JP6493629B2

JP6493629B2 - 細胞培養基材

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Publication number: JP6493629B2
Application number: JP2018535907A
Authority: JP
Inventors: 高田　哲生; 哲生高田; 直人櫻井; 綾子一色; 典子山東
Original assignee: DIC Corp
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-04-03
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: KR20190096968A; CN110114454A; EP3561042A4; WO2018116905A1; KR102464294B1; US11499136B2; EP3561042A1; US20200063094A1; JPWO2018116905A1

Description

本発明は、細胞培養用の基材に関する。

ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といったヒト多能性幹細胞は、病理解明や新薬開発並びに再生医療への応用可能性から注目されている。ヒト多能性幹細胞の利用には、安定かつ安全に培養し、さらには培養した細胞を回収したのちに、創薬や医療へ応用する必要がある。
従来より、ヒト多能性幹細胞はその低い培養率が課題となってきた。解決法のひとつとして、フィーダー細胞を利用した培養法が試みられてきたが、用いたフィーダー細胞がコンタミするという問題があることから、安全とはいえなかった。

それに対する解決策として、特許文献１では、細胞培養基材上に細胞外マトリクスであるラミニン及びラミニンフラグメントを塗布することで、フィーダー細胞レスであってもヒト多能性幹細胞が培養可能であることが報告されている。
一方、特許文献１では基材上での培養は可能なものの、培養細胞の回収については言及されておらず、培養細胞を利用すると言う点では課題が残されている。例えば上記方法で培養された細胞は、細胞外マトリクスとの接着が強いことから、酵素処理した後にセルスクレパー（ゴムまたは樹脂製ヘラ）等で物理的に細胞を掻き集める方法で細胞を回収しており、作業効率が低い上に物理的刺激を与えることから細胞の生存率に悪影響を及ぼすという課題があった。

一方、ラミニン等の細胞外マトリクスをヒト多能性幹細胞に利用するに当たっては、細胞外マトリクスが失活しやすいという課題がある。特に、基材表面が乾燥すると細胞外マトリクスが失活し、ヒト多能性幹細胞の培養効率が低下する。細胞培養基材の保存輸送等を考えると、乾燥状態でも培養効率を維持することが重要である。特許文献２では、ラミニン以外のタンパク質をコーティングすることで乾燥状態に耐えられる細胞培養基材が開示されているが、こちらについても培養は可能なものの、培養細胞の回収という課題は解決されていない。

ＷＯ２０１１／０４３４０５ＷＯ２０１４／１９９７５４

本発明の課題は、ヒト多能性幹細胞であっても高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を高い生存率を維持したまま剥離させ回収することが可能な細胞培養基材を提供することにある。また、さらには、細胞剥離可能かつ乾燥状態にも耐えうる細胞培養基材を提供することにある。

本発明者らは鋭意検討の結果、下限臨界溶解温度を有する重合体を含有する細胞培養基材であって、該基材が水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料を含有し、更に基材中に、接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする細胞培養基材が、上記課題を解決しうることを見出した。

また、細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントから選ばれる少なくとも一種である細胞培養基材を提供する。

また、接着性合成基質が、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］またはオリゴペプチド担持ポリマーである細胞培養基材を提供する。

前記下限臨界溶解温度を有する重合体が、
下記式（１）で表されるモノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、
前記またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）、の少なくとも一種であり、
細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体の含有率が５量％〜９９質量％である細胞培養基材を提供する。

（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ_３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）

（式中、Ｒ_４は水素原子またはメチル基、Ｒ_５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）

（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）

またさらには、前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト及び水膨潤性合成雲母から選択される、水媒体（Ｗ）中で１〜１０層に層状剥離する１種以上の粘土鉱物であり、前記シリカが水分散性のコロイダルシリカである細胞培養基材を提供する。

また、下限臨界溶解温度を有する重合体を含有する細胞培養基材上に、更にゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を有することを特徴とする細胞培養基材を提供する。

また、下限臨界溶解温度を有する重合体上に、
ゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含有する溶液を塗布する工程と、
さらに請求項１に記載の接着基質を含有する溶液を塗布し細胞培養基材とする工程と、
得られた細胞培養基材を乾燥する工程とを有する、乾燥細胞培養基材の製造方法を提供する。

本発明の細胞培養基材は、ヒト多能性幹細胞を高効率で培養可能な上、培養後の細胞を高い生存率のまま基材から剥離させ、回収することができる。
また、乾燥状態を経ても培養可能かつ細胞剥離可能な基材を開示する。

本発明は、下限臨界溶解温度を有する重合体を含有する細胞培養基材であって、該基材が水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料を含有し、更に基材上に、接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする、細胞培養基材を提供するものである。

［下限臨界溶解温度を有する重合体］
本発明における下限臨界溶解温度を有する重合体とは、ある一定温度以下になると水に溶解する重合体である。下限臨界溶解温度を有する重合体としては、下記１）及び２）が挙げられる。
１）ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体
２）疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体

１）は、ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーのみを重合させて得られる重合体である。ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーとしては、例えばＮ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンが例示される。これらのモノマーは、単独でも複数種を同時に利用してもかまわない。

