JP5862061B2

JP5862061B2 - 胚性幹細胞の培養方法

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Publication number: JP5862061B2
Application number: JP2011130099A
Authority: JP
Inventors: 高田　哲生; 哲生高田; 原口　和敏; 和敏原口; 典子山東; 正法永淵
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Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2016-02-16
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Also published as: JP2012254054A

Description

本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｂ）とを含有する細胞培養基材の上で、フィーダー細胞を使用せずに、胚性幹細胞(以下ES細胞と略す) を、その全分化能を維持したまま培養する方法、及びそれによって得られる培養胚性幹細胞に関する。

再生医療の細胞供給源として最も期待されているのはES細胞のような「万能細胞」である。ES細胞はどんな組織にも分化する可能性を秘めており、これらを使い、組織の再生や、これまで治療法のなかった病気の治療が可能になってくる。
ES細胞は、増殖が速く、またプラスチックなどの生体親和性の低い物質に触れると分化しやすい特徴を有しており、再生医療分野では、ES細胞の全分化能を維持したまま増殖させることが最も重要なポイントになる。

通常、ES細胞の培養は、増殖に必要なタンパク質を分泌し、更にES細胞の足場となる線維芽細胞層（フィーダー細胞）の上で行われている。フィーダー細胞から放出されるなんらかの因子がその未分化性や増殖能に寄与していると考えられている。フィーダー細胞としては、通常マウス１４〜１５日胚の線維芽細胞初代培養細胞や線維芽細胞由来細胞株であるSTO細胞等が用いられている。
しかし、細胞移植療法を用いる再生医療の分野においては、異種動物や非自己由来の細胞や血清、タンパク質などの使用は、人体に対し、予期せぬ悪影響をもたらす可能性が考えられる。これらの不特定因子によってもたらされるリスクを排除するために、フィーダー細胞を使用しないES細胞の培養方法が求められている。

近年、ポリスチレンやポリ乳酸などの非水溶性ポリマーからなる平均孔径１μｍの孔を有するハニカム状多孔質体で、間葉系幹細胞を未分化の状態で成長因子を添加せずに培養できる培養基材が開示されている（例えば特許文献１参照）。
しかし、この培養基材は、フィーダー細胞を必要としない間葉系幹細胞の培養には有効であるが、ES細胞の培養に関する有効性は開示されていない。

一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）を含むモノマーの重合体（Ｐ）と、水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）とが三次元網目を形成してなる有機無機複合体粒子（Ｘ）の分散液を乾燥してなる有機無機複合体（Ｘ）の乾燥皮膜を表面に有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献２参照）。
しかし、上記従来文献においては、ES細胞の培養方法に関する具体的手段は開示されていない。

特開２０１０−６３３７２公報特許第４４３０１２４

本発明が解決しようとする課題は、フィーダー細胞及び成長因子を使用せずに、ES細胞を、未分化状態を保持したまま培養する方法、及び培養ES細胞を提供することにある。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｂ）とを含有する細胞培養基材の上で、フィーダー細胞及び成長因子を使用せずに、ES細胞を、未分化状態を保持したまま増殖させることができる、ＥＳ細胞の培養方法を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性ヘクトライトからなる無機材料（Ｂ）とを含有する細胞培養基材の上で、フィーダー細胞を使用せずに、ＥＳ細胞を、未分化状態を保持したまま培養することを特徴とするＥＳ細胞の培養方法を提供する。

本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記無機材料（Ｂ）の構成部分がＥＳ細胞の増殖を担い、メトキシエチルアクリレート（ａ）重合体（Ａ）は、ＥＳ細胞との間の弱い接着性の維持を担うことにある。この二つの部分をＥＳ細胞の未分化能の維持状態、増殖状況に応じてそれぞれ単独に調節できることにある。例えば、無機材料（Ｂ）の含有量が増すと、細胞の増殖速度が速くなり、培養細胞数が多くなる。また、無機材料（Ｂ）の種類を変えることにより、細胞の増殖速度を調整することができる。ここでいうＥＳ細胞とは、ヒト胚性幹細胞またはヒト以外の動物胚性幹細胞のことをいう。

重合体（Ａ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｂ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｂ）を引き離すことはできない。

本発明のＥＳ細胞の培養方法は、フィーダー細胞及び成長因子を使用せずに、ES細胞を、未分化状態を保持したまま増殖させることができる特徴を有する。
また、本培養方法に用いられる培養基材は、γ線や電子線などの放射線滅菌が可能である特徴を有する。

