PBS)中の0.5M NaCl溶液で2回、BSA−PBSで2回洗浄した。コラーゲン被覆プレート上に固定化されたHCPSの量は、カルバゾールアッセイ(Bitter T.,等,Anal.Biochem.,4:330−334(1962))を用いて見積もった。
また、24ウェル組織培養プレート中のコラーゲン膜(64mm2、コウケン社製)も、同様に100μlのHCPS水溶液(例えば0.1重量%)で、4℃において終夜被覆した。HCPS結合コラーゲン膜を、次いでBSA−PBS中の0.5M NaCl溶液で2回、BSA−PBSで2回洗浄した。コラーゲン膜上に固定化されたHCPSの量は、カルバゾールアッセイを用いて見積もった。
上記の方法により、種々の濃度のHCPS水溶液を用いてコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜にHCPSを結合させたところ、HCPS濃度の上昇に伴ってコラーゲン上に結合するHCPS量は増加し、やがて平衡に達した(図1)。コラーゲン上に結合したHCPS量は、37℃での3日間のインキュベーション後でも変化しなかった(データは示さず)。一方、対照としての(種々の型のコラーゲンとの相互作用が知られている)天然ヘパリン分子は、コラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜に結合したものの、結合したヘパリン量はHCPSより少なかった(図1)。さらに、結合したヘパリンの多くがPBS−BSA中の0.5MのNaCl溶液でのリンスで脱離してしまった。
これらの結果は、HCPSのコラーゲン表面への強力な結合性が、ヘパリン鎖のコラーゲンへの特異的結合のみではなく、HCPSとコラーゲンとの間の立体構造上のマッチングなどにも依存することを示唆している。一般的に、HCPS結合コラーゲン膜を調製するのに100μg/100μlのHCPS水溶液を用いた場合、洗浄後にコラーゲン表面1cm2当たりに10〜20μgのヘパリン分子が固定されると見積もられた。このようにして、本実施例のGAGタンパク質複合体が形成された。
3.GAGタンパク質複合体への成長因子の担持
100μlのBSA−PBS中の種々の濃度のFGF−2及びVEGF165を、上記で作成したGAGタンパク質複合体(HCPS結合したコラーゲン被覆96ウェルプレート及びコラーゲン膜)上に添加し、4℃で終夜インキュベートした。プレート及びコラーゲン膜をBSA−PBSで4回洗浄し、続いてBSA−PBSで1:500に希釈した100μの抗−FGF−2又は抗−VEGF165(R&Dシステムズ社製)を添加して、室温で1時間緩やかに振盪させて混合した。次いでプレート又はコラーゲン膜をBSA−PBSで4回洗浄した後、BSA−PBSで1:1000に希釈した100μlの抗−IgG(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)複合物を添加し、さらに1時間混合した。次に、プレート及びコラーゲン膜をBSA−PBSで4回洗浄し、100μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ基質溶液(Nippon Bio−Rad Lab.社製)を添加して室温で1時間混合することにより発色させた。各ウェルのODを、イムノミニプレートリーダー(Nunc InterMed製)を用いて414nmで読み取った。
ヘパリンと特異的結合性を有し、内皮及び繊維芽細胞の増殖を刺激する成長因子であるFGF−2及びVEGF165のGAGタンパク質複合体への結合性について、上記に従って一般的なELISA法を用いて試験した。FGF−2及びVEGF165の両方とも、濃度依存的にGAGタンパク質複合体上に固定化されることがわかった(図2)。固定化されたFGF−2及びVEGF165の量は、37℃で3日間インキュベートした後でも変化しなかった。一方、これら2つの成長因子が、対照としてのコラーゲンのみ及び天然ヘパリンで処理したコラーゲンに結合する量は、GAGタンパク質複合体への結合量に比較して有意に少なかった。
4.細胞培養及び細胞接着アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)及びヒト皮膚繊維芽細胞をTakara Biochemical社から購入した。この実験に使用した細胞は、4〜8継代の間である。HUVECを、10%の不動化ウシ胎児血清(FBS)、抗生物質(100U/mlペニシリン及び100μl/mlストレプトマイシン)及び10ng/mlのヒト組換えFGF−2(hrFGF−2、R&Dシステムズ製)を添加した199培地(Life Technology Oriental)中で培養した。繊維芽細胞は、10%の熱不活性化FBS及び抗生物質(上記と同様)を添加したDMEM(Life Technology Oriental)中で培養した。
細胞接着アッセイを行うに当たり、トリプシン−EDTA溶液(Sigma Aldrich社)で処理することにより細胞を培養ディッシュから遊離させ、各培地で細胞密度25x104細胞/mlで懸濁させた。細胞懸濁液(プレートに対しては0.5ml、膜に対しては0.3ml)を複数のコラーゲン被覆24ウェルプレート及びコラーゲン膜(GAGタンパク質複合体及び対照品)に添加し、所定時間インキュベートした。次いで、各被覆ウェル及びコラーゲン膜をPBSで3回洗浄した。被覆ウェル及びコラーゲン膜に結合した細胞を、トリプシン−EDTA溶液で処理することにより遊離させた。遊離した細胞数をヘモサイトメーター(Sigma Aldrisch社製)で数えた。
