JP6865264B2 - 細胞シート製作方法及び応用のための高分子薄膜培養プレート製作方法及び用途 - Google Patents
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Description
本特許出願は、２０１６年７月５日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１６−００８４８５６号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
本発明は培養プレートに関し、より詳しくは、表面自由エネルギー調節が可能な高分子薄膜コーティングを含む培養プレートとその製造方法及び前記培養プレートを用いて細胞シート形態の細胞集合体を製造する方法に関する。
再生医学で組織工学的治療は生分解性高分子を基盤に細胞を培養して組織を再建し、損傷されるか、または機能不全に陥った臓器に移植して正常に機能するようにする治療法に発展している。しかしながら、生分解性高分子支持体が移植された時、免疫反応及び生分解性高分子の分解による炎症反応などの問題点を避けることはできない（非特許文献１）。他の方法には、細胞を生分解性高分子溶液に混ぜて人体に注入する方法があるが、この過程中、細胞のＥＣＭ（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ：細胞外マトリックス）が破られて、ターゲット組織に移植した時、細胞再生効率が格段に低下するようになる（非特許文献２）。
支持体無しで細胞を移植するために細胞シートが開発されており（非特許文献３）、現在最も多く使われる方法は日本のＴｅｒｕｏ Ｏｋａｎｏにより開発された技術であって、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）培養皿の表面に電子ビーム照射により温度感応型高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）を２０ｎｍ以下の厚さで共有結合させるものである（非特許文献４〜５、特許文献４）。温度感応型培養皿は表面の下限臨界温度（ｌｏｗｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＬＣＳＴ）以上では細胞が付着して細胞シートを形成し、下限臨界温度以下では高分子が膨潤して細胞をシート形態に回収することができる（非特許文献６）。しかしながら、この方式は細胞の温度を２０℃以下に下げなければならず、表面の化学的機能基を変えることに多くの制約があり、製作方法が難しいだけでなく、多くの時間がかかる等の限界点により汎用性及び商用化が困難な問題がある（非特許文献７）。
温度感応型培養皿以外に、電気刺激、超音波刺激、ｐＨ感応型を用いた研究が進められたが、電気刺激及び超音波効果を発生させるためには主に金属物質（Ａｕ、Ａｇ、またはＣＮＴ）を使用しなければならないので、細胞培養用基板を製作するに当たって、コーティング方法に難しさが発生し、また高価の装備が必要であるので使用の限界点が発生する（非特許文献８〜１３）。
また、細胞シートを製作したとしても、これを実際に臨床的に適用するためにはシートを積層する過程が反復的に必要であり、これを効率よく適用しようとする部位に転写可能でなければならない。しかしながら、現在まで知られている方法は相変らず積層と転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）時、再現性が不足し、過程が複雑で、消耗時間が長いという短所がある。特に、既存の大部分の細胞シート転写方法は多数枚の細胞シートを一度に転写するよりは、単層の細胞シートを個別的に転写して積層する方法を選択した。したがって、よりやさしくて速く細胞シートを積層すると共に、他の基板及び疾病モデルなどに転写することができる新たな細胞シートの転写方法開発に対する必要性が提起されている実状である。
Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ， １９９６， ３０ （１）， ３１−４０
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Ｙａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００５ Ｎｏｖ；２６（３３）：６４１５−２２
Ｔａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２０１２， ４， １４７８−１４９８
Ｙａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００７；２８（３４）：５０３３−５０４３
Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ２０１２， ７， ８５０−８５８
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Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ Ｔ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ２０１２， ６， ９５８５−９５９５
本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本発明者らは前記の問題点を解決するために、例の努力した結果、細胞と培養表面の接着力に影響を与える表面自由エネルギー（Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ）を調節することによって、多様な形態に細胞シートの形成及び分離が可能であるだけでなく、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）が含まれた状態で回収されるので、細胞シートの積層が可能であるということを確認した。また、開始剤を用いた化学気相蒸着法（ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｉＣＶＤ）による培養プレートのコーティングは気相蒸着工程であるので、基板の制約がなく、比較的短い時間に多様な機能性高分子をコーティングすることができるので、汎用性及び商用化において大きな長所を有しているだけでなく、共重合体コーティングを通じて表面自由エネルギーを調節して細胞シートを形成することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、培養プレートを提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞シート形態の細胞集合体製造方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、開始剤を用いた化学気相蒸着法を用いて培養プレート表面改質方法を提供することにある。