繰り返しの培養によるＥＳ細胞数の増加を示した図である。

本発明に用いる無機材料（Ｂ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。

本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ_２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。

また、本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０３〜１．０であることが好ましく、０．０５〜０．５がより好ましく、０．０５〜０．３が特に好ましい。質量比（（Ｂ）／（Ａ））がこの範囲であると、ＥＳ細胞に対し良好な培養性と未分化能の維持を兼ね備えることができ、好ましい。

また、細胞と培養基材表面の接着性や、培養性と未分化能維持の調整、及び／または培養した細胞を、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用せず、３０℃以下の低温処理のみで、細胞を培養基材表面から剥離、回収する場合は、その他の重合体、例えばポリエチレングリコール、ジメチルアクリルアミドの重合体、ポリグルタミン酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体を重合体（Ａ）と併用することができる。例えば、重合体１ｇに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体を０．０３〜０．３ｇを併用する培養基材を用いることにより、培養した細胞を、培地温度を３０℃以下に下げ、以下に列挙した物理的外部刺激により、細胞を容易に剥離させることができる。
（１）ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作で剥離させる方法
（２）ガラス棒、ピペットの先や、ゴムヘラ等を細胞と培養基材間に差し込んで、細胞を剥離させる方法、
（３）ピンセット等を用いて直接細胞の周りを挟んで持ち上げる方法等がある。
上記低温処理で剥離回収したＥＳ細胞は、トリプシンなどのタンパク分解酵素を使用しないため、細胞の基底タンパクがダメージを受けず、生体内の細胞形態により近い状態にあり、細胞活性も高く、移植後の定着性や治癒性が高いと考えられる。

本発明の培養基材の形態は、ＥＳ細胞の培養性と未分化能の維持を兼ね備えるものであれば、特に限定されない。例えば、ディッシュ状、シート状、円筒状、球状、薄いフィル状で他の樹脂と積層して一体化したものであってもよい。

本発明の培養基材の製造方法は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）が無機材料（Ｂ）と相互作用し、有機無機複合体を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、前記メトキシエチルアクリレート（ａ）と前記無機材料（Ｂ）および重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｃ）を支持体に塗布して、前記メトキシエチルアクリレート（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｂ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する製造方法が挙げられる。
前記製造方法に用いる水媒体（Ｃ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｂ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、必要に応じて防腐剤や抗菌剤、抗生物質、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ^２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。

触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。

一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。

本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。

また、本発明の培養基材の第二の製造例としては、水媒体（Ｃ）中の前記無機材料（Ｂ）の濃度が下記式（１）又は式（２）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｂ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｃ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｂ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法が挙げられる。
式（１）Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（２）Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｂ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｂ）の質量を水媒体（Ｃ）と無機材料（Ｂ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｂ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））である。）

無機材料（Ｂ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（１）又は式（２）で表される範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。

本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。

［アルカリホスファターゼ染色］
培養したES細胞が未分化能を保っているかどうかを判定するため、下記の方法でLeukocyte Alkaline Phosphatase Kit (Sigma)を用いて細胞のアルカリホスファターゼ活性を測定した。
先ずES細胞を下記実施例１に示す方法で二日間培養した後、培地を除いてPBSで1回洗浄し、Fixative Solution（Citrate Concentration Solution７８μL、超純水３．９２ｍｌ、アセトン６ｍｌ）を加えて細胞を固定する（30秒）。次いで、超純水で２回洗浄し、染色液（Diazonium Salt Solution４．８ｍｌ、Naphthil AS-MX phosphate Alkaline Solution２００μL）を加えて、室温で１時間静置する（遮光）。次いで、再び超純水で２回洗浄し、封入剤を滴下しカバーガラスで覆って顕微鏡で観察する。細胞の未分化能が保っている場合、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、赤く染色される。逆に分化ES細胞では、アルカリホスファターゼ活性を示さず、染色されない。

