CN112831005B - 细胞培养用的温敏性智能型基材及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种以聚乙烯基己内酰胺(PNVCL)嵌段聚合物为基质材料制备温敏性培养皿的方法.采用原子转移自由基聚合(ATRP)以卤代烷(Haloalkane)为引发剂合成聚甲基丙烯酸正丁酯（PBMA）聚合物.进一步的温敏性嵌段共聚物使用疏水性PBMA聚合物作为大分子引发剂.以n‑乙烯基己内酰胺(NVCL)单体为原料,经聚合得到聚n‑乙烯基己内酰胺（PNVCL）共聚物,该嵌段共聚物利用乙醇溶解浸泡旋涂方法能使疏水性的PBMA片段紧密凝聚于疏水性的培养皿界面起到打桩作用,而亲水性的PNVCL片段具温敏性特征暴露于培养皿表层完成了温敏性培养皿的制备。

Description

细胞培养用的温敏性智能型基材及其制备方法
技术领域
该发明属于生物科学技术领域。
发明概要
将合成的嵌段共聚物(PNVCL-b-PBMA)溶于纯乙醇有机溶剂后,通过简单旋涂或浸泡方法形成温敏性表面的培养皿用于细胞培养，所述细胞培养的温敏性表面能够有效地培养细胞。用含2.0至8.0ug/cm2量的两性(亲水与疏水)嵌段共聚物涂覆于基材表面通过改变基材表面的温度，可以无损伤地将培养的细胞或细胞片从温敏性基材表面自行脱离移除。
技术问题
本发明的目的是用N-乙烯基己内酰胺(NVCL)代替传统的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)(1,2)作为细胞培养的温敏性底物。酸水解时不产生有毒的小酰胺分子及其生产方法。
背景技术
问题的解决
聚N-乙烯基己内酰胺(PNVCL)是一种仅次于PNIPAAM的温敏性聚合物,该温敏性聚合物不仅有接近生理温度的相转变温度,而且其具有良好的生物兼容性,无毒性.因此,PNVCL在医疗器械,生物医学等方面具有广泛的应用价值。欲将PNVCL固定在疏水性聚苯乙烯的表面采用NVCL和甲基丙烯酸丁酯(BMA)进行嵌段聚合不失为一种可靠有效的方法.遗憾的是目前国内外还没有关于NVCL与BMA嵌段聚合的报导，我们尝试用传统的自由基聚合方法(FRP)对聚乙烯基己内酰胺-聚甲基丙烯酸丁酯(PNVCL-co-PBMA)进行聚合，但共聚物的转化率很低，分子量难于控制，分子量分布宽不易制备此嵌段共聚物。活性自由基聚合包括可逆加成裂解链移转聚合法(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)等已成为可控地合成各种拓扑结构聚合物的高效方法。例如Wan等人报导了RAFT聚合方法合成PNVCL均聚物。然而，这些聚合物的分子量仅为4k到11k，且分子量分布相对较宽(4)。最近利用优化的链移转剂CTAs和反应条件(5)，以O-乙基-S-(1-甲氧基羰基)，乙基二硫代碳酸酯为引发剂，在1，4-二氧六环中60℃(5)采用AIBN成功地引发了NVCL聚合，并制备了分子量分布窄的PNVCL均聚物。但由于NVCL单体活性和BMA有很大不同，用该方法制备PNVCL嵌段共聚物具有很大的挑战性。近年来，我们的研究小组采用ATRP以及RAFT聚合方法成功地合成了控制良好的PNVCL-b-PBMA嵌段共聚物。以0.2-0.8(w/v％)的量在TCPS表面涂覆PNVCL-b-PBMA共聚物，细胞可以有效地培养，培养的细胞或细胞片能仅靠改变基质表面的温度而有效地分离。根据本发明，提供了一种用于细胞培养的温敏性基板，其中细胞培养的表面涂覆有嵌段共聚物，其中疏水聚合物段与温敏性聚合物段以5.0至8.0μg/cm2的温敏聚合物量偶合。
发明内容