１）であるホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体は、簡便に下限臨界溶解温度を有する重合体を製造することが可能である。しかしこれらのモノマーは、プラスチック表面との間に接着性が低く、水に触れると、塗布された重合体層が剥離しやすいと言う課題があるが、本願の細胞培養基材は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカといった無機材料を含有することから、重合体と無機材料の間でイオン結合や水素結合により三次元網目構造を形成し、耐水性に優れるため、細胞培養基材が剥離せずに使用することができる。

２）は、疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体である。疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体が下限臨界溶解温度を有するためには、
２−１）親水性モノマーが、前述したホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーである場合と、
２−２）下記式（１）で表されるモノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、前記またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）、が挙げられる。

（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）

疎水化モノマーとは、モノマー時は水溶性であるが重合すると水性溶媒に不溶化するモノマーである。このようなモノマーが共重合体に含有されている場合、耐水性に優れ支持体から剥がれにくい細胞培養基材とすることができる。
疎水化モノマーとしては、前記式（１）で表される化合物や、ジアセトンアクリルアアミド、（メタ）アクリル酸ポリプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレートが挙げられる。これらは単独でも複数種を同時に使用してもかまわない。中でも、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチル、アクリル酸３メトキシプロピルが好ましく、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチルが特に好ましい。

２−２）で開示される共重合体の場合、得られる共重合体の下限臨界溶解温度が、モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、細胞の種類に応じて、適宜モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できることから好ましい。例えば、モノマー（ａ）に対し、モノマー（ｂまたはｃ、またはｄ）の比率が増えるにつれ、得られる共重合体の下限臨界溶解温度が高温側へシフトする。この比率と下限臨界溶解温度がほぼ直線関係にある。細胞培養温度は通常３７℃であるため、得られる共重合体の下限臨界溶解温度は２０〜３２℃付近になるように調製することが好ましい。

〔無機材料〕
本発明の無機材料は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。

本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。

本発明の無機材料を配合することで、耐水性が向上し支持体への密着性が向上する。また、本発明の下限臨界溶解温度を有する重合体と無機材料は、主にイオン結合や水素結合などにより相互作用し結合している。この結合力は強く、容易に重合体と無機材料を引き離すことはできない。その相互作用のため、滅菌用の放射線（γ線、電子線）に晒されても重合体が架橋しにくいことから、耐放射線滅菌性を有する。

〔モノマー（ａ）の重合体（Ａ）〕
本発明の細胞培養基材は、更に前記モノマー（ａ）の重合体（Ａ）を含有してもよい。重合体（Ａ）を含有することで、細胞培養基材の耐水性が向上する。

〔製造方法〕
次いで、本発明の製造方法について説明する。
水媒体（Ｗ）中における本発明の無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（４）又は式（５）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ_ＭＣ）の分散液（Ｌ_ＭＣ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記重合体（Ｂ）を添加し、均一に混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式（４）Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（５）Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）

この製造方法に用いられるモノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）及び重合体（Ｂ）は、前記細胞培養基材の説明で述べたのと同じものを使用できるので、省略する。

本発明の製造方法に用いる水媒体（Ｗ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体分散液が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。

本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。

触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。

一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。

前記光重合開始剤は非水溶性のものである。ここで言う非水溶性とは、重合開始剤の水に対する溶解量が０．５質量％以下であることを意味する。非水溶性の重合開始剤を使用することにより、開始剤がより粘土鉱物の近傍に存在しやすく、粘土鉱物近傍からの開始反応点が多くなり、得られる重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の粒径分布が狭く、分散液（Ｌ）の安定性が高く、好ましい。

前記光重合開始剤を、水媒体（Ｗ）と相溶する溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記水媒体（Ｗ）中に添加することが好ましい。この方法によって光重合開始剤がより均一に分散でき、より粒径の揃った複合体（Ｘ）が得られる。

光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液中における光重合開始剤（Ｄ）と溶媒（Ｅ）の質量比（Ｄ）／（Ｅ）は、０．００１〜０．１であることが好ましく、０．０１〜０．０５が更に好ましい。０．００１以上であると、紫外線の照射によるラジカルの発生量が十分に得られるため好適に重合反応を進行させることができ、０．１以下であれば、開始剤による発色や、臭気を実質的に生じることがなく、またコストの低減が可能である。

本発明の溶媒（Ｅ）としては、光重合開始剤（Ｄ）と非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶解でき、且つ一定以上の水溶性を有する溶剤を用いることができる。ここで言う水溶性を有する溶剤とは、水１００ｇに対し５０ｇ以上溶解できる溶剤であることが好ましい。水への溶解性が５０ｇ以上であると、非水溶性の重合開始剤（Ｄ）の水媒体（Ｗ）への分散性が良く、得られる複合体（Ｘ）の粒径が揃いやすくなり、分散液（Ｌ）の安定性が高く好ましい。

例えば、水溶性溶剤としては、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの溶剤を混合して用いても良い

