KR101752715B1 - 세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치, 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법{Device for Preparing Cell Sheet and Process for Manufacturing the Same}
본 발명은 세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치, 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.
조직 공학용 지지체(Tissue engineering scaffold)는 배양 시스템 내 세포들을 지지하고 손상된 조직의 재생을 돕는 합성(synthetic) 세포외 매트릭스(ECM)로서의 역할을 한다(Levenberg, S. et al. Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12741-12746 (2003)). 지지체 기술분야에서 재료의 개선 및 구조 설계를 포함한, 상당한 진보가 이루어졌지만(Dvir, T., Timko, B.P., Kohane, D.S. & Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat. Nanotechnol. 6, 13-22 (2011), Sun, J.Y. et al. Highly stretchable and tough hydrogels. Nature 489, 133-136 (2012)), 대부분의 지지체는 수동적인 채로 있고, 즉, 이들은 어떠한 인 시츄 모니터링(in situ monitoring) 기능 없이, 오직 구조적 지지(structural support)만을 제공하여, 궁극적으로 세포의 희생 또는 사멸을 야기하는, 익스 시츄(ex situ) 생물학적 분석법을 사용하게 한다.
따라서, 지속적으로 세포 생리학(cellular physiology) 및 환경을 모니터링하는, 활성 센서를 내장한 지지체는, 조직 공학에서 새로운 개척자(new frontier)에 해당한다(Tian, B. et al. Macroporous nanowire nanoelectronic scaffolds for synthetic tissues. Nat. Mater. 11, 986-994 (2012)).
웨이퍼 기반의 전자장치(Wafer-based electronics)는 이러한 기능을 증명하였으나(Straub, B., Meyer, E. & Fromherz, P. Recombinant maxi-K channels on transistor, a prototype of iono-electronic interfacing. Nat. Biotechnol. 19, 121-124 (2001)); 이러한 강성(rigid) 평면형 웨이퍼는 연성(flexible) 조직과 기계적으로 호환되지 않는다. 연성(Sekitani, T., Zschieschang, U., Klauk, H. & Someya, T. Flexible organic transistors and circuits with extreme bending stability. Nat. Mater. 9, 1015-1022 (2010), Viventi, J. et al. A conformal, bio-interfaced class of silicon electronics for mapping cardiac electrophysiology. Sci. Transl. Med. 2, 24ra22 (2010), Viventi, J. et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nat. Neurosci. 14, 1599-1605 (2011), Kaltenbrunner, M. et al. An ultra-lightweight design for imperceptible plastic electronics. Nature 499, 458-463 (2013)) 및 신축성(Sekitani, T. et al. A rubberlike stretchable active matrix using elastic conductors. Science 16 321, 1468-1472 (2008), Kim, D.H. et al. Epidermal Electronics. Science 333, 838-843 (2011), Keplinger, C. et al. Stretchable, transparent, ionic conductors. Science 341, 984-987 (2013), Son, D. et al. Multifunctional wearable devices for diagnosis and therapy of movement disorders. Nat. Nanotechnol. 9, 397-404 (2014)) 전자장치는 이러한 문제에 대한 실행가능한 해결책(viable solution)을 제공할 수 있다.
한편, 온보드(onboard) 전자 소자의 생분해성(biodegradability) 및 세포독성(cytotoxicity)은 이러한 지지체의 잠재적인 생체 내 이식(the potential in vivo implantation)을 방해할 수 있다. 따라서, 무지지체 세포 시트 치료(scaffold-free cell sheet treatment)는 이러한 한계를 극복하기 위한 매력적인 방법이다. 세포 시트 치료법은 높은 분비작용(high paracrine effects)을 유도함으로써 국부적 치료에 강한 이점을 제공하고, 각막(Nishida, K. et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196 (2004)), 치주(Iwata, T. et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model. Biomaterials 30, 2716-2723 (2009)) 및 심장(Miyahara, Y. et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 459-465 (2006))에 성공적으로 사용되어 왔다.
온도-감응성(temperature-sensitive) 고분자인 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PIPPAm)는 세포 시트의 제조 및 생체 내 모델로의 전달(Haraguchi, Y. et al. Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro. Nat. Protoc. 7, 850-858 (2012))에 폭 넓게 사용되어 왔다.
그러나, 상기 PIPAAm 기판의 초박 두께(<30 nm)를 정밀하게 제어해야 하는(Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M. & Okano, T. Ultrathin poly(Nisopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir 20, 5506-5511 (2004)) 전자 조사 공정(electron irradiation process)은 매우 까다롭다. 또한, 포토리소그래피 과정 중의 불안정성 때문에, 무기(inorganic) 전자장치와 PIPAAm의 융합은 복잡하다. 따라서, 무지지체 세포 시트 치료를 위한 더 간편하고 효율적인 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 기본적인 목적은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (i) 실리콘 웨이퍼 위에 니켈층을 형성하는 단계; (ii) 상기 니켈층 위에 전극층을 차례로 형성하는 단계; (iii) 상기 전극층을 패터닝하는 단계; (iv) 상기 패터닝된 전극층 위에 그래핀층을 형성하는 단계; (v) 상기 그래핀층위에 부착층을 형성하는 단계; (vi) 상기 니켈층을 에칭하여 제거하여 실리콘 웨이퍼를 분리하는 단계; (vii) 상기 분리된 부착층/그래핀층/전극층을 실리콘 고무층 위에 부착하는 단계; 및 (viii) 상기 부착층을 제거하는 단계를 포함하는, 세포 시트 제조용 장치 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치 위에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 시트 제조 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치를 제공함으로써 달성될 수 있다.