本発明の目的は以上から言及した目的に制限されず、言及されていない本発明の他の目的及び長所は以下の説明により理解されることができ、本発明の実施形態により、より明らかに知るようになる。また、本発明の目的及び長所は請求範囲に示した手段及び組合せにより実現できることが容易に分かる。
本発明の一態様によれば、本発明は表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体を含む培養プレートを提供する。
本明細書で使われた表現、“表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体”は表面自由エネルギーが６０ｍＪ／ｍ２以下である単量体を意味する。“表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体”は表面自由エネルギーが６０ｍＪ／ｍ２以上である単量体を意味する。また、“第１単量体と第２単量体が形成した共重合体”は、前記第１単量体と第２単量体を用いて形成された表面自由エネルギーが３０ｍＪ／ｍ２〜９０ｍＪ／ｍ２である共重合体を意味する。
本発明によれば、培養プレートの表面自由エネルギーが第１単量体または第２単量体により形成された同種重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）を通じて３０ｍＪ／ｍ２〜９０ｍＪ／ｍ２で具現される場合を意味することもある。
本明細書で使われた表現、“表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体を含む培養プレート”は、表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体を含む培養プレートの一部分である場合（例えば、前記共重合体で表面がコーティングされた培養プレート）を意味するだけでなく、表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体自体を培養プレートに使用できることを意味するために使われる。
本明細書で、第１単量体は細胞付着の弱い低い表面自由エネルギーを有する単量体である。例えば、芳香族ビニル系単量体（例えば、ジビニルベンゼン（ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）、ビニルベンゾエート（Ｖｉｎｙｌ Ｂｅｎｚｏａｔｅ）、スチレン（ｓｔｙｒｅｎｅ）など）、メタアクリレート系単量体（例えば、ベンジルメタクリレート（Ｂｅｎｚｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、シクロヘキシルメタクリレート（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ブチルメタクリレート（ｂｕｔｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、イソプロピルメタクリレート（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、エチレングリコールジメタクリレート（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ヒドロキシエチルメタクリレート（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、フッ素系列単量体（フルフリルメタクリレート（ｆｕｒｆｕｒｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、パーフルオロデシルアクリレート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｄｅｃｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ））、ビニル基を有するシラザンまたはシクロシラザン（例えば、２，４，６，８−テトラメチル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ）−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサン（ｔｅｔｒａｖｉｎｙｌｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｓｉｌｏｘａｎｅ）、１，３，５−トリビニル（ｔｒｉｖｉｎｙｌ）−１，３，５−トリメチルシクロトリシロキサン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｔｒｉｓｉｌｏｘａｎｅ）、ヘキサビニルジシロキサン（ｈｅｘａｖｉｎｙｌｄｉｓｉｌｏｘａｎｅ）など）、エポキシ作用基を有する単量体（グリシジルメタクリレート（Ｇｌｙｃｉｄｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）など）、架橋剤に使われる単量体（エチレングリコールジメタクリレート（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、エチレングリコールジアクリレート（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）、ジ（エチレングリコール）ジビニルエーテル（Ｄｉ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｄｉｖｉｎｙｌｅｔｈｅｒ）など）で構成された群より選択される単量体でありうる。
