JPH04278083A - 細胞数を制御した細胞塊状体形成法およびそれに用いる細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、所望の細胞数を有する
細胞塊状体を培養する方法およびそれに用いる細胞培養
用基材に関する。

【０００２】本発明は、細胞産生物を効率よく生産する
のに適した細胞塊状体の培養法や、医薬品などの被検物
質や放射線などの物理的刺激が細胞に与える影響を定量
的にかつ鋭敏に測定するのに適した細胞塊状体の培養法
および、細胞組織の欠損部の補綴などの生体組織に適し
た細胞塊状体の培養法に関する。

【０００３】

【従来の技術】動物細胞は、接着非依存性細胞と接着依
存性細胞の２種類に分類される。接着非依存性細胞は細
胞の足場である基質が存在しなくても、また、それぞれ
の細胞が単独の状態でも、生存、増殖、物質産生能など
の細胞機能を正常に発現させ得る細胞である。典型的な
例としては、血液系の細胞、癌細胞などが挙げられる。 一方、接着依存性細胞は、基質に接着した状態あるいは
細胞同士で集合した状態ではじめて生存、増殖、物質産
生能などの細胞機能を発現する細胞である。

【０００４】初代培養細胞を初めとする正常二倍体細胞
の大部分は接着依存性である。さらに無限に増殖可能な
樹立細胞系にも接着依存性を示すものが数多く知られて
いる。例えば、インターフェロン、インターロイキンな
どのサイトカイン類、エリスロポエチン、コロニー・ス
テュミレイティング・ファクター、トロンボボエチンな
どの各種分化成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、ワクチンなどの有用な細胞産生物を生産す
る樹立細胞系にも接着依存性を示すものが多く知られて
いる。従って、これらの有用な細胞産生物の生産のため
にも接着依存性細胞の培養技術の確立は非常に重要であ
る。

【０００５】一般に細胞を物質生産のために利用する場
合、細胞を高機能を維持した状態で大量にかつ高密度に
培養することが重要である。ところが、動物細胞は微生
物細胞と比較して老廃物の蓄積および酸素をはじめとし
た栄養物の供給不足の影響を受け易く、高密度で大量に
培養する時にその機能を維持することが極めて困難であ
る。

【０００６】接着非依存性細胞の場合には、浮遊培養法
が最も適当であると考えられている。撹拌下に浮遊培養
法を行えば、細胞老廃物の速やかな除去および栄養物の
効率的な供給が可能であり、大量かつ高密度化を目的と
した装置のスケール・アップが容易だからである。しか
し、既に述べたように、接着依存性細胞は、基質に接着
した状態か細胞同士が集合した塊状体ではじめて生存し
細胞機能を発現することができる。このため、細胞が単
独に浮遊した状態で存在する浮遊培養法は接着依存性細
胞には適用できなかった。

【０００７】そこで従来、接着依存性細胞の大量培養法
として、基質としての高分子材料からなるマイクロビー
ズを培養液中に浮遊させ、マイクロビーズ表面に細胞を
接着させて撹拌下に培養を行う疑似浮遊培養法（マイク
ロビーズ培養法）が開発された。しかし、多くの臓器実
質細胞の場合は生体内では単層では存在せず３次元的な
細胞塊状体を形成しているため、マイクロビーズ培養法
で採用する単層培養系は実際の生体中の細胞構築と著し
く異なっている点に大きな問題があった。また、生体内
で単層状で存在している上皮系や内皮系細胞であっても
、マイクロビーズ培養法で用いる高分子材料基質上に接
着させられた状態は生体内の環境と著しく異なっている
。このような生体内との環境の差異は、細胞の特異的機
能の発現、すなわち特異的な細胞産生物の生産機能など
を著しく阻害する要因になると考えられている。さらに
、単層培養法には、細胞集合体の形状が単層状であるた
め培養細胞密度が低くて、細胞産生物生産の効率が悪い
という欠点もある。

【０００８】これらの問題点を解決するために、細胞同
士を互いに接着させて３次元構造を形成させる塊状培養
法が検討されている。単層培養法と比較すると、人工基
質も存在せず、細胞を取り囲む環境は生体内の状態に近
くてより生理的であると考えられる。

