JP6447787B2 - 細胞培養基材 - Google Patents
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Description
このような背景のもと、温度応答性のポリマーを基材表面に固定化した細胞培養基材が提案されている。このような基材では、細胞培養温度ではタンパク接着性であるが、低温に下げることで細胞培養基材の表面状態が変わってタンパク接着性が低下するため、酵素処理なしで細胞を剥離することが可能となる。(例えば、特許文献1)
しかし、特許文献2で開示されているブロックコポリマーは耐水性が不足しており、基材表面からの溶出が起こるという課題と、細胞剥離性が不十分であるという課題が存在した。
本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントとは、ブロックポリマーにおけるセグメントであって、該セグメントは、ある一定温度以下になると溶解する重合体で構成されたセグメントのことをいう。
1)ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体
2)疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体
2−1)親水性モノマーが、ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーである場合と、
2−2)下記式(1)で表されるモノマー(a)と親水性のアミド系ビニルモノマー(b)との共重合体(B1)、前記またはモノマー(a)と下記式(2)表されるモノマー(c)との共重合体(B2)、またはモノマー(a)と下記式(3)表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー(d)との共重合体(B3)、が挙げられる。
疎水化モノマーとしては、前記式(1)で表される化合物や、 疎水化モノマーとしては、前記式(1)で表される化合物や、ジアセトンアクリルアアミド、(メタ)アクリル酸ポリプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレートが挙げられる。これらは単独でも複数種を同時に使用してもかまわない。中でも、アクリル酸2メトキシエチル、アクリル酸2エトキシエチル、アクリル酸3メトキシプロピルが好ましく、アクリル酸2メトキシエチル、アクリル酸2エトキシエチルが特に好ましい。
好ましい重合としては1000−8000であり、この範囲であれば細胞剥離性と培養効率のバランスに優れる。特に好ましくは3000―6000である。
本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することを特徴とする。なお、本明細書において、ブロックポリマーのセグメントにおける「疎水性」とは、セグメントからなる重合体について、水中における25℃での溶解度が0.5g/100mL未満であることを意味する。疎水性セグメントは、少なくとも疎水性モノマーのモノマー単位を含む。
本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することから、耐水性に劣る下限臨界溶解温度を有するセグメントを有していても、耐水性に優れ支持体との密着性に優れる。
その中でも好ましくは、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、スチレンであり、特に好ましくはブチルアクリレートである。
本発明のブロックポリマーは、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとを有するポリマーである。下限臨界溶解温度を有するセグメントをA、疎水性セグメントをBとした時に、本発明のブロックポリマーはABのジブロックタイプでもよく、ABAまたはBABのトリブロックタイプでも、それ以上のセグメント数を有するポリマーであってもかまわない。好ましくは、ジブロックタイプまたはトリブロックタイプであり、特に好ましくはジブロックタイプである。
ブロックポリマーの製造方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。このうち、精密ラジカル重合であることが好ましく、可逆的付加−開裂連鎖移動(RAFT)重合、原子移動ラジカル重合(ATRP)、ニトロキシド媒介重合(NMP)であることがより好ましく、RAFT重合であることがさらに好ましい。
本発明の細胞培養基材は、ブロックポリマーのほかに、配合物を有していても良い。例えば防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、糖類、たんぱく質、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、DNA類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含んでもかまわない。
本発明の細胞培養基材の形状は、細胞培養でき、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、フィルム状のもの、皿状のもの、ボトル(ビン)状のもの、チューブ状のもの、太さ5nm〜5mmの糸状または棒状のもの、バッグ(袋)状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの(例えばトランスウエル、セルストレイナー)、粒径が好ましくは10〜2000μm、より好ましくは100〜500μmの球状のものなどが挙げられる。
また、本発明の細胞培養基材の膜厚としては、下限臨界温度以上の温度で十分に乾燥させた状態で、1000nm以下が好ましく、500nm以下がさらに好ましい。
前記コーティング剤は、ブロックポリマーと、溶媒と、を含む。その他、必要に応じて、添加剤等を含んでいてもよい。