前記細胞接着アッセイの結果を図3に示す。本発明のGAGタンパク質複合体及びコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜は、両方の細胞型で1及び3時間後において類似の接着挙動を示したが、未被覆のプレートはいずれの細胞型についても接着性が極めて低かった。一方、HCPS被覆したのみのプレートも、両方の細胞型に良好な接着性を示したが、コラーゲン基質よりは(HCPS固体化有無に関わらず)低かった。即ち、HCPSは両方の細胞の接着を促進するものの、HUVEC及び繊維芽細胞の初期的接着ではコラーゲン基質との相互作用が優先することが解った。
5.細胞増殖アッセイ
(1)遊離の成長因子を用いた場合
HUVEC増殖アッセイにおいては、96ウェル被覆プレート上に6,000細胞/ウェルの初期密度、あるいは(24ウェル培養プレートについて)15,000細胞/コラーゲン膜の密度で、所定濃度のFGF−2又はVEGF165の何れかを含有せしめた10%の非動化FBSと抗生物質を添加した199培地中の細胞を蒔き、3日間培養した。インキュベーションの後、使用した培地を除去し、10μlのWST−1試薬(Cell Counting Kit、同仁化学研究所製)を含む新鮮培地を各ウェルに添加した。次いで、1時間のインキュベーションの後に、イムノミニプレートリーダーを用いて450nmにおけるODを読み取った。
繊維芽細胞増殖アッセイにおいては、96ウェル被覆プレート上に3,000細胞/ウェルの初期密度、あるいは7,000細胞/コラーゲン膜で、所定濃度のFGF−2を含有せしめた1%の非動化FBSと抗生物質を添加したDMEM培地中の細胞を蒔いた。細胞を4日間培養し、インキュベーションの後に、各ウェル又は膜のODを上記のように測定した。
培養培地中にFGF−2又はVEGF165が存在する場合のHUVEC(各々、図4A及びB)並びにFGF−2が存在する場合の繊維芽細胞(図6A)の増殖を、各成長因子の濃度の関数として示した。本発明のGAGタンパク質複合体以外に、対照としてコラーゲン被覆プレート、コラーゲン膜、及び未被覆(コラーゲン無し)プレート上にHCPSのみを被覆したものを試験した。その結果、HCPSが存在することにより、まず、FGF−2及びVEGF165の不存在下でのHUVEC成長が幾分促進された(図4)。さらにFGF−2は、未被覆プレート以外の全ての基質において濃度依存的にHUVEC増殖を刺激するのに有効であることがわかった。特に、HUVEC増殖は、GAGタンパク質複合体(プレート及び膜)において低濃度のFGF−2(0.13、0.25、0.5ng/ml)を用いても有意に刺激された。同様に、繊維芽細胞増殖も、GAGタンパク質複合体において刺激された(図6A)。HUVEC増殖の刺激に対してVEGF165はFGF−2より効果は顕著ではないものの、VEGF165のマイトジェン活性に類似する刺激が低濃度において観察された。
(2)成長因子を固定化した場合
199培地中のHUVECを、FGF−2又はVEGFを予め固定化したGAGタンパク質複合体(プレート及び膜)に蒔いた。細胞を199培地中で成長因子無しに3日間培養し、上記のようにしてODを測定した。さらに、DMEM中のヒト皮膚繊維芽細胞を、FGF−2が固定化されたGAGタンパク質複合体(プレート及び膜)に蒔いた。細胞をDMEM中でFGF−2無しに4日間培養してODを測定した。
FGF−2及びVEGF165の固定化は上述のように実施した。HUVECを、FGF−2(図5A)又はVEGF165(図5B)の何れかを固定化したGAGタンパク質複合体(被覆プレート又は膜)上で、(成長因子を含まない)199培地中で培養した。HUVECの増殖は、GAGタンパク質複合体(プレート及び膜)において、予め固定化したFGF−2及びVEGF165の濃度依存的に刺激されたが、(HCPSを担持していない)コラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜におけるHUVEC増殖は、予め固定化した成長因子の濃度によって変化しなかった。同様に、繊維芽細胞の成長も、GAGタンパク質複合体において予め固定化したFGF−2の濃度依存的に促進された(図6B)。即ち、本発明のGAGタンパク質複合体(HCPS結合コラーゲン基質)は、ヘパリン結合性成長因子を保持し内皮及び繊維芽細胞増殖を刺激する優れた基質を提供したといえる。
(実施例2)
実施例1と同様にしてHCPSを用いてGAGタンパク質複合体を作成し、その上にHGF、HBEGF、TGF−γ、GM−CSF、及びIL−3という他の成長因子が有効に固定化されることを観察した。
(実施例3)
1.コンドロイチン硫酸担持ポリスチレン(PV−CoC)の調製
GAG高分子としてのコンドロイチン硫酸担持ポリスチレンは、ヘパリンをコンドロイチン硫酸Cに換えて実施例1と同様にして調製した。
2.軟骨細胞の接着アッセイ
