JP2020062009A - 細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、及びスフェロイドの製造方法 - Google Patents

細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、及びスフェロイドの製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 細胞の効率的なスフェロイド形成を可能とすると共に、細胞の生存率が高く、サイズが均質かつ任意の形状のスフェロイドを形成可能な細胞培養基材、及び該細胞培養基材の製造方法、該細胞培養基材を用いたスフェロイド内部の細胞生存率に優れるスフェロイド製造方法を提供する。【解決手段】 基材と、前記基材上に被覆された刺激応答性高分子とを有する細胞培養基材であって、前記刺激応答性高分子は水不溶性ブロックセグメント及び刺激応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であり、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有することを特徴とする細胞培養基材。（Ａ）細胞増殖性及び刺激応答性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。【選択図】 図１

Description

本発明は、効率的なスフェロイド形成を可能とすると共に、サイズが均質かつ任意の形状のスフェロイドを形成可能な細胞培養基材、及び該細胞培養基材の製造方法、該細胞培養基材を用いたスフェロイドの製造方法に関する。
胚性細胞（ＥＳ細胞）や人工細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野や創薬スクリーニングのための細胞ソースとして大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療や創薬スクリーニングに応用するには、多能性幹細胞から目的の細胞へと分化させる必要があるが、その際、多能性幹細胞のスフェロイド（胚様体）を形成する必要がある。また、多能性幹細胞は様々な細胞へと分化することができるが、分化後の細胞の種類によって最適なスフェロイドのサイズが異なることが知られており、サイズを制御し、さらにサイズの均一なスフェロイドを作成することが望ましい。
スフェロイドを形成する方法として従来、多能性幹細胞が接着しない基材を用いることで多能性幹細胞に自発的に凝集体を形成させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この方法はスフェロイドの量産性に優れるものの、均一なサイズのスフェロイドを得ることができないという問題があった。
サイズの均一なスフェロイドを形成する方法として、表面に微細な凹凸を設けた細胞培養基材を使用する方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら、このような微細な凹凸を設けた細胞培養基材は量産性に乏しく、大量のスフェロイドを形成する用途には不向きであるという問題があった。また、形成可能なスフェロイドは球状の形状に限られ、球状以外の形状のスフェロイドを形成することはできないという問題があった。
特開平８−１４０６７３号公報 特開２０１５−０７３５２０号公報
本発明の目的は、細胞の効率的なスフェロイド形成を可能とすると共に、サイズが均質かつ任意の形状のスフェロイドを形成可能な細胞培養基材、該細胞培養基材の製造方法、及び該細胞培養基材を用いたスフェロイドの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、以上の点を鑑み鋭意研究を重ねた結果、特定の刺激応答性を有する領域を形成した基材によって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の［１］乃至［１２］に存する。
［１］ 基材と、前記基材上に被覆された刺激応答性高分子とを有する細胞培養基材であって、前記刺激応答性高分子は水不溶性ブロックセグメント及び刺激応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であり、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有することを特徴とする細胞培養基材。
（Ａ）細胞増殖性及び刺激応答性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
［２］ 前記（Ａ）領域が、下記（Ａ１）及び（Ａ２）の２つの領域からなり、前記（Ｂ）領域が、下記（Ｂ１）及び（Ｂ２）の２つの領域からなるものであることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養基材。
（Ａ１）細胞増殖性領域
（Ａ２）刺激応答性領域
（Ｂ１）基材接着領域
（Ｂ２）刺激応答性領域
［３］ 前記（Ａ）領域が、細胞増殖性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの温度応答性領域が分散してなるものであるか、又は、細胞増殖性を有しない温度応答性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの細胞増殖性の領域が分散してなるものであることを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載の細胞培養基材。
［４］ 細胞増殖性の領域と、細胞増殖性を有しない領域の２つの領域を有する基材と、前記基材上に形成された刺激応答性高分子を含む層を有し、前記層の平均粗さ／層厚の比が０．５以上１以下であることを特徴とする、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［５］ 前記刺激応答性高分子が水不溶性ブロックセグメント及び９０ｗｔ％を超える刺激応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であることを特徴とする前記［４］に記載の細胞培養基材。
［６］ 前記（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［７］ 多能性幹細胞のスフェロイド形成用であることを特徴とする、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［８］ 以下の（１）及び（２）工程を有することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養基材の製造方法。
（１）細胞増殖性を有しない基材の表面に、細胞増殖性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域を形成する工程。
（２）基材の表面に、刺激応答性物質による層を形成する工程。
［９］ 前記（１）工程において、細胞増殖性を有しない基材の表面に、プラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理のいずれか、またはこれらの複数の組み合わせによって、細胞増殖性を有する領域を形成することを特徴とする、前記［８］に記載の細胞培養基材の製造方法。
［１０］ 前記（１）工程で用いる基材が細胞接着性を有するが細胞増殖性を有しないものであることを特徴とする、前記［８］又は［９］に記載の細胞培養基材の製造方法。
［１１］ 前記（１）工程が、面積０．００１〜１０ｍｍ２の穴を有する表面保護フィルムを基材に貼付する工程を有することを特徴とする、前記［９］又は［１０］に記載の細胞培養基材の製造方法。
［１２］ 以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）工程を経ることを特徴とするスフェロイドの製造方法。
（ｉ）前記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養基材に細胞を播種する工程。
（ｉｉ）前記播種された細胞を培養し、前記細胞培養基材上に接着した細胞のコロニーを形成する工程。
（ｉｉｉ）外部刺激を与えることにより前記コロニーの少なくとも一部分を細胞培養基材から剥離し、細胞のスフェロイドを形成する工程。
本発明によって、細胞の効率的なスフェロイド形成を可能とすると共に、細胞の生存率が高く、サイズが均質かつ任意の形状のスフェロイドを形成可能な細胞培養基材、及び該細胞培養基材の製造方法、該細胞培養基材を用いたスフェロイド内部の細胞生存率に優れるスフェロイド製造方法を提供することができる。
本発明の細胞培養基材の模式図（斜視図）。 刺激応答性高分子による層を有する細胞培養基材の模式図（断面図）。 本発明のスフェロイド製造方法の（ｉ）工程後の細胞の様子を示す模式図。 本発明のスフェロイド製造方法の（ｉｉ）工程後の細胞の様子を示す模式図。 本発明のスフェロイド製造方法の（ｉｉｉ）工程後の細胞の様子を示す模式図。 実施例１のスフェロイドを示す位相差顕微鏡画像。 実施例２のコロニーを示す位相差顕微鏡画像。 実施例２のスフェロイドを示す位相差顕微鏡画像。 実施例４のスフェロイドを示す位相差顕微鏡画像。 実施例５のスフェロイドを示す位相差顕微鏡画像。 実施例７の細胞培養基材の原子間力顕微鏡像。 実施例８の細胞培養基材の原子間力顕微鏡像。 実施例８のスフェロイドを示す位相差顕微鏡画像。
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
本明細書において、「スフェロイド」とは、複数の細胞が集まって形成される細胞の三次元凝集塊で、細胞が基材上に接着した状態で形成する細胞シート状のものを除く。球状の形状を有するものが好ましく、シート状の細胞が折りたたまれることで形成する隙間のある球状や、中空の形状であっても良い。また、本明細書において、「コロニー」とは、細胞が基材上に接着した状態で形成する細胞シート状の細胞集団を示す。
