JP2010094057A - 細胞培養基材 - Google Patents

Abstract

【課題】生体組織において共存する異種の細胞を共培養する場合において、より生体に近い細胞機能を発現させるために細胞をパターニングした状態での培養を行うための、細胞の機能が十分保持される共培養可能な細胞培養基材の提供。
【解決手段】細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種と、温度応答性高分子を２種以上含む細胞培養基材であって、前記温度応答性高分子が基材表面で異なる領域を形成していること特徴とする細胞培養基材。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子及び温度応答性高分子を含む足場材からなる細胞培養基材とその製造方法、及び該細胞培養基材を用いた細胞の培養・回収方法に関する。

細胞培養技術は、生体を対象とする様々な分野で用いられる基本技術であり、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの様々な目的で利用されている。特に生化学の分野では、医薬品の開発や診断などには欠くことのできない技術となっている。近年では、研究目的の細胞培養技術のみならず、生物学、医学、免疫学等の分野での利用を目的とした工業生産的培養方法も種々検討されており、医療分野においては、生体外で培養した細胞を人工臓器、人工歯骨、人工皮膚等の代替組織として利用する研究も行われている。

細胞の機能を維持したまま細胞を培養する場合、一種類の細胞のみを用いる培養系よりも、より生体に近い状態、つまり共存する異種の細胞を同時に培養する共培養の形態が望ましく、例えば肝細胞と血管内皮細胞を同一平面状で培養した場合、肝細胞単独で培養した場合と比較して細胞の寿命が延びることが知られている。

従来知られている共培養の方法としては、複数の細胞の混合物を同一の細胞培養基材上に播種し培養する方法、又は、共存する細胞を逐次播種して培養する方法が挙げられる。

このように生体組織において共存する異種の細胞を共培養する場合、より生体に近い細胞の機能を発現させるために、細胞をパターニングした状態での培養が検討されているが、そのパターニング基材の作製が煩雑であり、また、パターニングされた細胞を回収する際、細胞種によっては剥離が困難な場合があった。

従来、細胞培養はガラス基板上、或いは高分子基材の表面上で行われており、一例として、ポリスチレンのディッシュ状の成形品表面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理等を施したものは既に市販されているが、このような細胞培養基材上で共培養された細胞を基材表面から剥離、回収する場合、トリプシンのようなタンパク分解酵素で細胞外マトリクスタンパクを分解し、カルシウムイオンを、キレート剤を用いて除去することが必要であった。このような手段により細胞を回収した場合、処理工程が煩雑であったり、また培養された細胞が前記処理により変性し、細胞の機能を維持したまま回収することが困難であったりした。

これに対し、複数の温度応答性高分子をパターニングした細胞培養基材を用い、培養時に細胞間、或いは細胞と培養基材間に生成した細胞接着性タンパク質（フィブロネクチン）等の細胞外マトリックスを保持したまま、細胞をシート状、或いは細胞塊状で剥離し、細胞を基材から分離、回収する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、この培養基材を用いて培養された細胞は、培養時における細胞への細胞成長因子の供給が不十分であり、得られる細胞の機能が十分に保持されていないといった問題があった。これに対し、培養時における脱分化を抑制し、より生体に近い機能を発現させるために、細胞の成長過程で細胞が産生する成長因子を取り込み、徐放する機能を有する培養基材が提案されている（特許文献２〜４）。しかしながら、これらの培養基材を用いた場合は培養後に細胞機能を保持したまま剥離することができず、三次元化した大型組織の再生には適用できないといった問題があった。
国際公開第０１／６８７９９号パンフレット 特開平５−２５２９４１号公報 特開２００１−２３３７８６号公報 特開２００２−３１５５６７号公報

従来、生体組織において共存する異種の細胞を共培養する場合、より生体に近い細胞機能を発現させるために細胞をパターニングした状態での培養において、従来の共培養可能な培養基材を用いたとき、培養した細胞の機能が十分保持されていないといった問題があった。

