JP2002065246A - 細胞培養基質、その製造方法及び細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養基質、その製造方法及び細胞培養方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞を安定に培養するための培養基質及び製
造方法とこれを用いる培養方法を提供する。 【解決手段】 ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアク
リレート）に放射線を照射し細胞接着性高分子と複合化
する細胞培養基質及び製造方法。
造方法とこれを用いる培養方法を提供する。 【解決手段】 ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアク
リレート）に放射線を照射し細胞接着性高分子と複合化
する細胞培養基質及び製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞培養に関わる技
術であり、さらに詳しくは、細胞培養基質、その製造方
法及び培養方法に関するものである。
術であり、さらに詳しくは、細胞培養基質、その製造方
法及び培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】通常の細胞培養の方法は均一な培養面を
もつ培養基質を用いて行われる。具体的には、ガラスや
ポリスチレンなどの透明な材料を一定の形状に成形した
容器を用いる。細胞の接着性を高めるため、ポリスチレ
ンなどの疎水性の材料は表面を親水化するなどの表面改
質を施したものが用いられる。また塩基性の高分子（ポ
リエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン等）
や細胞接着性蛋白質（フィブロネクチン、コラーゲン、
ゼラチン、ラミニン等）をコートすることにより、接着
性をより高める方法もよく用いられている。
もつ培養基質を用いて行われる。具体的には、ガラスや
ポリスチレンなどの透明な材料を一定の形状に成形した
容器を用いる。細胞の接着性を高めるため、ポリスチレ
ンなどの疎水性の材料は表面を親水化するなどの表面改
質を施したものが用いられる。また塩基性の高分子（ポ
リエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン等）
や細胞接着性蛋白質（フィブロネクチン、コラーゲン、
ゼラチン、ラミニン等）をコートすることにより、接着
性をより高める方法もよく用いられている。
【０００３】培養面を不均一にして行う培養方法も用い
られるようになってきた。すなわち、培養細胞を一定の
形態に制御したり、他の細胞から隔離し単一細胞のみの
培養環境を得たり、複数の細胞間の相互作用を検討する
などの目的で用いられている。また、平面的ではなく、
球状の細胞集塊構造を形成させる培養方法もある。神経
幹細胞や毛根細胞などの培養に用いられている。それぞ
れの培養方法はその目的や利便性などにより、細胞固有
の培養方法としてではなく、さまざまに使い分けられて
いる。
られるようになってきた。すなわち、培養細胞を一定の
形態に制御したり、他の細胞から隔離し単一細胞のみの
培養環境を得たり、複数の細胞間の相互作用を検討する
などの目的で用いられている。また、平面的ではなく、
球状の細胞集塊構造を形成させる培養方法もある。神経
幹細胞や毛根細胞などの培養に用いられている。それぞ
れの培養方法はその目的や利便性などにより、細胞固有
の培養方法としてではなく、さまざまに使い分けられて
いる。
【０００４】ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリ
レート）は細胞非接着性高分子としてよく用いられてい
るものである。細胞の集塊構造を取らせるため培養面を
非接着性にする。結果として、接着を阻害された細胞は
凝集し、集塊構造をとるようになる。また、この非接着
性の機能を生かし、培養面をパターン化、培養細胞に一
定の形態を与える目的でも用いられている（神経細胞の
シナプス形成の制御等。特開平7-075547号公報等）。
レート）は細胞非接着性高分子としてよく用いられてい
るものである。細胞の集塊構造を取らせるため培養面を
非接着性にする。結果として、接着を阻害された細胞は
凝集し、集塊構造をとるようになる。また、この非接着
性の機能を生かし、培養面をパターン化、培養細胞に一
定の形態を与える目的でも用いられている（神経細胞の
シナプス形成の制御等。特開平7-075547号公報等）。
【０００５】この非接着性という特性を低下させ、塩基
性高分子をコートし選択的な細胞接着性を与え得ること
も報告されている（特許第2654744号）。これらの特性
には、吸水性（保水性）を持つという性質が寄与してい
るが、いわゆる親水性ゲルに分類される材料も細胞培養
の分野では古くから用いられている。その用途は異なる
がコラーゲンゲルや寒天が代表的なものである。これら