また、本明細書において、「刺激応答性」とは、外部刺激によって構造が変化又は親水性／疎水性の程度が変化することを示す。ここで、本明細書において「外部刺激」とは、超音波や振動、対流等の力学的刺激、光や電気、磁気等の電磁気学的刺激、加温や冷却等の熱力学的刺激を示し、酵素反応等の生物反応によるものを除く。
また、本明細書において、「温度応答性」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化することを示す。さらに、親水性／疎水性の程度が変化する境界温度を「応答温度」と表記する。
また、本明細書において、「生体由来物質」とは、生物の体内に存在する物質であるが、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記生体由来物質をベースとして化学的に合成した物質であっても良い。生体由来物質に特に限定はないが、例えば、生体を構成する基本材料である核酸、タンパク質、多糖や、これらの構成要素であるヌクレオチドやヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖、あるいは脂質やビタミン、ホルモンである。
また、本明細書において、「細胞接着性」とは、培養温度における細胞培養基材への接着しやすさを示し、「細胞接着性を有する」とは、細胞が培養温度において基材又は細胞培養基材に直接又は生体由来物質を介して接着可能であることを示す。また、「細胞接着性を有しない」とは、培養温度において細胞が基材又は細胞培養基材に接着できないことを示す。
また、本明細書において、「細胞増殖性」とは、培養温度における細胞の増殖しやすさを示し、「細胞増殖性を有する」とは、細胞が培養温度において基材又は細胞培養基材に直接又は生体由来物質を介して接着し、さらに増殖可能であることを示す。また、「細胞増殖性を有しない」とは、培養温度において細胞が基材又は細胞培養基材に接着できないか、又は、接着はするが増殖できないことを示す。さらに、「細胞増殖性が高い」とは、同一の培養期間で比較した際により多くの細胞へと増殖することを示す。
本発明の一態様にかかる細胞培養基材は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する。
（Ａ）細胞増殖性及び刺激応答性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
前記（Ａ）領域は、細胞増殖性及び刺激応答性を有する。細胞増殖性及び刺激応答性を有することによって、本発明の細胞培養基材は細胞を培養してコロニーを形成し、外部刺激によってコロニーを剥離することによってスフェロイドを製造することができる。細胞増殖性又は刺激応答性を有しない場合、細胞を培養してコロニーを形成することができないか、外部刺激によってコロニーを剥離することができないため、スフェロイドを製造することができない。
前記刺激応答性としては、外部刺激によってコロニーを剥離可能であれば特に限定はないが、温度応答性、光応答性、ｐＨ応答性、磁気応答性、電場応答性、力学的刺激応答性を挙げることができ、温度応答性、光応答性、ｐＨ応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが好ましく、温度応答性、光応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることがさらに好ましく、温度応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが特に好ましく、温度応答性が最も好ましい。
（Ａ）領域はまた、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域である。面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域であることにより、細胞を培養した際に、スフェロイドを製造するのに最適なサイズ及び形状のコロニーを形成することができる。また、島状の領域の形状によってコロニーの形状を制御することが可能であり、球状以外のスフェロイドが製造可能となる。面積０．００１ｍｍ２未満であるか５ｍｍ２を超える場合、細胞を培養した際に、最適なサイズのコロニーを形成することができず、スフェロイドの形状が歪であるか、又はスフェロイドを製造することができない。また、多能性幹細胞の分化誘導等の用途に適したスフェロイドを形成するのに好適であることから、面積０．００５〜１ｍｍ２が好ましく、面積０．０１〜０．５ｍｍ２がさらに好ましく、面積０．０１５〜０．２５ｍｍ２が特に好ましく、面積０．０２〜０．２ｍｍ２が最も好ましい。
また、均一なサイズ及び形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、（Ａ）領域の面積の標準偏差／平均面積が８０％以下であることが好ましく、５０％以下であることがさらに好ましく、２０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。
本発明において「島状」とは、海島構造に存在する島構造のように平面に配置した独立した領域を示す（例えば、図１の符号Ａで示される部分。）。（Ａ）領域が島状であることにより、本発明の細胞培養基材は細胞を培養してコロニーを形成し、外部刺激によってコロニーを剥離することによってスフェロイドを製造することができる。（Ａ）領域が島状ではない場合、例えばストライプ構造等の場合、剥離に際してコロニーが破断しやすく、均一なサイズ及び形状のスフェロイドが製造できない。島状の形状としては特に限定はなく、目的とするスフェロイドの形状に応じて適宜設定可能であるが、例えば、円や楕円、多角形、不定形の直線又は曲線からなる閉じた形状等を挙げることができる。また、球に近い形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、島状の形状として、円又は楕円、多角形が好ましく、円又は楕円、長方形がさらに好ましく、円又は楕円、正方形が特に好ましく、円又は楕円が最も好ましい。
また、本発明において、球に近い形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、島状の形状のアスペクト比としては５以下が好ましく、２以下がさらに好ましく、１．５以下が特に好ましく、１．１以下が最も好ましい。ここで、本発明において「アスペクト比」とは、形状の最大径（長径）と最小径（短径）の比である長径／短径を示す。
前記（Ｂ）領域は、前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない。（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域であることにより、細胞を培養した際に、（Ａ）領域のみにコロニーを形成し、（Ａ）領域の周囲にはコロニーが存在しない状態を形成することが可能であり、外部刺激によってコロニーを剥離することによってスフェロイドを製造することができる。（Ｂ）領域が（Ａ）領域に隣接していないか、又は細胞増殖性を有する場合、細胞を培養した際に、（Ａ）領域の周囲にもコロニーが存在するため、外部刺激によって（Ａ）領域のコロニーを剥離した際に、（Ａ）領域のコロニーが周囲のコロニーによって固定化されるためにスフェロイドが製造できないか、周囲のコロニーが（Ａ）領域のコロニーに付着するために均一なサイズ及び形状のスフェロイドを製造することができない。また、製造されるスフェロイドのサイズ及び形状を均一化するのに好適であることから、（Ｂ）領域が細胞増殖性だけでなく細胞接着性も有しないものであることが好ましい。
（Ｂ）領域の形状としては、（Ａ）領域に隣接すること以外に限定はないが、均一なサイズ及び形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、（Ａ）領域との境界線の２０％以上の長さに（Ｂ）領域が隣接していることが好ましく、５０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、（Ａ）領域の周囲が全て（Ｂ）領域であることが最も好ましい。また、細胞培養基材の量産性を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域が島状で（Ｂ）領域が海状の海島構造であることが好ましい（例えば、図１の符号Ｂで示される部分。）。（Ａ）領域に隣接する（Ｂ）領域以外の領域としては、細胞増殖性を有するが刺激応答性を有しない領域を挙げることができる。
前記（Ｂ）領域はまた、刺激応答性を有することが好ましい。（Ｂ）領域が（Ａ）領域と同様に刺激応答性を有するものである場合、本発明の細胞培養基材の製造に際し（Ａ）領域と（Ｂ）領域で刺激応答性物質の被覆でパターニングを行う必要がなく、細胞培養基材の全面に均一に刺激応答性物質を被覆すればよいため、細胞培養基材の量産性を高めることができる。また、（Ｂ）領域に刺激応答性物質を被覆することによって、（Ｂ）領域の細胞接着性を低下させることができるため、均一な形状のコロニーを作製しやすく、均一なサイズ及び形状のスフェロイドを製造しやすいため好ましい。
（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積比としては、特に限定はないが、培養基材の単位面積当たりに製造可能なスフェロイドの量を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域の面積が基材全体の１０％以上であることが好ましく、３０％以上がさらに好ましく、５０％以上が特に好ましく、７０％以上が最も好ましい。また、複数の（Ａ）領域の間に十分な距離を設け、複数の（Ａ）領域のコロニーが融合して不均一な形状となることを抑制するのに好適であることから、（Ｂ）領域の面積が基材全体の２０％以上であることが好ましく、４０％以上がさらに好ましく、６０％以上が特に好ましく、８０％以上が最も好ましい。