光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の添加量が、モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）、重合開始剤（Ｄ）及び溶媒（Ｅ）の総質量に対し、０．１質量％〜５質量％であることが好ましく、０．２質量％〜２質量％であることが更に好ましい。該分散量が０．１質量％以上であると、重合が十分に開始され、５質量％以下であると、複合体（Ｘ）中の重合開始剤の増加による臭気の発生、更には一旦分散された光重合開始剤が再び凝集する等の問題を低減でき、均一な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を得ることができるため好ましい。

無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（４）又は式（５）で表される範囲であることが本発明の細胞培養基材製造法の特徴である。無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）が上記範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。

本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、ペプチド類、多糖類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。

本製造方法の第１工程に用いられる重合用光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さから紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。

本製造方法の第２工程に用いられる塗布方法は、公知慣用の方法でよく、例えば、分散液を支持体に流延させる方法やバーコーターやスピンコーターによる塗布法、または噴霧などのスプレー法が挙げられ、また、パターン状に塗布する場合は、模様のあるゴム版に分散液をつけてから支持体に転写する方法、また支持体に塗布しない部分を予め遮蔽して塗布後遮蔽部分を取り除く方法、インクジェットプリンター方式による塗布方法が挙げられる。

乾燥方法も、分散液（Ｌ）中の揮発成分が揮発し、複合体（Ｘ）の薄層ができれば、任意の方法でよい。例えば、室温自然乾燥、室温の風や加熱または熱風による乾燥、遠赤外線乾燥などがあげられる。或いは分散液をスピンコーターで回転しながら熱風を当てたり加熱したりする方法も挙げられる。

本製造方法における重合体（Ｂ）は、その重量平均分子量Ｍｗが１×１０^４〜２×１０^７であることが好ましく、１×１０^５〜５×１０^６であることが更に好ましい。１×１０^４以上であれば、十分な細胞剥離性が維持でき、また、２×１０^７以下であれば、十分な細胞増殖性が維持でき、性能のよい細胞培養基材を製造できる。

本製造方法は、モノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）の比率を調整することにより、細胞の増殖速度を幅広く調整することができ、また、重合体（Ｂ）の種類や下限臨界溶解温度、及び含有量を調整することにより、温度変化による細胞の剥離速度を制御できるという特徴を有する。

本製造方法で得た細胞培養基材の表面は、重合体（Ｂ）が一層覆っているものではなく、複合体（Ｘ）の薄層の中から重合体（Ｂ）が伸び出て、該薄層の表面も適宜露出しているような構造になっている。重合体（Ｂ）は、複合体（Ｘ）の薄層中から表面までイオン結合や水素結合などにより粘土鉱物またはシリカに結合しており、物理的な力や水中でもその結合が切れることなく、安定な構造になっている。

また、本発明の第２の製造方法として、下記の方法が挙げられる。即ち、
水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が前記式（４）又は式（５）で表される範囲となるように、重合して下限臨界溶解温度を有する重合体になるモノマー｛例えば（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、（ａ）と（ｃ）の組み合わせ、（ａ）と（ｄ）の組み合わせ、またはホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマー（ｅ）｝と、前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、モノマーを重合させることにより、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ_ＮＣ）の分散液（Ｌ_ＮＣ）を製造する第１工程、前記分散液（Ｌ_ＮＣ）を支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
この第２の製造方法に用いられるモノマー（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と無機材料（Ｃ）及び重合体（Ｂ）は、前記細胞培養基材の説明で述べたのと同じものを使用できるので、省略する。また、分散液の重合方法や基材の製造方法は、第１の製造方法と同様であるので、省略する。
本第２の製造方法で得た細胞培養基材は、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と無機材料が層状に重なり、重合体（Ｂ）と無機材料の間でイオン結合や水素結合などにより結合しており、物理的な力や水中でもその結合が切れることなく、安定な構造になっている。また表面には、重合体（Ｂ）が厚く覆っており、水溶液中で、下限臨界溶解温度より高い温度から、下限臨界溶解温度より低い温度まで温度変化をした場合、重合体（Ｂ）の分子が大きく伸びる運動が起き、高い細胞剥離性が得られると思われる。

〔接着基質〕
本発明の細胞培養基材は、接着基質を基材中に有することで、ヒト多能性幹細胞の培養性が向上する接着基質としては、細胞外マトリクスと接着性合成基質が挙げられる。

細胞外マトリクスとしては、具体的には、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントが挙げられる。好ましくは、ラミニン及びビトロネクチン、及びそれらのフラグメントが挙げられる。細胞外マトリクスとしては動物由来であれば利用できるが、好ましくはヒト及びマウス由来の細胞外マトリクスである。更に好ましくは組換えタンパク質として製造されたものである。市販品として、マトリゲル（コーニング社製）、ゲルトレックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）、Ｌａｍｉｎｉｎ５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）等が利用可能である。

細胞外マトリクスと同時に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｋｉｎａｓｅ）阻害剤を使用しても良い。ＲＯＣＫ阻害剤を使用することで、単一細胞に分散したヒト多能性幹細胞の培養がさらに容易になる。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２（和光純薬工業）やＦａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成工業株式会社製）が挙げられる。