は、細胞接着性が必ずしも良好なものではない。しか
し、生体にある多くの細胞は、このような保水性のある
構造体に囲まれた環境におかれている。
性高分子をコートし選択的な細胞接着性を与え得ること
も報告されている（特許第2654744号）。これらの特性
には、吸水性（保水性）を持つという性質が寄与してい
るが、いわゆる親水性ゲルに分類される材料も細胞培養
の分野では古くから用いられている。その用途は異なる
がコラーゲンゲルや寒天が代表的なものである。これら
は、細胞接着性が必ずしも良好なものではない。しか
し、生体にある多くの細胞は、このような保水性のある
構造体に囲まれた環境におかれている。
【０００６】材料による細胞接着の制御を図ろうとする
場合には、蛋白質などの変成しやすいものは加工法に制
限が加わり、使い易いものではない。プラスチックと総
称される合成高分子が加工法に関してはバリエーション
が豊富である。しかし、細胞の接着性という点では適す
るものは少ない。（そこで表面を親水化するなどの方法
が適用される。）水溶性の塩基性高分子などが多く使わ
れている程度である。しかし、これもハードな材料にコ
ートするという使用法であり、生体の組織に近い状態を
構成するものではない。
場合には、蛋白質などの変成しやすいものは加工法に制
限が加わり、使い易いものではない。プラスチックと総
称される合成高分子が加工法に関してはバリエーション
が豊富である。しかし、細胞の接着性という点では適す
るものは少ない。（そこで表面を親水化するなどの方法
が適用される。）水溶性の塩基性高分子などが多く使わ
れている程度である。しかし、これもハードな材料にコ
ートするという使用法であり、生体の組織に近い状態を
構成するものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】我々は、生体により近
い保水可能なゲル状物でありながら、細胞接着も良好な
材料を種々検討し、本発明に至ったもので、以下に示す
細胞培養基質とその製造方法及びこれを用いた細胞培養
方法を提供する。
い保水可能なゲル状物でありながら、細胞接着も良好な
材料を種々検討し、本発明に至ったもので、以下に示す
細胞培養基質とその製造方法及びこれを用いた細胞培養
方法を提供する。
【０００８】
【問題を解決するための手段】即ち本発明の、第１の発
明は、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレー
ト）に放射線を照射し細胞接着性高分子と複合化するこ
とを特徴とする細胞培養基質の製造方法であり、第２の
発明は第１の発明の製造方法で作られることを特徴とす
る細胞培養基質である。さらに第３の発明は第２の発明
の細胞培養基質を用いることを特徴とする細胞培養方法
である。
明は、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレー
ト）に放射線を照射し細胞接着性高分子と複合化するこ
とを特徴とする細胞培養基質の製造方法であり、第２の
発明は第１の発明の製造方法で作られることを特徴とす
る細胞培養基質である。さらに第３の発明は第２の発明
の細胞培養基質を用いることを特徴とする細胞培養方法
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】ポリ（２−ハイドロキシエチルメ
タアクリレート）はそのまま成形加工することも可能で
あるが、強度等から他の基材にコーテイングする方法が
好適である。濃度は特に限定されるものではなく、製造
法に適した、かつ用途に適した選択が可能である。また
形成されるコート層は均一である必要はなく、種々の形
態が可能であり、コート基材の選択により形態制御培養
の可能な様々な培養基質を形成することができる。
タアクリレート）はそのまま成形加工することも可能で
あるが、強度等から他の基材にコーテイングする方法が
好適である。濃度は特に限定されるものではなく、製造
法に適した、かつ用途に適した選択が可能である。また
形成されるコート層は均一である必要はなく、種々の形
態が可能であり、コート基材の選択により形態制御培養
の可能な様々な培養基質を形成することができる。
【００１０】照射に用いることができる放射線は、電子
線、ガンマ線等があるが、好ましくはガンマ線である。
線量は形成される培養基質の状態により異なるが、5〜5
0kGyが好適である。塩基性高分子及び細胞接着性蛋白質
は、細胞培養に用いることが可能ならばいずれのものも
用いることができる。ポリリジン、ポリオニチン、ポリ
エチレンイミン、ポリアリルアミン、フィブロネクチ
ン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ビトロネクチ
ン、テネイシン等であり、細胞接着性をもつならば特に
限定されるものではない。
線、ガンマ線等があるが、好ましくはガンマ線である。
線量は形成される培養基質の状態により異なるが、5〜5
0kGyが好適である。塩基性高分子及び細胞接着性蛋白質
は、細胞培養に用いることが可能ならばいずれのものも