本発明において、細胞培養基材の量産性を高めるのに好適であることから、刺激応答性が刺激応答性高分子を含む層によるものであることが好ましい。ここで、本発明において「基材」と表記した場合、本発明の物品におけるベース基材（例えば、図２の符号１で示される部分。）を示す。また、「細胞培養基材」と表記した場合、スフェロイド形成を行うための物品全体（例えば、図２の符号１０で示される部分。）を示す。
前記刺激応答性高分子の種類としては特に限定はないが、基材に被覆されたブロック共重合体、アジド基等の反応性基を介して基材に固定化された共重合体、モノマーを基材に塗布して基材上で電子線重合又はラジカル重合を行うことにより基材上に固定化された重合体等を好適に用いることができる。
前記刺激応答性高分子としては、弱い刺激でコロニーを剥離し、細胞にダメージを与えることなくスフェロイドを製造するのに好適であることから、温度応答性高分子が好ましい。また、細胞培養基材上で細胞を培養する際に、体温に近い温度で細胞を培養可能であることから、応答温度５０℃以下が好ましく、３５℃以下がさらに好ましく、また、培養中に培地交換等の作業を行う際に細胞が剥離してしまうことを抑制するのに好適であることから、２５℃以下が特に好ましく、１５℃以下が最も好ましい。さらに、細胞にダメージを与えない温度での冷却操作によってスフェロイドを形成することが可能であることから、応答温度０℃以上が好ましく、５℃以上がさらに好ましく、１０℃以上が特に好ましく、１５℃以上が最も好ましい。
前記温度応答性高分子の種類に特に限定はないが、単量体単位としては例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）− ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができ、応答温度を０〜５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、ブロック共重合体の応答温度を室温よりも低い温度とするのに好適であることから、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミドが好ましい。
また、温度応答性高分子は共重合体でもよく、例えば、前述の単量体単位から選択される少なくとも２種類以上の単量体単位からなる共重合体を挙げることができ、特に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドの共重合体は、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミドの含有量を５〜６０ｍｏｌ％の範囲で変化させることで、応答温度を５〜３０℃の範囲で制御することができ好ましい。さらに、前述の温度応答性セグメントを構成する単量体単位とその他の単量体単位との共重合体でも良く、例えば、親水性の単量体単位との共重合体とすることで応答温度を高温側へシフトさせることができ、疎水性の単量体単位との共重合体とすることで応答温度を低温側へシフトさせることができる。なお、共重合体の配列はランダム配列、交互配列、ブロック配列のいずれでもよい。
本発明において、温度応答性高分子に含まれる温度応答性の構成単位比率は、コロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、７０ｗｔ％以上が好ましく、８０ｗｔ％以上がさらに好ましく、９０ｗｔ％以上が特に好ましく、９２ｗｔ％以上が最も好ましい。
前記刺激応答性高分子としては、刺激応答性ブロックセグメント及び水不溶性ブロックセグメントを有するブロック共重合体、又は、刺激応答性ブロックセグメント及び反応性セグメントを有するブロック共重合体が好ましい。刺激応答性高分子が前記ブロック共重合体であることにより、細胞培養基材の量産性を高めるとともに、製造されるスフェロイドへの刺激応答性高分子の混入を抑制することができる。前記刺激応答性ブロックセグメントとしては特に限定はなく、前述の温度応答性の単量体単位からなる高分子を挙げることができる。また、ブロック共重合体が水不溶性ブロックセグメント又は反応性セグメントを含有することにより、培養液へのブロック共重合体の混入を抑制することができ、細胞を汚染することなく培養することができるために、スフェロイドへの刺激応答性高分子の混入を抑制することができ好ましい。ここで、本明細書において、ブロックセグメントが「水不溶性を有する」とは、該ブロックセグメントを構成する単量体単位のみからなるホモポリマーの少なくとも一部が水に不溶であることを示す。また、「反応性セグメント」とは、該ブロックセグメントが反応性基を有し、熱やｐＨ変化、光照射等の外部刺激によって基材に固定化可能であることを示す。
前記水不溶性ブロックセグメントを構成する単量体単位としては、例えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−デシルアクリレート、ｎ−デシルメタクリレート、ｎ−ドデシルアクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−テトラデシルアクリレート、ｎ−テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。また、ブロック共重合体を基材に強固に固定化するために好適であることから、反応性基を有するものが好ましく、例えば、４−アジドフェニルアクリレート、４−アジドフェニルメタクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。さらに、細胞増殖性を高めるのに好適であることから、芳香環を有する構造が好ましく、例えば、２−ヒドロキシフェニルアクリレート、２−ヒドロキシフェニルメタクリレート、３−ヒドロキシフェニルアクリレート、３−ヒドロキシフェニルメタクリレート、４−ヒドロキシフェニルアクリレート、４−ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、スチレン等を挙げることができる。
本発明において、前記反応性ブロックセグメントを構成する単量体単位としては、例えば、４−アジドフェニルアクリレート、４−アジドフェニルメタクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。
本発明において、水不溶性ブロックセグメント又は反応性ブロックセグメントはまた、ブロック共重合体の応答温度を制御する繰り返し単位を含んでいてもよい。ブロック共重合体の応答温度を制御する繰り返し単位としては、親水性又は疎水性の成分を挙げることができ、特に限定はないが例えば、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等のアミノ基を有するもの；Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン等のベタインを有するもの；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、２−エトキシエチルアクリレート、２−エトキシエチルメタクリレート、３−ブトキシエチルアクリレート、３−ブトキシエチルメタクリレート、３−ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等のポリエチレングリコール基、メトキシエチル基を有するもの；メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２−エトキシメチルアクリレート、２−エトキシメチルメタクリレート、３−ブトキシメチルアクリレート、３−ブトキシメチルメタクリレート、３−ブトキシメチルアクリルアミド等のアクリレート基を有するもの；２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するものを挙げることができる。
前記水不溶性ブロックセグメント又は反応性ブロックセグメントは共重合体でもよく、共重合体の配列はランダム配列、交互配列、ブロック配列のいずれでもよい。
前記水不溶性ブロックセグメント又は反応性ブロックセグメントの構成単位比率は、ブロック共重合体が培養液に混入し、細胞を汚染することを抑制するのに好適のため、また、継代培養において未分化維持率が高い観点から１ｗｔ％以上が好ましく、２ｗｔ％以上がさらに好ましく、５ｗｔ％以上が特に好ましく、１０ｗｔ％以上が最も好ましい。
本発明における刺激応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、刺激応答性高分子の強度を高めるのに好適のため、数平均分子量で１０００〜１００万であることが好ましく、２０００〜５０万であることがさらに好ましく、５０００〜３０万であることが特に好ましく、１万〜２０万であることが最も好ましい。
本発明において、刺激応答性高分子がスフェロイドへ混入することを抑制するのに好適であることから、刺激応答性高分子が含有する数平均分子量５０００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。また、数平均分子量１００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。さらに、数平均分子量３００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。ブロック共重合体に含まれる特定分子量以下の成分の含有量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定することができる。