接着性合成基質としては、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］（以降ＰＭＥＤＳＡＨと略）またはオリゴペプチド担持ポリマーが挙げられる。オリゴペプチド担持ポリマーは、細胞接着活性を有するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有するオリゴペプチドをポリマーに共有結合させた基質である。市販品としてＳｙｎｔｈｅｍａｘ（コーニング社製）が挙げられる。

接着基質は、基材に対しどのような方法で供してもかまわない。例えば接着基質を基材中に混合してもよいし、塗布してもかまわない。また、細胞培養用の培地に接着剤基質を含有させ、培地と同時に基材と接触させる形で供しても良い。
当該接着基質は、基材中に均一に存在していても、不均一に存在していてもかまわない。好ましくは、基材表面に存在する場合である。塗布による接着剤基質の供給を行う場合、塗布方法としては接着基質の溶液を公知慣用の方法を用いて塗ればよく、スプレーコート、スピンコート、インクジェット等で塗布してもよいし、版を用いてスタンプしてもかまわない。溶液を基材上に注ぎ、一定期間静置したのちに溶液を除去する方法でもよく、使用方法に応じて適宜選択すればよい。

接着基質を細胞培養基材表面に塗布する場合、塗布量としては、細胞培養基材の面積あたり、０．０１〜５μｇ／ｃｍ^２が好ましく、０．２〜２μｇ／ｃｍ^２が更に好ましく、０．５〜１μｇ／ｃｍ^２が特に好ましい。

［その他の配合物］
本発明の細胞培養基材は、細胞外マトリクス、ゼラチンまたはコラーゲンのほかに、配合物を有していても良い。例えば防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、糖類、たんぱく質、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含んでもかまわない。

〔ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミン〕
更に接着基質の活性維持や細胞培養効率を上げるために、細胞培養基材上にゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンを存在させてもかまわない。ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンは、前記接着基質と同様、細胞培養基材中に混合してもよいし、塗布してもかまわない。塗布する場合は、ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンを先に塗布した後に接着基質を塗布するほうが、接着基質の活性維持や細胞培養効率においては好ましい。また、ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンは、１種でもよいし複数種を同時に用いてもかまわない。

ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンの塗布量としては、０．５〜５００μｇ／ｃｍ^２が好ましく、５〜２００μｇ／ｃｍ^２が更に好ましく、２０〜１００μｇ／ｃｍ^２が特に好ましい。

［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材の形状は、細胞培養でき、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、フィルム状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、太さ５ｎｍ〜５ｍｍの糸状または棒状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）、粒径が好ましくは１０〜２０００μｍ、より好ましくは１００〜５００μｍの球状のものなどが挙げられる。

本発明の細胞培養基材は、単体で用いてもよいが、支持体上に基材を形成した細胞培養器材として用いる事が好ましい。細胞培養器材とした場合、輸送や保管等の利便性に優れるほか、そのまま培養容器や培養用担体として用いることもできるからである。

本発明で用いられる支持体の材質は、培養基材が十分接着でき、且つ接着された培養基材上で細胞培養ができ、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリスチレンのようなスチレン系樹脂、ポリプロピレンのようなポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスルホン系樹脂、フッ素系樹脂、セルロースのような多糖類天然高分子、ガラスやセラミックスのような無機材料、ステンレス、チタンのような金属類材料が好適に用いられる。

支持体の形状には特に限定はなく、本発明の細胞培養基材の支持体となりうる形状であればよい。例えばフィルム状のもの、膜状のもの、板状のもの、球状のもの、多角形状のもの、棒状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、針・糸状のもの、繊維状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）等が挙げられる。これらを組み合わせた形状でも良いし、特定の形状を有さない不定形状の支持体であっても良い。

更に、本発明の細胞培養基材が、支持体と一体化して細胞培養器材として使用されるのは勿論のこと、支持体から剥がして単独に使用してもよい。

〔乾燥細胞培養基材〕
本発明の細胞培養基材は、乾燥状態を経てもヒト多能性幹細胞の培養が可能である。それゆえに、長期間保存や輸送に耐えうることから、産業上利用可能性が非常に高い。
乾燥方法としては特に限定は無く、後述する支持体上に細胞培養基材を積層したのち、乾燥させればよい。例えば室温乾燥（１８〜３０℃、湿度２０％〜６０％ＲＨ）、加熱乾燥（３０〜３７℃）、恒温乾燥機やデシケーターによる乾燥等が挙げられる。タンパクの変性を防ぐ観点から、室温乾燥が好ましい。
乾燥時の細胞培養基材の膜厚は、１０００ｎｍ以下であることが好ましく、５００nm以下であると更に好ましい。１０００ｎｍ以下であれば、細胞培養性が良好であるためである。

〔培養細胞〕
本発明の細胞培養基材は、様々な細胞、特に動物細胞を好適に培養することが可能である。動物細胞としては、由来は動物であればよく、ヒト、マウス、サル等が挙げられ、人工細胞であっても構わない。細胞種としては特に限定は無いが、上皮細胞（角膜上皮細胞など）、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞など）、線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、マウス線維芽細胞など）、血球細胞、収縮性細胞（骨格筋細胞、心筋細胞など）、血液と免疫細胞（赤血球、マクロファージなど）、神経細胞（ニューロン、グリア細胞など）、色素細胞（網膜色素細胞など）、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、神経幹細胞）等が挙げられる。中でも、本発明の細胞培養基材は、培養が難しい幹細胞、特にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に対し好適に利用可能である。

