JPH04278075A - 細胞培養試験用基材およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞の接着性、増殖性
、剥離性を簡単に判定することができる細胞培養試験用
基材に関する。本発明の細胞培養試験用基材は、培養液
の温度を変化させることによって培養した細胞を基材か
ら剥離させ回収することができる。また、本発明は、か
かる細胞培養試験用基材の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日の細胞培養技術は、１）細胞産生物
の産生、２）生体の病変部や欠損部への補綴材、３）薬
剤の毒性および薬理活性評価用のシュミレーターなどに
利用されている。

【０００３】以下に上記の応用分野を中心として従来技
術について概観する。

【０００４】今日、細胞培養に使用されている動物細胞
は２種類に分類される。即ち、接着非依存性細胞（ａｎ
ｃｈｏｒａｇｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ
）と接着依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　ｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）である。前者の接着非依存性細
胞は、生存、増殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の
足場である基質が存在しなくても正常に発現される細胞
である。典型的な例としてミエローマ細胞、リンホーマ
細胞などから形成されるハイブリドーマがあげられる。

【０００５】一方、後者の接着依存性細胞は、生存、増
殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足場である基質
が存在しなくては正常に発現されない細胞である。初代
培養細胞をはじめとした正常二倍体細胞の大部分は接着
依存性である。さらに無限に増殖可能な樹立細胞系にも
、接着依存性を示すものが数多く知られている。例えば
、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカ
イン類、エリスロポエチン、コロニー・ステュミレイテ
ィング・ファクター、トロンボボエチンなどの各種分化
成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、
ワクチンなどの有用な細胞産生物を生産する樹立細胞系
にも接着依存性を示すものが多く知られている。従って
、これら有用な細胞産生物の生産のためにも接着依存性
細胞の培養技術の確立は非常に重要である。

【０００６】一般に細胞を物質生産のために利用する場
合、細胞を高機能を維持した状態で大量にかつ高密度に
培養することが重要である。ところが、動物細胞は微生
物細胞と比較して老廃物の蓄積および酸素をはじめとし
た栄養物の供給不足の影響を受け易く、高密度で大量に
培養する時にその機能を維持することが極めて困難であ
る。

【０００７】接着非依存性細胞の場合には、浮遊培養法
が最も適当であると考えられている。撹拌下に浮遊培養
法を行えば、細胞老廃物の速やかな除去および栄養物の
効率的な供給が可能であり、大量かつ高密度化を目的と
した装置のスケール・アップが容易だからである。しか
し、接着依存性細胞の場合には、細胞の足場としての基
質が必要なために浮遊培養法を適用することができない
。そこで従来、種々の接着依存性細胞の培養器が開発さ
れてきた。例えば実験室的に少量の細胞を培養する場合
には、一般的にはデイッシュ型、フラスコ型、プレート
型などの細胞培養器が広く使用されている。しかし、こ
れらの容器は細胞を大量に効率良く培養したい場合には
不適当である。このため、細胞が接着する基質面積を全
体の容積に対して大きくすることによって大量培養を可
能にするために、以下のような工夫が行われてきた。

【０００８】■　　細胞培養用のガラスビンを回転させ
壁面全体に細胞を増殖させるローラーびん法：■　　細
胞接着用の板を培養溶液中に平行に並べその間に培養液
を循環させるマルチトレー法：■　　プラスチックフィ
ルムを渦巻状にしたものを円筒内に挿入し横に回転させ
ながら細胞を接着させた後にフィルム間に培養液を循環
させるコイル培養法。

【０００９】■　　半透過性を有する中空糸膜を用いて
中空糸の外面に細胞を接着させ内側に培養液を循環させ
ることにより、中空糸膜から栄養物を補給し、老廃物を
除去する中空糸培養法：■　　充填したガラスビーズに
細胞を接着させその間隙に培養液を循環させる充填ガラ
スビーズ法：■　　マイクロビーズを培養液中に浮遊さ
せマイクロビーズ表面に細胞を接着させて撹拌下に培養
を行う疑似浮遊培養法（マイクロビーズ培養法）である
。