【０００９】多くの癌細胞は浮遊培養によって志望同士
が凝集し塊状体を形成する（Ｒ．Ｍ．Ｓｕｔｈｅｒｌａ
ｎｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４０，　１７７，　１９
８８）。これに対して、正常二倍体細胞の場合には、浮
遊培養によって塊状体を形成することはほとんど不可能
である。唯一、正常二倍体細胞で塊状体が得られたケー
スは、特殊な培養基質上で肝細胞を単層培養中に偶然に
形成されたものである（Ｎ．Ｋｏｉｄｅ，　ｅｔ　ａｌ
．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，　１６１，　３８５，　１９８９）。しかし
、従来の塊状体は癌細胞であれ、正常細胞であれ、偶然
に形成されたものであり、所望の細胞数からなる塊状体
を大量に得ることは困難であった。特に、塊状体を構成
する細胞数は塊状体の大きさと密度に関連していて、塊
状体の内部の細胞への栄養物の補給や老廃物の除去に大
きな影響を与える。塊状体が大きすぎると、内部の細胞
が壊死してしまう。したがって、塊状体を構成する細胞
数は特に重要な因子である。細胞産生物を大量に産生さ
せるためには、所望の細胞数からなる塊状体を大量に製
造する必要があり、上述したように従来法では不可能で
あった。

【００１０】一方、従来法で作製された細胞塊状体を、
医薬品、化粧品、食品添加物、殺虫剤、工業試薬などの
種々の被検物質の細胞機能に与える影響の測定に用いる
と、塊状体を構成している細胞数が不均一であるために
、その効果を定量的に判定することができなかった。 これは放射線、温度、電場、電磁場などの物理的刺激に
よる細胞障害性の測定に関しても全く同様であった。

【００１１】以上、概観してきたように、従来の細胞塊
状体の作製技術では、所望の細胞数を有する細胞塊状体
を大量に作製することは困難であった。したがって、従
来法はこれらの塊状体の有効利用を著しく損なわしめる
重大な欠点を有していた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の課題
を解決して、所望の細胞数を有する細胞塊状体を大量に
作製する方法を提供することを目的とする。また、本発
明は、そのような方法に使用する細胞培養用基材を提供
することをも目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、ＬＣＳＴ
を有する温度感応性高分子化合物と一部または全部が架
橋されている細胞接着性物質とからなる細胞培養用基材
の表面積を制御して、該温度感応性高分子化合物のＬＣ
ＳＴ以上の温度で細胞を培養し、特定の細胞数に増殖さ
せた後、培養液の温度をＬＣＳＴ以下にして該細胞培養
用基材上に増殖した細胞を基材より剥離させる工程から
なる細胞塊状体形成法を提供する本発明によって達成さ
れた。

【００１４】本発明の細胞培養用基材に使用する細胞接
着性物質は、試料として与えられた細胞を変性すること
なく接着する物質を１以上含み、コラーゲンを５０％以
上含有するものを意味する。細胞を変性することなく接
着する物質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、
ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコ
サミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分や、コラ
ーゲンの熱変性物であるゼラチンやその他のコラーゲン
誘導体、細胞膜上の糖鎖に親和力を有するコンカナバリ
ンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）などのレクチン、イガイ由来の接着
タンパク質、フィブロネクチンと細胞との接着部位に対
応する接着性オリゴペプチドなどが挙げられる。一方、
細胞接着性物質に含有させることができるコラーゲンの
種類は、特に限定されない。したがって、各種タイプの
コラーゲン単体やそれらの混合物を広く用いることがで
きる。

【００１５】本発明の細胞培養用基材に使用するＬＣＳ
Ｔを有する温度感応性高分子とは、水に対する溶解度温
度係数が負を示す高分子化合物であり、低温にて生成す
る高分子化合物と水分子との水素結合に依存する水和物
（オキソニウムヒドロキシド）が、高温で分解し脱水和
することにより、高分子化合物同士が凝集し沈殿する特
徴を有する。ＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ
　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、
このような温度感応性高分子化合物の水和と脱水和の転
移温度をいう（例えば、ハスキンズ（Ｍ．　Ｈａｓｋｉ
ｎｓ）らの　Ｊ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌ，　Ｓｃｉ．−Ｃ
ｈｅｍ．，　Ａ２　（８），　１４４１　（１９６８）
　参照）。したがって、温度感応性高分子化合物は、Ｌ
ＣＳＴより高い温度では非水溶性で固体状態であり、温
度をＬＣＳＴより低くすることによって可逆的に水溶性
になる。