상기 지지층을 구성하는 실리콘 고무는 유리, PET 필름, 웨이퍼 또는 폴리디메틸실록산일 수 있다. 바람직하게는 폴리메틸실록산일 수 있다. 폴리메틸실록산은 유연하고 신축성이 있으며, 상기 세포층의 배양에 적합한 시스템 모듈러스를 가지므로 세포시트의 전사 인쇄에 효과적이다.
또한, 상기 전극은 Al, Cu, Pt 또는 Cr/Au 전극일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전극은 Cr/Au 전극일 수 있다. 예를 들면, 열 증발기(thermal evaporator) 또는 전자빔 증발기(e-bean evaporator)를 이용해 증착할 수 있는 금속들을 상기 전극의 재료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, Au은 기판과의 접착력이 크지 아니하므로, 상기 Au과 접착력이 좋은 Cr을 상기 기판 위에 얇게 증착한 후에 다시 Au을 Cr 박막 위에 증착시킬 수 있다.
또한, 상기 그래핀층은 패터닝된 것일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 근육 세포가 신체 내에서 정렬되어 있기 때문에, 상기 그래핀을 패터닝하면, 근육세포가 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식하므로 근육 세포를 배양하기에 적합하다. 예를 들면, 상기 그래핀을 5 μm 이하의 간격으로 일자로 배열되게 패터닝하염, 근육세포가 그 위에 배양될 때 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식된다.
더욱이, 상기 전극을 통해 얻은 전기적 신호로부터 세포의 성장 및 증식 상태를 실시간으로 확인할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 서로 떨어진 두 전극사이의 세포배양액에 흐르는 교류 전류를 통해 임피던스, 그리고 직류 전류를 통해 컨덕턴스를 읽어낼 수 있다. 전극 위에 세포가 배양되면 세포로 인해 전류의 흐름이 변화되고 이로 인해 임피던스 및 컨덕턴스의 결과가 달라진다. 이러한 원리를 이용해 세포의 증식과 분화에 따라 임피던스와 컨덕턴스의 변화 값을 실시간으로 측정함으로써 세포 상태의 변화를 확인할 수 있다. 다음으로, 온도의 변화는 다음과 같이 측정된다. 금속의 경우 온도에 따라 금속의 저항이 달라진다. 따라서 저항을 측정하게 되면 전극 주변의 온도 신호를 알 수 있게 된다. 이러한 온도 센서를 이용해 세포 배양 시 온도 환경의 변화를 실시간으로 측정할 수 있는 장점을 가지게 된다.
본 발명의 하나의 실시 태양에서, 본 발명의 세포 시트를 이용하여 세포(예를 들면, 근육세포)를 재생 및 치료하기 위해서, 우선 세포시트를 옮기기 위해 전사 인쇄(transfer printing) 과정을 거친다. 기판을 이용해 세포 시트를 전사인쇄하기 위해서는 다음의 두 단계를 거쳐야 한다: i) (준비 단계) 세포 시트가 부착되어 있는 장치를 세포 배양액에서 꺼내어 플라스틱 기판 위에 뒤집어(세포 시트와 플라스틱 기판이 맞닿도록) 얹는다. 약 30초 후에 장치를 떼어내면 세포 시트가 상기 장치와 부착된 채로 상기 플라스틱 기판 위에서 떨어진다. ii) (전사 단계) 상기 준비 단계를 거친 세포 시트가 붙어 있는 장치를 원하는 표적 조직에 뒤집어(세포시트와 조직이 맞닿도록) 얹는다. 밀착 부착이 되도록 PDMS 고무를 부드럽게 눌러주어 기포를 제거한다. 약 90초 후에 장치를 떼어내면, 상기 세포 시트는 표적 조직에 부착된 채로 남아있고, 나머지 장치는 분리된다. 상기 두 단계를 반복적으로 수행함으로써 여러 층의 세포 시트를 3차원 구조로 생체 내 조직위에 전사인쇄할 수 있다. 이식된 세포 시트는 생체 내에서 증식 및 분화를 진행하며, 주변의 손상된 조직의 재생을 촉진하는 다양한 물질을 분비하여 손상된 조직의 재생에 직접적/간접적으로 작용한다.