【００１０】以上のように、細胞を高密度で大量培養す
ることにより有用な細胞産生物を効率良く大量に生産さ
せるために、培養装置および培養基材の形状に重点をお
いた開発が従来進められてきた。しかし近年、接着依存
性細胞の活性あるいは機能維持および発現には培養基材
の性質が著しく関連していることがわかってきて、上述
したように培養基材の形状により酸素をはじめとした栄
養素の効率的供給あるいは細胞老廃物の効率的除去のみ
では細胞を長期間にわたり、その活性および特異的な機
能を維持した状態で培養することがほとんど不可能であ
るということがわかってきた。そこで培養基材の性質を
種々変えることにより細胞の活性、機能維持を向上させ
る試みが近年活発に行われはじめた。現在、細胞培養容
器の材質として光学的透明性、無毒性、良好な機械的物
性および成型性、低コストなどの点からポリスチレンが
広く使用されている。しかしポリスチレン表面は疎水性
が強く、細胞活性維持のために細胞の接着が著しく阻害
されるという重大な欠点を有している。そこでポリスチ
レン表面をコロナ放電処理することにより表面にのみ陰
イオン基を導入し親水性を付与することにより細胞の接
着性、増殖性を改善した細胞培養基材が開発され広く使
用されている。しかしこの程度の改善では細胞の特異的
な機能を発現させそれを維持することが困難であること
がわかってきて最近では培養細胞の環境を細胞が生体内
に存在する状態に出来るだけ近づけることにより細胞の
接着、増殖、分化、物質産生能などの機能を向上させる
研究が行われてきた。即ち、細胞外マトリックスを細胞
基材に組合せる方法である。

【００１１】ところで、生体内での細胞外マトリックス
の機能についての研究が近年急速に進み、従来から知ら
れていた細胞を支持、固定化するという単純な受動的な
役割だけではなく、細胞機能を能動的に制御する機能も
有していることが分かってきた。

【００１２】例えば、細胞外マトリックスの主成分であ
るコラーゲンには１０種以上あることが発見されており
、それぞれのコラーゲンは決まった細胞によって合成さ
れ、一定の組織に局在し、そして異なる細胞機能を制御
する役割を有していることが解明されつつある。また、
同一タイプのコラーゲンでも、高次構造の変性あるいは
種々の官能基を導入するなどの改質によっても細胞機能
に影響があることがわかってきた。

【００１３】また、細胞外マトリックスの第２成分であ
る、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プ
ロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどは、コラー
ゲンおよび細胞膜に対して特異的な結合部位を有し、細
胞の基質への接着に重要な役割を果たしている。なお、
接着性タンパク質はそれぞれ一定種の細胞、コラーゲン
に特異的に結合する。例えば、フィブロネクチンは主と
して繊維芽細胞およびＩ型、ＩＩ型のコラーゲンに、ラ
ミニンは上皮、内皮細胞およびＩＶ型コラーゲンにそれ
ぞれ特有の結合部位を有している。更に上記の細胞外マ
トリックス以外にも細胞機能に大きな影響を与えるもの
としてコラーゲンの熱変性物であるゼラチン、細胞膜上
の糖鎖に特異的に結合するレクチン、フィブロネクチン
などの結合部位である接着性オリゴペプチド、イガイか
ら得られた細胞接着蛋白等が知られている。上記の細胞
の接着、増殖を制御する因子を培養基材に組合せた例と
しては、コラーゲンをコーティングした培養基材（Ｋ．
Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ．ｅｔ　ａｌ．．Ａｎｎａｌｓ　ｏ
ｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ．１３．９．１９
８４）、またフィブロネクチンをコーティングした基材
（Ｆ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ．Ｅｘｐｌ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ
．１０２．５１．１９７６）、またイガイから得られた
細胞接着蛋白をコーティングした基材（Ｐ．Ｔ．Ｐｉｃ
ｃｉａｎｏ．ｅｔ　ａｌｌ．．Ｉｎ　ＶｉｔｒｏＣｅｌ
ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　２２（３）．２４Ａ．１９８６）などが
開発され、細胞接着および増殖効果の改善が認められて
いる。さらには生体由来の細胞外基質のかわりにガラク
トース末端を側鎖に有するポリスチレンをコーティング
した基材（赤池敏宏ら、人工臓器、１７．２２７．１９
８８）が開発され特に肝細胞の接着性の向上および生存
性の維持が認められている。従来、培養条件が厳しく接
着が非常に困難であった細胞も上記したような方法で表
面を処理した培養した基材を用いることによって培養が
可能になってきた。以上述べたように、栄養素への効率
的な補給および老廃物の効率的な除去が可能な細胞培養
法の開発、細胞の特異的な機能を維持することを目的と
して細胞接着・増殖因子をくみこんだ培養基材の開発が
進んできたにも拘らず、現在の技術には下記のような重
大な問題点が残されていた。

