JP5396803B2 - 細胞培養基材及び細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子材料、及び光照射によって細胞との接着性が変化する温度応答性高分子材料を含む足場材からなる細胞培養基材、及び該細胞培養基材を用いた細胞の培養・回収方法に関する。

細胞培養技術は、生体を対象とする様々な分野で用いられる基本技術であり、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの様々な目的で利用されている。特に生化学の分野では、医薬品の開発や診断などには欠くことのできない技術となっている。近年では、研究目的の細胞培養技術のみならず、生物学、医学、免疫学等の分野での利用を目的とした工業生産的培養方法も種々検討されており、医療分野においては、生体外で培養した細胞を人工臓器、人工歯骨、人工皮膚等の代替組織として利用する研究も行われている。

細胞の機能を維持したまま細胞を培養する場合、一種類の細胞のみを用いる培養系よりも、より生体に近い状態、つまり共存する異種の細胞を同時に培養する共培養の形態が望ましく、例えば肝細胞と血管内皮細胞を同一平面状で培養した場合、肝細胞単独で培養した場合と比較して細胞の寿命が延びることが知られている。従来知られている共培養の方法としては、複数の細胞の混合物を同一の細胞培養基材上に播種し培養する方法、または、共存する細胞を逐次播種して培養する方法が挙げられる。このように生体組織において共存する異種の細胞を共培養する場合、より生体に近い細胞の機能を発現させるために、細胞をパターニングした状態での培養が検討されているが、そのパターニング基材の作製が煩雑であり、また、パターニングされた細胞を回収する際、細胞種によっては剥離が困難な場合があった。従来、細胞培養はガラス基板上、あるいは高分子基材の表面上で行われており、一例として、ポリスチレンのディッシュ状の成形品表面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理等を施したものが既に市販されている。このような細胞培養基材上で共培養された細胞を基材表面から剥離、回収する場合、トリプシンのようなタンパク分解酵素で細胞外マトリクスタンパクを分解し、カルシウムイオンを、キレート剤を用いて除去することが必要であった。このような手段により細胞を回収した場合、処理工程が煩雑であったり、また培養された細胞が前記処理により変性したり、細胞の機能を維持したまま回収することが困難であった。これに対し、温度応答性の細胞培養基材を用いることで、培養時に細胞間、あるいは細胞と培養基材間に生成した細胞接着性タンパク質（フィブロネクチン）等の細胞外マトリックスを保持したまま、細胞をシート状、あるいは細胞塊状で剥離できるため、細胞の機能を損なわずに基材から分離、回収できる方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、培養する細胞をパターニングするためには、培養基材の表面に複数のポリマー領域をポリマー種毎に形成しなければならず、操作が煩雑であった。また、細胞をパターニングした形状で培養し、これを生きたまま転写して組織を形成する技術が提案されているが、細胞転写に時間がかかることや、操作が煩雑であるといった課題があった（例えば、特許文献２参照）。

また、これらの培養基材を用いて培養された細胞は、培養時における細胞への細胞成長因子の供給が不十分であり、得られる細胞の機能が十分に保持されていないといった問題があった。これに対し、培養時における脱分化を抑制し、より生体に近い機能を発現させるために細胞の成長因子を取り込む機能を有する、あるいは成長因子を保持した培養基材が提案されている（特許文献３〜５）。しかしながら、これらの培養基材を用いた場合は培養後に細胞機能を保持したまま剥離することができず、三次元化した大型組織の再生には適用できないといった問題があった。
国際公開第０１／６８７９９号パンフレット 特開２００５−３４２１１２号公報 特開平５−２５２９４１号公報 特開２００１−２３３７８６号公報 特開２００２−３１５５６７号公報