用いることができる。ポリリジン、ポリオニチン、ポリ
エチレンイミン、ポリアリルアミン、フィブロネクチ
ン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ビトロネクチ
ン、テネイシン等であり、細胞接着性をもつならば特に
限定されるものではない。
【００１１】これらの細胞接着性機能を持つ分子との複
合化は、まずポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリ
レート）の層を形成する。これを乾燥した後、ガンマ線
を照射し、複合化する細胞接着性高分子を含む水溶液に
短時間浸漬する。あるいはコートする方法でもよい。特
に温度は限定されないが室温程度から冷蔵温度程度が好
ましい。この後、充分な純水または生理的緩衝液で洗浄
する。このようにして調製したものは、直ちに使用が可
能である。
合化は、まずポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリ
レート）の層を形成する。これを乾燥した後、ガンマ線
を照射し、複合化する細胞接着性高分子を含む水溶液に
短時間浸漬する。あるいはコートする方法でもよい。特
に温度は限定されないが室温程度から冷蔵温度程度が好
ましい。この後、充分な純水または生理的緩衝液で洗浄
する。このようにして調製したものは、直ちに使用が可
能である。
【００１２】または、ポリ（２−ハイドロキシエチルメ
タアクリレート）の層を形成した後、細胞接着性分子を
コートし、その後ガンマ線を照射する方法も好適な方法
である。ガンマ線を照射する前には、乾燥する方が適し
ている。細胞接着性高分子をコートする前は、乾燥、非
乾燥のいずれの場合も可能である。
タアクリレート）の層を形成した後、細胞接着性分子を
コートし、その後ガンマ線を照射する方法も好適な方法
である。ガンマ線を照射する前には、乾燥する方が適し
ている。細胞接着性高分子をコートする前は、乾燥、非
乾燥のいずれの場合も可能である。
【００１３】培養法は特に限定されるものではなく、通
常の方法が可能である。培養液は、血清添加培地に比べ
無血清培地が好ましい。培養細胞も特に限定されるもの
ではない。なお、細胞接着性高分子が安定ならば（ポリ
リジン、ポリエチレンイミン等）乾燥後の安定した保管
も可能である。そうでなければ冷蔵ないしは冷凍保管が
好ましい。
常の方法が可能である。培養液は、血清添加培地に比べ
無血清培地が好ましい。培養細胞も特に限定されるもの
ではない。なお、細胞接着性高分子が安定ならば（ポリ
リジン、ポリエチレンイミン等）乾燥後の安定した保管
も可能である。そうでなければ冷蔵ないしは冷凍保管が
好ましい。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。 （実施例１、実施例２、比較例）特開平07-0745541号公
報に記載された渡辺の方法を用いてＩＴＯ層のパターン
を形成したポリエーテルスルホンフィルム（住友ベーク
ライト製）を用いてポリ（２−ハイドロキシエチルメタ
アクリレート）の格子状パターンを形成した。すなわ
ち、フォトレジストをマスキング剤として用いＩＴＯの
パターンを形成した。直径15mmの円状にカットした。3
％のポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレート）
をスピンコートしたのち、冷塩酸（1mol／l）を用いて
超音波洗浄し、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアク
リレート）のパターンを形成した。格子間は100μｍ、
格子幅は20μmとした。室温下乾燥後窒素ガスを充填、
密封したものに、10kGyガンマ線を照射した。その後５
０μg/mlのポリリジン溶液に0.5時間浸漬。純水で5回洗
浄し培養基質とした（実施例１）。実施例２として、乾
燥したパターンを実施例１と同濃度のポリリジン液に2
時間浸漬した。純水で3回洗浄、乾燥した後、10kGyガン
マ線を照射した。比較例としては、ガンマ線を照射しな
いものを作成した。
報に記載された渡辺の方法を用いてＩＴＯ層のパターン
を形成したポリエーテルスルホンフィルム（住友ベーク
ライト製）を用いてポリ（２−ハイドロキシエチルメタ
アクリレート）の格子状パターンを形成した。すなわ
ち、フォトレジストをマスキング剤として用いＩＴＯの
パターンを形成した。直径15mmの円状にカットした。3
％のポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレート）
をスピンコートしたのち、冷塩酸（1mol／l）を用いて
超音波洗浄し、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアク
リレート）のパターンを形成した。格子間は100μｍ、
格子幅は20μmとした。室温下乾燥後窒素ガスを充填、
密封したものに、10kGyガンマ線を照射した。その後５
０μg/mlのポリリジン溶液に0.5時間浸漬。純水で5回洗