本発明は、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種を含み、基材表面で２種以上の温度応答性高分子がパターニングされた細胞培養基材であることを特徴としている。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、培養基材が前記温度応答性高分子と細胞成長因子を取り込む機能を有する高分子とを含む構成とすることで、該基材表面で複数の細胞を共培養させた培養細胞を、その細胞機能を損傷することなくより生体に近い機能を保持したまま簡便に剥離、回収することが可能であることを見出した。

本発明は、以下の構成により達成される。

１．細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種と、温度応答性高分子を２種以上含む細胞培養基材であって、前記温度応答性高分子が基材表面で異なる領域を形成していることを特徴とする細胞培養基材。

２．前記温度応答性高分子の少なくとも一種がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと他のモノマー成分との共重合体から選ばれた温度応答性高分子であることを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。

３．前記１又は２に記載の細胞培養基材上で、２種以上の異なる細胞を共培養した後、得られた基材表面の細胞を剥離させることを特徴とする細胞培養方法。

４．前記１又は２に記載の細胞培養基材の製造方法であって、基材表面にインクジェット記録装置を用いて複数の温度応答性高分子の領域を形成することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。

本発明によれば、共培養に効果的なパターン化された培養表面と、細胞成長に不可欠な成長因子を細胞に効率的に供給できる機能を有することで、培養細胞をより生体に近い機能を保持したまま培養することが可能な細胞培養基材を提供できる。

以下本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明の細胞培養基材は、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子と、温度応答性高分子を２種以上含む細胞培養基材であって、前記温度応答性高分子が基材表面でパターニングされ異なる領域を形成している足場材から成ることを特徴としている。以下、本発明を更に詳しく説明する。

（細胞成長因子の取り込み能を有する高分子）
本発明の細胞成長因子の取り込み能を有する高分子は、細胞培養時に成長細胞から分泌される細胞成長因子を取り込んだ後、細胞成長の過程で徐放することで細胞の成長を促進する機能を有するものであって、予め細胞成長因子を含有させてから培養したり、該高分子表面に成長因子を化学結合して用いることで、より細胞成長を促進することが可能となる。用いられる高分子としては、合成高分子として、ポリペプチド、合成多糖類、脂肪系ポリエステル（ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクチレンサクシネート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酢酸（ＰＭＬＧ）等が、天然高分子として、動物系ではゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサンなど、植物系ではデンプン、セルロース、酢酸セルロース等が、微生物産生高分子として、バイオポリエステル（Ｐ（３−ＨＢ／３−ＨＶ））（Ｐｏｌｙ−（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｃｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｌｖａｌｅｒａｔｅ））等、バクテリアセルロース、微生物多糖類（プルラン、カードラン）等が挙げられる。これらの中で特に、ゼラチン、コラーゲンを用いることが好ましく、これらの一種又は二種以上を混合して用いても良い。

また、前記細胞成長因子としては、細胞成長を促進し、細胞の活性を高めるものであれば特に限定されず、例えば血管新生作用をもつような細胞成長因子、具体的には塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血漿板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、等が挙げられる。

本発明において好ましく用いられる細胞成長因子としては、血管新生を促進し、細胞の活性を高めることができる塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が挙げられる。これは生体内で不安定な物質でありかつ水溶液の状態で使用した場合には細胞の成長促進効果はほとんど認められないのに対し、本発明に係る成長因子の取り込み機能を有する培養基材を用いることで、より生体機能に近い細胞を培養することが可能となる。

（温度応答性高分子）
本発明で使用される温度応答性高分子は、低温で親水性となり細胞接着性が低下する一方、高温では疎水性となり細胞接着性が増強する温度応答性を示すものである。

本発明の温度応答性高分子は、温度によって溶媒親和性（親疎水性）が変化する性質を有しており、このような成分を含む高分子を培養基材として用いた場合、疎水性の状態では細胞が接着し易く、逆に親水性の状態では細胞が接着しにくい、或いは剥がれやすい表面物性を示すものである。