本明細書で、第２単量体は細胞付着の強い高い表面自由エネルギーを有する単量体である。例えば、ビニル系アミン（２−ビニルピリジン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、４−ビニルピリジン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、１−ビニルイミダゾール（ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、１−ビニルピロリドン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、２−ビニルピリジン（ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、４−アミノスチレン（ａｍｉｎｏｓｔｙｒｅｎｅ）、９−ビニルカルバゾール（ｖｉｎｙｌｃａｂａｚｏｌｅ）など）、メタアクリレート系アミン（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ジエチルアミノエチルアクリレート（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）、ジメチルアミノエチルアクリレート（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）、ジエチルアミノエチルアクリレート（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）など）、酸性の作用基を有する単量体（マレイックアンハイドライド（Ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、メタアクリル酸（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）など）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、メタクリルアミド（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、塩素系列作用基を有する単量体（４−ビニルベンジルクロライド（Ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２−クロロエチルアクリレート（Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）など）、シアン系列単量体（シアノエチルアクリレート（Ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、ビニルベンジルシアニド（Ｖｉｎｙｌ ｂｅｎｚｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ）など）、ビニル−Ｎ−メチルピリジニウムクロリド（ｖｉｎｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）で構成された群より選択される単量体でありうる。
本発明において、第１単量体と第２単量体が形成する共重合体形成時、混合割合の制限はない。第１単量体と第２単量体の混合割合は１％〜９９％まで調節可能である。
したがって、本発明の一具現例によれば、第１単量体は表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする単量体であり、第２単量体は表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする単量体である。
１つの特定例によれば、表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体はジビニルベンゼン（ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ（以下、‘ＤＶＢ’と命名する））であり、表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体は４−ビニルピリジン（４−ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（以下、‘４ＶＰ’と命名する））であり、前記第１単量体と第２単量体が形成した共重合体はジビニルベンゼン−４−ビニルピリジン共重合体（Ｐｏｌｙ（ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｚｅｎｅ−ｃｏ−４−ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ））（以下、‘ＰＤ４Ｖ’と命名する）である。
本発明の他の具現例によれば、前記表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体上で細胞を培養することによって、細胞シート形態の細胞集合体を製造することができる（図１）。
本発明の他の態様によれば、本発明は本発明の培養プレートで細胞を培養するステップを含む細胞シート形態の細胞集合体製造方法を提供する。
本発明の更に他の態様によれば、本発明は開始剤を分解して遊離ラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）を形成するステップと、遊離ラジカルにより第１単量体と第２単量体を重合反応させて共重合体を形成するステップと、培養プレートに共重合体が蒸着されて薄膜を形成するステップとを含む化学気相蒸着法を用いた培養プレート表面改質方法を提供する。
本明細書で、化学気相蒸着法は開始剤を用いた化学気相蒸着法（ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｉＣＶＤ）を用いることができ、開始剤はＴＢＰＯ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）を使用することができる。一方、開始剤は熱または電気により分解されて遊離ラジカルを生成し、前記遊離ラジカルにより第１単量体と第２単量体を活性化させることによって、前記単量体を連鎖重合反応させて共重合体を形成するようになり、前記共重合体が蒸着されて薄膜を形成することによって、培養プレートの表面を改質することができる。また、培養プレートの高分子薄膜の厚さは特別に制限されないが、例えば、５ｎｍ〜５００μｍでありうる。支持体層の厚さがあまり薄いか厚ければ、薄膜形成の効率性と細胞培養のための薄膜表面の安定性に影響を及ぼすことがある。