a.根据本发明，提供了一种用于细胞培养的温敏性基板，其中细胞培养的表面涂覆有嵌段共聚物，其中疏水聚合物段与温敏性聚合物段以5.0至8.0μg/cm2的温敏聚合物量偶合。
b.根据本发明的温敏性细胞培养基材包括但不限于下面描述的优选实施例。
b-1根据本发明的一个实施例，基板的基材表面涂覆含5.0到8.0μg/cm2 PNVCL量的PNVCL-b-PBMA嵌段共聚物。
b-2根据本发明的一个实施例，基板表面具有相分离结构。
b-3根据本发明的一个实施例，嵌段共聚物中温敏性聚合物的含量为50-80wt％。
b.4根据本发明的一个实施例，嵌段共聚物中温敏性聚合物的平均分子量为6000或更多。因为如表1所示，重量平均分子量(Mw)与数量平均分子量(Mn)的比率约为1.3。只要有利于本发明，可采用任何平均分子量。
b.5根据本发明的一个实施例。温敏性聚合物包括聚N-乙烯基己内酰胺衍生物、聚N-乙烯基吡咯烷酮衍生物、N-3-甲基-乙烯基己内酰胺衍生物及其共聚物中的任何一种或多种。
b.6根据本发明的一个实施例，温敏聚合物是聚N-乙烯基己内酰胺。
b.7根据本发明的一个实施例，基板的基材是一种板状基材，或两种或两种以上板状基材的组合。
b.8根据本发明，提供了一种用于细胞培养的温敏性基材基底的制备方法，其步骤包括：溶解或分散于有机溶剂中，其中疏水性聚合物段与温敏性聚合物段偶联的嵌段共聚物；通过旋涂将嵌段共聚物溶液均匀地涂布在基材表面；并干燥表面。根据本发明用于产生供细胞培养的温敏性底物的方法包括但不限于下面描述的优选实施例。
b.9根据本发明的一个实施例，通过原子转移自由基聚合(ATRP)聚合获得嵌段共聚物。
b.10根据本发明的一个实施例，溶解嵌段共聚物的溶剂为无水乙醇(99.5％)。
发明的有利功效
根据本发明的用于细胞培养的温敏性基板，可以有效地培养细胞，并且仅靠改变基板表面的温度就可以有效地分离培养的细胞或细胞片。此外根据本发明，可以容易地制备这种功能化表面。
附图说明
图1示出了实施例1中嵌段共聚物的合成路线。
图2示出了在实施例1中获得的细胞行为与各接枝量涂布的温敏性嵌段共聚物表面间的关系。
图3示出了表示在实施例1中获得的细胞行为和温敏性表面之间的关系照片。在每一接枝量的嵌段共聚物。在37℃、在TCPS表面上(a)和用B82-CL123的0.2w/v％(b)、0.4w/v％(c)和0.8w/v％(d)涂覆TCPS制备的温敏性表面上，观察了贴壁细胞在37℃、在TCPS表面和72小时后的显微照片。将温度降低到4℃再培养5-10min后，细胞的形态分别(e)到(h)表示。细胞接种：1.4x 10^4个/cm2。(I)到(K)表示细胞卷曲脱离培养皿接触面。
图4显示了PNVCL的分子链长度与细胞行为之间的关系。
图5示出了在实施例1中获得的温敏性表面上的细胞培养结果。
具体实施方式
实施例说明
本发明涉及一种用于细胞培养的热敏基质。其中，基板的基材表面涂覆有嵌段共聚物。其中疏水聚合物段与热敏聚合物段以2.0至5.0ug/cm2的量耦合。它的优点是，嵌段共聚物的疏水聚合物部分覆盖在基底材料表面上，不仅在细胞培养步骤中，而且在通过改变温度来分离培养细胞或细胞片的步骤中，不会从表面分离。“嵌段共聚物”通常指具有至少两个组成上不同的段的聚合物。如本领域技术人员所理解的，嵌段共聚物的实例包括二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、无规嵌段共聚物、星形支化嵌段共聚物和超支化嵌段共聚物。本发明中使用的嵌段共聚物通常具有疏水聚合物段(a)和热敏聚合物段(b)。嵌段共聚物还可以具有以下结构之一：含有两个嵌段的a-b结构；含有三个嵌段的a-b-a或b-a-b以及含有多个嵌段的-(a-b)n(其中n是2个或更多的整数)。