また、温度により親水性と疎水性とが変化する温度を臨界温度といい、特に高温で疎水性、低温で親水性になるときの温度は下限臨界温度と定義される。細胞培養に使用される細胞は、多くは恒温動物由来であるため、体温に近い３７℃前後で培養されることが多く、３７℃近辺では培養支持体表面は細胞が接着しやすい疎水性であることが好ましい。これに対し、培養した細胞を剥離する場合は、支持体の表面は、細胞の接着性が低下する親水性であることが好ましく、このことから該温度応答性高分子の下限臨界温度は２０℃以上４０℃以下程度の温度範囲にあることが好ましい。

このような温度応答性高分子としては、重合させることによって温度応答性を発現するモノマーの重合体を使用することができる。重合させることによって温度応答性を示すモノマーとしては、アクリルアミド系のモノマーが挙げられ、例えば、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体等を好ましく用いることができる。具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界温度；３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同３５℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）等が挙げられる。

これらモノマーは、単独で、又は使用目的によっては、２種類以上を適宜組み合わせて使用することができる。

（培養基材の構成と作製方法）
本発明の培養基材は、足場材として少なくとも細胞成長因子の取り込み能を有する高分子と、２種以上の、基材表面で異なる領域を形成しパターニングされた温度応答性高分子が含まれるものであって、形態としては、成長因子の取り込み能を有する高分子と温度応答性高分子の１種を混合した材料を２種以上調製し、これらを支持体上にパターニングした構成、或いは成長因子の取り込み能を有する高分子の薄膜と２種以上の温度応答性高分子が同一平面上にパターニングされた薄層を積層した構成等が挙げられる。

これらの中で好ましい形態としては、各高分子層が積層された構成であって、より好ましくは支持体上にまず細胞成長因子の取り込み能を有する高分子層（第一の高分子層）が形成され、その上に２種以上の温度応答性高分子が同一平面状にパターニングされた（第二の高分子層）が積層された構成が挙げられる。

以下により好ましい形態の培養基材の作成方法を説明する。

用いられる培養支持体としては、通常細胞培養に用いられるガラス製、ポリスチレン製、ポリメチルメタクリレート製等の培養皿を用いればよいが、その素材や形状等は特に限定されるものではない。足場材層を形成するには、先ず、細胞成長因子の取り込み能を有する高分子を含む水溶液を培養支持体上に塗布し、これを乾燥させて細胞成長因子取り込み能を有する第一の高分子層を形成した後、この上に２種以上の温度応答性高分子を含む溶液を塗布法、或いはインクジェット法等によりそれぞれ任意の形状で吐出し、これを乾燥させてパターニングされた第二の高分子層を形成すればよい。また、第二の高分子層を形成する場合は、２種以上の、重合させることによって温度応答性を示すモノマーの水溶液を、予め形成した第一の高分子層に、塗布法或いはインクジェット法にてそれぞれ任意の形状で吐出した後、電子線照射する方法、或いは前記高分子の混合水溶液に熱、又は光重合開始剤を添加し、それぞれ加熱、又は光照射する方法でモノマーを重合させることによって形成させてもよい。

パターニングされた温度応答性高分子層の形成について、一例として肝細胞と血管内皮細胞を共培養する場合について説明する。まず、再生すべき血管パターンを患者等の生体から抽出するが、具体的には、例えばレントゲンや顕微鏡観察等で得られた血管パターンの観察結果を画像データとしてパソコン等に取り込み、抽出した血管パターンの画像をデータ処理して血管パターンの原画を作製する。次に、この作製したデータに基づき、所望の温度応答性を示す高分子、或いはモノマーを含む溶液を用いてパターニングした高分子層を形成するが、この際、血管細胞といった３０μｍ幅程度のサイズの細胞を培養する場合は、前記高分子、或いはモノマー溶液を、インクジェット装置を用いて画像パターンに従って吐出し、複数の高分子領域を有する高分子層を形成することが好ましい。