（参考例） EF細胞（フィーダー細胞）上でのＥＳ細胞培養例
直径３５ｍｍのポリスチレン製ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３５−３００２）の底面を覆うようにゼラチン溶液を添加し、37℃のインキュベーター内で30分以上静置した後、Dishからゼラチン溶液を除去し、EF細胞（Ｂａｌｂ／ｃ由来胎児線維芽細胞）用培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High-Glucose，10% Fetal Bovine Serum)で懸濁したEF細胞（フィーダー細胞）を播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で一晩培養を行った。次いで、DishからEF細胞用培地を除去し、予めES細胞用培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium High-Glucose，MEM Non Essential Amino Acid,10^-4M 2-Mercaptoethanol,1000U/mL ESGRO mLIF Medium Supplement,L-Glutamine,15% ES cell FBS)で懸濁したES細胞を0.5×10⁶ cell/Dish播種し、５％二酸化炭素中、３７℃で二日間培養を行った。次いで、D-PBSで培地を洗浄後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いて、ES細胞をDishから剥離回収し、ES用培地で細胞を懸濁しながら洗浄した後、再び予めEF細胞を培養したDish上に播種し、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。上記操作（培養・回収）を１５回繰り返してES細胞を培養した。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、輪郭が丸くはっきりしており、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、１５回繰り返し培養した結果、細胞数は約３×１０^１８個オーダーであった。

（実施例１）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｂ）、水媒体（Ｃ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｂ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｃ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。

［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｅ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９

［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。

［ＥＳ細胞の培養］
（イ）ＥＳ細胞の継代（準備）
直径３５ｍｍのポリスチレン製ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３５−３００１）の底面を覆うようにゼラチン溶液を添加し、37℃のインキュベーター内で30分以上静置した後、Dishからゼラチン溶液を除去し、EF細胞（Balb／c由来胎児線維芽細胞）用培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High-Glucose，10% Fetal Bovine Serum）で懸濁したEF細胞（フィーダー細胞）を播種して、5％二酸化炭素中、37℃で一晩培養を行った。次いで、DishからEF細胞用培地を除去し、予めES細胞用培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High-Glucose，MEM Non Essential Amino Acid,10^-4M 2-Mercaptoethanol,1000U／mL ESGRO mLIF Medium Supplement,L-Glutamine,15% ES cell FBS）で懸濁したES細胞を0.5×10⁶ cell／Dish播種し、5％二酸化炭素中、37℃で二日間培養を行った。次いで、D-PBSで培地を洗浄後、0.25％ Trypsin-EDTAを用いて、ES細胞をDishから剥離回収し、ES用培地で細胞を懸濁しながら洗浄した後、再び予めEF細胞を培養したDish上に播種し、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。上記操作（培養・回収）を３回繰り返して継代したES細胞を培養した。この細胞について、顕微鏡観察、アルカリホスファターゼ染色により、細胞の未分化能が保っていることを確認した。

（ロ）フィーダー細胞を使用しないES細胞の培養試験
前記得られた細胞培養基材１を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、前記３回継代した未分化のES細胞を0.5×10⁶ cell/Dish播種し、５％二酸化炭素中、３７℃で二日間培養を行った。次いで、（イ）と同様にして、培養細胞を基材１から剥離回収し、細胞数計測と顕微鏡観察及びアルカリホスファターゼ染色測定を行った後、再び電子線滅菌済みの細胞培養基材１に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、二日間培養を行う。この操作を１１回（計２２日間培養）繰り返した。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、輪郭が丸くはっきりしており、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約２×１０^１５個オーダーであった。

（実施例２）
無機材料（Ｂ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG ０．８ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養基材２を製造した。
この反応系のＲａ＝０．２５、無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＝０．７９（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３９

［ＥＳ細胞の培養］
実施例１と同様に、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、１０ｋGyの電子線滅菌済みの細胞培養基材２に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、繰り返し培養を行った。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、はっきりとした丸い輪郭が観察され、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約８×１０^１５個オーダーであった。

以上の実施例１、２より、細胞培養基材中の無機材料含有量が増えるにつれ、細胞の培養性（増殖した細胞数）が増加することが理解できる。

（実施例３）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｂ）、水媒体（Ｃ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｂ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．４ｇ、γ-ポリグルタミン酸（日本ポリグル株式会社製）１ｇ、水媒体（Ｃ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を作製した。

この反応系のＲａ＝０．１０、無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＝０．４０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．２９

［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材３を得た。

［ＥＳ細胞の培養］
実施例１と同様に、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、１０ｋGyの電子線滅菌済みの細胞培養基材３に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、繰り返し培養を行った。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、はっきりとした丸い輪郭が観察され、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約１×１０^１５個オーダーであった。

（実施例４）（参考例）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｂ）、水媒体（Ｃ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｂ）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ_２＝０．２ｇ）水媒体（Ｃ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（４）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（４）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ４）を作製した。

［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ４）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材４を得た。