【００１４】接着依存性細胞の重要な特徴は、細胞が培
養基材に接着し、増殖し、基材表面を完全に覆ってしま
うとコンタクト・インヒビションという機能が働きそれ
以上の細胞増殖が停止してしまうという性質である。し
たがって細胞を更に増殖させるためには細胞を新しい培
養基材に植え替える継代操作が必要となる。

【００１５】従来、基材表面に接着し、増殖した細胞を
脱離させる継代操作にはトリプシン、コラゲナーゼ、な
どの蛋白分解酵素、カルシウムイオンの錯体化合物であ
るＥＤＴＡなどが一般的に用いられてきたがこれらの細
胞脱離剤は下記のように細胞機能および細胞培養工程に
重大な障害をもたらす。

【００１６】１）従来の細胞脱離剤は培養基材と細胞の
間の結合を破壊するのみならず細胞と細胞の間のあらゆ
る結合を破壊してしまう。細胞間の結合にはタイトジャ
ンクション、ギャップジャンクション、デスモゾームと
呼ばれる３種類の結合様式があることがわかっていて、
細胞同士が集合してタイトジャンクションが形成される
と細胞集合体としての物質透過に対してのバリヤーとし
ての働き生体内部の特異的環境が維持される。またギャ
ップジャンクションが形成されるとその結合を通じて隣
り合う細胞間の情報および物質の交換が行われる。一方
、デスモゾームはタイトジャンクション、ギャップジャ
ンクションの結合が維持されるように細胞集合体を機械
的に保持する。したがって細胞はそれ自身単独では活性
、機能の発現は困難であり上述した細胞間結合によって
社会を形成してはじめて機能が発現するものと考えられ
ている（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ．ｅｔ　ａｌ．゛Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｂｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ
″．３ｒｄ　ｅｄｎ．Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ．Ｉｎｃ．．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ　
Ｐ．６７３．１９８３）。したがって従来の細胞脱離剤
は高度に機能が維持された状態で培養された細胞に対し
ても継代時に致命的な障害を与えてしまう。

【００１７】２）　　細胞膜上にはホルモン、神経伝達
物質などの種々の信号物質に対するリセプターが存在し
、細胞はこれらの信号物質とリセプターの特異的反応に
より遠隔制御を受けかつ行っている。蛋白分解酵素など
の従来の細胞脱離剤はこれらの細胞膜リセプターを破壊
してしまうことがわかっている（Ｃ．Ｓｕｎｇ．ｅｔ　
ａｌ．．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．３８．
６９６．１９８９）。したがって従来の技術によって継
代された細胞を特異的生理活性を有する信号物質により
その機能をコントロールすることはほとんど不可能であ
る。