浄し培養基質とした（実施例１）。実施例２として、乾
燥したパターンを実施例１と同濃度のポリリジン液に2
時間浸漬した。純水で3回洗浄、乾燥した後、10kGyガン
マ線を照射した。比較例としては、ガンマ線を照射しな
いものを作成した。
【００１５】（培養による実施例と比較例の培養試験）
定法により、ラット胎児（胎生17日）の大脳を切り取
り、0.25％のトリプシン（SIGMA社製）で５分間処理し
た。分散後、遠心分離により細胞を分離、DMEM/F-12培
養液（ＳＩＧＭＡ社製）で再分散した。グリア細胞培養
上清を含有する神経細胞用培養液（住友ベークライト
製）を用いて、3×105cells/mlの細胞液を調製した。上
記フィルムを24ウェルプレートに入れ、細胞液を500μ
ｌ加え4日間培養を行った。顕微鏡下で培養状態を観察
したところ、実施例１、２では多くの神経細胞がパター
ン状でネットワークを形成していた。一部にはグリア細
胞と思われる細胞が観察された。ただし、パターン上の
ガイダンス効果は実施例２のほうが優れていた。一方、
比較例のほうではネットワークを形成している部分は一
部分であった。しかし、グリア細胞と思われる細胞は極
くわずかであった。
定法により、ラット胎児（胎生17日）の大脳を切り取
り、0.25％のトリプシン（SIGMA社製）で５分間処理し
た。分散後、遠心分離により細胞を分離、DMEM/F-12培
養液（ＳＩＧＭＡ社製）で再分散した。グリア細胞培養
上清を含有する神経細胞用培養液（住友ベークライト
製）を用いて、3×105cells/mlの細胞液を調製した。上
記フィルムを24ウェルプレートに入れ、細胞液を500μ
ｌ加え4日間培養を行った。顕微鏡下で培養状態を観察
したところ、実施例１、２では多くの神経細胞がパター
ン状でネットワークを形成していた。一部にはグリア細
胞と思われる細胞が観察された。ただし、パターン上の
ガイダンス効果は実施例２のほうが優れていた。一方、
比較例のほうではネットワークを形成している部分は一
部分であった。しかし、グリア細胞と思われる細胞は極
くわずかであった。
【００１６】
【発明の効果】本発明を用いることにより安定な培養系
を得ることができ、細胞に与える薬剤の影響評価、各種因
子の検討、細胞間相互作用の検討などが効果的に行え
る。
を得ることができ、細胞に与える薬剤の影響評価、各種因
子の検討、細胞間相互作用の検討などが効果的に行え
る。
Claims (5)
- 【請求項１】 ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアク
リレート）に放射線を照射し細胞接着性高分子と複合化
することを特徴とする細胞培養基質の製造方法。 - 【請求項２】 細胞接着性高分子が塩基性高分子及び細
胞接着性蛋白質の少なくとも一つからなる請求項１記載
の細胞培養基質の製造方法。 - 【請求項３】 放射線がガンマ線である請求項１又は２
記載の細胞培養基質の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３記載のいずれかの製造方法
で作られることを特徴とする細胞培養基質。 - 【請求項５】 請求項４記載の細胞培養基質を用いるこ
とを特徴とする細胞培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000227027A JP2002065246A (ja) | 2000-06-15 | 2000-07-27 | 細胞培養基質、その製造方法及び細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-180335 | 2000-06-15 | ||
| JP2000180335 | 2000-06-15 | ||
| JP2000227027A JP2002065246A (ja) | 2000-06-15 | 2000-07-27 | 細胞培養基質、その製造方法及び細胞培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002065246A true JP2002065246A (ja) | 2002-03-05 |
Family
ID=26594014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000227027A Pending JP2002065246A (ja) | 2000-06-15 | 2000-07-27 | 細胞培養基質、その製造方法及び細胞培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002065246A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004049921A (ja) * | 2002-07-19 | 2004-02-19 | Sanyo Chem Ind Ltd | 創傷被覆材 |