［ＥＳ細胞の培養］
実施例１と同様に、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、１０ｋGyの電子線滅菌済みの細胞培養基材４に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、繰り返し培養を行った。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、はっきりとした丸い輪郭が観察され、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約５×１０^１３個オーダーであった。

（実施例５）（参考例）
［Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体水溶液の調製］
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約１０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体水溶液（ＰＮＩＰＡ５）を調製した。この溶液に更に水を５ｇ添加し、均一に混合した後、ＤＩＧＩＴＡＬＶＩＳＣＯＭＡＴＥ粘度計（ＭＯＤＥＬＶＭ−１００Ａ、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は３６８ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２４．２℃であった。

また、ＳｈｏｄｅｘＧＰＣＳｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０^６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。

［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｂ）、水媒体（Ｃ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｂ）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ_２＝０．２ｇ）水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｃ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（５）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（５）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ５）を作製した。

［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ５）全量に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体水溶液（ＰＮＩＰＡ５）を５ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材５を得た。

［ＥＳ細胞の培養］
実施例１と同様に、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、１０ｋGyの電子線滅菌済みの細胞培養基材５に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、繰り返し培養を行った。各回二日間培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が盛り上がって増殖し島状のコロニーとなり、はっきりとした丸い輪郭が観察され、細胞の未分化能が保っていることが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が濃く染色され、高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化能が保っていることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約９×１０^１２個オーダーであった。

［ＥＳ細胞の剥離回収］
上記ＥＳ細胞培養において、最初の二日間、及び第11回目の二日間培養を行ったディッシュ中の培地を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の細胞が培養基材５の表面から剥離されたことが観察された。剥離された細胞を回収し、更にＤ−ＰＢＳと０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いて、ディッシュに残ったES細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測し、下記式（３）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率はそれぞれ９４％と９６％であった。
式（３）細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収された細胞の数／（低温処理で回収された細胞の数＋Trypsin処理で回収された細胞の数）｝×１００

（比較例１）
市販のコラーゲンＩコートディッシュ（商品名：Collagen I Cellware、Becton Dickinson Labware社製）を用いて、実施例１と同様にして、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、0.5×10⁶ cell/Dish播種して、二日間の培養した後、剥離回収し、再び播種、培養の操作を計１１回繰り返した。各回培養した細胞について、顕微鏡観察したところ、細胞が境界のはっきりした扁平な上皮様形態になり、分化してしまったことが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が殆ど染色されず、アルカリホスファターゼ活性を示さない、分化した状態であることが確認された。また、各回二日間培養した細胞数の累計を図１に示した。増殖した細胞の数はほぼ直線的に増加し、11回繰り返し培養した結果、細胞数は約６×１０^１６個オーダーであった。
この比較例より、コラーゲンコートディッシュでは、ES細胞を未分化状態を保持したまま増殖させることはできないことが理解できる。

（比較例２）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、水媒体（Ｃ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、水媒体（Ｃ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（２’）を調製した。

［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（２’）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２’）を作製した。

この反応系のＲａ＝０、無機材料（Ｂ）の濃度（質量%）＝０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．０５

［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２’）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材２’を得た。

［ＥＳ細胞の培養］
実施例１と同様に、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、１０ｋGyの電子線滅菌済みの細胞培養基材２’に0.5×10⁶ cell/Dish播種して、二日間培養したところ、細胞は殆ど増殖しなかった。

（比較例３）
市販の直径３５ｍｍポリスチレン製ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３５−３００１）を用いて、実施例１と同様にして、予めEF細胞（フィーダー細胞）上で３回継代したES細胞を用いて、0.5×10⁶ cell/Dish播種して、二日間培養したところ、細胞が境界のはっきりした扁平な上皮様形態になり、分化してしまったことが分かる。更に、アルカリホスファターゼ染色により、細胞が殆ど染色されず、アルカリホスファターゼ活性を示さない、分化した状態であることが確認された。

Claims

メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性ヘクトライトからなる無機材料（Ｂ）とを含有する細胞培養基材の上で、フィーダー細胞を使用せずに、胚性幹細胞を、未分化状態を保持したまま培養することを特徴とする胚性幹細胞の培養方法。
前記重合体（Ａ）と無機材料（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．２５〜１．０の範囲にある請求項１に記載の胚性幹細胞の培養方法。
前記細胞培養基材が、ポリエチレングリコール、ジメチルアクリルアミドの重合体、ポリグルタミン酸、又はＮ−イソプロピルアクリルアミドの重合体をさらに含む請求項１又は２に記載の胚性幹細胞の培養方法。