軟骨細胞(ウサギ)について、実施例1の内皮細胞及び繊維芽細胞と同様の細胞接着アッセイを実施した。基材としては、未被覆プレート、PV−CoC又はHCPS又はコラーゲンのみを被覆したプレート、コラーゲン膜、及びコラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜にHCPSを固定化したGAGタンパク質複合体を用いた。結果を図7に示す。図7に見られるように、軟骨細胞の場合、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン(被覆プレート及び膜)上に最も良く接着し、PV−CoCを固定化したGAGタンパク質複合体でも実施例1と同様にHCPSを固定化したコラーゲン基質と殆ど同様の接着性が見られた。しかしながら、コラーゲンを含まない基材では極めて低い接着性しか示さなかった。即ち、軟骨細胞の初期接着においても、PV−CoCもHCPSと同様にコラーゲンへの細胞の接着を阻害せずコラーゲンとの相互作用を優先することがわかった。
3.軟骨細胞の増殖アッセイ
基材としてハニカム構造のコラーゲンスポンジ(コウケン社製)を用い、その表面にGAG高分子であるHCPS又はPV−CoCを固定化したGAGタンパク質複合体を作成した。これらのGAGタンパク質複合体及びコラーゲンスポンジに成長因子FGF−2又はTGF−β1を固定化し、そこにおける軟骨細胞の増殖アッセイを行った。HCPS被覆は上記の通り0.1%水溶液を用いて終夜実施し、PV−CoC被覆もそれに準じた。次いで、得られたGAGタンパク質複合体又はコラーゲンスポンジにFGF−2又はTGF−β1で終夜被覆し、0.5MのNaCl/PBSで1時間洗浄した。培地中の軟骨細胞懸濁物を添加して4日間インキュベートした後の軟骨細胞の増殖性を測定した。結果を下記の表1に示す。表1中、増殖性は、GAG高分子を固定化しないコラーゲンスポンジ(対照)を用いた場合の増殖性を1とした場合の比率で示した。
表1において注目すべき点は各成長因子を添加しない場合(添加量=0)であり、このとき、コンドロイチン硫酸構造を持つGAG高分子に基づくGAGタンパク質複合体では、コラーゲン単独の場合に比較して軟骨細胞の増殖性が約3割向上している。この値は、成長因子接着性のヘパリン/HS構造を持つHCPSの増殖促進効果よりも大きい。
また成長因子が存在する場合には、細胞の拡張を促進するFGFの場合は軟骨細胞様の形態を維持しながらFGFの濃度依存的に増殖が増大し、細胞分化やECM合成を促進するTGFの場合はTGFの存在によって大型の細胞形態を維持しながら増殖性が若干低下しており、細胞の組織化が支障なく進行していると考えられる。また、対象のコラーゲンのみでは、線維芽細胞状の形態を維持した。
なお、低分子のヘパリン又はコンドロイチン硫酸を用いた場合には、それらは洗浄過程において殆ど洗い落とされてしまい、未被覆のコラーゲンスポンジの場合と同等の結果しか得られなかった。
【図面の簡単な説明】
図1は、コラーゲン被覆24−ウェルプレート(A)及びコラーゲン膜(B)へのHCPS及び天然ヘパリンの結合性を示すグラフである。横軸に表示した濃度の水溶液を用いて4℃で終夜被覆した。次いで、PBS−BSAで2回洗浄した後に結合しているHCPS(○)及びヘパリン(●)の量、及び0.5MのNaClを含むPBS−BSAで同様に洗浄した後に結合しているHCSP(△)及びヘパリン(▲)の量を示す。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図2は、HCPS有無のコラーゲン被覆プレート(A)及びコラーゲン膜(B)への成長因子(VEGF165及びFGF−2)の固定化を示すグラフである。横軸に示した濃度の成長因子水溶液100mlを各基材に添加した。HCPS担持コラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜へのVEGF165(○)及びFGF−2(●)、天然ヘパリン処理したコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜へのVEGF165(△)及びFGF−2(▲)、並びにコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜へのVEGF165(□)及びFGF−2(■)の固定化について比較して示す。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図3は、HCPS有無のコラーゲン被覆プレート(A)及びコラーゲン膜(B)へのHUVEC及び繊維芽細胞の接着性を示すグラフである。対照としてHCPSのみを被覆したプレート及び未被覆プレートについても示した(A)。37℃で1時間(黒棒)及び3時間(白棒)のインキュベーションをした後の値である。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図4は、遊離したFGF−2(A)又はVEGF165(B)が存在する系でのHUVEC細胞増殖に対するHCPS担持の影響を示すグラフである。HUVECは、HCPS担持コラーゲン被覆プレート(●)、コラーゲン被覆プレート(○)、HCPS担持コラーゲン膜(▲)、コラーゲン膜(△)、HCPSのみ被覆したプレート(■)及び未被覆プレート(□)に蒔いた。培地には、横軸に表示した濃度のFGF−2(A)又はVEGF165(B)を含有せしめて3日間培養した。