当具有a-b结构的嵌段共聚物包括例如聚甲基丙烯酸正丁酯(PBMA)segment时，用于本发明细胞培养的热敏性基质中的嵌段共聚物优选具有根据本文所使用的上述结构的a-b结构。比如聚甲基丙烯酸正丁酯PBMA作为疏水聚合物段(A)和聚N-乙烯基己内酰胺(PNVCL)段作为热敏聚合物段(B)，嵌段共聚物可以表示为“B82-CL123”，使用每个聚合物中的单体单元数(例如，82个BMA单元和123个NVCL单元)(见示例1)。”本文所用的“疏水性聚合物”只要不溶于水，就不特别有限。疏水性聚合物的实例包括聚烷基丙烯酸酯，例如聚丙烯酸正丁酯和聚丙烯酸叔丁酯；聚烷基甲基丙烯酸酯，例如聚甲基丙烯酸正丁酯、聚甲基丙烯酸叔丁酯和聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯等。
如本文所使用的“温敏性聚合物”是指具有较低临界溶液温度(LCST)的聚合物和/或具有较高临界溶液温度(UCST)的聚合物。也可以是任何均聚物、共聚物及其混合物。具体地说，这种聚合物是通过如下所述的单体的均聚或共聚来获得的。所用单体的实例包括乙烯基己内酰胺化合物、乙烯基吡咯烷酮衍生物、乙烯基醚衍生物、N-3-甲基-乙烯基己内酰胺衍生物。对于共聚物，这些单体中的任何两个或多个都可以使用。此外，也可使用具有除上述单体以外的单体的共聚物、聚合物的接枝或共聚物、或聚合物和/或共聚物的混合物。此外，只要聚合物的固有特性不受损害，聚合物可以任选地交联。由于要分离的物质通常是生物物质，因此优选适合于分离4℃到40℃范围内,感兴趣的生物物质的温敏性聚合物。本发明中可使用的温敏性聚合物也可以是聚N-乙烯基己内酰胺衍生物、聚N-乙烯基吡咯烷酮衍生物、聚N-3-甲基-乙烯基己内酰胺衍生物及其共聚物中的任何一种或两种以上的组合。
根据本发明，上述嵌段共聚物中热敏聚合物的含量可在50至80wt％范围内，优选地可在55至70wt％范围内，且可进一步优选地在60至65wt％范围内。在小于30wt％的情况下。在聚合物上培养的细胞很难通过改变温度来分离，从而大大降低了操作效率。因此。这样的情况是不利的。相反，在90％以上的情况下。细胞很难粘附在聚合物区域。由于难以将细胞粘附到聚合物上，因此这种情况不利于本发明的细胞培养。这种情况也是不利的因为嵌段共聚物中疏水聚合物部分的量很低，因此嵌段聚合物很容易从基底表面分离。本发明中使用的温敏性聚合物的平均分子量为6,000或更多，优选10,000或更多，进一步优选20,000或更多，最优选25,000或更多。在分子量小于3000的情况下，通过改变温度很难分离培养在聚合物上的细胞，从而大大降低了操作效率。因此。这种情况是不利的。此外。根据本发明，当所述热敏聚合物的分子量具有上述下限时，所述培养细胞可在不受分子量上限限制的情况下有效分离。在一个实施例中，温敏性聚合物的平均分子量的上限也可以是35000，并且优选30000，更优选25000。
本发明用于细胞培养的温敏性基材以温敏性聚合物含5.0至8.0ug/cm2、优选5.5至7.5ug/cm2、更优选6.0至7.0ug/cm2的量涂覆上述嵌段共聚物。当涂覆量小于2.0ug/cm2时，嵌段共聚物上培养的细胞很难通过改变温度来分离，从而大大降低了操作效率。这种情况是不利的。相比之下，在大于9.0ug/cm2的情况下，细胞很难粘附到聚合物区域。由于难以将细胞粘附到聚合物上，因此这种情况不利于本发明的细胞培养。涂层量可根据普通程序测量，也可使用任何方法。例如。FTIR-ATR法，元素分析法，ESCA。也可使用类似的方法。