一方、ｉＣＶＤは高分子薄膜が蒸着される基板表面の温度が１０℃〜４５℃の間に低く維持される低温及び低真空工程であるので、プラスチック材質の多様な培養プレート（３５ｐｉ、１００ｐｉディッシュ、６、１２、２４、９６ウェルプレート）に損傷無しで多様な高分子コーティングが可能である。既存に使われるディップコーティング、スピンコーティングなどの液状工程は、溶媒による基板損傷問題、不均衡コーティングなどの問題を有しているので、ｉＣＶＤを通じて培養プレートに製作すれば、既存のコーティング方法で不可能であったコーティング問題を解決することができる。
本発明によれば、前記培養プレートは細胞を培養することができる任意の空間を提供することで充分であるので、その形態は制限がない。例えば、培養プレートはディッシュ（培養皿）、シャーレやプレート（例えば、６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、９６００ウェルなどのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディップウェルプレートなど）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピナーフラスコ、中空繊維（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒｓ）、マイクロキャリア、ビーズなどの形状を有することができる。また、支持性を有する物質であれば、前記培養プレートに制限無しで使用することができ、例えば、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属、シリコン、及びガラスなどの材質を培養プレートに使用することができる。本発明の一実施形態に従う培養プレートの構造は図１に図示されている。
本発明の一具現例によれば、第１単量体は表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする単量体であり、第２単量体は表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする単量体である。
１つの特定例によれば、表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体はＤＶＢであり、表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体は４ＶＰであり、前記第１単量体と第２単量体が形成した共重合体はＰＤ４Ｖである。
他の１つの特定例によれば、図２に開示されたように、ｉＣＶＤにより共重合体蒸着時、第１単量体であるＤＶＢと第２単量体である４ＶＰの注入割合によって細胞シート（ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔ）形態または細胞スフェロイド（ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）形態の細胞集合体に培養することができ、ＤＶＢ注入割合が高いほどスフェロイド形態の細胞集合体に培養することに適合した培養プレート表面改質が可能であり、ＤＶＢ対４ＶＰの注入割合が増加するほどシート形態の細胞集合体に培養することに適合した培養プレート表面改質が可能である。一方、単量体の注入割合を調節すれば、接触角と表面エネルギーが異なる培養プレート表面を製作することができ、各共重合体コーティング表面のエネルギーによって細胞と培養プレート表面との接着力が変わって、各々異なる形態に細胞が育つようになり、温度変化無しで培養プレート表面から細胞シート形態の細胞集合体を分離することができる。
本発明の培養プレート上で多様な細胞を培養して細胞シートを形成することができる。培養される細胞は本発明で特別に限定されず、例えば、心臓、筋肉、肝、骨、骨髄、胸腺、腎臓、脾臓、肺、脳、精巣、卵巣、ランゲルハンス島（ｉｓｌｅｔ）、内臓、耳、皮膚、胆嚢組織、前立腺、膀胱、胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）、免疫系、及び造血系などから分離または活性化できる細胞を使用することができる。好ましくは、各種の幹細胞、角膜上皮細胞、神経細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、纖維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、腎臓細胞、肝細胞、脂肪細胞、角質細胞、筋肉細胞、心臓筋肉細胞、または食道上皮細胞を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明はホール構造体を用いた細胞シート形態の細胞集合体の積層及び転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）方法を提供する。
前記細胞集合体の積層及び転写方法は、次のステップを含むことができる：
（ａ）細胞シート形態の細胞集合体をホール構造体（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｈｏｌｅｓ）の表面に１層以上付着するステップ；及び
（ｂ）細胞集合体の適用を必要とする部位に細胞集合体が付着された面が対向するようにホール構造体を配置した後、ホール構造体のみを剥離するステップ。
（ａ）細胞シート形態の細胞集合体をホール構造体（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｈｏｌｅｓ）の表面に１層以上付着するステップ；及び
（ｂ）細胞集合体の適用を必要とする部位に細胞集合体が付着された面が対向するようにホール構造体を配置した後、ホール構造体のみを剥離するステップ。
