JP4555773B2 - 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は、培養皿等の細胞培養基質に効率よく吸着し、細胞接着の再現性に優れた、細胞培養基質表面に疎水結合性吸着ポリマーでコーティングされている細胞培養基質、および、該細胞培養基質に効率よく結合し、細胞接着の再現性に優れた細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品、更には、該細胞接着ペプチドの固相化標品上に細胞を播種し、培養することにより調製される人工組織を提供することにある。
第2図は、MMACを用いて細胞外マトリックス蛋白質および細胞接着ペプチドを固相化したシリコンウェル上で、T2細胞を伸展培養した結果形成された肺胞上皮組織の位相差顕微鏡写真を示した写真である。
第3図は、培養皿に塗布・固相化した細胞外マトリックス蛋白質に対するT2細胞の接着が、遊離の当該細胞接着ペプチドにより阻害されることを示した図である。
第4図は、MMACを用いて固相化した細胞接着ペプチド基質に対するT2細胞の接着、およびその接着が遊離の当該細胞接着ペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第5図は、疎水結合性吸着ポリマーのMASTを用いて固相化した細胞接着ペプチド基質に対するT2細胞の接着、およびその接着が遊離の当該細胞接着ペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第6図は、MMACを用いて固相化した細胞接着ペプチド上におけるT2細胞の細胞接着、伸展の様子を微分干渉顕微鏡で撮影した写真である。
第7図は、MMACを用いて固相化した細胞接着ペプチド基質に対するT2細胞の接着が、ヘパリンによって阻害を受けることを示した図である。
第8図は、固相化細胞接着ペプチド基質に対するT2細胞の接着は、お互いに遊離ペプチドで競争阻害を受ける場合と一方的に競争阻害を受ける場合があることを示した図である。
第9図は、固相化したFIB−1ペプチドに対するT2細胞の接着結合力(親和性、affinity)を基準にした場合、固相化したLNの細胞接着ペプチドの親和性は、FIB−1と同程度のものから100倍高いものまで広範囲に亘ることを示した図である。
第10図は、無血清培地で1−10μg/mlの濃度に希釈し、培養皿に吸着・固相化させた偽似マトリックスMBAC−peptideに対するT2細胞の接着、およびその接着が遊離の当該細胞接着ペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第11図は、無血清培地で1−10μg/mlの濃度に希釈し、培養皿に吸着・固相化させた偽似マトリックスMAST−peptideに対するT2細胞の接着、およびその接着が遊離の当該細胞接着ペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第12図は、無血清培地で1−10μg/mlの濃度に希釈し、培養皿に吸着・固相化させた偽似マトリックスMBAC−peptideを当該ペプチドに対するポリクローナル抗体で処理すると、T2細胞の接着が特異的に阻害されることを示した図である。
第13図は、無血清培地で1−10μg/mlの濃度に希釈し、培養皿に吸着・固相化させた偽似マトリックスMBAC−peptideをヘパリンで処理すると、T2細胞の接着が特異的に阻害されることを示した図である。
第14図は、無血清培地で1−10μg/mlの濃度に希釈し、培養皿に吸着・固相化させた偽似マトリックスMBAC−peptideをヘパリンで処理すると、T2細胞の接着が特異的に阻害されることを示した図である。
第15図は、50%エタノールで2−20μg/mlの濃度に希釈して培養皿に50μl注ぎ、風乾・固相化させた偽似マトリックスMAST−GRGDSPおよびMMAC−GRGDSPの塗布量(0.1−1.0μg/well)に依存して、無血清培地に懸濁したT2細胞の接着量が変化することを、FNを塗布した場合を基準として示した図である。