本発明において、刺激応答性高分子がスフェロイドへ混入することを抑制するのに好適であることから、刺激応答性高分子の水への溶出量が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。刺激応答性高分子の水への溶出量は、刺激応答性高分子による層を形成した基材を２５℃において水へ１時間浸漬した前後における、刺激応答性高分子の重量減少割合を示す。ここで、刺激応答性高分子の重量減少の測定方法については特に制限はなく、一般的に用いられる方法により測定することができ、例えば、ＦＴ−ＩＲによる方法、平均膜厚の測定による方法等を用いることができる。
本発明における刺激応答性高分子は、必要に応じて連鎖移動剤や重合開始剤、重合禁止剤等を含んでいてもよい。連鎖移動剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、ジチオベンゾエート、トリチオカルボナート、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド、２−シアノプロパン−２−イル Ｎ−メチル−Ｎ−（ピリジン−４−イル）カルバモジチオアート、２−プロピオン酸メチルメチル（４−ピリジニル）カルバモジチオアートを挙げることができる。また、重合開始剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酸化水素、ペルオキソ二硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、トリエチルボラン、ジエチル亜鉛等を挙げることができる。さらに、重合禁止剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、ヒドロキノン、ｐ−メトキシフェノール、トリフェニルフェルダジル、２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシル、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシル等を挙げることができる。
本発明における刺激応答性高分子の合成方法としては、特に限定はないが、（株）エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いることができる。
本発明において、細胞増殖性を高めるのに好適であることから、刺激応答性高分子による層の層厚が、１０００ｎｍ以下を有することが好ましく、２００ｎｍ以下がさらに好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。また、コロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、刺激応答性高分子による層の層厚が、５ｎｍ以上を有することが好ましく、２０ｎｍ以上がさらに好ましく、３０ｎｍ以上が特に好ましく、３５ｎｍ以上が最も好ましい。ここで、本発明において刺激応答性高分子による層の「層厚」とは、基材と刺激応答性高分子による層の界面から、刺激応答性高分子による層の表面構造における山部分までの面外方向の長さを示す。刺激応答性高分子による層の層厚は、細胞培養基材を培養温度の水中に２４時間以上浸漬し、エアーを吹きつける等により急速に乾燥させた試料について、層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作成した細胞培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。
本発明において、細胞増殖性を高め、さらにコロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、刺激応答性高分子による層が、表面の平均粗さ／層厚の比が０．３以上であることが好ましい。刺激応答性高分子の表面の平均粗さ／層厚の比が０．３以上であることにより、細胞が強く接着する領域とそうでない領域を設けることができ、細胞増殖性を高めつつコロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うことができる。細胞増殖性を高め、さらにコロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、刺激応答性高分子による層の表面の平均粗さ／層厚の比が、０．５以上であることがさらに好ましく、０．７以上が特に好ましく、０．９以上が最も好ましい。ここで、本発明において刺激応答性高分子による層の表面の「平均粗さ」とは、ＪＩＳ Ｂ０６０１：２０１３に従って求めた輪郭曲線の平均高さを示し、細胞培養基材の代表的な表面の原子間力顕微鏡像を測定し、無作為に選んだ１０点の粗さ曲線において、１μｍを基準長さとして平均高さを求めることで算出することができ、前述の層厚の測定と同様に、細胞培養基材を培養温度の水中に２４時間以上浸漬し、エアーを吹きつける等により急速に乾燥させた試料について測定する。
本発明の一態様にかかる細胞培養基材において、前記（Ａ）領域が、下記（Ａ１）及び（Ａ２）の２つの領域からなり、前記（Ｂ）領域が、下記（Ｂ１）及び（Ｂ２）の２つの領域からなるものであることが好ましい。
（Ａ１）細胞増殖性領域
（Ａ２）刺激応答性領域
（Ｂ１）基材接着領域
（Ｂ２）刺激応答性領域
ここで、「基材接着領域」とは、細胞培養基材に被覆された成分が基材に接着している領域を示す。刺激応答性領域は細胞増殖性を低下させる効果を有することから、（Ａ）領域が（Ａ１）及び（Ａ２）の２つの領域からなることにより、細胞培養基材に接着させて増殖させることが難しい多能性幹細胞のスフェロイド形成及び刺激応答による細胞培養基材からの剥離を好適に行うことができる。また、（Ｂ）領域が（Ｂ１）を有することにより、細胞培養基材に被覆された成分を基材に強固に固定化するのに好適である。さらに、（Ｂ）領域が（Ｂ２）領域を有することにより、多能性幹細胞が（Ｂ）領域で増殖するのを抑制し、均一なスフェロイドを形成するのに好適である。（Ａ１）及び（Ａ２）、（Ｂ１）及び（Ｂ２）領域は、細胞培養基材表面の原子間力顕微鏡像又は透過型電子顕微鏡像を測定し、各領域に存在する主成分を判定することで確認可能である。例えば、細胞増殖性の単量体単位と刺激応答性の単量体単位からなる共重合体を被覆した場合、各領域に存在する単量体単位を、原子間力顕微鏡像における位相像や、透過型電子顕微鏡像におけるコントラストから判定可能である。
前記（Ａ１）及び（Ａ２）、（Ｂ１）及び（Ｂ２）領域は、親水性／疎水性の程度が大きく異なる単量体単位の組み合わせからなるブロック共重合体を被覆することで好適に形成可能である。ただし、（Ａ１）及び（Ａ２）、（Ｂ１）及び（Ｂ２）領域を形成できる共重合体の組成や被覆量は、ブロック共重合体の種類によって異なる。ブロック共重合体がブチルメタクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドのジブロック体の場合、一方の成分が９０％を超えるジブロック体が好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが９０％を超えることがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが９２％を超えることが特に好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが９４％を超えることが最も好ましい。また、膜厚１〜２００ｎｍで被覆すことが好ましく、膜厚５〜１００ｎｍがさらに好ましく、膜厚１０〜５０ｎｍが特に好ましく、膜厚１５〜３５ｎｍが最も好ましい。
本発明において、前記（Ａ）領域が、細胞増殖性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの温度応答性領域が分散してなるものであるか、又は、細胞増殖性を有しない温度応答性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの細胞増殖性の領域が分散してなるものであることが好ましい。（Ａ）領域が前記直径１０〜５００ｎｍの領域が分散したものであることにより、多能性幹細胞のスフェロイド形成及び刺激応答による細胞培養基材からの剥離を好適に行うことができる。
本発明において、スフェロイドの量産性を高め、さらに均一なスフェロイドを形成するのに好適であることから、前記（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることが好ましい。（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることで、（Ａ）領域のみに多くの細胞を集めることができ、均一なスフェロイドを大量に形成しやすい。
本発明において、スフェロイドの量産性を高め、さらに均一なスフェロイドを形成するのに好適であることから、（Ａ）領域と（Ｂ）領域のゼータ電位の差が５ｍＶ以上であることが好ましく、１０ｍＶ以上がさらに好ましく、２０ｍＶ以上が特に好ましく、４０ｍＶ以上が最も好ましい。
本発明において、スフェロイドの量産性を高めるのに好適であることから、前記（Ａ）領域の周囲に細胞が越えることができない隔壁が存在しないことが好ましい。（Ａ）領域の周囲に細胞が越えることができない隔壁が存在しないことで、細胞が自由に動きやすく、多くの細胞が（Ａ）領域に集まることができるため、スフェロイドの量産性を高めることができる。また、スフェロイドの量産性を高めるのに好適のため、高さが１μｍ以上の隔壁が存在しないことがさらに好ましく、高さ０．１μｍ以上の隔壁が存在しないことが特に好ましく、高さ０．０５μｍ以上の隔壁が存在しないことが最も好ましい。
本発明において、細胞培養基材は、必要に応じて生体由来物質を表面に含有していてもよい。前記生体由来物質としては特に限定はないが、例えば、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン等を挙げることができる。
これら生体由来物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質をベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。