【００１８】３）　　一般的に細胞培養液中には栄養素
として血清が添加されていて血清中には強力なトリプシ
ン阻害物質が存在する。このため、トリプシン処理の継
代時には、あらかじめ緩衝液で充分細胞を洗浄しトリプ
シン阻害物質を除去しておくことが必要である。この洗
浄工程は操作を煩雑にするばかりでなく細胞培養にとっ
て致命的な汚染の重大な原因にもなる。すでに述べたよ
うに細胞外マトリックスなどの細胞の接着、増殖、分化
などの機能の発現を促進させる因子を用いた培養基材の
進展にもかかわらず、細胞を回収、継代する際に従来の
細胞脱離剤を用いれば上述（１）、（２）の理由により
せっかく維持された細胞の高機能性が著しく損なわれる
ことになる。この問題が高機能性を維持した細胞を培養
する技術の大きな障害になっている。

【００１９】一方、従来の細胞脱離操作は大量培養技術
にも致命的な欠点をもたらす。即ち接着依存性細胞は培
養液中の初期細胞濃度が低すぎると細胞は基質に接着し
ても増殖および物質産生機能を十分に発揮することがで
きないといわれている。特に採取が困難な初代培養細胞
あるいは正常二倍体細胞などの場合は、初めから大容量
の培養液中で培養することは細胞濃度が低くなりすぎる
ので、小容量の培養装置を用いて段階的に細胞継代を繰
り返しながら大容量化しなければならない。即ち通常、
大量培養時には数回の細胞回収、継代の操作が必要にな
る。したがって（３）の理由により従来の細胞脱離法は
特に大量培養時の致命的欠隔である操作装置の煩雑化お
よび汚染の大きな危険性にもつながることになる。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】従来の細胞培養技術が
有していた上記の問題点に対処するために、温度感応性
高分子化合物を用いた細胞培養技術が開発されている（
特願平２−４１９５５および特願平２−９１９２７）。 しかし、その後の本発明者らによる検討により、細胞の
接着、増殖性が非常に良好で、かつ増殖した細胞を効率
よく回収する基材の条件は、細胞の種類によって微妙に
異なることが明らかになった。このため、異なる条件を
備えた複数の部分からなる細胞培養試験用基材を開発し
、様々な細胞の接着、増殖、剥離性を簡単に判定しうる
ようにする必要性があった。

【００２１】本発明は、かかる課題を解決した細胞培養
試験用基材およびその製造方法を提供することを目的と
する。

【００２２】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、ＬＣＳＴ
を有する温度感応性高分子化合物と架橋の程度が異なる
細胞接着性物質からなる複数の部分を有する細胞培養試
験用基材を提供する本発明により達成された。

【００２３】本発明の細胞培養試験用基材に使用する細
胞接着性物質は、試料として与えられた細胞を変性する
ことなく接着する物質を１以上含み、コラーゲンを５０
％以上含有するものを意味する。細胞を変性することな
く接着する物質としては、コラーゲン、フィブロネクチ
ン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、グ
リコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分や、
コラーゲンの熱変性物であるゼラチンやその他のコラー
ゲン誘導体、細胞膜上の糖鎖に親和力を有するコンカナ
バリンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）などのレクチン、イガイ由来の
接着タンパク質、フィブロネクチンと細胞との接着部位
に対応する接着性オリゴペプチドなどが挙げられる。一
方、細胞接着性物質に含有させることができるコラーゲ
ンの種類は、特に限定されない。したがって、各種タイ
プのコラーゲン単体やそれらの混合物を広く用いること
ができる。