本発明の目的は、生体組織において共存する異種の細胞をパターニングした状態で共培養することの可能な、パターニングが容易であり、かつ、培養細胞の機能が充分に保持され、また培養後に細胞機能を保持したまま剥離することの可能な細胞培養基材を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、細胞を播種する前、及び／又は、後に光照射することにより細胞接着性を変化させることができる光応答性表面を有し、且つ温度によっても細胞接着性を制御できる足場材を細胞培養基材として用いることで、培養機材表面の親水性領域（細胞非接着性）と疎水性領域（細胞接着性）を簡便に任意の形状にパターニングでき、また、該基材表面で複数の細胞を共培養させた培養細胞を、その細胞機能を損傷することなく簡便に細胞を剥離、回収することが可能であることを見出した。また、従来、共培養できる培養基材においても培養した細胞機能の発現が不十分な場合があったが、培養基材が細胞成長因子を取り込む機能を有する高分子を含む構成とすることで、より生体に近い機能を保持したまま培養細胞を回収できることが判明した。

本発明は、以下の構成により達成される。
１．細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種と、光応答性基を有し、光照射によって照射部の細胞接着性が変化する温度応答性高分子の少なくとも一種を含む足場材からなることを特徴とする細胞培養基材。
２．前記光応答性基が、アゾベンゼン、スピロピラン、フルギド及びジアリールエテン構造を有するフォトクロミック基から選ばれる基であることを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。
３．前記１又は２に記載の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、前記細胞培養基材の所定領域に光照射し、光照射領域における細胞接着性を増強または低減させて細胞を選択的に播種、接着させ培養する工程、続いて細胞接着領域以外の領域に光照射して細胞接着性を増強させ他の細胞を選択的に播種、接着させ共培養する工程、及び基材表面に形成された細胞シートを剥離して回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。

本発明によれば、細胞成長に不可欠な成長因子を細胞に効率的に供給でき、且つ簡便な操作で共培養に必要なパターン化された培養表面を形成できる細胞培養基材を提供できる。

以下本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明の細胞培養基材は、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子と、光応答性表面を有し、温度によっても細胞接着性を制御できる温度応答性高分子を含む足場材から成ることを特徴としている。以下、本発明を更に詳しく説明する。

（細胞成長因子の取り込み能を有する高分子）
本発明の細胞成長因子の取り込み能を有する高分子は、細胞培養時に成長細胞から分泌される細胞成長因子を取り込んだ後、細胞成長の過程で徐放することで細胞の成長を促進する機能を有するものであって、予め細胞成長因子を含有させてから培養したり、該高分子表面に成長因子を化学結合させたりして用いることで、より細胞成長を促進することが可能となる。用いられる高分子としては、合成高分子として、ポリペプチド、合成多糖類、脂肪系ポリエステル（ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクチレンサクシネート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酢酸（ＰＭＬＧ）等が、天然高分子として、動物系ではゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサンなど、植物系ではデンプン、セルロース、酢酸セルロース等が、微生物産生高分子として、バイオポリエステル（Ｐ（３−ＨＢ／３−ＨＶ等））、バクテリアセルロース、微生物多糖類（プルラン、カードラン）等が挙げられるが、これらの中で特に、ゼラチン、コラーゲンを用いることが好ましく、これらの１種または２種以上を混合して用いても良い。また、前記細胞成長因子としては、細胞成長を促進し、細胞の活性を高めるものであれば特に限定されず、例えば血管新生作用をもつような細胞成長因子、具体的には塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血漿版由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、等が挙げられる。本発明において好ましく用いられる細胞成長因子としては、血管新生を促進し、細胞の活性を高めることができる塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これは生体内で不安定な物質でありかつ水溶液の状態で使用した場合には細胞の成長促進効果はほとんど認められないのに対し、本発明に係る成長因子の取り込む機能を有する培養基材を用いることで、より生体機能に近い細胞を培養することが可能となる。

（光応答性基を有する温度応答性高分子）
本発明で使用される温度応答性高分子は、光応答性基を有し、光照射によって照射部の細胞接着性が変化する高分子である。また、本発明で使用される温度応答性高分子は、好ましくは、少なくともアゾベンゼン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、及びジアリールエテン構造から選ばれる光応答性のフォトクロミック基を結合した単量体を含む単量体組成物を重合せしめた重合体を光応答性成分として含むものであり、且つ低温で親水性となり細胞接着性が低下する一方、高温では疎水性となり細胞接着性が増強する温度応答性を示すものである。