本発明において、前記マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品としては例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
前記ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１又はラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いることができる。前記ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ラミニンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（（株）ニッピ製）を好適に用いることができる。
前記ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ビトロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ−Ｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
前記フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記フィブロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（株）製）を好適に用いることができる。
前記コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲンを用いることができる。前記コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記コラーゲンをベースとした合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やコラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を好適に用いることができる。
本発明において、生体由来物質の変性を抑制することができ、細胞増殖性を高めることができるため、生体由来物質は共有結合ではなく非共有結合により細胞培養基材上に固定化されていることが好ましい。ここで、本発明において「非共有結合」とは、静電相互作用、水不溶性相互作用、水素結合、π−π相互作用、双極子−双極子相互作用、ロンドン分散力、その他のファンデルワールス相互作用等、分子間力に由来する共有結合以外の結合力を示す。生体由来物質のブロック共重合体への固定化は、単一の結合力によるものであっても、複数の組み合わせであってもよい。
本発明において、生体由来物質の固定化方法は特に限定されるものではないが、例えば、細胞培養基材に生体由来物質の溶液を所定時間塗布することで固定化させる方法や、細胞を培養する際に培養液中に生体由来物質を添加することで生体由来物質を細胞培養基材に吸着させ固定化する方法を好適に用いることができる。
本発明において、基材の材質は特に限定されるものではないが、通常細胞培養に用いられるガラス、ポリスチレン等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、セラミックス、金属類などを用いることができる。培養操作の容易性から、基材の材質がガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレンの内少なくとも１種類を含むことが好ましく、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンの内少なくとも１種類を含むことがさらに好ましく、可撓性を高めるのに好適であることからポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンが特に好ましい。また、後述する親水化処理によるパターニングによって細胞増殖性を付与するのに好適であることから、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートが最も好ましい。
基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。また、必要に応じて基材上に仕切り板を設ける等により、各スフェロイドを区分するための構造を設けてもよい。
本発明において、コロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であり、さらに、大きなスフェロイドを製造する場合にも、コロニーの内部まで万遍なく栄養を行き渡らせることが可能であることから、基材が多孔質基材であり、多孔質基材の細孔径が細胞よりも小さなものであることが好ましい。また、コロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、前記細孔径が０．０１〜８μｍであることが好ましく、０．０１〜３μｍであることがさらに好ましく、０．０１〜１μｍであることが特に好ましく、０．１〜１μｍであることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「細孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
前記多孔質基材としてはまた、コロニーからスフェロイドを形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、空隙率が０．０１〜６０％であることが好ましく、０．０１〜２０％がさらに好ましく、０．０１〜４％が特に好ましく、０．０１〜１．５％が最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「空隙率」とは、多孔質基材の表面の一主面について、細孔部分の合計面積を基材面積で割った値で、面積割合で基材面にどの程度の空隙が存在するのかを示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域を観察することによって測定することができる。
本発明の細胞培養基材は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法に特に限定はないが、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、γ線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌等を用いることができる。ブロック共重合体の変性を抑制するのに好適であることから、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、エチレンオキシドガス滅菌が好ましく、基材の変形を抑制するために好適であることからＵＶ滅菌又はエチレンオキシドガス滅菌がさらに好ましく、量産性に優れることからエチレンオキシドガス滅菌が特に好ましい。
本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の株化細胞に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、間葉系幹細胞、骨髄細胞、Ｍｕｓｅ細胞のように種々の組織に存在する幹細胞、さらにはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞（多能性幹細胞）、それらから分化誘導した細胞等を用いることができる。本発明の培養基材における細胞の増殖性及び剥離性の観点から、幹細胞又は多能性幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞又は多能性幹細胞がさらに好ましく、多能性幹細胞が特に好ましく、ｉＰＳ細胞が最も好ましい。
本発明は、前記細胞培養基材の量産性に優れる製造方法にも関する。前記手法は、以下の（１）及び（２）工程を有することを特徴とする。
（１）細胞増殖性を有しない基材の表面に、細胞増殖性を有する、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域を形成する工程。
（２）基材の表面に、刺激応答性物質による層を形成する工程。
以下、本発明の細胞培養基材の製造方法における（１）〜（２）工程について詳細に述べる。
本発明の細胞培養基材の製造方法における（１）工程は、細胞増殖性を有しない基材を用い、細胞増殖性で面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域を前記基材の表面に形成する。細胞増殖性を有しない基材を用い、パターニングによって細胞増殖性の領域を形成することによって、任意の形状及びサイズの細胞増殖性の領域を効率的に作製することができる。細胞増殖性の領域を形成する方法としては、細胞培養基材の量産性を高めるのに好適であることから、プラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理等の親水化処理、又は、細胞増殖性を有する物質を基材に被覆する方法が好ましく、プラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理等の親水化処理によって基材の一部の領域に細胞増殖性を付与する方法がさらに好ましく、中でもプラズマ処理が特に好ましい。
前記パターニングの方法としては、特に限定はないが、メタルマスクやシリコンマスク、表面保護フィルム等で被覆した状態でプラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理等の親水化処理を行うことにより所望の形状に親水化処理を行う方法や、フォトリソグラフィー法やインクジェット法により所望の形状で細胞増殖性を有する物質を基材に被覆する方法を挙げることができる。細胞培養基材の量産性を高めるのに好適のため、レーザー加工で穴を形成した表面保護フィルムを基材に貼付した状態でプラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理等の親水化処理を行うことが好ましい。