第16図は、50%エタノールで希釈して培養皿に注ぎ、風乾・固相化させた偽似マトリックスMAST−GRGDSP(0.1−1.0μg/well)に対するT2細胞の接着が、遊離のGRGDSPペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第17図は、50%エタノールで希釈して培養皿に注ぎ、風乾・固相化させた偽似マトリックスMMAC−GRGDSP(0.1−1.0μg/well)に対するT2細胞の接着が、遊離のGRGDSPペプチドにより競争阻害を受けることを示した図である。
第18図は、50%エタノールで希釈して培養皿に注ぎ、風乾・固相化させた偽似マトリックスMBAC−peptideおよびMAST−peptide(0.1−1.0μg/well)に対するT2細胞の接着が、遊離の当該ペプチドにより競争阻害をうけることを示した図である。
第19図は、50%エタノールで希釈して培養皿に注ぎ、風乾・固相化させた偽似マトリックスMBAC−FIB−1およびMAST−FIB−1(0.1−1.0μg/well)を、FIB−1ペプチドに対するポリクローナル抗体で処理すると、T2細胞の接着が特異的に阻害されることを示した図である。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂何れの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂またはフッ素樹脂等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコン樹脂等が例示される。
無機物としては、ガラス、ヒドロキシアパタイト、シリコン等のIC基材またはカーボンナノチューブ等が例示される。
疎水結合性吸着ポリマーとしては、分子内に疎水性を有する直鎖状骨格と蛋白質またはペプチドと反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーであって、以下の式[I]
a)培養皿に塗布する工程が簡素化され、工業生産上は有利となる。
b)培養皿以外の基質にもプリント技術を使えば、吹き付けることにより容易に塗布出来るので、種々の基材が培養基質になる。
c)細胞接着させる部分をプリントし、どの様に種々の細胞と共培養するかデザイン(配置)出来るようになり、丁度、IC回路を設計する感覚で人工組織を構築することができる。
d)偽似マトリックスは、必ずしも培養液で希釈して培養皿表面に吸着・固相化するだけが唯一の方法では無く、例えば50%エタノールに希釈して塗布することも出来る。この場合は、風乾しても塩は析出せず、高温での保存性が格段に優れている。
等の利点を有している。
20mm×20mm×10mmの溝を有するシリコンウェルに、50μg/mlのMMAC(ISP,International Specialty Products,USA)のエタノール溶液0.5mlを注ぎ、余分な溶液は吸い取り、その後風乾することにより、MMACでコーティングされたシリコンウェルを得た。
実施例1の方法で得たコーティングしたシリコンウェルに、0.1Mトリエタノールアミン緩衝液、pH8.8に溶かした10μg/mlのフィブロネクチン(FN)、ラミニン−1(LN)の細胞接着蛋白質溶液、あるいは0.25mg/mlのFIB−1、AG73の細胞接着ペプチド溶液を各々注ぎ、37℃で数時間以上反応させ、これらの細胞接着活性を有する蛋白質あるいはペプチド類を結合し、固相化した(固相化の詳細は後述する実施例6参照)。その後、単位面積当たり5x104/cm2の肺胞2型上皮細胞(T2細胞)懸濁液を注いで、CO2培養装置内で培養を開始した。
なお、図中の1d、2dおよび3dは、それぞれ培養日数を意味する。