【００１６】本発明では、培養温度より低いＬＣＳＴを
有する温度感応性高分子化合物を使用する。このような
高分子化合物であれば、その構造を問わず広く使用する
ことができる。該高分子化合物は、細胞培養温度では水
に不溶性の固体状態あるため、細胞接着性物質と温度感
応性高分子化合物とからなる層を足場として細胞が接着
、増殖することができる。また、温度をＬＣＳＴ以下に
することによって高分子化合物は水に可溶性になるため
増殖した細胞は足場を失い、細胞間の結合を損なわずし
かも細胞膜表面のタンパク質を損傷することなく細胞塊
状体を形成する。したがって、細胞接着性物質と温度感
応性高分子化合物とからなる本発明の基材を用いれば、
トリプシンやＥＤＴＡといった剥離剤を使用せずに、機
能を損なうことなく細胞塊状体を得ることができる。

【００１７】本発明で使用することができる温度感応性
高分子化合物としては、ポリＮ置換アクリルアミド誘導
体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体およびこれら
の共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレン
オキサイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニル
アルコール部分酢化物などが挙げられる。特に好ましい
のは、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ置換メ
タアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリ
ビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化
物である。

【００１８】好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが
低い順に列挙する。

【００１９】ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ
ーＮ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−イ
ソプロピルアクリルアミド；ポリーＮ，Ｎ−ジエチルア
クリルアミド；ポリーＮ−イソプロピルメタアクリルア
ミド；ポリーＮ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ
ーＮ−アクリロイルピロリジン；ポリーＮ，Ｎ−エチル
メチルアクリルアミド；ポリーＮ−シクロプロピルメタ
アクリルアミド；ポリーＮ−エチルアクリルアミド上記
の高分子は、他の単量体と共重合したものであってもよ
い。共重合する単量体は、親水性単量体、疎水性単量体
のいずれであってもよい。一般的には、親水性単量体と
共重合するとＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体と共重合
するとＬＣＳＴは下降する。したがって、これらを選択
することによって所望のＬＣＳＴを有する高分子化合物
を得ることもできる。

【００２０】親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリル
アミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル
メタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒ
ドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルア
クリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル
酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスルホ
ン酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスル
ホン酸など、並びに塩基性を有するＮ，Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル
アクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。

【００２１】一方、疎水性単量体としては、エチルアク
リレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリ
レートなどのアクリレート誘導体およびメタクリレート
誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置
換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、ア
クリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【００２２】本発明で使用する温度感応性高分子化合物
は、分子量が１．０ｘ１０５以上であるのが好ましい。 さらに好ましくは１．０ｘ１０６以上である。分子量が
小さいと、細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物と
を含有する層をコーティングしたときにその一部が剥離
してしまうため、十分に細胞を脱離することができない
。なお、ここでいう分子量とは、粘度から求めた平均分
子量をさす。例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリル
アミドの平均分子量（Ｍｎ）と極限粘度（［η］）との
関係は、 ［η］　　＝　　９．５９ｘ１０−５　Ｍｎ０．６５（
２７℃テトラヒドロフラン溶液）（伊藤、Ｒ．Ｔ．Ｇｅ
ｒｏｎｉｍｏ、繊維高分子材料研究所研究報告第１５９
号、１９８８）で表される。

【００２３】本発明の細胞塊状体形成法の特徴は、コラ
ーゲンまたはコラーゲンを主成分とする細胞接着性物質
の一部または全部に架橋が導入されている細胞培養用基
材を用いる点にある。