本発明の光応答性表面を発現する光応答性成分は、前記フォトクロミック基が光照射によって分子構造が変化し、その特性、特に分極率や溶媒親和性（親疎水性）が変化する性質を有しており、このような成分を含む高分子を培養基材として用いた場合、疎水性の状態では細胞が接着し易く、逆に親水性の状態では細胞が接着しにくい、あるいは剥がれやすい表面物性を示すものである。

例えば、アゾベンゼンは光によるシス−トランス異性により、またスピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、及びジアリールエテン等の構造は環形成／開裂の可逆的な反応によって構造が変化し、分極率や溶媒親和性（親疎水性）が変化し、細胞の接着性に差が生じることに本発明は基づいている。

また、温度により親水性と疎水性とが変化する温度を臨界温度といい、特に高温で疎水性、低温で親水性になる時の温度を下限臨界温度と定義される。細胞培養に使用される細胞は、多くは恒温動物由来であるため体温に近い３７℃前後で培養されることが多く、３７℃近辺では培養支持体表面は細胞が接着しやすい疎水性であることが好ましい。これに対し、培養した細胞を剥離する場合は、支持体の表面は細胞の接着性が低下する親水性であることが好ましく、このことから該温度応答性高分子の下限臨界温度は２０℃以上４０℃以下程度の温度範囲にあることが好ましい。このような光応答性を有する温度応答性高分子としては、例えばアゾベンゼン、スピロピラン、フルギド、及びジアリールエテンから選ばれた光応答性基が結合した重合性二重結合を有するモノマーと、重合させることによって温度応答性を示すモノマーと共重合させたものを使用することができる。重合させることで温度応答性を示すモノマーとしては、アクリルアミド系のモノマーが挙げられ、例えば、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体等を好ましく用いることができる。具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルピロリジン等が挙げられる。

これらの光応答性を有する温度応答性高分子は、単独で、または使用目的によっては、２種類以上を適宜組み合わせて使用することができる。前記光応答性を有する重合体の光応答性基を有するモノマーユニットは、光応答性基を有する重合体を構成する全モノマーユニット数に対し、０．１〜１００ｍｏｌ％、好ましくは１〜１０ｍｏｌ％であり、より好ましくは１〜３ｍｏｌ％程度である。

（培養基材の構成と作製方法）
本発明の培養基材は、足場材として少なくとも細胞成長因子の取り込み能を有する高分子と光応答性基を有する温度応答性高分子が含まれるもので、形態としてはこれらを混合した材料を支持体上に足場材層として形成された構成、或いは前記各々の高分子の薄膜を積層した構成等が挙げられる。これらの中で好ましい形態としては、各高分子層が積層された構成であって、より好ましくは支持体上に先ず細胞成長因子の取り込み能を有する高分子層（第一の高分子層）が形成され、その上に光応答性基を有する温度応答性高分子層（第二の高分子層）が積層された構成が挙げられる。

以下により好ましい形態の培養基材の作成方法を説明する。

用いられる培養支持体としては、通常細胞培養に用いられるガラス製、ポリスチレン製、ポリメチルメタクリレート製等の培養皿を用いればよいが、その素材や形状等は特に限定されるものではない。足場材層を形成するには、先ず、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子を含む水溶液を培養支持体上に塗布し、これを乾燥させて細胞成長因子取り込み能を有する第一の高分子層を形成した後、この上に光応答性基を有する温度応答性高分子を含む水溶液を塗布し、これを乾燥させて光照射によるパターニングが可能な第二の高分子層を形成すればよい。また、第二の高分子層を形成する場合は、光応答性基が結合した重合性二重結合を有するモノマーと、重合させることによって温度応答性を示すモノマーを混合した水溶液を予め形成した第一の高分子層に塗布した後、電子線照射する方法、あるいは前記高分子の混合水溶液に熱、または光重合開始剤を添加し、それぞれ加熱、または光照射する方法でモノマーを重合させることによって形成させてもよい。

また、形成される各高分子層の層厚は、用いる支持体の親疎水性が基材表面の親疎水性に影響されるため、支持体の材質（表面の親疎水性）に基づき調整すればよく、例えばポリスチレンを支持体とした場合は各高分子層の積層後のトータルの厚さが１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましく、より好ましくは２０ｎｍ〜５０ｎｍである。