実施例2の方法とほぼ同様にして調製した、細胞接着蛋白質またはペプチドを固相化したシリコンウェルに単位面積当たり2x105/cm2のT2細胞を播種し、1日間静置培養した。播種した細胞が培養面全体をconfluentに伸展していることを確認した後、培養細胞伸展装置((株)スカラテック社製)を用い、25%伸展率、毎分15回の頻度で水平方向に強制的に細胞伸展を開始し、更に1日間培養を継続した。培養終了後、細胞接着の状態を位相差顕微鏡で撮影した(図2の上段4列)。
実施例2の方法とほぼ同様にして調製した、細胞接着蛋白質またはペプチドを固相化したシリコンウェルに単位面積当たり5x104/cm2のT2細胞を播種し、3日間静置培養した。T2細胞は、図1の3dと同様に生育した(結果は、重複するので示さず)。次に、図1と同じ強制伸展刺激を与え、更に1日間培養を継続した。培養終了後、細胞接着の状態を位相差顕微鏡で撮影した(図2の中段4列)(FN,3dC−1dS、LN,3dC−1dS、FIB−1,3dC−1dS、およびAG73,3dC−1dS)。
実施例4の伸展培養とほぼ同様にして、強制的な伸展培養を3日間行った。培養終了後、細胞接着の状態を位相差顕微鏡で撮影した(図2の下段4列)(FN,3dC−3dS、LN,3dC−3dS、FIB−1,3dC−3dS、およびAG73,3dC−3dS)。
全ての操作は無菌操作を前提とする。始めに、細胞接着蛋白質の場合はエタノールに10μg/mlのMMACやMAST等の疎水結合性吸着ポリマーを、ペプチドの場合は50μg/mlのMMACやMASTを溶かし、フィルターを通した後に細胞培養用に表面処理をしていない96穴培養皿に50μlずつ注ぎ、暫く静置後MMAC等を吸い取って風乾する。次に、0.1Mトリエタノールアミン緩衝液、pH8.8溶液に10〜20μg/mlの細胞接着蛋白質または0.25mg/mlのペプチドを溶かし、先程MMAC等をコートした96穴培養皿に50μlずつ注ぐ。37℃に加温されたインキュベーター内で加湿しながら、一晩反応させる。反応終了後、反応液を吸い取り、残余の反応液を培地でリンスして、細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品を調製する。該標品は、固相化細胞接着蛋白質またはペプチド基質として、以下の実施例に示すように、細胞培養に供することができる。
また、MMAC等コートだけのときは、96穴培養皿の底面は、無水マレイン酸が加水分解して出来たカルボキシル基の陰電荷のため、細胞はほとんど接着できない。
細胞培養の際に、細胞接着蛋白質として通常使用されている市販品のFN、LNおよびVNを各々5μg/ml、10μg/mlおよび10μg/mlの濃度で培養皿に塗布した。ColI(I型コラーゲン)の場合は、1mMHClに溶かした100μg/mlの濃度のColIを培養皿に注ぎ、暫く静置した後、溶液を除いて風乾し、使用前に培地で洗って使用した。次に、上記の細胞外基質を塗布した96穴培養皿上に、無血清のDMEM培地に懸濁した6x105個/mlの肺胞2型上皮細胞(T2細胞)を100μlづつ播種し、CO2インキュベーター内で、37℃、1日間培養した。培養終了後、メタノール100μlで細胞を5分間固定し、0.4%クリスタルバイオレット50μlで30分間細胞を染色した。過剰な染色は水洗し、細胞質の吸光度(A595)から、培養皿に塗布されたFN、ColI、LNおよびVNに接着した細胞数を計測した。
実施例6の方法に準じて調製した細胞接着ペプチドが固相化された培養皿に、無血清のDMEM培地に6×104個/100μlの濃度に懸濁したT2細胞を播き、CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した。以下、実施例7の方法に準じて、メタノールで固定、染色後、吸光度を測定した。別途、細胞を播種する直前に、固相化に使用されている細胞接着ペプチドと同一の遊離ペプチドを細胞懸濁液に添加し、以下、上記と同様に培養後、吸光度を測定した。標準物質としてFNを塗布した場合についても、併せて測定した。結果を図4および図5に示す。