【００２４】一般に、コラーゲンは培養状態においては
線維を形成し、生体内に存在していたときと同様の構造
をとることが知られており、この状態では培養液に溶解
することはほとんどない。しかし、温度感応性高分子化
合物とコラーゲンが共存する系においては、コラーゲン
が有する本来の線維形成能力が十分に発揮されない。コ
ラーゲンの線維形成が不十分であると、細胞が基材に接
着する前に基材中のコラーゲンの一部が培養液中に溶解
してしまう。これに対処し、細胞の接着性や増殖性を向
上させるためには、本来細胞の接着、増殖のために必要
である量よりもかなり多量のコラーゲンを使用しなけれ
ばならなかった。しかし、本発明のように、コラーゲン
に架橋を導入すれば、コラーゲンを培養液に対して不溶
化することができる。したがって、本発明には、コラー
ゲンの使用量を大幅に減らすことができるとともに、コ
ストを低く抑えることができるという利点がある。

【００２５】コラーゲンへの架橋の導入方法は、特に限
定されるものではなく、一般に用いられる方法であれば
いかなるものであってもよい。例えば、グルタルアルデ
ヒドなどを用いた化学処理法、オゾン処理法、紫外線処
理法、電子線処理法、プラズマ処理法などを用いること
ができる。経済的な面を考慮すると、紫外線処理法によ
るのが最も有効であると思われる。紫外線の照射量（照
射強度ｘ時間：２５４ｎｍ）は、１００〜５０００Ｊ／
ｍ２とするのが好ましく、５００〜４０００Ｊ／ｍ２と
すればより好ましい。１００Ｊ／ｍ２以下では紫外線照
射の効果がほとんどなく、また、５０００Ｊ／ｍ２以上
では細胞がまったく剥離しない。なお、２５４ｎｍ以外
の波長の紫外線を使用する場合は、２５４ｎｍの紫外線
を上記の範囲で照射したときと同程度の架橋を生じる量
を照射する。紫外線照射は１回であっても、複数回であ
ってもよい。

【００２６】本発明で使用する細胞培養用基材に含有さ
せる細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物との重量
比は、１：９から１：４９の範囲内にすれば、細胞の接
着、増殖、剥離性が良好であるため好ましい。より好ま
しい範囲は、１：９から１：３９の範囲内である。

【００２７】また、本発明で使用する細胞培養用基材の
構造は、特に限定されるものではない。したがって、細
胞接着性物質と温度感応性高分子化合物は上下に層状構
造を形成していてもよいし、また海島構造、ラメラ構造
や２層が連結した変調構造を形成していてもよい。

【００２８】本発明で使用する細胞培養用基材は、この
ような細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物からな
るコーティング層と支持体から形成されているのが一般
的である。しかし、支持体上にコーティングされていな
い基材も本発明の範囲に含まれる。乾燥後のコーティン
グ層の厚みは０．５μｍ以上であるのが好ましく、１．
０μｍ以上であればより好ましい。コーティング層の厚
みは、基材を形成する物質の密度を１．０と考えて、混
合物溶液の濃度と乾燥前のコーティング層の厚みから計
算して求める。コーティング層の厚みが０．５μｍ以下
であると、細胞の脱離性が悪くなったり、脱離までの時
間が非常に長くなったりして、性能が不安定になる。細
胞接着性物質と温度感応性高分子化合物からなる層のコ
ーティングは、支持体の全表面にわたってもよいし、一
部であってもよい。

【００２９】本発明において、コーティングされる支持
体は、透明または半透明であるのが好ましい。とくに、
細胞を顕微鏡下で観察するのに十分な透明性を有してい
ることが好ましい。材料は、ガラス、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリメチル
メタクリレート、アクリル系樹脂などの透明または半透
明の材料を広く用いることができる。また、物質透過性
を有する膜を使用するのも好ましい。そのような膜の例
として、再生セルロース、セルロースアセテート、コラ
ーゲン、キトサンなどの半透膜や、ポリプロピレン、セ
ルロースアセテート、テフロンＴＭ、ポリフッ化ビニリ
デンなどの多孔質膜などを挙げることができるが、これ
らに限定されるものではない。支持体の形状は、ディッ
シュ、プレート、ボトル、チューブ、フラスコ、フィル
ムなどが一般的であるがこれらに限定されるものではな
い。