また、前記（１）工程以外の方法でパターニングを行う方法としては、細胞増殖性を有する基材の表面に、細胞増殖性を有しない領域を形成する方法も利用可能である。この方法としては例えば、細胞増殖性を有する基材を用いるか、細胞増殖性を有しない基材の全面に細胞増殖性を付与した後、フォトリソグラフィー法やインクジェット法により所望の形状で細胞増殖性を有しない物質を基材に被覆する方法を挙げることができる。
本発明の細胞培養基材の製造方法における（２）工程は、基材の表面に刺激応答性物質による層を形成する。この際、基材の表面に刺激応答性物質による層を層厚１００ｎｍ以下で形成することによって、（１）工程の後に（２）工程を行う場合においても、パターニング工程で形成した細胞増殖性の表面に刺激応答性物質の分子鎖が疎な状態で被覆されやすく、パターニングの効果を維持しつつも刺激応答性を付与するのに好適である。また、層厚を１ｎｍ以上とすることで、十分な刺激応答性を付与し、スフェロイド形成工程を迅速に行うことが可能な細胞培養基材を製造することができ、好適である。
前記刺激応答性物質を被覆する方法としては、基材に刺激応答性物質を、化学的な結合によって被覆させ層を形成させる方法、物理的な相互作用によって被覆させ層を形成させる方法、を単独または併用して行うことができる。すなわち、化学的な結合による方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、刺激応答性高分子と基材が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。物理的な相互作用による方法としては、刺激応答性高分子との相溶性が良く、塗工性のよいマトリックスを媒体とし、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
前記刺激応答性物質を被覆する方法としてはまた、細胞培養基材の全面に刺激応答性物質を被覆することが好ましい。刺激応答性物質の被覆に際しパターニングを行うことなく、通常用いられる塗工方法を用いて刺激応答性物質を被覆することにより、細胞培養基材の量産性を高めることができる。また、細胞培養基材の全面に刺激応答性物質を被覆することによって、（Ａ）領域に刺激応答性を付与するとともに、（Ｂ）領域にも刺激応答性物質が被覆される。（Ｂ）領域に刺激応答性物質が被覆されることにより、（Ｂ）領域の細胞接着性を低下させることができる。このために、基材として細胞接着性を有するが細胞増殖性を有しない基材を用いた場合、前記パターニング工程のみでは（Ｂ）領域は細胞接着性を有するが、（Ｂ）領域にも刺激応答性物質を被覆することにより（Ｂ）領域を細胞接着性も有しない領域とすることができ、サイズや形状の均一なスフェロイドを形成しやすく好ましい。この時、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の被覆量の差が１μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、０．８μｇ／ｃｍ２以下がさらに好ましく、０．６μｇ／ｃｍ２以下が特に好ましく、０．４μｇ／ｃｍ２以下が最も好ましい。また、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の被覆量としては、０．１〜１０μｇ／ｃｍ２が好ましく、０．５〜７μｇ／ｃｍ２がさらに好ましく、１〜５μｇ／ｃｍ２が特に好ましく、２〜４μｇ／ｃｍ２が最も好ましい。
本発明の細胞培養基材の製造方法においては、（１）工程と（２）工程の順序はいずれが先であってもよい。表面の刺激応答性物質による層に傷が入る等の、（１）工程における影響を小さくするのに好適であることから、（１）工程を行った後に（２）工程を行うことが好ましい。
本発明は、前記細胞培養基材を用い、スフェロイドを製造する方法にも関する。前記手法は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）工程を経てスフェロイドを製造することを特徴とする。
（ｉ）前記細胞培養基材に細胞を播種する工程。
（ｉｉ）前記播種された細胞を培養し、前記細胞培養基材上に接着した細胞のコロニーを形成する工程。
（ｉｉｉ）外部刺激を与えることにより前記コロニーを細胞培養基材から剥離し、細胞のスフェロイドを形成する工程。
以下、本発明のスフェロイド製造方法における（ｉ）〜（ｉｉｉ）工程について詳細に述べる。
本発明のスフェロイドの製造方法における（ｉ）工程は、前記細胞培養基材を用い、前記細胞培養基材に細胞を播種する工程である。本発明において「細胞を播種する」とは、細胞が分散した培地（以下、「細胞懸濁液」と表記する。）を細胞培養基材上に塗布、又は、細胞培養基材に注入する等により、細胞懸濁液と細胞培養基材とを接触させることを示す。細胞増殖性の領域を有する細胞培養基材を用いることにより、後述する（ｉｉ）工程で細胞を培養することができる。細胞培養基材が細胞増殖性の領域を有していない場合、（ｉｉ）工程で細胞を培養することができない。また、前記細胞増殖性の領域がさらに刺激応答性の領域を有することにより、後述する（ｉｉｉ）工程において外部刺激によりコロニーを細胞培養基材から剥離し、スフェロイドを形成することができる。刺激応答性を有していない場合、（ｉｉｉ）工程において外部刺激によりスフェロイドを形成することができない。
前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）工程においては、細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件で、培養が実施される。未分化性を維持させるのに有効な条件としては、特に制限はないが、例えば、培養開始時の細胞の密度を下記播種の際の細胞密度として記載した好ましい範囲とすること、適切な液体培地の存在下で行うことなどが挙げられる。細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地としては、例えば、細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２−メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることができる。細胞の未分化性を維持するのに特に好適であることから、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地を用いることがさらに好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を用いることが最も好ましい。
前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ製）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２−Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等を挙げることができる。細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３（味の素（株）製）がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
前記（ｉ）工程において、細胞の播種方法に特に制限はないが、例えば、細胞培養基材に細胞懸濁液を注入することで行うことが出来る。播種の際の細胞密度は特に制限はないが、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、１．０×１０２〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、５．０×１０２〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．０×１０３〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が特に好ましく、１．２×１０３〜１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
前記（ｉ）工程で用いる培地としてはまた、細胞の生存を維持するのに好適であることから、前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地にさらにＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることが好ましい。特にヒトの細胞を用いる場合であって、ヒトの細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ−２７６３２）、１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ〜５０μＭであり、より好ましくは３μＭ〜２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ〜１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ〜１２μＭである。
前記（ｉ）工程を開始するとまもなく、細胞は細胞培養基材に接着し始める。
本発明のスフェロイドの製造方法における（ｉｉ）工程では、前記播種された細胞を培養する。細胞の増殖能や生理活性，機能維持に好適であることから、培養温度としては、好ましくは３０〜４２℃、さらに好ましくは３２〜４０℃、特に好ましくは３６〜３８℃、最も好ましくは３７℃である。
前記（ｉｉ）工程を開始して２２〜２６時間後に、最初の培地交換を行うことが好ましい。その４８〜７２時間後に２度目の培地交換を行い、その後、２４〜４８時間毎に培地交換を行うことが好ましい。この間、細胞は増殖し、コロニーと呼ばれる平たい細胞塊を形成する。コロニーは細胞培養基材に接着した状態である。コロニーの大きさが（Ａ）領域のサイズ程度になるまで培養を継続させ、その後（ｉｉｉ）工程に移行する。