本発明の一具現例によれば、前記ホール構造体は細胞シート形態の細胞集合体を、適用を必要とする場所または部位に容易に適用できるように細胞集合体を載置することができるメンブレン形態の構造物をいう。前記ホール構造体は、例えばニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ポリビニリデンフルオライド（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）メンブレン、ポリテトラフルオロエチレン（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＰＴＦＥ）メンブレン、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）メンブレン、ＭＣＥ（ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒ）メンブレン、ポリアマイドメンブレン、及びＰＥＳ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）メンブレンからなる群より選択されたものであって、１つ以上の孔があることなどでありうるが、これに限定されるものではなく、当業界で使われることができる多様な種類のメンブレンを制限無しで使用することができることを特徴とする方法。
本発明の一具現例によれば、前記ホール構造体は１つ以上の孔があるものが好ましく、孔の個数と形態には制限がないし、孔のサイズは細胞シート形態の細胞集合体をメンブレンの孔の上に上げて置いても下に通過されなければ制限がない。
本発明の他の一具現例によれば、前記ホール構造体を細胞集合体から剥離する時、細胞集合体が付着された面の反対面に燐酸緩衝溶液、または細胞培養培地を点滴するステップを追加的に含むことができる。
前述した細胞集合体の転写方法で使われたホール構造体の構造的特徴は構造体上に孔が形成されているということで、前記孔は細胞シートとメンブレンとの間の過度な付着力を防止すると共に、効果的な転写が可能であるようにする。
第一に、孔が生じるようになれば、メンブレンとシートとの間の接触面積が相対的に減って、絶対的な付着力が少なくなり、転写が容易になる。
第２に、転写時、孔を通じて燐酸緩衝溶液や細胞培養液を少量流せば、細胞シートとメンブレンが互いによりよく離れることができる。
前記のような本発明によれば、表面自由エネルギーの低い薄膜を形成するようにする第１単量体と表面自由エネルギーの高い薄膜を形成するようにする第２単量体が形成した共重合体を含む培養プレートとその製造方法、及び前記培養プレートを用いて細胞シート形態の細胞集合体を製造する方法を提供することによって、従来技術と比較して易しく簡単な工程により細胞シート形態の細胞集合体を生産及び分離回収することができる効果がある。
本発明の前述した目的、特徴、及び長所は添付した図面を参照して後述されている詳細な説明を通じてより明確になり、それによって、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が本発明の技術的思想を容易に実施することができる。また、本発明を説明するに当たって、本発明と関連した公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を不必要に曖昧にすることがあると判断される場合に、その詳細な説明を省略する。以下、添付した図面を共に参照して、本発明に従う好ましい実施形態を詳細に説明する。
実施形態１．培養プレートの製造
ｐＤ４Ｖ蒸着時、化学気相蒸着反応器（ｉＣＶＤ、Ｄａｅｋｉ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）を使用して、ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）単量体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４ＶＰ（４−ビニルピリジン）単量体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と開始剤（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ＴＢＰＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を６０：２４０：６０の割合でｉＣＶＤ反応器内に流しながら、反応器内のフィラメントの温度は１４０℃、反応器内の基板温度は２３℃、反応器内チャンバーの圧力は３００ｍＴｏｒｒに維持しながら１時間３０分蒸着を遂行して、４００ｎｍ厚さのＤＶＢ−４ＶＰ共重合体（ｎｐＤ４Ｖ）が蒸着された培養プレートを得た。
ｐＤ４Ｖ蒸着時、化学気相蒸着反応器（ｉＣＶＤ、Ｄａｅｋｉ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）を使用して、ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）単量体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４ＶＰ（４−ビニルピリジン）単量体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と開始剤（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ＴＢＰＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を６０：２４０：６０の割合でｉＣＶＤ反応器内に流しながら、反応器内のフィラメントの温度は１４０℃、反応器内の基板温度は２３℃、反応器内チャンバーの圧力は３００ｍＴｏｒｒに維持しながら１時間３０分蒸着を遂行して、４００ｎｍ厚さのＤＶＢ−４ＶＰ共重合体（ｎｐＤ４Ｖ）が蒸着された培養プレートを得た。
実施形態２．細胞シート培養プレート表面分析
重合体薄膜を蒸着した後、フーリエ変換赤外線分光学（ＦＴ−ＩＲ、ＡＬＰＨＡ ＦＴ−ＩＲ吸光モード、Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて重合体の分子骨格及び分率を測定した。その結果、図３に示したように、１５９６ｃｍ−１と１４１５ｃｍ−１（左側２つの点線）ピークを通じて４ＶＰ分子の存在を、７１０ｃｍ−１と９０３ｃｍ−１（右側２つの点線）ピークを通じてＤＶＢ分子の存在及び重合体合成を確認した。
重合体薄膜を蒸着した後、フーリエ変換赤外線分光学（ＦＴ−ＩＲ、ＡＬＰＨＡ ＦＴ−ＩＲ吸光モード、Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて重合体の分子骨格及び分率を測定した。その結果、図３に示したように、１５９６ｃｍ−１と１４１５ｃｍ−１（左側２つの点線）ピークを通じて４ＶＰ分子の存在を、７１０ｃｍ−１と９０３ｃｍ−１（右側２つの点線）ピークを通じてＤＶＢ分子の存在及び重合体合成を確認した。