〔細胞の培養方法〕
培養方法としては、公知慣用の方法を用いればよく、例えば皿状容器の底面に形成させた培養基材に、所定量の培地や培養試薬を入れ、細胞を播種して、所定温度、ＣＯ_２濃度条件で培養してもよいし、糸状や球状に形成させた培養基材を、培地の入った市販ポリスチレン容器に入れ、細胞を播種して培養してもかまわない。後者の場合、細胞はポリスチレン容器に接着せず、糸状や球状培養基材の表面に接着して増殖する。例えば太さ５０μｍの糸状培養基材を用いた場合、細胞は糸の長さ方向に増殖するため、細胞形状を制御した形で培養することもできる。また、球状培養基材を用いた場合、通常の皿状容器に比べ、表面積が大きく、より多くの細胞を培養できる利点がある。

〔細胞の剥離方法（温調法）〕
培養された細胞を基材から剥がす方法としては特に限定されないが、例えば、培養終了後、所定温度（６℃〜３０℃）の培地で３７℃の培地を置換し、所定温度（６℃〜３０℃）で静置して、細胞の自然剥離を待っても良いし、培養容器を軽く揺らしたり、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング」操作で、穏やかな水流で細胞に物理的刺激を与えて、細胞を剥離しても良い。

〔細胞の剥離方法（酵素法）〕
細胞同士の結合を切り、単一細胞にしたい場合は、酵素処理による剥離法を使用してもよい。使用するタンパク分解酵素の種類は、細胞の種類により適宜選択すればよい。例えば、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。処理温度や時間は、細胞の種類や基材との接着強さにより適宜調整すればよい。例えば、培養終了後、培地を除去し、緩衝液等で細胞を洗浄して、酵素溶液を加え、３７℃一定時間静置した後、酵素溶液を除去し、所定温度（６℃〜３７℃）の緩衝液または培地を加え、静置または「ピペッティング」操作により細胞を剥離する方法が挙げられる。勿論、低温処理と酵素使用を合わせて細胞を剥離しても良い。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。

＜ＧＰＣ＞
ＧＰＣの測定方法は以下の通り。
装置：ＳｈｏｄｅｘＧＰＣＳｙｓｔｅｍ−２１（昭和電工株式会社製）
溶媒：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬＬｉＢｒ含有）
カラム：ＫＦ−７０５Ｌ２本連結
標準物質：ポリスチレンＳＴＡＮＤＡＲＤＳＨ−７５、ＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）

＜粘度＞
樹脂溶液の粘度は以下の装置で測定した。
ＤＩＧＩＴＡＬＶＩＳＣＯＭＡＴＥ粘度計（ＭＯＤＥＬＶＭ−１００Ａ、山一電機株式会社製）

＜下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定方法＞
以下条件で樹脂溶液の透過度を測定し、変曲点の温度を下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）とした。
装置：紫外可視分光光度計（Ｖ−５３０、日本分光株式会社製）
波長：６００ｎｍ（透過率）
温度範囲：２５℃−４０℃
昇温速度：１０℃／６０ｍｉｎ

（合成例１）（ＭＣ１１４）
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｅ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（ＤＥ）を調製した。

［重合体（Ｂ）水溶液の調製］
モノマーとしてＮ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）２．３ｇ、水１００ｇ、重合開始剤として２質量％の過硫酸カリウム水溶液２ｍＬ、触媒としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン８０μＬを混合した後、室温（２０〜２８℃）、１５時間静置して、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡ）水溶液（ＡｑＢ）を調製した。この溶液の粘度は１９．６ｍＰａ・ｓ、測定時の溶液温度は２５．７℃であった。
また、このＰＮＩＰＡの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０^６であった。

［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）０．３２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物ＬａｐｏｎｉｔｅＸＬＧ（ＲｏｃｋｗｏｏｄＡｄｄｉｔｉｖｅｓＬｔｄ．社製）０．０２ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、開始剤として溶液（ＤＥ）５０μＬを均一に混合して反応溶液（１）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製］
上記反応溶液（１）を、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９

［コート液の調製］
上記分散液（Ｌ１）全量に、前記ＰＮＩＰＡ水溶液（ＡｑＢ）を３．１２ｇ（固形分０．０７ｇ）入れ、均一に混合してコート液１（ＭＣ１１４）を得た。
細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体ＰＮＩＰＡの含有率は１７質量％である。

（合成例２）（ＭＣ４１４）
合成例１の無機材料（Ｃ）としての水膨潤性粘土鉱物ＬａｐｏｎｉｔｅＸＬＧ０．０２ｇ、を０．０８ｇに変更したこと以外は、合成例１と同様にしてコート液２（ＭＣ４１４）を調製した。

この反応系のＲａ＝０．２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＝０．７９（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３９
細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体ＰＮＩＰＡの含有率は１５質量％である。