【００２４】本発明の細胞培養試験用基材に使用するＬ
ＣＳＴを有する温度感応性高分子とは、水に対する溶解
度温度係数が負を示す高分子化合物であり、低温にて生
成する高分子化合物と水分子との水素結合に依存する水
和物（オキソニウムヒドロキシド）が、高温で分解し脱
水和することにより、高分子化合物同士が凝集し沈殿す
る特徴を有する。ＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃ
ａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）と
は、このような温度感応性高分子化合物の水和と脱水和
の転移温度をいう（例えば、ハスキンズ（Ｍ．　Ｈａｓ
ｋｉｎｓ）らの　Ｊ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌ，　Ｓｃｉ．
−Ｃｈｅｍ．，　Ａ２　（８），　１４４１　（１９６
８）　参照）。したがって、温度感応性高分子化合物は
、ＬＣＳＴより高い温度では非水溶性で固体状態であり
、温度をＬＣＳＴより低くすることによって可逆的に水
溶性になる。

【００２５】本発明では、培養温度より低いＬＣＳＴを
有する温度感応性高分子化合物を使用する。このような
高分子化合物であれば、その構造を問わず広く使用する
ことができる。該高分子化合物は、細胞培養温度では水
に不溶性の固体状態あるため、細胞接着性物質と温度感
応性高分子化合物とからなる層を足場として細胞が接着
、増殖することができる。また、温度をＬＣＳＴ以下に
することによって高分子化合物は水に可溶性になるため
増殖した細胞は足場を失い、細胞間の結合を損なわずし
かも細胞膜表面のタンパク質を損傷することなく増殖細
胞を回収することができる。したがって、細胞接着性物
質と温度感応性高分子化合物とからなる本発明の基材を
用いれば、トリプシンやＥＤＴＡといった剥離剤を使用
せずに、機能を損なうことなく細胞を簡単に剥離して回
収することができる。

【００２６】本発明で使用することができる温度感応性
高分子化合物としては、ポリＮ置換アクリルアミド誘導
体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体およびこれら
の共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレン
オキサイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニル
アルコール部分酢化物などが挙げられる。特に好ましい
のは、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ置換メ
タアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリ
ビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化
物である。

【００２７】好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが
低い順に列挙する。

【００２８】ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ
ーＮ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−イ
ソプロピルアクリルアミド；ポリーＮ，Ｎ−ジエチルア
クリルアミド；ポリーＮ−イソプロピルメタアクリルア
ミド；ポリーＮ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ
ーＮ−アクリロイルピロリジン；ポリーＮ，Ｎ−エチル
メチルアクリルアミド；ポリーＮ−シクロプロピルメタ
アクリルアミド；ポリーＮ−エチルアクリルアミド上記
の高分子は、他の単量体と共重合したものであってもよ
い。共重合する単量体は、親水性単量体、疎水性単量体
のいずれであってもよい。一般的には、親水性単量体と
共重合するとＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体と共重合
するとＬＣＳＴは下降する。したがって、これらを選択
することによって所望のＬＣＳＴを有する高分子化合物
を得ることもできる。

【００２９】親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリル
アミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル
メタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒ
ドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルア
クリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル
酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスルホ
ン酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスル
ホン酸など、並びに塩基性を有するＮ，Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル
アクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。

【００３０】一方、疎水性単量体としては、エチルアク
リレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリ
レートなどのアクリレート誘導体およびメタクリレート
誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置
換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、ア
クリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【００３１】本発明で使用する温度感応性高分子化合物
は、分子量が１．０ｘ１０５以上であるのが好ましい。 さらに好ましくは１．０ｘ１０６以上である。分子量が
小さいと、細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物と
を含有する層をコーティングしたときにその一部が剥離
してしまうため、十分に細胞を脱離することができない
。なお、ここでいう分子量とは、粘度から求めた平均分
子量をさす。例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリル
アミドの平均分子量（Ｍｎ）と極限粘度（［η］）との
関係は、 ［η］　　＝　　９．５９ｘ１０−５　Ｍｎ０．６５（
２７℃テトラヒドロフラン溶液）（伊藤、Ｒ．Ｔ．Ｇｅ
ｒｏｎｉｍｏ、繊維高分子材料研究所研究報告第１５９
号、１９８８）で表される。