| WO2004085606A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | National Institute For Environmental Studies | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| JP2008303287A (ja) * | 2007-06-07 | 2008-12-18 | Chisso Corp | 表面改質高分子物品及びその製造方法 |
| JP2009502243A (ja) | 2005-07-20 | 2009-01-29 | サーモディクス，インコーポレイティド | ポリマーコーティング及び細胞接着方法 |
| JP2011050295A (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-17 | Scivax Kk | 細胞培養構造体、細胞培養容器及びこれらの製造方法 |
| JP2013507143A (ja) * | 2009-10-12 | 2013-03-04 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 中空糸型バイオリアクタの組立方法 |
| JP2013138622A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 表面親水性基材の製造方法 |
-
2000
- 2000-07-27 JP JP2000227027A patent/JP2002065246A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004049921A (ja) * | 2002-07-19 | 2004-02-19 | Sanyo Chem Ind Ltd | 創傷被覆材 |
| JP4705319B2 (ja) * | 2002-07-19 | 2011-06-22 | 三洋化成工業株式会社 | 創傷被覆材 |
| WO2004085606A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | National Institute For Environmental Studies | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| JPWO2004085606A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2006-06-29 | 独立行政法人国立環境研究所 | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| JP4555773B2 (ja) * | 2003-03-24 | 2010-10-06 | 独立行政法人国立環境研究所 | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| US8304238B2 (en) | 2003-03-24 | 2012-11-06 | Nat'l Institute for Environmental Studies | Cell culture medium and immobilized preparation of cell adhesion protein or peptide |
| JP2009502243A (ja) | 2005-07-20 | 2009-01-29 | サーモディクス，インコーポレイティド | ポリマーコーティング及び細胞接着方法 |
| JP2008303287A (ja) * | 2007-06-07 | 2008-12-18 | Chisso Corp | 表面改質高分子物品及びその製造方法 |
| JP2011050295A (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-17 | Scivax Kk | 細胞培養構造体、細胞培養容器及びこれらの製造方法 |
| JP2013507143A (ja) * | 2009-10-12 | 2013-03-04 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 中空糸型バイオリアクタの組立方法 |
| JP2013138622A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 表面親水性基材の製造方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040706 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040824 |
|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041112 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050408 |