重合体薄膜を蒸着した後、接触角測定装備（Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｎｇｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｈｏｅｎｉｘ １５０、ＳＥＯ， Ｉｎｃ．））を用いて５μｌの蒸溜水とダイアイオドメタン（Ｄｉｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ、ＤＩＭ）に対して基板の表面接触角を測定した。その結果、図４に示したように、単量体の混合割合によって形成された重合体により表面が改質されて接触角が変わることを確認することができた。これに基づいてＶａｎ Ｏｓｓ−Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ−Ｇｏｏｄ（ＯＣＧ）数式を用いて基板の表面自由エネルギーを計算した。その結果、重合体の分率によって表面自由エネルギー値が変わることを確認した。
実施形態３．共重合体分率に従う細胞形態観察
ＤＶＢ−４ＶＰ共重合体（ｐＤ４Ｖ）がコーティングされている細胞培養皿にＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養した後、細胞シート形成有無を確認した。細胞が十分に育った時、４％ホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩとファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて核とアクチンを染色して蛍光顕微鏡で観察した。図５に示したように、全ての培養プレートで細胞が毒性無しでよく育つことが確認されており、ＤＶＢ培養表面では細胞スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）が形成され、４ＶＰ培養表面では細胞が付着されて育つことが観察された。一方、共重合体培養表面（ｐＤ４Ｖ１、ｐＤ４Ｖ２）では細胞が付着されて育ったが、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を用いて洗浄した後に、自ずから細胞シート形態に離れて出ることが観察された。
ＤＶＢ−４ＶＰ共重合体（ｐＤ４Ｖ）がコーティングされている細胞培養皿にＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養した後、細胞シート形成有無を確認した。細胞が十分に育った時、４％ホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩとファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて核とアクチンを染色して蛍光顕微鏡で観察した。図５に示したように、全ての培養プレートで細胞が毒性無しでよく育つことが確認されており、ＤＶＢ培養表面では細胞スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）が形成され、４ＶＰ培養表面では細胞が付着されて育つことが観察された。一方、共重合体培養表面（ｐＤ４Ｖ１、ｐＤ４Ｖ２）では細胞が付着されて育ったが、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を用いて洗浄した後に、自ずから細胞シート形態に離れて出ることが観察された。
実施形態４．細胞シート形成及び分離
前記実施形態１により製造されたｐＤ４Ｖが蒸着された３５ｐｉディッシュでＮＩＨ３Ｔ３とｈＭＳＣを培養後、細胞シート形成を確認した。細胞培養はＮＩＨ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）／１０％ＦＢＳ／１％抗生剤（ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）で、ｈＭＳＣ細胞はＭＥＭα（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）／１７％ ＦＢＳ／１％抗生剤（ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、３日〜５日培養したら細胞シートが形成された。この際、培養液を除去し、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄すれば、形成された細胞シートが培養プレート表面から自発的に分離されて出ることを確認することができた（図６及び図７）。
前記実施形態１により製造されたｐＤ４Ｖが蒸着された３５ｐｉディッシュでＮＩＨ３Ｔ３とｈＭＳＣを培養後、細胞シート形成を確認した。細胞培養はＮＩＨ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）／１０％ＦＢＳ／１％抗生剤（ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）で、ｈＭＳＣ細胞はＭＥＭα（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）／１７％ ＦＢＳ／１％抗生剤（ペニシリンストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、３日〜５日培養したら細胞シートが形成された。この際、培養液を除去し、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄すれば、形成された細胞シートが培養プレート表面から自発的に分離されて出ることを確認することができた（図６及び図７）。
実施形態５．培養プレートで形成された細胞シートを分離回収後、細胞シートの積層方法