温度応答性高分子のパターニングについては、共培養させる細胞の種類や形態、培養細胞の適用用途等に応じて適宜選択すればよく、その形状、大きさについては限定されるものではない。

また、形成される各高分子層の層厚は、用いる支持体の親疎水性が基材表面の親疎水性に影響される為、支持体の材質（表面の親疎水性）に基づき調整すればよく、例えばポリスチレンを支持体とした場合は各高分子層の積層後のトータルの厚さが１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましく、より好ましくは２０ｎｍ〜５０ｎｍである。

（細胞の培養方法）
ここでは、より好ましい足場材として、支持体上にまず細胞成長因子の取り込み能を有する高分子層（第一の高分子層）が形成され、その上に２種の異なる応答温度を有する温度応答性高分子Ａと温度応答性高分子Ｂが同一平面状にパターニングされた、高分子層（第二の高分子層）が積層された構成の培養基材を例にとり、細胞の培養方法について説明する。ここで、前記温度応答性高分子Ａ、及びＢの応答温度とは高分子層表面が疎水性から親水性に変化する温度であって、それぞれ応答温度Ａ、応答温度Ｂとした場合、３７℃＞Ａ＞Ｂなる応答温度序列である培養基材を用いる場合について説明する。

まず、必要に応じて細胞成長因子を添加した培地溶液を培養基材上に塗布、含浸させた後、パターン化された培養基材表面に、第一の細胞を播種し、３７℃にて所定時間培養する。次に、この培養基材の温度を前記応答温度Ａより低く、且つ前記応答温度Ｂよりも高い温度に調整して温度応答性高分子Ａがパターニングされた領域を親水性とし、この領域に存在する細胞をピペッティングにより脱着させた後、培養基材の温度を３７℃に戻して再度疎水性とする。この疎水性に変化した領域に第二の細胞を播種し、３７℃にて所定時間共培養させる。

得られた共培養細胞シートを回収する場合は培養基材を前記応答温度Ｂより低い温度まで冷却すればよく、冷却により培養基材の全面が親水化する為、細胞機能を保持したまま容易に回収できる。

また、細胞の活性（機能発現）については、例えば、肝実質細胞については、ＥＬＩＳＡ法にてアルブミン産生能（培地中に分泌されたアルブミン量を測定する）を測定することで評価することができる。

このように、培養基材表面に複数の応答温度の異なる温度応答性高分子がパターニングされていることで、温度により親水−疎水相転移が起こる領域を制御できるため、細胞をパターニングした状態で複数の細胞を共培養させることが可能であり、また、パターニングされた細胞を回収する際にも、細胞培養基材上で共培養された細胞をその細胞機能を損傷することなく基材表面から容易に剥離、回収することが可能となる。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

（製造例１）
コラーゲン（ＳＣＰ−５１００、分子量５，０００、新田ゼラチン社製）３質量部を蒸留水１００質量部に溶解し、得られた水溶液を市販のポリスチレン製細胞培養皿（ファルコン３００２ペトリディッシュ、ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製）に加えて流延した後、乾燥させて細胞成長因子を有する高分子層（第一の高分子層）を形成した。

次に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度；３２℃）の３５質量％イソプロピルアルコール溶液とＮ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度；２７℃）の３５質量％イソプロピルアルコール溶液を調製し、第一の高分子層の表面にインクジェット装置にてそれぞれのモノマー溶液を図１に示すような形状でパターン化して吐出した後、この基材表面に０．２５ＭＧｙの電子線を照射してモノマーを重合して、パターニングされた温度応答性高分子層（第二の高分子層）を形成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド溶液の吐出は、線幅３０μｍとなるように調製してパターニングを行った。