ブロックポリマーとしては、上述したものが用いられることからここでは説明を省略する。
なお、ブロックポリマーは1種のみを含んでいてもよいし、異なる構成を有する2種以上のブロックポリマーを含んでいてもよい。
ブロックポリマーの含有量は、コーティング剤の全質量に対して、0.01〜90質量%であることが好ましく0.1〜50質量%であることがより好ましい。ブロックポリマーの含有量が0.01質量%以上であると、得られる塗膜が表面親水性を発現しやすいことから好ましい。一方、ブロックポリマーの含有量が90質量%以下であると、粘度が低いことから塗工適性が高まることから好ましい。
コーティング剤に含有されうる溶媒としては、特に制限されず公知のものが使用されうる。
溶媒の具体例としては、水または有機溶媒が挙げられる。
前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、sec−ブタノール、iso−ブタノール、tert−ブタノール等のアルコール系溶媒;テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン等のエーテル系溶媒;シクロヘキサノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒;アセトニトリル等のニトリル系溶媒;ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒;ジメチルスルホキシド;ジオキシラン;ピロリドン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒としてはアルコール系溶媒を用いることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、tert−ブタノールを用いることがより好ましい。
上述のうち、溶媒は、水、アルコール系溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、tert−ブタノールであることがより好ましい。
上述の溶媒は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
コーティング剤中の溶媒の含有量は、コーティング剤の全質量に対して、10〜99.99質量%であることが好ましく、50〜99.9質量%であることがより好ましく、80〜99.5質量%であることがさらに好ましい。溶媒の含有量が10質量%以上であると、コーティング剤溶液の粘度が低くなるため、塗工適正に優れることから好ましい。一方、溶媒の含有量が99.99質量%以下であると、コーティング後の塗膜の厚さが薄くなりすぎず好ましい。
コーティング剤は、使用目的に応じて添加剤を含有してもよい。
当該添加剤としては、特に制限されず、公知のものが使用されうる。具体的には、賦形剤、
界面活性剤、可塑剤、消泡剤、顔料、抗酸化剤、抗生物質、紫外線吸収剤、結晶核剤、結晶化促進剤、安定化剤、抗菌剤等が挙げられる。これらの添加剤は、単独で用いても、2種以上を混合して用いてもよい。
また、基材がチューブ状である場合には、コーティング剤を通液させる方法等が挙げられる。この際、通液後は、通常、溶媒を通液させてチューブ内部の余分なコーティング剤を除去する。
乾燥条件についても特に制限されず、自然乾燥であっても加熱乾燥であってもよい。加熱乾燥である場合の乾燥温度は、使用するコーティング剤によっても異なるが、30〜70℃であることが好ましく、40〜60℃であることがより好ましい。なお、乾燥を制御することで、一部溶媒を残存させた塗膜を得ることができる。
本発明の細胞培養基材は、動物細胞を好適に培養することが可能である。動物細胞としては、由来は動物であればよく、ヒト、マウス、サル等が挙げられる。細胞種としては特に限定は無いが、上皮細胞(角膜上皮細胞など)、内皮細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞など)、線維芽細胞(ヒト皮膚線維芽細胞、マウス線維芽細胞など)、血球細胞、収縮性細胞(骨格筋細胞、心筋細胞など)、血液と免疫細胞(赤血球、マクロファージなど)、神経細胞(ニューロン、グリア細胞など)、色素細胞(網膜色素細胞など)、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、幹細胞(ES細胞、iPS細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、EC細胞、EG細胞、神経幹細胞)等が挙げられる。
ブロックポリマー1の合成
ブチルアクリレート(和光純薬株式会社製)0.59g、RAFT剤として2−(ドデシルチオカルボノチオイルチオ)プロパン酸0.0065g、Dimethyl 2,2’−azobis(2−methylpropionate)0.0036g、tブタノール9.0g、水1.0gを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、70℃にて7時間攪拌して、第1の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは81%であった。
次いで、N−イソプロピルアクリルアミド(以下NIPAM、株式会社KJケミカル製)10・53g、tブタノール49.86g、水5.54gの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に70℃にて20時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール66.7gを加えて、AB型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをNMRで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは100%、NIPAMのコンバージョンは99%であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Mn=220000、Mw=760000であった。後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表1に示す。