（合成例３）（ＭＣ８１４）
合成例１の無機材料（Ｃ）としての水膨潤性粘土鉱物ＬａｐｏｎｉｔｅＸＬＧ０．０２ｇ、を０．１６ｇに変更したこと以外は、合成例１と同様にしてコート液３（ＭＣ８１４）を調製した。
この反応系のＲａ＝０．５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＝１．５７（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．６１
細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体ＰＮＩＰＡの含有率は１３質量％である。

（合成例４）（ＮＣ２１４）
［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマーとしてＮ―イソプロピルアクリルアミド０．２８ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物ＬａｐｏｎｉｔｅＸＬＧ０．０４ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、開始剤として溶液（ＤＥ）５０μＬを均一に混合して反応溶液（４）を調製した。

［コート液の調製］
上記反応溶液（４）を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約１０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ４）であるコート液４（ＮＣ２１４）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．１４、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）＝０．４０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．７９

細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体ＰＮＩＰＡの含有率は８８質量％である。

ＭＥＡ：アクリル酸２メトキシエチル
ＮＩＰＡ：Ｎ―イソプロピルアクリルアミド
Ｉｒｇ１８４：イルガキュアー１８４

（アルカリホスファターゼ染色（ＡＰ染色）例）
未分化ｉＰＳ細胞は高いアルカリホスファターゼ活性を示すため、濃く染色される。逆に、分化細胞はアルカリホスファターゼ活性を示さず染色されない。
試薬としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の「ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＫｉｔ」を使用した。操作手順としては、培養終了後、シャーレ中の培地を除いてＰＢＳ（緩衝液）を加え細胞を洗浄した後ＰＢＳを除く。次いで、固定液を加え約１分間製置してから固定液を除き水で洗浄した後、染色液を加え室温（２５℃）１時間静置する。染色液を除き、水で洗浄して、封入剤をいれカバーガラスで覆って顕微鏡で観察する。アルカリホスファターゼ活性を示す場合（陽性）、赤く染色される。

（細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定）
培養終了後、温調法または酵素法で細胞剥離操作を行い、剥離された細胞懸濁液を細胞計測専用カセットに吸入し、細胞計数装置ＮＣ−１００（株式会社エムエステクノシステムズ社製）を用いて細胞懸濁液中の死細胞数を計測する。また、剥離された細胞１００μＬを１．５ｍｌのチューブに移し、ＲｅａｇｅｎｔＡとＲｅａｇｅｎｔＢ（株式会社エムエステクノシステムズ社製）を１００μｌずつ加え、数回ピペッティングして均一に混同した後、同様に新たなカセットで液を吸入し、細胞計数装置ＮＣ−１００にセットし剥離した細胞数を計測する。更に、剥離操作後の剥離細胞を全て除去したシャーレにＲｅａｇｅｎｔＡを適量加え、室温（２５℃）にて１０分間静置してスクレーパー（ゴムヘラ）を用いてシャーレに残存した細胞を完全に剥離・溶解した後、ＲｅａｇｅｎｔＢを適量加え、数回ピペッティングして均一に混同して細胞計数装置ＮＣ−１００にセットしシャーレに残った未剥離の細胞数を計測する。細胞剥離率と生存率及び培養性はそれぞれ下記式（６）、（７）、（８）より算出する。
剥離率＝［剥離した細胞数／（剥離した細胞数＋未剥離の細胞数）］×１００
・・・（６）
生存率＝（１−剥離細胞中の死細胞数／剥離した細胞数）×１００
・・・（７）
培養性＝培養基材で得た細胞総数／ＴＣＰＳ（市販の組織培養用シャーレ）で得た細胞総数＊
・・・（８）
＊細胞総数＝剥離した細胞数＋未剥離の細胞数

（実施例１）
培養基材表面にコラーゲン、ラミニン、ＲＯＣＫ阻害剤を順次コートし乾燥した後ＲｅｐｒｏＦＦ２培地で評価した例である。
［培養基材の作製］
合成例１で調製したコート液１（ＭＣ１１４）を３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（TCPS、３５ｍｍ／ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）に適量を入れ、スピンコーターを用いてシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の恒温器中で２０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時乾燥して、細胞培養基材１（ＭＣ１１４）を得た。ＡＦＭ（原子間力顕微鏡、Bruker AXS製、NanoScope（Ｒ）ＩＩＩａ、測定モード：ＤＦＭ、サンプル測定2箇所の平均）を用いて塗膜の厚みを測定したところ、膜厚は約２０ｎｍであった。

［接着基質のコート］
細胞培養基材１（ＭＣ１１４）に、濃度１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン（商品名：ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ｃ、新田ゼラチン株式会社製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量５０μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、次いで、濃度１μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．０５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、更に、濃度１００μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（和光純薬工業株式会社製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．００５μｍｏｌ／ｃｍ^２相当）、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で乾燥させ、培養容器１を得た。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
培養容器１にＲｅｐｒｏＦＦ２培地（株式会社リプロセル製）を２ｍｌ添加し、更にヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社製）を一定量（約１×１０^４個／ｃｍ^２）入れ、５％ＣＯ_２雰囲気の３７℃恒温器内で静置し、５日間培養を行なった。培地は２日に１回の頻度で交換を行った。次いで、温調剥離法で細胞を剥離した。即ち４℃の冷媒地で培地交換をし、室温で１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング操作」を約１０回行い、細胞剥離を行った。次いで、前記「細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定」方法に従って、剥離した細胞数と剥離細胞中の死細胞数、及び全培養細胞数を計測し、式（６）、（７）、（８）より剥離率、生存率及び培養性を算出した。