細胞シートを製造するためには、ｐＤ４Ｖ重合体がコーティングされている細胞培養プレートに細胞を培養して細胞間の接合が十分に起こることができるまで培養した後、Ｄｕｌｂｅｓｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）溶液を用いて培養した細胞をシート形態に分離すればよい。培養皿上で剥離した１枚の細胞シートを吸引して新たな細胞培養皿に移した後、３７℃飽和水蒸気のインキュベーターに適当な時間（例えば、１５分間〜３０分間）放置した。その間に細胞シートは培養皿上に接着した。次に、剥離した直後の２番目の細胞シートを培養液と共にピペットで吸引して、培養皿上に固定された最初の細胞シートの上に滴下した。滴下した２枚のシートに、また新たな培養液をゆっくり滴下することによって、２番目のシートを最初のシートに重なった状態で接合することができた。同一な手法を繰り返して細胞シートを順に積層化することができた。
細胞シートを製造するためには、ｐＤ４Ｖ重合体がコーティングされている細胞培養プレートに細胞を培養して細胞間の接合が十分に起こることができるまで培養した後、Ｄｕｌｂｅｓｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）溶液を用いて培養した細胞をシート形態に分離すればよい。培養皿上で剥離した１枚の細胞シートを吸引して新たな細胞培養皿に移した後、３７℃飽和水蒸気のインキュベーターに適当な時間（例えば、１５分間〜３０分間）放置した。その間に細胞シートは培養皿上に接着した。次に、剥離した直後の２番目の細胞シートを培養液と共にピペットで吸引して、培養皿上に固定された最初の細胞シートの上に滴下した。滴下した２枚のシートに、また新たな培養液をゆっくり滴下することによって、２番目のシートを最初のシートに重なった状態で接合することができた。同一な手法を繰り返して細胞シートを順に積層化することができた。
実施形態６．細胞シートを積層後、転写時、ホール構造体を用いる方法
本発明により製作された前記細胞シートを積層し、これを他の細胞培養皿または細胞シートの適用を必要とする客体に一層容易に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）するために、次のような方法を使用した。
本発明により製作された前記細胞シートを積層し、これを他の細胞培養皿または細胞シートの適用を必要とする客体に一層容易に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）するために、次のような方法を使用した。
まず、図８に示したように、培養皿上で剥離した１枚の細胞シートをホール構造体（例えば、１つ以上の孔があるニトロセルロースメンブレン）の表面に滴下して付着させた。次に、剥離した他の細胞シートを前記ニトロセルロースメンブレンに先に付着された細胞シートの表面に追加的に滴下して付着させることによって、２枚の細胞シートを積層した。同一な方法を繰り返すと、所望の数の細胞シートをメンブレンに積層することができる。
前記積層した２枚の細胞シートをメンブレンと共に新たな細胞培養皿に移した後、３７℃飽和水蒸気のインキュベーターに適当な時間（例えば、５分間〜３０分間）インキュベーションした。その結果、積層された細胞シートは培養皿上に接着され、ホール構造体メンブレンから落ちる。このように、細胞シートをホール構造体に積層して所望の個所に転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）することが可能である。
以上で説明した本発明は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者において、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内でさまざまな置換、変形、及び変更が可能であるので、前述した実施形態及び添付した図面により限定されるものではない。
Claims (5)
- ジビニルベンゼンと４−ビニルピリジンが形成した共重合体でコーティングされた表面を有し、
前記ジビニルベンゼンと前記４−ビニルピリジンとのモル比が１〜３：４（ジビニルベンゼン：４−ビニルピリジン）であることを特徴とする、培養プレート。 - 前記培養プレートは、細胞シート形態の細胞集合体製造用であることを特徴とする、請求項１に記載の培養プレート。
- 前記培養プレートの素材は、ガラス、金属、金属酸化物、繊維、紙、及びプラスチックで構成された群より選択されることを特徴とする、請求項１から２のいずれかに記載の培養プレート。
- 前記プラスチックは、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＥ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ、ＰＰ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ、ＰＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ、ＰＥＴ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅｓ、ＰＡ）、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ、ＰＥＳ）、ポリ塩化ビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＰＶＣ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｓ、ＰＵ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＰＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＣ）、ポリテトラフルオロエチル（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｔｈｅｒｒｋｅｔｏｎｅ、ＰＥＥＫ）、及びポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ）で構成された群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の培養プレート。
- ジビニルベンゼンと４−ビニルピリジンが形成した共重合体でコーティングされた表面を有する培養プレートで細胞を培養するステップを含み、
前記ジビニルベンゼンと前記４−ビニルピリジンとのモル比が１〜３：４（ジビニルベンゼン：４−ビニルピリジン）であることを特徴とする、細胞シート形態の細胞集合体製造方法。
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