根据本发明的用于细胞培养的温敏性基板的特征在于，基板的基材表面涂覆有嵌段共聚物，其中疏水聚合物段与温敏聚合物段以预定比例偶合。当嵌段共聚物中温敏性聚合物的含量大于80wt％(即，当嵌段共聚物中疏水聚合物的含量小于20wt％)时，嵌段共聚物容易从基底材料表面分离，如上所述。因此。优选20wt％或更多的嵌段共聚物中的“疏水聚合物”。此外，当根据本发明生成细胞片时，作为嵌段共聚物涂层主要成分温敏性聚合物的"含量”是重要的。因此，可适当调整嵌段共聚物中疏水性聚合物的含量，以使培养板基材表面可在上述期望量范围内涂覆温敏性聚合物。更具体地，根据本发明用于细胞培养的温敏性基板表面可涂覆2.0到5.0ug/cm2、优选3.0到5.0ug/cm2、进一步优选3.5到4.5ug/cm2量的上述疏水性聚合物。如上所述，本发明的嵌段共聚物包括疏水聚合物段和对水有亲和力的温敏性聚合物段。因此，当基底材料表面涂有该嵌段共聚物并干燥时，有望形成相分离结构。比如细片状结构,圆柱状结构、海岛状结构或连续体结构在表面形成。相分离结构的形态、尺寸等没有特别的限制。当细胞粘附于基底表面时，由于可以抑制细胞的衰退，因此在基底表面存在相分离结构是首选的。
通常，可逆加成-裂解-链转移(RAFT)聚合法、原子转移自由基聚合(ATRP)、氮氧稳定自由基聚合(NMP)以及钴盐调控的活性自由基聚合法，以及阴离子聚合法通常用于制备嵌段共聚物。在本发明中，虽然制备嵌段共聚物的方法不限于上述方法和其他聚合方法，但优选使用ATRP方法。当使用ATRP聚合方法生产嵌段共聚物时，基于作为ATRP引发剂的部分官能团保留在所获得的嵌段共聚物的末端。这是ATRP聚合方法特有的，在ATRP聚合反应之后，可以从末端开始进一步的聚合反应。因此，根据本发明，可以在用于细胞培养的热敏基板的表面上赋予新的功能性。官能团的实例包括但不限于羟基、羧基、氨基、羰基、醛基、磺酸基等。此外，还可以将能够加速细胞粘附的肽或蛋白质固定在上述聚合物链末端上。在这种情况下，将官能团引入聚合物链末端将从不同的角度提供一种控制热敏基底表面的新方法，因为聚合物的较低临界溶液温度(LCST)如聚N-乙烯基己内酰胺根据末端官能团的亲水性和疏水性而变化。
如上所述，本发明的嵌段共聚物通过ATRP聚合方法获得，即在ATRP引发剂存在下进行活性自由基聚合以生长温敏聚合物的方法。此方法中使用的引发剂的示例包括但不特别限于1-氯-1-苯乙烷、1-溴-1-苯乙烷等，根据本发明这些引发剂可生长聚合物链。
本发明中用于聚合的溶剂未特别限定，而是优选苯、1.4-二氧六环、二甲基甲酰胺(DMF)等。根据聚合反应中所使用的单体、ATRP引发剂的种类，可以适当地选择溶剂，本发明是一种通过园子移转自由基聚合方法,从单体中生长水化力在0～80℃范围内变化的聚合物的方法，其中在ATRP引发剂、催化剂和配体等试剂的存在下，在1.4-二氧六环等溶剂中引发聚合。聚合过程中的引发剂浓度、催化剂/配体浓度、反应温度、反应时间等没有特别的限制，但可以根据目的而改变。此外，反应液可以保持静止或搅拌。
根据本发明的用于细胞培养的温敏性材料通常通过溶解或分散在溶剂中来获得，所述溶剂是如上所述获得的嵌段共聚物，然后用所述共聚物均匀地涂覆基材表面。在这种情况下，溶剂不是特别限定的，但可以从能够溶解或分散嵌段共聚物而不溶解基材表面的溶剂中适当地选择。溶剂的实例包括N，N-二乙基丙烯酰胺、异丙醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二甲基亚砜、甲基乙基酮、N，N-二甲基乙酰胺、氯仿、二氯甲烷或乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等。当使用多种溶剂时，溶剂的混合比例没有特别的限制，我们更喜欢使用乙醇，因为它是对环境友好的。