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図5は、FGF−2(A)又はVEGF165(B)を固定化した系でのHUVEC細胞増殖に対するHCPS担持の影響を示すグラフである。HCPS担持コラーゲン被覆プレート(●)、コラーゲン被覆プレート(○)、HCPS担持コラーゲン膜(▲)、コラーゲン膜(△)、HCPSのみ被覆したプレート(■)及び未被覆プレート(□)を横軸に表示した濃度のFGF−2(A)又はVEGF165(B)で処理して固定化し、成長因子を含有しない培地中のHUVECを3日間培養した。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図6は、遊離した(A)又は固定化したFGF−2が存在する系での繊維芽細胞増殖に対するHCPS担持の影響を示すグラフである。繊維芽細胞は、HCPS担持コラーゲン被覆プレート(●)、コラーゲン被覆プレート(○)、HCPS担持コラーゲン膜(▲)、コラーゲン膜(△)、HCPSのみ被覆したプレート(■)及び未被覆プレート(□)に表示した濃度のFGF−2を含有する培地中で(A)、又は上記プレートを表示した濃度のFGF−2で処理して固定化した後に成長因子を含まない培地中で4日間培養した。図中のデータは、3回の実験の平均±SDで表した。
図7は、GAG高分子(HCPS又はPV−CoC)有無のコラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜への軟骨細胞の接着性を示すグラフである。
Claims (7)
- ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子をタンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体。
- 前記タンパク質がコラーゲンであることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記グリコサミノグリカン機能化高分子が、下記の一般式(1):
−(CWX−CYZ)n− (1)
(上記式中、Wは糖鎖を表し、X、Y及びZは水素原子を含む任意の置換基を表し、nは1以上の繰り返し単位数を示す)
で表されることを特徴とする請求項1又は2に記載の複合体。 - 前記糖鎖が、ヘパリン/ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、あるいはそれらの部分的脱硫酸化修飾体であることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の複合体。
- 前記グリコサミノグリカン機能化高分子を介して成長因子又はサイトカインをさらに固定化したことを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の複合体。
- 請求項1から5のいずれかに記載の複合体を含んでなることを特徴とする細胞培養基材。
- 請求項1から5のいずれかに記載の複合体を含んでなることを特徴とする組織再生治療材。
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US8460691B2 (en) | 2010-04-23 | 2013-06-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Fenestrated wound repair scaffold |
US8790699B2 (en) | 2010-04-23 | 2014-07-29 | Warsaw Orthpedic, Inc. | Foam-formed collagen strand |
FR2972626B1 (fr) | 2011-03-16 | 2014-04-11 | Sofradim Production | Prothese comprenant un tricot tridimensionnel et ajoure |
FR2977790B1 (fr) | 2011-07-13 | 2013-07-19 | Sofradim Production | Prothese pour hernie ombilicale |
FR2977789B1 (fr) | 2011-07-13 | 2013-07-19 | Sofradim Production | Prothese pour hernie ombilicale |
US20130071443A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Agency For Science, Technology And Research | Glycosaminoglycans |
AU2012313983B2 (en) | 2011-09-30 | 2017-01-19 | Sofradim Production | Multilayer implants for delivery of therapeutic agents |
CN103781499B (zh) | 2011-09-30 | 2016-09-28 | 索弗拉狄姆产品公司 | 轻质网的可逆硬化 |
FR2985170B1 (fr) | 2011-12-29 | 2014-01-24 | Sofradim Production | Prothese pour hernie inguinale |