培養皿に固相化された細胞接着ペプチドおよびT2細胞を用い、実施例8の方法に準じて、1〜24時間培養した。培養後の細胞接着と伸展の様子を微分干渉(光学)顕微鏡で観察した。培養1、6および24時間後の結果を図6に示す。
図6では、T2細胞を播種した細胞培養基質上で、1時間(A〜C)、6時間(D〜L)、および24時間(M〜O)培養後の微分干渉顕微鏡写真を示している。
細胞接着ペプチドとして、B、EおよびMはAG73を、C、LおよびOはFIB−1を、FはA3G72を、GおよびNはA4G82を、HはA5G71を、IはA5G77を、JはhA3G75を、KはhA3G83を、また、AおよびDは標準物質としてFNを使用した。
実施例6の方法に準じて調製した細胞接着ペプチドが固相化した培養皿に100μg/mlのヘパリン溶液を注ぎ、2時間インキュベートした。ヘパリンが固相化した細胞接着ペプチドに結合した後ヘパリン溶液を除き、T2細胞懸濁液を培養皿に播種した。24時間培養した後の接着細胞数についての結果を図7に示す。
このことから、AG73、AG73T、AG76.8、AG81.2、A2G73、A3G72、A4G78、A4G82、A5G73、A5G77、hA3G75、hA3G83の結合相手は、細胞表面のシンデカンであると考えられる。また、FIB−1ペプチドの場合は阻害が掛からない。FNとの結合に関与する細胞接着受容体はインテグリンα5β1であり、その結合部位がRGDアミノ酸配列であることは確立された事実である。この配列を含むFIB−1ペプチドに対してもインテグリンが関与するので、ヘパリンによる阻害が掛からないのは当然の結果である。このこともまた、本実施例の信頼性を示唆している。
実施例7の方法に準じて、固相化した細胞接着ペプチド上でT2細胞を培養する際に、固相化ペプチドとは異なる遊離ペプチドを添加した結果を図8に示す。
固相化したペプチドを同じペプチドを培養液に遊離の状態で添加すると、両者はT2細胞のシンデカンを巡って競争し、その結果細胞接着が阻害される(実施例7参照)。現在、シンデカンには遺伝的に4種類の存在が知られている。ここでは、それぞれのペプチドに対するシンデカンが、互いに共有(融通)し合っている(common)のか、有る程度の範囲で重複しているだけか、それとも互いに排他的なのかを検討した。
この結果は、お互いのペプチドはリセプターを共有(融通)し合っていることを示している。しかし、その共有(融通)は対等ではなく、ペプチド間で受容体との親和性に順位が存在することを伺わせる。即ち、AG73、A3G72、A4G82、A5G71、A5G77、hA3G75、hA3G83>AG81.2、AG73T。なお、AG73Tは、AG73のアミノ酸配列を入れ替えて作った人工の配列で、天然には存在しない。
図8において、遊離のFIB−1ペプチドは、T2細胞が固相化FIB−1ペプチドに細胞接着するのを競争阻害しただけでなく、AG73TおよびAG81.2ペプチドに接着するのも阻害した。反対に、遊離のAG73TおよびAG81.2ペプチドは、固相化FIB−1に対する細胞接着を阻害できなかったので、T2細胞に対するAG73TおよびAG81.2ペプチドの結合力(affinity)は、FIB−1の結合力より低い(実施例12および表1参照、クラスCに分類)。
疎水結合性吸着ポリマー、MBAC、MASTまたはMMACの各々200mgを水に分散させ、1N NaOH溶液を少量ずつ添加し、完全に溶解させた。これに、WSC(1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl)carbodiimide,hydrochloride)50mgを加えて2時間反応させた後、ペプチド20mgを加えて、室温で2時間攪拌反応させた。反応終了後、水に透析してアルカリと低分子を除き、反応生成物を凍結乾燥して目的の偽似マトリックスを調製した。