【００３２】本発明の細胞培養試験用基材の特徴は、コ
ラーゲンまたはコラーゲンを主成分とする細胞接着性物
質の一部または全部に架橋が導入されていることと、そ
の架橋の程度が基材の場所によって異なることにある。

【００３３】一般に、コラーゲンは培養状態においては
線維を形成し、生体内に存在していたときと同様の構造
をとることが知られており、この状態では培養液に溶解
することはほとんどない。しかし、温度感応性高分子化
合物とコラーゲンが共存する系においては、コラーゲン
が有する本来の線維形成能力が十分に発揮されない。コ
ラーゲンの線維形成が不十分であると、細胞が基材に接
着する前に基材中のコラーゲンの一部が培養液中に溶解
してしまう。これに対処するためには、本来細胞の接着
、増殖のために必要である量よりもかなり多量のコラー
ゲンを使用しなければならなかった。しかし、本発明の
ように、コラーゲンに架橋を導入すれば、コラーゲンを
培養液に対して不溶化することができる。したがって、
本発明の細胞培養試験用基材に使用するコラーゲンの量
は従来より大幅に減らすことができ、製造も低コストで
行うことができるという利点がある。

【００３４】本発明の細胞培養試験用基材を用いた場合
は、一般に細胞の種類を問わず、架橋の程度を大きくす
ると細胞の接着、増殖性は増し、剥離性は低下する。逆
に、架橋の程度を小さくすると、細胞の接着、増殖性は
悪くなるが、剥離性はよくなる。したがって、基材上に
コラーゲンの架橋の程度が異なる複数の部分を形成して
おく本発明の基材を使用すれば、種々の細胞の接着、増
殖、剥離性を簡単に判定し、最適な条件を見いだすこと
ができる。

【００３５】コラーゲンへの架橋の導入方法は、特に限
定されるものではなく、一般に用いられる方法であれば
いかなるものであってもよい。例えば、グルタルアルデ
ヒドなどを用いた化学処理法、オゾン処理法、紫外線処
理法、電子線処理法、プラズマ処理法などを用いること
ができる。基材上にコラーゲンの架橋の程度が異なる部
分を形成させるには、部分的に短時間に架橋を導入でき
る方法が適している。例えば、紫外線処理法、電子線処
理法、プラズマ処理法が適している。

【００３６】本発明の細胞培養試験用基材に含有させる
細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物との重量比は
、１：９から１：４９の範囲内にすれば、細胞の接着、
増殖、剥離性が良好であるため好ましい。より好ましい
範囲は、１：９から１：３９の範囲内である。

【００３７】また、本発明の細胞培養試験用基材の構造
は、特に限定されるものではない。したがって、細胞接
着性物質と温度感応性高分子化合物は上下に層状構造を
形成していてもよいし、また海島構造、ラメラ構造や２
層が連結した変調構造を形成していてもよい。

【００３８】本発明の細胞培養試験用基材は、このよう
な細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物からなるコ
ーティング層と支持体から形成されているのが一般的で
ある。しかし、支持体上にコーティングされていない基
材も本発明の範囲に含まれる。乾燥後のコーティング層
の厚みは０．５μｍ以上であるのが好ましく、１．０μ
ｍ以上であればより好ましい。コーティング層の厚みは
、基材を形成する物質の密度を１．０と考えて、混合物
溶液の濃度と乾燥前のコーティング層の厚みから計算し
て求める。コーティング層の厚みが０．５μｍ以下であ
ると、細胞の脱離性が悪くなったり、脱離までの時間が
非常に長くなったりして、性能が不安定になる。細胞接
着性物質と温度感応性高分子化合物からなる層のコーテ
ィングは、支持体の全表面にわたってもよいし、一部で
あってもよい。