前記合成例1で得られたブロックポリマー1をメタノールで希釈して0.5%溶液を作成し、35mmポリスチレンシャーレ(TCPS、IWAKI製)に60ul添加した。その後、80℃にて30分間乾燥させ、さらに純水に10分間浸漬させる操作を三回繰り返して洗浄し、40℃にて一晩乾燥させることで、細胞培養基材1を得た。この細胞培養基材を後述する試験法を用いて細胞培養性・剥離性の評価を行った結果を表1に示す。
前記培養基材0.1gを200メッシュのステンレス金網で包み、4℃の水中で20時間放置前後のサンプルを130℃の熱風乾燥機で2時間乾燥させた重量をそれぞれ測定し、冷水中に静置した前後の重量減少率を調べた。この値が高いほど、培養基材の耐水性が高く、培養基材からの水による溶出が起こり難いと言える。
培地はEagle’s minimal essential medium(E−MEM、GIBCO社製)500mLに50mL 牛胎児血清MEM Non−Essential Amino Acids Solution, 100X(GIBCO社製)を1mL, L−Glutamine, 200 mM Solution(GIBCO社製)を添加した。当該培地2mLと共に、細胞密度1.0×104 cell/cm2 となるようマウスBalb3T3細胞(JCRB細胞バンク)を播種し、播種3日後の培養性を顕微鏡下で観察し評価した。
○:基材無しTCPSのみでの培養結果と培養性が同等。
△:基材無しTCPSのみでの培養結果よりも培養性が悪い。
×:細胞が全く育たない。
前記細胞培養基材1上で、Balb3T3細胞を培養し、播種3日後に細胞剥離試験を行った。培養中の培地を除去後、4℃の冷培地を1mL加え、25℃の室温で20分放置した。剥離した細胞ごと培地を除去後、培養基材をリン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))で洗浄した。洗浄後の細胞培養基材に対し、HistoChoice MB Tissue Fixative (amresco製)を1mL加え、室温で30分残存細胞を固定化後、除去した。その後、10%ギムザ染色液を1mL加え室温で1時間染色し、染色液を除去した後、水道水で洗浄し乾燥させた。ギムザ染色された細胞は目視で計測した。
○:細胞が完全に剥離した。
△:細胞が一部剥離した。
×:細胞が全く剥離しなかった。
ブチルメタクリレート(和光純薬製)1.92g、RAFT剤として2−(ドデシルチオカルボノチオイルチオ)プロパン酸0.06g、Dimethyl 2,2’−azobis(2−methylpropionate)0.012g、tブタノール10.8g、水1.2gを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、70℃にて7時間攪拌して第1の反応液を得た。この段階におけるブチルメタクリレートのコンバージョンは88%であった。
次いで、N−イソプロピルアクリルアミド(株式会社KJケミカル製)6.12g、tブタノール18g、水2.18gの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に70℃にて20時間攪拌して、AB型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをNMRで測定したところ、ブチルメタクリレートのコンバージョンは100%、NIPAMのコンバージョンは100%であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Mn=34000、Mw=51000であった。このポリマーの水ゲル分率の測定結果を表1に示す。
比較ブロックポリマー1を実施例1と同様の方法に従ってTCPSに塗布し、比較細胞培養基材1を作成した。その細胞培養性・剥離性を実施例1と同様に評価したところ、表1のようになった。
細胞培養基材を塗布しない状態の35mmポリスチレンシャーレ(TCPS、IWAKI製)に対し、細胞培養性・剥離性の評価を実施例1と同様に評価したところ、表1のようになった。
Claims (5)
- 下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が400−10000であることを特徴とする細胞培養基材。
- 前記疎水性セグメントが、下記式(1)で表されるモノマーを重合して得られるものである、請求項1に記載の細胞培養基材。
(上記式(1)中、R1は水素原子またはメチル基であり、R2はフェニル基、アルキル炭素数1〜8のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数7〜8のカルボキシアラルキル基、下記式(2)で表される基、下記式(3)で表される基のうちのいずれか1つを表す。
(上記式(2)において、nは2または3を表し、R3は炭素数1〜3のアルキル基を表す。)
(上記式(2)において、R4およびR5は、それぞれ独立して水素原子または炭素数1〜6のアルキル基を表し、R4およびR5の合計炭素数が5以上であることを表す。)) - 支持体上に積層されたことを特徴とする、請求項1から2のいずれかに記載の細胞培養基材。
- 平均膜厚が1000nm以下である、請求項3に記載の細胞培養基材。
- 支持体と請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養基材とを有する細胞培養器材。
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