次に、この培養基材をイオン交換水を用いて洗浄した後、乾燥することにより図２に示した形態の細胞培養基材１を得た。なお、図２において５は培養皿（基板）、４は第一の高分子層であり、３が第二の高分子層を示す。

（製造例２）
製造例１において、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いる代わりにＮ−エトキシエチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度；３５℃）を用いる他は同様の操作にて、図２に示した形態の細胞培養基材２を得た。

（製造例３）
製造例１と同様の操作にて第一の高分子層を形成し、この上にＮ−イソプロピルアクリルアミドの３５質量％イソプロピルアルコール溶液を基材前面に塗布した後、この基材表面に０．２５ＭＧｙの電子線を照射してモノマーを重合して温度応答性高分子層（第二の高分子層）を形成した。

次に、この培養基材をイオン交換水を用いて洗浄した後、乾燥することにより細胞培養基材３を得た。

（実施例１）
製造例１で得られた細胞培養基材１をエチレンオキサイドガス滅菌した後、細胞成長因子として２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン社製）を含浸させた。次に、３７℃にてこの培養基材表面にラット肝実質細胞を播種し、２日間培養した。培養後、培養基材の温度を３０℃とした後にピペッティングによりポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）がパターニングされた領域（親水性表面）の細胞を脱着させた。続いて温度を３７℃に戻し、肝実質細胞が脱着した領域にラット血管内皮細胞を播種して３日間共培養した。この共培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。この回収した肝実質細胞について、細胞活性を表すアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

（実施例２）
実施例１において、細胞培養基材１を用いる代わりに細胞培養基材２を用いること以外は同様の操作にてラット肝実質細胞とラット血管内皮細胞を共培養した。この共培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。この回収した肝実質細胞について、細胞活性を表すアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

（実施例３）
実施例１において、細胞成長因子を添加せずに同様の操作にてラット肝実質細胞と血管内皮細胞を共培養させた。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却することで容易に回収することができた。この回収した肝実質細胞について、細胞活性を表すアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

（比較例１）
実施例１において、細胞培養基材１を用いる替わりに細胞培養基材３を用い、エチレンオキサイドガス滅菌した後、細胞成長因子として２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン社製）を含浸させた。次に、３７℃にてこの表面にラット肝実質細胞を播種し、５日間培養した。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却して回収した。培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

（比較例２）
比較例１において、細胞成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加せずに、他は同様に操作にてラット肝実質細胞培養した。得られた培養細胞は、培養皿を２５℃まで冷却して回収した。培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能について、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表１に示す。

表１より、本発明の培養方法を用いて肝細胞の共培養を行えば、肝細胞単独での培養細胞と比較して長期に亘り細胞活性を維持でき、また、細胞成長因子を取り込むことで、より生体機能を保持した細胞の培養が可能であることから、本発明の培養基材を用いた細胞培養方法は極めて有用である。

製造例１、２で形成されるパターニングされた温度応答性高分子層の斜視図である。 製造例１、２で製造される培養基材の斜視図である。

符号の説明

１ ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）領域
２ ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）領域
３ 第二の高分子層
４ 第一の高分子層
５ 培養皿（基板）

Claims (4)

1. 細胞成長因子の取り込み能を有する高分子の少なくとも一種と、温度応答性高分子を２種以上含む細胞培養基材であって、前記温度応答性高分子が基材表面で異なる領域を形成していることを特徴とする細胞培養基材。
2. 前記温度応答性高分子の少なくとも一種がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと他のモノマー成分との共重合体から選ばれた温度応答性高分子であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
3. 請求項１又は２に記載の細胞培養基材上で、２種以上の異なる細胞を共培養した後、得られた基材表面の細胞を剥離させることを特徴とする細胞培養方法。
4. 請求項１又は２に記載の細胞培養基材の製造方法であって、基材表面にインクジェット記録装置を用いて複数の温度応答性高分子の領域を形成することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。

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