【００３０】次に、本発明の大きな特徴である、所望の
細胞数を有する細胞塊状体の形成について説明する。

【００３１】細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物
からなる細胞培養用基材が細胞と接触する面積と、形成
される細胞塊状体の細胞数との間には、簡明な相関関係
があることが明らかになっている。例えば、繊維芽細胞
については後述する実施例に示すように、ｙ　　＝　　
ａｘ という極めて簡単な関係式でその関係を表すことができ
る（ｙは形成される細胞塊状体の細胞数；ｘは細胞培養
用基材と細胞との接触面積；ａは細胞に特有の定数）。 これに類似する簡単な相関関係は、さらに肝細胞、表皮
細胞および骨細胞においても認められる。

【００３２】このような相関関係が存在するために、本
発明を応用してさらに所望の細胞数を有する細胞塊状体
を形成することが可能である。すなわち、（１）あらか
じめ数点のサンプル試験を行うことによって、本発明に
よって得られる細胞塊状体の細胞数と、剥離前に該細胞
が接触していた細胞培養用基材上の面積との関係式中の
定数を決定しておき、次いで、（２）この式を用いて形
成したい細胞塊状体の細胞数に対応する接触面積を算出
し、さらに、（３）その面積を有する部分からなる細胞
培養用基材を用いて本発明の方法にしたがって培養を行
えば、目的とする細胞数を有する細胞塊状体が形成され
る。かかる方法によれば、細胞塊状体の細胞数の制御を
簡便に精度よく行うことができるため、その技術的価値
は極めて大きく、応用範囲もかなり広いものと考えられ
る。

【００３３】所定の接触面積を有する細胞培養用基材の
調製手段は、当業者が応用しうる方法の中から広く選択
されるものであり、特に限定されない。なお、ここでい
う接触面積とは、細胞培養用基材の中で細胞が有効に接
着、増殖および剥離する部分の面積をいう。したがって
、細胞接着性物質および温度感応性高分子化合物からな
る部分がすべて有効に細胞を接着、増殖および剥離する
ことができる場合はその全体の表面積を調節すればよい
。また、細胞接着性物質および温度感応性高分子化合物
からなる部分であっても、細胞が接着、増殖または剥離
しないように条件設定した箇所を設けることによって所
定の表面積を画定することもできる。

【００３４】例えば、細胞接着性物質および温度感応性
高分子化合物からなる２層構造を有する細胞培養用基材
を使用する場合は、これらのいずれかの層の表面積を調
製することによって接触面積を調製することができる。 すなわち、所定の表面積を有する細胞接着性物質の上に
広く温度感応性高分子化合物をコーティングした場合は
、細胞接着性物質の表面積に対応した箇所にだけに細胞
が接着する。また、所定の表面積を有する温度感応性高
分子化合物の上に広く細胞接着性物質をコーティングし
た場合は、温度感応性高分子化合物の表面積に対応した
箇所からだけ増殖細胞が剥離してくる。この関係は、２
層のコーティングの順序を逆にした場合にも同様に当て
はまる。

【００３５】また、細胞接着性物質に導入される架橋の
程度を変えて部分的に細胞の接着性や剥離性を変化させ
ることによって、表面積を調製することもできる。例え
ば、図１に示すように、細胞接着性物質および温度感応
性高分子化合物の混合層を支持体上にコーティングして
おき、部分的に適度の紫外線を照射して細胞が接着、増
殖および剥離しうる箇所を作り出すことができる。また
、部分的に過度の紫外線を照射して細胞の剥離性を下げ
ることによりその表面積を調整することもできる。

【００３６】細胞接着性物質および温度感応性高分子化
合物の混合層がすべて細胞の接着、増殖、剥離に適して
いる場合には、その表面積を調整するだけでよい。細胞
接着性の支持体にかかる層をコーティングした場合には
、層のみならず支持体上にも細胞が接着するが、増殖後
剥離するのは層上の細胞だけである。

【００３７】表面積の画定は、基材の構造を調節するこ
とによっても行うことができる。例えば、図２のように
、細胞非接着性の支持体上に、細胞接着性物質および温
度感応性高分子化合物からなる円柱状の混合層を形成し
、その上でのみ細胞を接着、増殖、剥離させるようにす
ることができる。また、図３のように、細胞接着性物質
および温度感応性高分子化合物からなる混合層上に格子
状に細胞非接着性物質を適用して、格子内でのみ細胞を
接着、増殖、剥離させるようにすることもできる。