本発明のスフェロイドの製造方法における（ｉｉｉ）工程では、細胞が培養された細胞培養基材に外部刺激を与え、前記コロニーの少なくとも一部分を細胞培養基材から剥離する。この際、コロニーの周囲から徐々に剥離することでコロニーが折りたたまれて丸い塊となり、形状の均一なスフェロイドが形成されやすい。ひとつのコロニーの全面を基材から剥離した場合、浮遊したスフェロイドを得ることができる。また、コロニーの外周部のみを基材から剥離し、コロニーの中心部は剥離しないことで、基材に接着したスフェロイドを形成することができる。外部刺激として冷却を用いる場合、細胞を短時間で剥離させ、冷却によるダメージを低減するために、冷却する際の温度として好ましくは０〜３０℃であり、より好ましくは３〜２５℃であり、さらに好ましくは５〜２０℃である。また、細胞へのダメージを低減するために、冷却時間としては１２０分以下が好ましく、６０分以下がさらに好ましく、３０分以下が特に好ましく、１５分以下が最も好ましい。
前記（ｉｉｉ）工程における細胞培養基材の冷却方法としては特に制限はないが、例えば、細胞培養基材を保冷庫に入れて冷却する方法、細胞培養基材をクールプレートの上に載せて冷却する方法、冷却した培地あるいは緩衝液に交換して所定時間静置する方法等を用いることができる。
また、前記（ｉｉｉ）工程においては、細胞を短時間で剥離させ、外部刺激によるダメージを低減するために、培養された細胞を含む液体に対流を生じさせる工程を含んでも良い。対流を生じさせる方法としては特に限定はないが、例えば、培養液をピペッティングさせることやポンプ、撹拌翼を用いる等の方法により、機械的に液体内部に強制対流を発生させる方法等を挙げることができる。
本発明のスフェロイドの製造方法で製造されるスフェロイドとしては、分化誘導等のスフェロイド形成後の培養において全ての細胞に均一な処理を施すために好適であることから、スフェロイドの粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）が２０％以下であることが好ましく、１５％以下がさらに好ましく、１０％以下が特に好ましく、５％以下が最も好ましい。
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ−ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカー製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製 ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製 ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロー２−イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．製）を用いた。
＜重合体の層厚＞
基材に被覆された重合体の層厚は、ＡＦＭ装置（（株）島津製作所製ＳＰＭ−９６００）によって測定した。カンチレバーはＢＬ−ＡＣ４０ＴＳ−Ｃ２を用い、表面にピンセットで傷を入れ、傷の深さを測定することで重合体の層厚を測定した。
［実施例１］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。
直径１０ｃｍの細胞増殖性を有しないディッシュ（アズワン製、材質：ポリスチレン）を直径０．３ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクで覆い、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ−２０）を用いてメタルマスクの上からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間１０秒間）を行うことで細胞増殖性の領域を形成するパターニングを行った。前記ブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．６ｗｔ％の溶液を調製し、パターニングを行った基材の表面にこの溶液を２０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
なお、ブロック共重合体の構成単位比率はｎ−ブチルメタクリレート４ｗｔ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド９６ｗｔ％、分子量はＭｎ７．７万であった。ポリスチレンディッシュ上へのブロック共重合体の被覆の層厚は２５ｎｍであった。
前記パターニング及びブロック共重合体で被覆した基材に培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００個／ｃｍ２、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度で加えた。３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞播種から２４時間後までは、培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、再度位相差顕微鏡で観察した。冷却に伴いコロニーが周囲から剥離していき、基材上でスフェロイドが形成される様子が観察された。さらに、基材側面を手で叩くことによりスフェロイドが基材から剥離し、サイズが均一で、球状のスフェロイドを回収することができた。
［実施例２］
実施例１におけるメタルマスクとして０．５ｍｍ×１ｍｍの長方形の穴を複数有するものを用い、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いた。サイズが均一で、形状が細長いロール状のスフェロイドを回収することができた。
［実施例３］
実施例１におけるメタルマスクとして直径０．５ｍｍの円形の穴を複数有するものを用い、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、再度３７℃で１時間培養した。冷却に伴いコロニーが周囲から剥離していきスフェロイドが形成され、基材上に接着したスフェロイドを得ることができた。
［実施例４］
実施例１におけるメタルマスクとして直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するものを用い、また、プラズマイオンボンバーダＰＩＢ−２０の代わりに、ウシオ電機（株）製の商品名ＶＵＶアライナーを使用し、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いた。サイズが均一で、球状のスフェロイドを回収することができた。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、６．６％であり、ばらつきの小さなものであった。
［実施例５］
実施例１におけるメタルマスクとして直径０．５ｍｍの円形の穴を複数有するものを用い、また、プラズマイオンボンバーダＰＩＢ−２０の代わりに、ウシオ電機（株）製の商品名ＶＵＶアライナーを使用し、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いて細胞を剥離した後、さらに１日培養を行った。サイズが均一で、球状のスフェロイドを回収することができた。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、１４．２％であり、ばらつきの小さなものであった。
［実施例６］
実施例１におけるメタルマスクの代わりに、表面保護フィルム（日東電工製Ｅ−ＭＡＳＫ）にレーザー加工により直径０．２ｍｍの円形の穴を複数形成したものを用い、基材にこの表面保護フィルムを貼り付けてプラズマ処理を行った後、表面保護フィルムを剥離した。その後、実施例１と同様にブロック共重合体の被覆を行い、細胞培養基材を作製した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いた。サイズが均一で、球状のスフェロイドを回収することができた。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、４．２％であり、ばらつきの小さなものであった。
［実施例７］
実施例１におけるメタルマスクとして直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するものを用い、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
作製した細胞培養基材の原子間力顕微鏡像を測定し、（Ａ）領域はＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーの多い直径約９０ｎｍの（Ａ２）領域と、その他の領域を有していた。また、（Ｂ）領域も同様にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーの多い直径約９０ｎｍの（Ｂ２）領域と、その他の領域を有していた。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いた。サイズが均一で、球状のスフェロイドを回収することができた。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、４．５％であり、ばらつきの小さなものであった。
［実施例８］
実施例１におけるメタルマスクとして直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するものを用い、また、下記方法でブロック共重合体の合成及び被覆を行った。
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．２６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