根据本发明，有必要将上述嵌段共聚物溶液均匀地应用于基材表面。应用该解决方案的方法的示例包括但不特别限于使用旋转涂布机的方法、将基材留在水平台上的方法等。根据本发明的用于细胞培养的温敏基板是通过在施用嵌段共聚物溶液后除去溶剂而获得的。除去溶剂的方法的例子包括但不特别限于：在室温下在大气中缓慢蒸发溶剂的方法、在室温下在溶剂饱和条件下缓慢蒸发溶剂的方法、蒸发溶剂的方法通过加热，通过减压使溶剂蒸发的方法等。前两种方法更适于制备具有清洁表面的用于细胞培养的热敏基底，并且更优选在溶剂饱和条件下在室温下缓慢蒸发溶剂的方法。
玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯等作为嵌段共聚物包被的细胞培养基的基材，通常用于细胞培养，也可用于细胞培养所形成的材料。可使用任意形状，包括但不限于上述以外的聚合物、化合物、陶瓷、金属等。细胞培养基底材料的形状不限于细胞培养皿，例如培养皿，而是板(板状基底材料)、纤维(丝状基底材料)、多孔颗粒(粒状基底材料)、管状基底材料或薄膜状基底材料。或两个或两个以上的组合也是可以接受的。通常用于细胞培养(烧瓶等)的容器形状的基底材料也是可以接受的。优选地，本发明的细胞培养基质的基材是一种板状基材，或两种或两种以上板状基材的组合。此外，当细胞培养的上述基材被嵌段共聚物涂覆时，所述基材的表面优选为疏水性。因此，当使用具有亲水表面的基材(例如玻璃板)时，优选预先进行疏水处理。疏水处理可以是使用硅烷偶联剂(例如，己基三乙氧基硅烷)的处理，而无特定限制。
可在本发明获得的温敏性基底表面培养的细胞不受其来源的限制。此外，细胞的来源和制备方法不是特别局限于本发明中使用的细胞的示例包括动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、细菌等。通常，动物细胞最好起源于人、猴、狗、猫、兔、鼠、裸鼠、鼠、豚鼠、猪、羊、中国仓鼠、牛、绒猴、非洲绿猴子之类的。此外，本发明中使用的培养基只要是用于动物细胞的培养基，就没有特别的限制。例如，培养基是无血清培养基。含血清的培养基。或者类似的。分化诱导物质如维甲酸或抗坏血酸也可进一步添加到该培养基中。可适当改变基质表面细胞的播种密度，并可按常规程序确定播种密度。
此外，当使用根据本发明的用于细胞培养的温敏基板时，仅通过将培养基板的温度改变到上临界溶液温度或更高温度，或改变到在培养基基材上涂覆的聚合物的临界溶液温度较低或更低的温度。上述分离可在培养液或另一等度液中进行。并且可以根据目的来执行。为了更快更有效地分离和收集细胞。也可以单独使用或组合使用敲击或摇动基底的方法、使用吸管搅拌介质的方法等。
根据本发明，通过使用用于细胞培养的温敏基质，可以有效地培养从每个组织获得的细胞。使用这培养方法，只需改变温度，就可以有效地分离培养细胞或细胞片，而不会造成损伤。以前，这样的操作需要操作者的努力和技巧。然而，本发明不需要它们，因此可以处理大量的单元。本发明的培养基材表面可以通过原子移转自由基聚合方法制备。特别是培养基材的表面设计简单、精确，通过ATRP法(原子移转自由基聚合法之)可以很容易地将官能团入分子链末端。根据本发明及其制备方法的温敏性细胞培养基材是非常有利的细胞培养技术。
实例本发明将参照以下实例进一步说明，但不限于此
例1温敏表面的制备和特性
在本实施例中，制备了包括一段温敏性聚合物,聚N-乙烯基己内酰胺(PNVCL)和一段疏水性聚合物,聚甲基丙烯酸正丁酯(PBMA)的温敏性嵌段共聚物，并将其旋涂于基材表面。对于涂有温敏性嵌段共聚物的表面，评估了聚合物的引入量和表面润湿性等物理性能。还研究了细胞与基底表面的粘附性随温度而改变。