【００３８】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体
的に説明するが本発明の範囲は特許請求の範囲の記載に
より定まるものであり、以下の実施例により制限を受け
るものではない。

【００３９】

【実施例】（実施例１）０．５％（ｗ／ｖ）ポリ−Ｎ−
イソプロピルアクリルアミド（平均分子量：約１．３ｘ
１０６；以下　ＰＮＩＰＡＡｍ）水溶液を作製した。該
水溶液のＬＣＳＴを濁度法で測定した結果、約３２℃で
あった。該水溶液をオートクレーブ滅菌処理した後、等
量の０．５％牛真皮ペプシン可溶化タイプＩコラーゲン
溶液（Ｋｏｋｅｎ　Ｃｅｌｌｇｅｎ　Ｉ−ＰＣ，　高研
（株）製）と混合し、ＰＰＮＩＰＡＡｍとコラーゲンの
濃度比が１／９の混合溶液を無菌的に作製した。

【００４０】次に、ポリプロピレンフィルム（厚さ約５
０μｍ）上に、径が約１０ｍｍ、５ｍｍ，３ｍｍの大き
さの円状の穴をあけたポリエステルフィルム（厚さ約１
５μｍ）のパターンをのせ、該０．５％混合溶液をコー
ティングし、図２に示すようにＰＮＩＰＡＡｍとコラー
ゲンの等量混合物のコーティング層をポリプロピレンフ
ィルム上に形成させた。さらに微小な円状コーティング
層（厚さ約１μｍ）を形成させるために径が約０．５ｍ
ｍの針の先端から、該混合液をポリプロピレンフィルム
上に滴下させ乾燥することによって、径が約１ｍｍのコ
ーティング層を形成させた。以上のコーティング操作は
、無菌的に行った。このフィルム全体に、クリーンベン
チ内の殺菌用紫外線ランプ（ＮＥＣ、１５Ｗ、２５４ｎ
ｍ）を用いて、照射量が１０００（Ｊ／ｍ２）になるよ
うに紫外線を照射した。

【００４１】このようにして作製したフィルムを、径が
３４ｍｍになるように打ち抜き、これを径が３５ｍｍの
ファルコンＴＭ組織培養用プラスチックディッシュ（＃
３００１、日本ベクトン・ディキンソン（株））に入れ
、さらにポリカーボネート製リング（滅菌済）で押さえ
て細胞培養を行った。

【００４２】次に、ヒト真皮由来の線維芽細胞をＤＭＥ
Ｍ（ダルベッコ改変イーグル培地ＧＩＢＣＯ社製、１０
％牛退治血清含有）中に分散させ、最終濃度が約２ｘ１
０５細胞／ｍｌの細胞分散液を作製し、３７℃に保温し
た。あらかじめ約３７℃に保温したコートフィルム入り
ディッシュ中に該３７℃の細胞分散液を約２ｍｌ注入し
、３７℃で空気／５％炭酸ガスインキュベーター（タバ
イエスペック製）中で４日間培養した。４日間培養後に
顕微鏡観察したところ、該フィルム上のコーティング部
分にのみ細胞が接着し増殖していることが確認された。 未コーティング部分には、細胞は全く接着していなかっ
た。各種の大きさにコーティングされた部分の細胞数を
顕微鏡下で計測した。結果は表１に示す通りであった。

【００４３】ただちに１０℃に保温されたインキュベー
ターに５分間放置したところ、各コーティング部分ごと
に細胞シートがフィルム表面より脱離した。この細胞シ
ートの各々を古い培地中から取り出し、２回新しい培地
で洗浄することにより溶解したポリマーとコラーゲンを
除去した。この後、２ｍｌの新鮮培地を含む疎水性ディ
ッシュ（ファルコン＃１００８、日本ベクトン・ディキ
ンソン（株））に移し、浮遊状態で２日間培養すること
によって細胞塊状体を得た。該細胞塊状体の直径を表１
に示す。

【００４４】

【００４５】コーティング部分の面積とコーティング部
分の細胞数の関係を図４に示した。コーティング部分の
面積を変えることによって、細胞塊状体中の細胞数を精
度よく制御することが可能であることが明らかになった
。さらに、表１の結果より、コーティング部分の面積に
よって細胞塊状体の径を制御することもできることが伺
えた。