【００３９】本発明において、コーティングされる支持
体は、透明または半透明であるのが好ましい。とくに、
細胞を顕微鏡下で観察するのに十分な透明性を有してい
ることが好ましい。材料は、ガラス、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリメチル
メタクリレート、アクリル系樹脂などの透明または半透
明の材料を広く用いることができる。また、支持体の形
状は、ディッシュ、プレート、ボトル、チューブ、フラ
スコ、フィルムなどが一般的であるがこれらに限定され
るものではない。

【００４０】本発明の細胞培養試験用基材は、通常用い
られている当業者に自明な方法で製造することができ、
その方法は特に制限されない。例えば、溶媒キャスティ
ング法やディップ法を用いれば簡便に製造することがで
きる。

【００４１】しかし、本発明の方法によって製造すれば
、安定した性能を有する細胞培養試験用基材を極めて効
率的に製造することができる。本発明の方法は、（ａ）
細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物を含有する層
を形成する工程と（ｂ）一定の面積だけ紫外線が透過す
るマスクを用いて、異なる場所に異なる照射量で紫外線
を複数回照射することにより架橋を導入する工程からな
る。

【００４２】工程（ａ）では、キャスト法やディップ法
など層を形成させることができる方法を広く採用するこ
とができる。したがって、細胞接着性物質と温度感応性
高分子化合物の層を別々に形成させるような方法を採る
こともできる。

【００４３】工程（ｂ）において使用するマスクは、紫
外線の透過量をなんらかの手段でコントロールすること
ができるものであればその種類はとくに制限されない。 一般にフォトマスクとして市販されているものであって
も、また、アルミホイルなどを用いて作製したものであ
ってもよい。紫外線の照射量（照射強度ｘ時間：２５４
ｎｍ）は、１００〜５０００Ｊ／ｍ２とするのが好まし
く、５００〜４０００Ｊ／ｍ２とすればより好ましい。 １００Ｊ／ｍ２以下では紫外線照射の効果がほとんどな
く、また、５０００Ｊ／ｍ２以上では細胞がまったく剥
離しない。なお、２５４ｎｍ以外の波長の紫外線を使用
する場合は、２５４ｎｍの紫外線を上記の範囲で照射し
たときと同程度の架橋を生じる量を照射する。工程（ｂ
）は、具体的には、マスクを移動させて紫外線を照射す
る方法や、あらかじめ透過量が場所によって異なるマス
クを固定しておいて紫外線を照射する方法などにより行
うことができる。

【００４４】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体
的に説明するが本発明の範囲は特許請求の範囲の記載に
より定まるものであり、以下の実施例により制限を受け
るものではない。

【００４５】

【実施例】（実施例１）０．５％（ｗ／ｖ）牛真皮ペプ
シン可溶化タイプＩコラーゲン溶液（ｐＨ３、ＫＯＫＥ
ＮＣＥＬＬＧＥＮ　Ｉ−ＰＣ、（株）高研製）と、０．
５％（ｗ／ｖ）ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
（Ｍｎ＝３．５×１０６、以下　ＰＮＩＰＡＡｍ）水溶
液（塩酸でｐＨ３に調整、この溶液はオートクレーブ処
理後再溶解したもの）を、コラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍ
の混合比が１対９、１対１９、１対３９になるように混
合し、キャスティング溶液を調整した。

【００４６】このキャスティング溶液の２．４ｍｌを市
販のポリスチレン製ディッシュ（Ｆａｌｃｏｍ３００３
、日本ベクトン製）に分注し、すばやく均一にのばしコ
ーティングした。その後１０℃のインキュベーター内で
約１０時間乾燥させた。乾燥後のコーティング層の厚み
は、約２μｍであった。このディッシュの裏面には、あ
らかじめ面積が均等に６分割になるような線を引いてお
いた。

【００４７】次に６分割した中の１つの場所だけが紫外
線が透過できるようなマスク（図１）を用い、表１に示
したような照射量になるように紫外線照射システム（Ｘ
Ｘ−１００、ウルトラバイオレット社製、２５４ｎｍ、
１５Ｗランプ２本付）を用い、５回照射を行った。これ
らの操作は、すべて無菌的な環境下で行われた。このよ
うにして作製したディッシュを培養評価実験に用い、評
価した。