（実施例２）
実施例１に比べ、無機材料量を増やした例である。
［培養基材の作製］
合成例１のコート液１（ＭＣ１１４）の代わりに、合成例２のコート液２（ＭＣ４１４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にした細胞培養基材２（ＭＣ４１４）をシャーレ上に形成し、培養容器２を作製した。ＡＦＭを用いて塗膜の厚みを測定したところ、膜厚は約２０ｎｍであった。
更に、実施例１と同様に接着基質のコートおよびｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行った。

（実施例３）
実施例１に比べ、無機材料量を増やした例である。
［培養基材の作製］
合成例１のコート液１（ＭＣ１１４）の代わりに、合成例３のコート液３（ＭＣ８１４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にした細胞培養基材３（ＭＣ８１４）を作製した。ＡＦＭを用いて塗膜の厚みを測定したところ、膜厚は約２０ｎｍであった。
更に、実施例１と同様に接着基質のコートおよびｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行った。

（実施例４）
培養基材３の表面にコラーゲン、ラミニンを順次コートし乾燥した後ＲｅｐｒｏＦＦ２培地で評価した例である。
［培養基材の作製］
実施例３と同じ細胞培養基材３（ＭＣ８１４）を使用した。

［接着基質のコート］
実施例１と同様にして、培養基材３の表面にコラーゲン、ラミニンを順次コートし、ＲＯＣＫ阻害剤はコートせずに乾燥を行った。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
最初に使用されるＲｅｐｒｏＦＦ２培地の代わりに、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（添加量：０．５μｇ／ｍＬ培地）を加えた培地を用いることと、１回目の培地交換の時に、培地の代わりに、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（添加量：０．５μｇ／ｍＬ培地）を加えたＲｅｐｒｏＦＦ２培地を用いること以外は、実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞の剥離率、生存率及び培養性を評価した。

（実施例５）
培養基材３の表面にラミニンのみをコートし乾燥した後、ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地で評価した例である。
［培養基材の作製］
実施例３と同じ細胞培養基材３（ＭＣ８１４）を使用した。

［接着基質のコート］
実施例１において、コラーゲンとＲＯＣＫ阻害剤を使用しないこと、及び濃度１μｇ／ｍＬのラミニン水溶液の代わりに、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン水溶液を使用すること以外は、実施例１と同様にして、培養基材３の表面にラミニンをコートし、乾燥を行った。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
実施例１のＲｅｐｒｏＦＦ２培地の代わりに、ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地を用いることと、細胞播種時は培地の代わりに、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（添加量：０．５μｇ／ｍＬ培地）を加えたＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地を用いること以外は、実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞の剥離率、生存率及び培養性を評価した。

（実施例６）
培養基材４の表面にラミニンのみをコートし乾燥した後、ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地で評価した例である。
［培養基材の作製］
合成例１のコート液１（ＭＣ１１４）の代わりに、合成例４のコート液４（ＮＣ２１４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にした細胞培養基材４（ＮＣ２１４）を作製した。ＡＦＭを用いて塗膜の厚みを測定したところ、膜厚は約３０ｎｍであった。
更に、実施例５と同様に接着基質のコートおよびｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行った。

（実施例７）
培養基材４の表面にラミニンとゼラチン混合液をコートし乾燥した後、ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地で評価した例である。

［接着基質のコート］
細胞培養基材４（ＮＣ２１４）に、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）と濃度１０μｇ／ｍＬのラミニンを含んだ水溶液を５００μＬ入れ（ゼラチンコート量１０μｇ／ｃｍ^２相当、ラミニンコート量０．５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で乾燥させた。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
実施例５と同様にｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行った。
結果を表３に示した。
また、ラミニンをコートし、室温２５℃で乾燥させた培養基材４を、更に室温（２５℃、４０％ＲＨ）で１日、３０日間静置して、同様な培養評価試験を行った。

（実施例８）
培養基材４の表面にラミニンをコートし、乾燥せずに培養に供した例である。
［培養基材の作製］
実施例６と同じ細胞培養基材４（ＮＣ２１４）を使用した。

［接着基質のコート］
細胞培養基材４（ＮＣ２１４）に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、乾燥させずにすぐ細胞培養に供した。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
実施例５と同様にｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行った。

（比較例１）
市販の組織培養用シャーレ（ＴＣＰＳ）の表面にラミニンをコートし、乾燥せずに培養に供したこと、及び培地にＲＯＣＫ阻害剤を加えた例である。
［接着基質のコート］
３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＡＧＣテクノグラス（株）製）に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、すぐ細胞培養に供した。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
細胞播種時、実施例１のＲｅｐｒｏＦＦ２培地の代わりに、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（添加量：０．５μｇ／ｍＬ培地）を加えた培地を用いること以外は実施例１と同様にしてｉＰＳ細胞の剥離率、生存率及び培養性を評価した。