（培養基材のパターニングと細胞の培養方法）
得られた培養基材に細胞を播種する場合は、培養基材を、所望のパターン、形状、サイズの領域に紫外光を照射して、照射部位の親疎水性を変化させ、細胞接着性の異なる領域をパターニングする。パターン化する場合は、所望のパターンを形成したマスクを用いて紫外光を照射する方法、あるいはＵＶレーザー等を用いてパターンを描画する方法等が挙げられる。

ここで、光応答性基としてスピロピラン基を有する光応答性成分を含有する温度応答性高分子を用いて表面層を形成した、培養基材表面のパターニングと細胞の播種方法について説明する。

先ず、必要に応じて細胞成長因子を添加した培地溶液を、培養基材上に塗布、含浸させた後、所望のパターン形状のマスクで基材表面を覆い、３６５ｎｍの紫外光を照射する。光照射部は、スピロピラン基の開環反応によりメロシアニン構造に変化することで親水性となり、細胞が付着しない（し難い）領域が形成される。

このパターン化された培養基材表面に、第一の細胞を播種し、３７℃にて所定時間培養する。次に、ピペッティングにより光照射部のみから細胞を脱着させた後、培養基材に５７０ｎｍの可視光を照射し、前記紫外線照射部のメロシアニン構造のスピロピラン基への閉環反応により基材表面を疎水性に変化させる。

この疎水性に変化した領域に第二の細胞を播種し、３７℃にて所定時間共培養させる。

得られた共培養細胞シートを回収する場合は基材を温度応答性高分子の相転移温度未満まで冷却すると基材が親水化するため、細胞機能を保持したまま容易に回収できる。

また、細胞の活性（機能発現）については、例えば、肝実質細胞については、ＥＬＩＳＡ法にてアルブミン産生能（培地中に分泌されたアルブミン量を測定する）を測定することで評価することができる。

このように、細胞を播種する前、及び／又は、後に光照射することにより細胞接着性を変化させることができる光応答性表面を有し、且つ温度により親水−疎水相転移が起こる表面層を有する細胞培養基材を用いることで、培養基材表面の親水性部領域（細胞非接着性）と疎水性領域（細胞接着性）を簡便に任意の形状にパターニングでき、細胞をパターニングした状態で複数の細胞を共培養させ、また、パターニングされた細胞を回収する際にも、細胞培養基材上で共培養された細胞をその細胞機能を損傷することなく基材表面から容易に剥離、回収することが可能となる。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

（製造例１）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（興人社製）４５質量部、及び光応答性の単量体としてＮ−［３−｛３′，３′−ジメチル−６−ニトロスピロ（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，２′−インドリン）−１−イル−プロピオニル｝−プロピル］−メタクリルアミド（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，５１，２６３９〜２６５１（１９９９）記載の製造方法に従って合成した）３質量部を、エタノール５００質量部に溶解し、これに蒸留水５００質量部を加え、窒素気流下７０℃で１０質量％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液５００質量部、およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１０質量部を加え、窒素気流下７０℃に保持したまま３０分間反応させた。得られた反応液を４℃の蒸留水３０００質量部で希釈し、該水溶液を４℃で限外濾過膜（バイオマックス１００、Ｐ２Ｂ１００Ｖ２０、ミリポア社製）を用いて溶液を容量１／２０まで濃縮した。濃縮液に蒸留水１０００質量部を加えて希釈、再度濃縮を行い、この希釈、濃縮操作を更に９回繰り返し、未反応物及び低分子量物を除去した。得られた最終濃縮液を凍結乾燥して、光応答性基を有する温度応答性高分子１を得た。

この温度応答性高分子の下限限界温度は３３℃であった。

尚、加減限界温度は、作製された温度応答性高分子を純水に溶解し（１０質量％）、その後２５℃から溶液の温度を上げてゆき、ポリマーが析出した温度を下限臨界温度とした。

（製造例２）
製造例１において、光応答性の単量体であるＮ−［３−｛３′，３′−ジメチル−６−ニトロスピロ（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，２′−インドリン）−１−イル−プロピオニル｝−プロピル］−メタクリルアミドを加えずに、他は同様の操作にて温度応答性高分子２を得た。