(1)制备温敏性嵌段共聚物，特别是PBMA-b-PNVCL嵌段共聚物用ATRP方法合成疏水性聚合物PBMA，作为一种大分子引发剂(如图1)。此外，通过ATRP控制分子量,合成的PBMA和PBMA-b-PNVCL的分子量及分子量分布等信息如表1所示。例如，在本说明书中，其中单体单位比为BMA与VCL的PBMA-b-PNVCL嵌段共聚物,82:123表示为“B82-CL123”。
表1以下是根据本发明的嵌段共聚物中,单体的数量、嵌段共聚物的平均分子量和聚乙烯基己内酰胺的重量百分比数据。
Figure GDA0002436807550000061
(2)温敏性嵌段共聚物的特性通过核磁共振波谱(1H-NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)对所得聚合物进行评估。PBMA-b-PNVCL用乙醇溶剂以0.2w/v％,0.4w/v％和0.8w/v％的浓度溶解。此外用PBMA(0.4w/v％)和PNVCL(0.4w/v％)的溶液当作对照组。然后在已经组织培养处理的聚苯乙烯(TCPS)的表面,用聚合物溶液(3000转/分，30秒)旋转涂覆，并在室温下干燥过夜，然后用水冲洗基底表面并在室温下减压干燥6小时，以制备温敏性表面。以未涂有聚合物溶液的TCPS为对照组。
为了研究聚合物涂层在水中的稳定性，将基材放置在37摄氏度的水中24小时。然后在4摄氏度的水中摇动6小时，减压干燥。首先，通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR/FTIR)法测定基材表面的聚合物量，以研究处理前和处理后聚合物量之间的差异(见表2)。然后，在20℃和37℃下，用水接触角测量仪测量润湿性。使用ATR/FTIR对PBMA-b-PNVCL涂层基板的表面稳定性进行了研究，结果表明，在处理前和处理后基板之间未观察到接枝PNVCL的数量差异(使基板在37℃的水中静置24小时然后在4摄氏度的水中摇晃6个小时)。这一结果表明，在LCST(在PNVCL的情况下为32℃)的温度变化过程中，嵌段共聚物在水中的基底材料上保持稳定的涂层(表3)。这一结果很可能是由于PBMA(一种疏水性聚合物)的稳定物理吸附引起的。将聚苯乙烯链作为细胞培养的基材，通过疏水作用。当表面润湿性超过PNVCL链的LCST时，以及当表面润湿性低于LCST时。在PBMA-b-PNVCL涂层基质中，两者之间没有差异。与PBMA涂层基板相同(图4)。PBMA-b-PNVCL涂层表面润湿性的测量没有发现明显的变化，跟踪了PBMA-b-PNVCL涂层表面宏观环境的变化。这很可能是因为PBMA链和PNVCL链是相分离的，在基底的表面层上形成各自的结构域，而基底的表面完全被PNVCL覆盖，PNVCL是一个温敏链，如常见的温敏性细胞培养物。此外，根据PNVCL链与由PBMA链和PNVCL链组成的嵌段共聚物的比率，很可能形成相分离结构(见表2)。
表2显示了根据本发明的嵌段共聚物的特性。术语“B(x)-CL(y)”(x)，(y)都是自然数表示嵌段共聚物中的PBMA段包括总共(x)个BMA单体，嵌段共聚物中的PNVCL段包括总共(y)个NVCL单体。例如，单体单元比为BMA与NVCL为82:123的PBMA-b-PNVCL嵌段共聚物表示为“B82-CL123”。
Figure GDA0002436807550000071
表3显示了根据本发明的温敏性细胞培养基材的特性。用水接触角测量仪评估20℃和37℃下的表面润湿性。在用ATR/FT-IR研究PBMA-b-PNVCL涂层基材的表面稳定性时，热敏感基材在处理前和将基材在37℃的水中静置24小时，然后在4℃的水中摇晃6小时后，未观察到接枝PNVCL量的差异。
Figure GDA0002436807550000081
例2嫁接量与细胞行为的研究