（比較例２）
市販の組織培養用シャーレ（ＴＣＰＳ）の表面にラミニンをコートし、乾燥せずに培養に供したこと、及び培地にＲＯＣＫ阻害剤を加えない例である。
［接着基質のコート］
３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＡＧＣテクノグラス（株）製）に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、すぐ細胞培養に供した。

［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞の剥離率、生存率及び培養性を評価した。

（比較例３）
市販の組織培養用シャーレ（ＴＣＰＳ）の表面にラミニンのみをコートし乾燥した後ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ培地で評価した例である。
［接着基質のコート］
３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＡＧＣテクノグラス（株）製）に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ^２相当）、３７℃、１時間静置して該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で乾燥させた。

実施例及び比較例について、結果を表２〜４に示した。

ｗｅｔ：ラミニンをコートして乾燥せずすぐ細胞培養に供した。
ｄｒｙ：ラミニンをコートして室温（２５℃、４０％ＲＨ）で乾燥した後、細胞培養に供した。

（実施例９〜１２、比較例４）
＜保存安定性試験＞
上記で作成した培養容器３、５〜７、比較培養容器３について、25℃４０％ＲＨで1日保存した容器と、25℃４０％ＲＨで30日保管した容器について、実施例１と同様にｉＰＳ細胞の剥離率、生存率及び培養性を評価し、結果を表5に記した。

上記実施例および比較例から、本発明の細胞培養基材を用いた培養容器は、高い培養性と剥離性および剥離後生存率を両立できることが確認できた。
更には、本発明の培養基材は、濡れた状態でも乾燥状態でも好適に使用が可能であり、更にはコラーゲンやゼラチン等の細胞外マトリクスを併用しなくとも、乾燥状態での高い保存安定性を示した。

（実施例１３）
実施例６の細胞培養基材４を用いて、下記のｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行なった。
即ち、培養容器４に、濃度０．５ｕｇ／ｕｌのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を４．８ｕｌ、濃度３．４ｕｇ／ｕｌのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を１．５ｕｌ、及び１．３ｘ１０^４個のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社製）を加えた培地（ＳｔｅｍＦｉｔＡｋ０２Ｎ、味の素株式会社製）１．５ｍｌを入れ、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃恒温器内で静置し、８日間培養を行なった。培養開始日の３日目より連続５日間毎日培地交換を行なった。
次いで、４℃の冷媒地で培地交換をし、室温で１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング操作」を約１０回行い、細胞剥離を行った。前記「細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定」方法に従って求めた細胞培養性は１，０（ＴＣＰＳ同等）、細胞剥離率は８５％、回収細胞の生存率は７０％であった。

（比較例５）
３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（３５ｍｍ／ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ、ＩＷＡＫＩ製）を用いること以外は、実施例１３と同様にして、ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行なった。その結果、細胞培養性は１．０、細胞剥離率は５％、回収細胞の生存率は２０％であった。

本発明の細胞培養基材は、ヒト多能性幹細胞であっても高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を高い生存率を維持したまま剥離させ回収することが可能であることから、例えば再生医療向け細胞培養基材といった用途に好適に用いられる。

Claims

下限臨界溶解温度を有する重合体を含有する幹細胞用の細胞培養基材であって、
該基材の平均膜厚が１０００ｎｍ以下であって、
該基材が水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料を含有し、更に基材中に、接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であって、
該細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、細胞培養基材。
接着性合成基質が、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］またはオリゴペプチド担持ポリマーである、請求項１に記載の細胞培養基材。
下限臨界溶解温度を有する重合体が、ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体であって、ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーが、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンから選ばれる少なくとも一種である、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
前記下限臨界溶解温度を有する重合体が、
下記式（１）で表されるモノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、
前記またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）、の少なくとも一種であり、
細胞培養基材全体に対する、下限臨界溶解温度を有する重合体の含有率が５量％〜９９質量％である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養基材。

（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ_３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）

（式中、Ｒ_４は水素原子またはメチル基、Ｒ_５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）

（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）
前記親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ−ビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマーである、請求項４に記載の細胞培養基材。
さらに、前記モノマー（ａ）の重合体（Ａ）を含有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養基材。
水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト及び水膨潤性合成雲母から選択される、水媒体（Ｗ）中で１〜１０層に層状剥離する１種以上の粘土鉱物であり、前記シリカが水分散性のコロイダルシリカである、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養基材。
下限臨界溶解温度を有する重合体を含有する細胞培養基材上に、更にゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を有することを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養基材。
下限臨界溶解温度を有する重合体、ゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質、接着基質の順に積層されることを特徴とする、請求項９に記載の細胞培養基材。
乾燥細胞培養基材である、請求項１から９のいずれかに記載の細胞培養基材。
支持体上に積層されたことを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の細胞培養基材。
支持体と請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞培養基材とを有する細胞培養器材。