実施例13で調製した各々の細胞接着ペプチド類を結合させた偽似マトリックス(MBAC−peptide)を、DMEM培地で1〜10μg/mlの濃度に希釈し、96穴培養皿に各100μl注ぎ、CO2インキュベーター内で一晩静置して、培養皿に吸着・固相化させた。未吸着のMBAC−peptideは、DMEM培地で十分洗って除いた。次に、無血清のDMEMに、6x105個/mlの濃度で懸濁したT2細胞を、各100μl播種した。無血清で1日培養した後、メタノール100μlで5分間固定し、0.4%クリスタルバイオレット50μlで30分間T2細胞を染色した。過剰な染色は水洗し、細胞質の吸光度(A595)から、接着した細胞数を計測した。その結果を図10に示す。
実施例13で調製した各々の細胞接着ペプチド類を結合させた偽似マトリックス(MAST−peptide)を、実施例14と同様に96穴培養皿に吸着・固相化させ、T2細胞を播種・培養した。その結果を図11に示す。
1〜10μg/mlの測定した範囲全てにおいて、MAST−AG73、−A3G72、−A4G82X、−FIB−1は、FNを直接塗布した場合と同等の細胞接着能を発揮した。また、遊離の当該細胞接着ペプチドで細胞接着が競争阻害されるが、その程度はMBAC−peptideの場合より低かった。これは、T2細胞とMAST−peptideの特異的結合が、T2細胞とMBAC−peptideとの結合より、一層強いことによると考えられる。なお、MAST−A4G82Xに対するT2細胞の接着が遊離のA4G82ペプチドで阻害されたことは、C末端のMet残基をNle残基に代えても、細胞接着に関しては同等に機能することを示唆している。
実施例13で調製した各々の細胞接着ペプチド類を結合させた偽似マトリックス(MBAC−peptide)を、DMEM培地で1〜10μg/mlの濃度に希釈し、96穴培養皿に各100μl注ぎ、CO2インキュベーター内で一晩静置して、培養皿に吸着・固相化させた。未吸着のMBAC−peptideは、DMEM培地で十分洗って除いた。次に、無血清のDMEMで4〜10μg/mlに希釈した抗体100μlを培養皿に注ぎ、2〜4時間インキュベートして、ペプチドに抗体を結合させた。対照群には、正常のIgGを用いた。処理後抗体を除き、6x105個/mlの濃度で懸濁したT2細胞を、各100μl播種した。無血清で1日培養した後、メタノール100μlで5分間固定し、0.4%クリスタルバイオレット50μlで30分間T2細胞を染色した。過剰な染色は水洗し、細胞質の吸光度(A595)から、接着した細胞数を計測した。結果を図12に示す。
実施例13で調製した各々の細胞接着ペプチド類を結合させた偽似マトリックス(MBAC−peptide)を、DMEM培地で1〜10μg/mlの濃度に希釈し、96穴培養皿に各100μl注ぎ、CO2インキュベーター内で一晩静置して、培養皿に吸着・固相化させた。未吸着のMBAC−peptideは、DMEM培地で十分洗って除いた。次に、1mg/mlのヘパリンを溶かしたDMEM100μlを培養皿に注ぎ、2時間インキュベートして、ペプチドにヘパリンを結合させた。対照群は、DMEMのみで処理した。処理後ヘパリンを除き、6x105個/mlの濃度で懸濁したT2細胞を、各100μl播種した。無血清で1日培養した後、メタノール100μlで5分間固定し、0.4%クリスタルバイオレット50μlで30分間T2細胞を染色した。過剰な染色は水洗し、細胞質の吸光度(A595)から、接着した細胞数を計測した。結果を図13および図14に示す。
50%エタノールに溶解した2−20μg/mlのMAST−GRGDSP(Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro)およびMMAC−GRGDSPを培養皿に50μl注ぎ、風乾・固相化させた。次に、MAST−GRGDSPおよびMMAC−GRGDSP(0.1−1.0μg/well)を塗布した培養皿を無血清のDMEM培地でリンスし、同培地に6×104個/100μlの濃度に懸濁したT2細胞を播き、CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した。以下、実施例7の方法に準じて、メタノールで固定、染色後、吸光度を測定した。結果を図15に示す。標準物質としてFNを塗布した培養も同時に行い、FNへの細胞接着を基準(100%)として示した。