根据实施例1的描述，制备了在不同浓度下用B 82-CL 123涂覆TCPS的基板。将小鼠腋窝淋巴结血管内皮细胞(SVEC)以1.4x10^4细胞/cm2的浓度接种于基板上，在37℃下观察其与聚合物涂层基板表面的粘附性及4℃低温处理后细胞的脱附行为。图2中的蓝色线表示无涂层聚合物的TCPS基板。图中的棕色和灰色线条分别表示在0.4和0.2w/v％的条件下，TCPS被B82-CL123覆盖的基质上细胞行为的变化。图2显示了将SVEC细胞接种在每种基质上，培养72小时后，将培养温度从37℃改为4℃时，细胞粘附率的变化。更确切地说，在37℃的细胞培养过程中，细胞粘附率增加。TCPS对细胞的粘附率最高，其次是B82-CL123涂层，0.4w/v％。B82-CL123涂层的细胞粘附率最低,为0.2w/v％。在TCPS上测定PNVCL的包被量，在0.4w/v％浓度下为3.05ug/cm2，在0.2w/v％浓度下为1.93ug/cm2，0.8w/v％浓度下为4.21ug/cm2。这些结果表明，PNVCL涂层量越大，细胞粘附率越低。在使用3.05ug/cm2的PNVCL涂层的情况下，当温度从37℃变化到4℃时，细胞粘附率有显著的变化。在使用TCPS的情况下，几乎没有观察到细胞粘附率在温度变化过程中的变化。另一方面。在使用含4.21ug/cm2PNVCL的底物的情况下，当温度从37℃变化到4℃时，细胞立即脱落，但37℃时细胞粘附率较低，不宜用于细胞培养。
此外，在改变温度的过程中，观察到在上述各种基板上培养的SVEC细胞的解吸，结果如照片所示。在37℃的培养基上，用0.4w/v％的B82-CL123进行3天的培养。观察到细胞粘附和扩散(图3)。其次，用4℃低温处理细胞粘附的基板5-10min。结果发现，细胞是自发地从基板表面解脱出来的。当在PBMA涂层基板上进行相同的操作时，观察到细胞粘附和扩散，而未观察到通过低温处理的细胞解吸(数据未显示)。基于上述结果，可能是基板表面的特征因PNVCL链引入基板表层当低温处理达LCST或更低的温度时基板被水合使得贴附细胞自动地脱离基板。
例3靠嵌段共聚物改变细胞行为的详细分析
(1)PNVCL分子链长度与细胞行为的关系
Relationship Between PNVCL Molecular Chain Length and Cell Behavior
根据实施例1中的生产工艺制备了具有恒定数量的BMA单体单元(单体数量)和可变数量的NVCL单体单元的嵌段共聚物。如实施例1所述，用嵌段共聚物涂覆TCPSs以检查SVEC细胞在改变温度期间的粘附率的变化(图4)。随着PNVCL涂层量的减少，细胞粘附率增加，如实施例2所示。对于温度变化引起的细胞脱附，发现与高浓度(3.05、3.57、4.16ug/cm2)相比，低浓度(2.52ug/cm2)的PNVCL涂层基板发生了缓慢的脱附，而涂有大量3.05、3.57、4.16ug/cm2等的涂层基板在温度改变后引起细胞快速的脱附。
(2)嵌段共聚物链长与细胞行为的关系
使用嵌段共聚物形成细胞片图5表示在涂有PBMA-b-PNVCL嵌段共聚物(B82-CL123的0.4w/v％)的基板上形成的细胞片的照片，通过改变温度分离的细胞片在37℃下培养。在PBMA-b-PNVCL嵌段共聚物(B82-CL123的0.4w/v％)包被的基板上，直到汇聚，然后在4℃培育，形成维持相邻细胞间连接的细胞片。
制备了具有不同链长的单体数和接枝量的嵌段共聚物。表4表示细胞在涂有各嵌段共聚物的基板上汇聚所需的时间(汇聚期)，以及从4℃的温度变化点开始到层细胞脱离的时间。结果发现，当涂层PNVCL含量较高(4.16ug/cm2或更高)时，细胞汇聚的时间为4天或更长。另一方面。结果表明，当PNVCL涂层量小于1.0ug/cm2时，细胞不能分离，细胞片不能形成。用PBMA-b-PNVCL涂层的基板表面可以有效地进行细胞培养和通过改变温度分离培养的细胞或细胞片。