【００４６】（実施例２）０．５％（ｗ／ｖ）牛真皮ペ
プシン可溶化タイプＩコラーゲン溶液（ｐＨ３、ＫＯＫ
ＥＮＣＥＬＬＧＥＮ　Ｉ−ＰＣ、（株）高研製）と、０
．５％（ｗ／ｖ）ＰＮＩＰＡＡｍ（平均分子量：３．５
×１０６）水溶液（塩酸でｐＨ３に調整、この溶液はオ
ートクレーブ処理後再溶解したもの）を、コラーゲンと
ＰＮＩＰＡＡｍの混合比が１対１９になるように混合し
、キャスティング溶液を調整した。

【００４７】このキャスティング溶液の２．４ｍｌを市
販のポリスチレン製ディッシュ（Ｆａｌｃｏｍ３００３
、日本ベクトン製）に分注し、すばやく均一にのばして
コーティングした。その後１０℃のインキュベーター内
で約１０時間乾燥させた。乾燥後のコーティング層の厚
みは、約２μｍであった。このディッシュに、表２に示
すような円形状の穴があいたアルミホイル製のマスクを
用い、紫外線照射システムＸＸ−１００（ウルトラバイ
オレット社、２５４ｎｍ、１５Ｗランプ２本付）を用い
て、照射量が約２５００（Ｊ／ｍ２）になるように紫外
線を照射した。このようにして作製したディッシュを培
養評価実験に用いた。条件は、実施例１と全く同一にし
た。結果は表２に示すとおりであった。

【００４８】

【００４９】紫外線照射部分の面積と紫外線照射部分の
細胞数との関係を図４に示した。紫外線照射部分の面積
によって細胞塊状体中の細胞数を精度よく制御すること
が可能であることが明らかになった。さらに、表２の結
果より、紫外線照射部分の面積によって細胞塊状体の径
を制御することもできることが伺えた。

【００５０】

【発明の効果】本発明の細胞培養用基材を用いることに
よって、所望の細胞数を有する細胞塊状体を大量に簡便
な方法で製造することができるようになった。

【００５１】本発明を利用すれば、細胞産生物を効率よ
く生産するのに適した細胞塊状体や、医薬品などの被検
物質や放射線などの物理的刺激が細胞に与える影響を定
量的にかつ鋭敏に測定するのに適した細胞塊状体、およ
び、細胞組織の欠損部の補綴などの生体組織に適した細
胞塊状体を効率よく培養することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とか
らなる層を支持体上に形成し、円状に適度の架橋を導入
したものを示す。

【図２】細胞非接着性材料表面上に、細胞接着性物質と
温度感応性高分子化合物とからなる円柱状の混合層を形
成したものを示す。

【図３】細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とか
らなる層上に格子状に細胞非接着性材料層を形成したも
のを示す。

【図４】細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とか
らなるコーティング部分の表面積または紫外線照射部分
の面積と、形成された細胞塊状体の細胞数との関係を示
す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物
   と一部または全部が架橋されている細胞接着性物質とか
   らなる細胞培養用基材の表面積を制御して、該温度感応
   性高分子化合物のＬＣＳＴ以上の温度で細胞を培養し、
   特定の細胞数に増殖させた後、培養液の温度をＬＣＳＴ
   以下にして該細胞培養用基材上に増殖した細胞を基材よ
   り剥離させる工程からなる細胞塊状体形成法。
2. 【請求項２】（ａ）請求項１の方法によって得られる細
   胞塊状体の細胞数と、剥離前に該細胞が接触していた細
   胞培養用基材上の面積との関係を求め、（ｂ）その関係
   に基づき、所望の細胞数を有する細胞塊状体を形成する
   のに必要な接触面積を求め、（ｃ）該接触面積を有する
   ように作製された細胞接着性物質とＬＣＳＴを有する温
   度感応性高分子化合物からなる細胞培養用基材を用いて
   、請求項１の方法によって所望の細胞数を有する細胞塊
   状体を形成する、ことを特徴とする細胞塊状体形成法。
3. 【請求項３】請求項１の細胞塊状体形成法で使用する、
   ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物と一部または
   全部が架橋されている細胞接着性物質とからなる表面積
   を制御した細胞培養用基材。