実施例18と同様に、50%エタノールにMAST−GRGDSPを溶解し、培養皿に風乾・固相化後、T2細胞を播種・培養した。別途、細胞を播種する直前に、遊離のGRGDSPペプチド0.25〜4.0mg/mlを細胞懸濁液に添加し、以下、上記と同様に培養後、吸光度を測定した。その結果を、図16に示す。遊離のGRGDSP濃度の増加と共に、細胞接着は次第に阻害され、4.0mg/mlではほぼ完全に阻害された。このことは、T2細胞は固相化されたGRGDSPを介して特異的に結合・接着していることを示唆する。また、MAST−GRGDSPの塗布量を低減すると、固相化されるGRGDSP量が低下し、遊離GRGDSPペプチドによる競争阻害は一層有効に働いた。
実施例18と同様に、50%エタノールにMMAC−GRGDSPを溶解し、培養皿に風乾・固相化後、T2細胞を播種・培養した。別途、細胞を播種する直前に、遊離のGRGDSPペプチド0.25〜4.0mg/mlを細胞懸濁液に添加し、以下、上記と同様に培養後、吸光度を測定した。その結果を、図17に示す。実施例19と同様に、遊離のGRGDSP濃度の増加と共に、細胞接着は次第に阻害され、1.0〜4.0mg/mlではほぼ完全に阻害された。このことは、実施例19と同様に、T2細胞は固相化されたGRGDSPを介して特異的に結合・接着していることを示唆する。
実施例18と同様に、50%エタノールにMBAC/MAST−AG73および−FIB−1を溶解し、培養皿に風乾・固相化後、T2細胞を播種・培養した。別途、細胞を播種する直前に、遊離のAG73またはFIB−1ペプチド0.25mg/mlを細胞懸濁液に添加し、以下、上記と同様に培養後、吸光度を測定した。その結果を、図18に示す。固相化したAG73およびFIB−1ペプチドに対して、T2細胞はFNを塗布した場合とほぼ同程度に接着した。また、遊離のAG73ペプチドによって、細胞接着はほぼ完全に阻害された。固相化FIB−1ペプチドの場合、特にMAST−FIB−1の場合は、固相化したFIB−1量の低減と共に遊離のFIB−1ペプチドによる競争阻害がより有効に働いた。
実施例21と同様に、MBAC/MAST−FIB−1を50%エタノールで希釈して培養皿に注ぎ、風乾・固相化させた。T2細胞を播種する前に、4μg/mlの抗FIB−1ポリクローナル抗体100μlを培養皿に注ぎ、4時間インキュベートして固相化FIB−1ペプチドに抗体を結合させた。対照には正常IgGで処理した後、実施例21と同様に培養、固定、染色した。その結果を、図19に示す。固相化FIB−1が0.1−0.25μg/wellで、抗体による細胞接着が特異的に阻害された。
Claims (3)
- 細胞接着ペプチドがアミド結合している、無水マレイン酸とスチレンとの共重合体であるMAST、無水マレイン酸とブチルビニルエーテルとの共重合体であるMBAC、又は無水マレイン酸とヘキシルビニルエーテルとの共重合体であるMHACから選ばれる疎水結合性吸着ポリマーが、疎水性結合で細胞培養基質に吸着していることを特徴とする細胞接着ペプチドの固相化標品。
- 無水マレイン酸とスチレンとの共重合体であるMAST、無水マレイン酸とブチルビニルエーテルとの共重合体であるMBAC、又は無水マレイン酸とヘキシルビニルエーテルとの共重合体であるMHACから選ばれる疎水結合性吸着ポリマーのペプチドと反応しうる官能基と細胞接着ペプチドとを反応させ、該反応物を細胞培養基質にコーティングし、疎水性結合で細胞培養基質に吸着させることを特徴とする固相化標品の製造方法。
- 請求項1記載の細胞接着ペプチドの固相化標品上に目的とする細胞を播種し、培養することにより調製されることを特徴とする人工組織。
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