FR2985271B1 (fr) | 2011-12-29 | 2014-01-24 | Sofradim Production | Tricot a picots |
FR2994185B1 (fr) | 2012-08-02 | 2015-07-31 | Sofradim Production | Procede de preparation d’une couche poreuse a base de chitosane |
FR2995779B1 (fr) | 2012-09-25 | 2015-09-25 | Sofradim Production | Prothese comprenant un treillis et un moyen de consolidation |
FR2995778B1 (fr) | 2012-09-25 | 2015-06-26 | Sofradim Production | Prothese de renfort de la paroi abdominale et procede de fabrication |
FR2995788B1 (fr) | 2012-09-25 | 2014-09-26 | Sofradim Production | Patch hemostatique et procede de preparation |
CA2880380C (en) | 2012-09-28 | 2020-09-15 | Sofradim Production | Packaging for a hernia repair device |
JP6202669B2 (ja) | 2013-04-26 | 2017-09-27 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | ペプチド及びその複合体、組織修復用スキャフォールド及びその表面処理方法、並びに表面処理液又は処理液のセット |
FR3006578B1 (fr) | 2013-06-07 | 2015-05-29 | Sofradim Production | Prothese a base d’un textile pour voie laparoscopique |
FR3006581B1 (fr) | 2013-06-07 | 2016-07-22 | Sofradim Production | Prothese a base d’un textile pour voie laparoscopique |
PL3193952T3 (pl) | 2014-09-18 | 2019-09-30 | Chondronest Sa | Kompozycja zawierająca glikozaminoglikany i białka |
EP3000489B1 (en) | 2014-09-24 | 2017-04-05 | Sofradim Production | Method for preparing an anti-adhesion barrier film |
EP3000432B1 (en) | 2014-09-29 | 2022-05-04 | Sofradim Production | Textile-based prosthesis for treatment of inguinal hernia |
EP3000433B1 (en) | 2014-09-29 | 2022-09-21 | Sofradim Production | Device for introducing a prosthesis for hernia treatment into an incision and flexible textile based prosthesis |
EP3029189B1 (en) | 2014-12-05 | 2021-08-11 | Sofradim Production | Prosthetic porous knit, method of making same and hernia prosthesis |
CA2974209A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | Aziz Ghahary | Engineered tissue substitute system |
EP3059255B1 (en) | 2015-02-17 | 2020-05-13 | Sofradim Production | Method for preparing a chitosan-based matrix comprising a fiber reinforcement member |
EP3085337B1 (en) | 2015-04-24 | 2022-09-14 | Sofradim Production | Prosthesis for supporting a breast structure |
ES2676072T3 (es) | 2015-06-19 | 2018-07-16 | Sofradim Production | Prótesis sintética que comprende un tejido de punto y una película no porosa y método para formarla |