この温度応答性高分子の下限限界温度は３２℃であった。

（製造例３）
コラーゲン（ＳＣＰ−５１００、分子量５，０００、新田ゼラチン社製）３質量部を蒸留水１００質量部に溶解し、得られた水溶液を市販のポリスチレン製細胞培養皿（ファルコン３００２ペトリディッシュ、ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製）に加えて流延した後、乾燥させて細胞成長因子を有する高分子層（第一の高分子層）を形成した。次に、製造例１で得られた温度応答性高分子３質量部を蒸留水１００質量部に溶解し、得られた水溶液を第一の高分子層が形成された培養皿に流延した後、乾燥させて細胞成長因子を有する高分子層と光応答性基を有する温度応答性高分子層が積層された細胞培養基材１を得た。

（製造例４）
製造例３において、第二の高分子層を形成する温度応答性高分子として製造例１で得られた温度応答性高分子１を用いる替わりに、製造例２で得られた温度応答性高分子２を用いること以外は同様の操作にて細胞培養基材２を得た。

〈実施例１〉
製造例３で得られた細胞培養基材１に、細胞成長因子として２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン社製）を含浸させ、この培養皿表面に直径１ｍｍ、中心間距離が１．５ｍｍの孔を有するマスクで被覆した後、光照射装置（ＬＣ６、浜松ホトニクス社製）を用い、バンドパスフィルターを装着して主波長３６５ｎｍ、強度２０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外光を１分間照射して培養皿表面をパターン化した。次に、この表面にラット肝実質細胞を播種し、２日間培養した。培養後、ピペッティングにより紫外線照射された領域（親水性表面）の細胞を脱着させた。続いて温度を３７℃に維持したままで、この培養皿表面にバンドパスフィルターを装着した光照射装置で５７０ｎｍの可視光を１分間照射して細胞が脱着した親水性表面を疎水化した後、肝実質細胞が脱着した領域にラット血管内皮細胞を播種して３日間共培養した。この共培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に剥離・回収することができた。次に、この回収した肝実質細胞について、細胞活性を表すアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

〈実施例２〉
実施例１において、細胞成長因子を添加せずに同様の操作にてラット肝実質細胞と血管内皮細胞を共培養させた。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。次に、この回収した肝実質細胞について、細胞活性を表すアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

〈比較例１〉
実施例１において、細胞培養基材１を用いる替わりに細胞培養基材２を用い、細胞成長因子として２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン社製）を含浸させた。次に、３７℃にてこの表面にラット肝実質細胞を播種し、５日間培養した。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。次に、培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

〈比較例２〉
比較例１において、細胞成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加せずに、他は同様に操作にてラット肝実質細胞培養した。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。次に、培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

表１より、本発明の培養方法を用いて肝細胞の共培養を行えば、肝細胞単独での培養細胞と比較して長期に亘り細胞活性を維持でき、また、細胞成長因子を取り込むことで、細胞機能を保持できる培養方法であることが分かる。

また、細胞の共培養に効果的な培養基材表面のパターニングについては、従来は所望の親疎水性を有するポリマーをポリマー種毎に形成しなければならなかったが、本発明の培養基材では所望のパターンに合わせて光を照射するだけで容易にパターニングが行え、また、細胞成長因子を取り込む機能を有していることからより生体機能を保持した培養が可能であることから、本発明の培養基材を用いた細胞培養方法は極めて有用である。

Claims (3)

1. 細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種を含む層と、
   光応答性基を有し、光照射によって照射部の細胞接着性が変化する温度応答性高分子の少なくとも一種を含む層と、
   が積層されてなる構造を有する足場材からなることを特徴とする細胞培養基材。
2. 前記光応答性基が、アゾベンゼン、スピロピラン、フルギド及びジアリールエテン構造を有するフォトクロミック基から選ばれる基であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
3. 請求項１又は２に記載の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、前記細胞培養基材の所定領域に光照射し、光照射領域における細胞接着性を増強または低減させて細胞を選択的に播種、接着させ培養する工程、続いて細胞接着領域以外の領域に光照射して細胞接着性を増強させ他の細胞を選択的に播種、接着させ共培養する工程、及び基材表面に形成された細胞シートを剥離して回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。