直径１０ｃｍの細胞増殖性を有しないディッシュ（アズワン製、材質：ポリスチレン）を直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクで覆い、プラズマ照射装置（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ−２０）を用いてメタルマスクの上からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間１０秒間）を行うことで細胞増殖性の領域を形成するパターニングを行った。前記ブロック共重合体をエタノールに溶解させ、１ｗｔ％の溶液を調製し、パターニングを行った基材の表面にこの溶液を２０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。１時間純水に浸漬した後、室温で２４時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
なお、ブロック共重合体の構成単位比率はｎ−ブチルメタクリレート５０ｗｔ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５０ｗｔ％、分子量はＭｎ０．６万であった。ポリスチレンディッシュ上へのブロック共重合体の被覆の層厚は５０ｎｍであった。
作製した細胞培養基材の原子間力顕微鏡像を測定し、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域内は均一であることを確認した。
実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においてもパターニングの形状に沿って細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、基材を室温で２０分間冷却し、基材側面を手で叩いたが細胞が剥離しなかったため、ピペッティングを２０回行うことで剥離した。サイズが均一で、形状が細長いロール状のスフェロイドを回収することができた。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、１４．６％であり、ばらつきは小さいものの、実施例７よりもばらつきが大きなものであった。
［比較例１］
実施例１においてプラズマ処理を行わず、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。細胞増殖性の領域が存在しないため、ｉＰＳ細胞は播種から２４時間後に死滅しており、スフェロイドは形成できなかった。
［比較例２］
実施例１においてブロック共重合体を被覆せず、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。刺激応答性の領域が存在しないため、コロニーは基材から剥離せず、スフェロイドは回収できなかった。また、コロニーの形状も不均一なものであった。
［比較例３］
実施例１においてパターニングを行わず、基材の全ての領域にプラズマ処理を行い、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。コロニーのサイズや形状が不均一であった。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、３６．５％であり、ばらつきの大きなものであった。
［比較例４］
実施例１におけるメタルマスクとして直径４ｍｍの円形の穴を多数有するものを用い、その他は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。コロニーのサイズや形状が不均一であった。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、３１．１％であり、ばらつきの大きなものであった。
［比較例５］
表面に凹凸形状が施され、さらに細胞非接着性の表面を有する市販のスフェロイド形成用細胞培養容器（ＡＧＣテクノグラス（株）製、商品名ＥＺＳＰＨＥＲＥ）を使用し、実施例１と同様にして細胞播種を行い、浮遊培養でスフェロイドを形成した。形成されたスフェロイドは概ね球状であったものの、複数のスフェロイドが凝集した凝集物が複数観察された。回収したスフェロイドの粒径を測定し、粒径のばらつき（粒径の標準偏差／平均粒径）を求めたところ、２２．３％であり、ばらつきの大きなものであった。
［参考例］
実施例１における（Ａ）領域及び（Ｂ）領域のゼータ電位を以下の方法で測定した。直径１０ｃｍの細胞増殖性を有しないディッシュの全面をプラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ−２０）を用いてプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間１０秒間）を行うことで、基材全面をプラズマ処理した。このプラズマ処理基材と、前記プラズマ処理を施していない基材それぞれに、実施例１と同様の方法でブロック共重合体を被覆することで、基材全面が実施例１の（Ａ）領域である試料と、基材全面が実施例１の（Ｂ）領域である試料をそれぞれ作製した。これらの基材のゼータ電位を測定し（（株）アントンパール製ＳｕｒＰＡＳＳを使用）、（Ｂ）領域のゼータ電位は（Ａ）領域よりも８ｍＶ大きな値であった。
Ａ （Ａ）領域
Ｂ （Ｂ）領域
１ 基材
２ 刺激応答性高分子
１０ 細胞培養基材
２０ 細胞
２１ コロニー
２２ スフェロイド

Claims (12)

  1. 基材と、前記基材上に被覆された刺激応答性高分子とを有する細胞培養基材であって、前記刺激応答性高分子は水不溶性ブロックセグメント及び刺激応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であり、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有することを特徴とする細胞培養基材。
    （Ａ）細胞増殖性及び刺激応答性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域。
    （Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
  2. 前記（Ａ）領域が、下記（Ａ１）及び（Ａ２）の２つの領域からなり、前記（Ｂ）領域が、下記（Ｂ１）及び（Ｂ２）の２つの領域からなるものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
    （Ａ１）細胞増殖性領域
    （Ａ２）刺激応答性領域
    （Ｂ１）基材接着領域
    （Ｂ２）刺激応答性領域
  3. 前記（Ａ）領域が、細胞増殖性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの温度応答性領域が分散してなるものであるか、又は、細胞増殖性を有しない温度応答性の領域中に直径１０〜５００ｎｍの細胞増殖性の領域が分散してなるものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
  4. 細胞増殖性の領域と、細胞増殖性を有しない領域の２つの領域を有する基材と、前記基材上に形成された刺激応答性高分子を含む層を有し、前記層の平均粗さ／層厚の比が０．５以上１以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養基材。
  5. 前記刺激応答性高分子が水不溶性ブロックセグメント及び９０ｗｔ％を超える刺激応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養基材。
  6. 前記（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。
  7. 多能性幹細胞のスフェロイド形成用であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養基材。
  8. 以下の（１）及び（２）工程を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養基材の製造方法。
    （１）細胞増殖性を有しない基材の表面に、細胞増殖性を有し、面積０．００１〜５ｍｍ２の島状の領域を形成する工程。
    （２）基材の表面に、刺激応答性物質による層を形成する工程。
  9. 前記（１）工程において、細胞増殖性を有しない基材の表面に、プラズマ処理、ＵＶ処理、コロナ処理のいずれか、またはこれらの複数の組み合わせによって、細胞増殖性を有する領域を形成することを特徴とする、請求項８に記載の細胞培養基材の製造方法。
  10. 前記（１）工程で用いる基材が細胞接着性を有するが細胞増殖性を有しないものであることを特徴とする、請求項８又は９に記載の細胞培養基材の製造方法。
  11. 前記（１）工程が、面積０．００１〜１０ｍｍ２の穴を有する表面保護フィルムを基材に貼付する工程を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載の細胞培養基材の製造方法。
  12. 以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）工程を経ることを特徴とするスフェロイドの製造方法。
    （ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養基材に細胞を播種する工程。
    （ｉｉ）前記播種された細胞を培養し、前記細胞培養基材上に接着した細胞のコロニーを形成する工程。
    （ｉｉｉ）外部刺激を与えることにより前記コロニーの少なくとも一部分を細胞培養基材から剥離し、細胞のスフェロイドを形成する工程。
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