【００４８】以下には、培養評価実験の内容を示す。

【００４９】ヒトの真皮由来の線維芽細胞を、ダルヘッ
コ改変イーグル培地（以下Ｄ−ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製
、１０％牛胎児血清含有）を用いて、最終濃度が約２×
１０５細胞／ｍｌになるような細胞分散液を作製し、３
７℃に保温した。あらかじめ保温プレート（マイクロウ
ォームプレートＴＭ、（株）北里サプライ社製）を用い
て、約３７℃に保温しておいた、コーティングしたディ
ッシュ中に該３７℃の細胞分散液を１２ｍｌ注入し、３
７℃の空気／５％炭酸ガスインキュベーター中で３日間
培養した。

【００５０】３日後、インキュベーターからディッシュ
をとりだし、あらかじめ３７℃に保温しておいた保温プ
レート上に移し、位相差顕微鏡下で細胞の接着、増殖性
につい観察を行った。

【００５１】また剥離性については、ディッシュを氷上
に移し、約３分放置した後、位相差顕微鏡下で観察した
。

【００５２】結果は、表１に示す通りであった。なお表
に示した結果は、目視による観察結果に基づき、以下の
式を用いて算出した。

【００５３】

【００５４】この表の結果は、各３ディッシュの平均値
である。

【００５５】このように細胞の接着、増殖性、剥離性を
簡単に評価することができた。この線維芽細胞の場合、
コラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍの混合比が、１対９の場合
は最適紫外線照射量は１０００〜２０００（Ｊ／ｍ２）
で、１対１９の場合は、約２０００（Ｊ／ｍ２）、１対
３９の場合は、約４０００（Ｊ／ｍ２）と判断すること
ができた。

【００５６】（実施例２）実施例１とまったく同様の方
法でコーティングした３種類のディッシュに、図２に示
すような石英ガラス製のマスクを用いて、実施例１と同
様の方法で紫外線を１回照射した。照射量は、表２に記
載される量とした。

【００５７】ヒトさい帯由来血管内皮細胞と、１９９培
地（ＧＩＢＣＯ社製、２０％血清含有）を用い、培養日
数を２日間とした点以外は、実施例１と同様に行った。

【００５８】結果を表２に示す。

【００５９】

【００６０】この内皮細胞の場合、コラーゲンとＰＮＩ
ＰＡＡｍの混合比が１対１９で紫外線照射量１０００（
Ｊ／ｍ２）のとき最適条件となることがわかった。

【００６１】

【発明の効果】本発明の細胞培養試験用基材を用いれば
、様々な細胞の接着、増殖、剥離性を簡単にかつ再現性
よく判定することが可能である。また、本発明の製造方
法を用いれば、かかる細胞培養試験用基材を安定して提
供することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞培養試験用基材の製造方法で使用
するマスクを示したものである。紫外線が一箇所でのみ
透過するようになっている点に特徴がある。図面中、斜
線部が紫外線透過部を表す。

【図２】本発明の細胞培養試験用基材の製造方法で使用
するマスクを示したものである。紫外線の透過率が下記
のように場所により異なる点に特徴がある。 １　　　　１００％ ２　　　　　　５０％ ３　　　　　　２５％ ４　　　　　　１２．５％ ５　　　　　　　　２．５％ ６　　　　　　　　０％

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物
   と架橋の程度が異なる細胞接着性物質からなる複数の部
   分を有する細胞培養試験用基材。
2. 【請求項２】（ａ）細胞接着性物質と温度感応性高分子
   化合物を含有する層を形成する工程 （ｂ）一定の面積だけ紫外線が透過するマスクを用いて
   、紫外線を照射することにより架橋を導入する工程から
   なる請求項１の細胞培養試験用基材の製造方法。