表4显示了通过第3实施例的本发明中,温敏性基板与细胞片形成之间的关系。表4显示了细胞在涂有嵌段共聚物的TCP上扩展长满所需的时间(扩殖时间)，以及从4℃温度变化到分离细胞片(4℃时细胞片收获)的时间。结果发现，当包被PNVCL的量较大时(如4.21μg/cm2或更大)，细胞融合的时间为4天或更长。相反，当PNVCL的包被量小于1.0μg/cm2时，细胞不能分离，细胞片也不能发育。总之，用PBMA-b-PNVCL包被的TCPS可以有效地进行细胞培养和通过改变温度分离培养的细胞或细胞片。
Figure GDA0002436807550000101
比较实施例1:
水溶剂制备温敏性表层膜在实施例1中使用的B82-VC 123试图以0.2w/v％的浓度分散在水中。结果表明该聚合物在水中没有分散或乳化，没有得到任何均匀的溶液，TCPS基板表面涂有所得溶液。但基板表面在视觉上变得不均匀。因此，本发明不优选水作为溶剂。
产业上的可利用性
使用本发明的温敏性基板可以有效地培养从每种组织获得的细胞。这种培养方法可以有效地分离培养的细胞或细胞片，而只通过改变温度而不会造成损伤。
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Claims (8)

1.一种用于细胞培养的温敏性基板，其中基板的表层涂有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物为不溶于水的聚合物段聚甲基丙烯酸正丁酯与温敏性的聚合物段聚N-乙烯基己内酰胺偶合，温敏性聚合物的含量在5.0至8.0ug/cm2，其中温敏性聚合物占嵌段共聚物50-80％的重量。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的温敏性基板，其中基板表面涂层的嵌段共聚物含有2.0至5.0ug/cm2的聚甲基丙烯酸正丁酯疏水性聚合物。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的温敏性基板，其中基板表面具相分离结构。
4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的温敏性基板，其中温敏性聚合物在嵌段共聚物中的平均分子量是6000或更多。
5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的温敏性基板，其中该基板之基材为板状基材或两种或两种以上板状基材的组合。
6.一种用于细胞培养的温敏性基板的制备方法，其中基板的基材表面涂覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物中疏水性聚合物段聚甲基丙烯酸正丁酯与温敏性聚合物段聚N-乙烯基己内酰胺以5.0至8.0ug/cm2的温敏性聚合物段耦合,其中嵌段共聚物中温敏聚合物的含量为50-80wt％，该方法包括在有机溶剂中溶解或分散疏水聚合物段与温敏聚合物段偶合的嵌段共聚物，通过旋涂将嵌段共聚物溶液均匀地涂在基材表面并干燥表面。
7.根据权利要求6所述的用于细胞培养的温敏性基板的制备方法，其中所述嵌段共聚物通过ATRP方法获得。
8.根据权利要求6或7所述的用于细胞培养的温敏性基板的制备方法，其中溶解嵌段共聚物的溶剂是绝对酒精的环保型溶剂。
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GR01 Patent grant
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