JP6901253B2 (ja) * | 2015-10-21 | 2021-07-14 | 株式会社日本触媒 | 接着性細胞培養用基材、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法 |
EP3195830B1 (en) | 2016-01-25 | 2020-11-18 | Sofradim Production | Prosthesis for hernia repair |
EP3312325B1 (en) | 2016-10-21 | 2021-09-22 | Sofradim Production | Method for forming a mesh having a barbed suture attached thereto and the mesh thus obtained |
EP3398554A1 (en) | 2017-05-02 | 2018-11-07 | Sofradim Production | Prosthesis for inguinal hernia repair |
EP3653171A1 (en) | 2018-11-16 | 2020-05-20 | Sofradim Production | Implants suitable for soft tissue repair |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4280954A (en) * | 1975-07-15 | 1981-07-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Crosslinked collagen-mucopolysaccharide composite materials |
US4060081A (en) * | 1975-07-15 | 1977-11-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Multilayer membrane useful as synthetic skin |
US4488911A (en) * | 1975-10-22 | 1984-12-18 | Luck Edward E | Non-antigenic collagen and articles of manufacture |
US5128134A (en) * | 1986-09-17 | 1992-07-07 | Fyodorov Svyatoslav N | Ophthalmological collagen coverings |
US4947840A (en) * | 1987-08-21 | 1990-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable templates for the regeneration of tissues |
US5510418A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-23 | Collagen Corporation | Glycosaminoglycan-synthetic polymer conjugates |
JPH03198768A (ja) | 1989-12-27 | 1991-08-29 | Sanyo Electric Co Ltd | 細胞培養方法及び細胞培養装置 |
SE470006B (sv) * | 1991-09-26 | 1993-10-25 | Corline Systems Ab | Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet |
IT1263316B (it) * | 1993-02-12 | 1996-08-05 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Tessuto non tessuto multistrato in cui uno degli strati e' costituito essenzialmente da esteri dell'acido ialuronico |
AU700584C (en) * | 1994-08-12 | 2002-03-28 | Meadox Medicals, Inc. | Vascular graft impregnated with a heparin-containing collagen sealant |
JPH08168372A (ja) | 1994-12-16 | 1996-07-02 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | コラーゲンコート細胞培養器およびその製造方法 |
AU771610B2 (en) * | 1999-04-02 | 2004-04-01 | Netech Inc. | Functionalized glycosaminoglycan polymer and medical instruments and drugs by using the same |
-
2002
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