전술한 본 발명의 다른 목적은 (i) 실리콘 웨이퍼 위에 니켈층을 형성하는 단계; (ii) 상기 니켈층 위에 전극층을 차례로 형성하는 단계; (iii) 상기 전극층을 패터닝하는 단계; (iv) 상기 패터닝된 전극층 위에 그래핀층을 형성하는 단계; (v) 상기 그래핀층위에 부착층을 형성하는 단계; (vi) 상기 니켈층을 에칭하여 제거하여 실리콘 웨이퍼를 분리하는 단계; (vii) 상기 분리된 부착층/그래핀층/전극층을 실리콘 고무층 위에 부착하는 단계; 및 (viii) 상기 부착층을 제거하는 단계를 포함하는, 세포 시트 제조용 장치 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 세포 시트 제조용 장치 제조 방법에 있어서, 상기 전극층은 Al, Cu, Pt 또는 Cr/Au 전극층일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전극층은 Cr/Au 전극일 수 있다. 예를 들면, 열 증발기(thermal evaporator) 또는 전자빔 증발기(e-bean evaporator)를 이용해 증착할 수 있는 금속들을 상기 전극의 재료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, Au은 기판과의 접착력이 크지 아니하므로, 상기 Au과 접착력이 좋은 Cr을 상기 기판 위에 얇게 증착한 후에 다시 Au을 Cr 박막 위에 증착시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 시트 제조용 장치 제조 방법에 있어서, 상기 (v)단계 이전에 상기 그래핀 층을 패터닝하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 근육 세포가 신체 내에서 정렬되어 있기 때문에, 상기 그래핀을 패터닝하면, 근육세포가 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식하므로 근육 세포를 배양하기에 적합하다. 예를 들면, 상기 그래핀을 5 μm 이하의 간격으로 일자로 배열되게 패터닝하염, 근육세포가 그 위에 배양될 때 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식된다.
더욱이, 상기 부착층은 PMMA(poly(methyl methacrylate))일 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 부착층은 PMMA A4 또는 PMMA A2일 수 있다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 실리콘 고무로 이루어진 지지층, 상기 지지층에 인접하여 형성된 패터닝된 전극, 및 상기 전극에 인접하여 형성된 그래핀층을 포함하는 세포 시트 제조용 장치 위에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 시트 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 세포 시트 제조 방법에 있어서, 상기 실리콘 고무는 폴리디메틸실록산일 수 있다.
또한, 상기 전극은 Al, Cu, Pt 또는 Cr/Au 전극일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전극은 Cr/Au 전극일 수 있다. 예를 들면, 열 증발기(thermal evaporator) 또는 전자빔 증발기(e-bean evaporator)를 이용해 증착할 수 있는 금속들을 상기 전극의 재료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, Au은 기판과의 접착력이 크지 아니하므로, 상기 Au과 접착력이 좋은 Cr을 상기 기판 위에 얇게 증착한 후에 다시 Au을 Cr 박막 위에 증착시킬 수 있다.
또한, 상기 그래핀층은 패터닝된 것일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 근육 세포가 신체 내에서 정렬되어 있기 때문에, 상기 그래핀을 패터닝하면, 근육세포가 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식하므로 근육 세포를 배양하기에 적합하다. 예를 들면, 상기 그래핀을 5 μm 이하의 간격으로 일자로 배열되게 패터닝하염, 근육세포가 그 위에 배양될 때 일자 방향으로 방향성을 가지며 증식된다.
또한, 상기 세포를 배양하는 동안에 상기 전극을 통해 얻은 전기적 신호로부터 상기 세포의 성장 및 증식 상태를 실시간으로 확인할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 서로 떨어진 두 전극 사이의 세포배양액에 흐르는 교류 전류를 통해 임피던스, 그리고 직류 전류를 통해 컨덕턴스를 읽어낼 수 있다. 전극 위에 세포가 배양되면 세포로 인해 전류의 흐름이 변화되고 이로 인해 임피던스 및 컨덕턴스의 결과가 달라진다. 이러한 원리를 이용해 세포의 증식과 분화에 따라 임피던스와 컨덕턴스의 변화 값을 실시간으로 측정함으로써 세포 상태의 변화를 확인할 수 있다. 다음으로, 온도의 변화는 다음과 같이 측정된다. 금속의 경우 온도에 따라 금속의 저항이 달라진다. 따라서 저항을 측정하게 되면 전극 주변의 온도 신호를 알 수 있게 된다. 이러한 온도 센서를 이용해 세포 배양 시 온도 환경의 변화를 실시간으로 측정할 수 있는 장점을 가지게 된다.
본 발명의 장치를 이용해 세포 시트를 제작함으로써 여러 가지 복잡한 방법을 통해 알 수 있었던 세포의 생리학적 변화를 전기적 신호로 간단히 그리고 실시간으로 확인할 수 있으며, 이러한 실시간 측정 방법은 실험의 용이성과 정확성을 담보한다. 더욱이, 전기적 신호를 관찰함으로써 종래의 실험 방법에서 유발되는 세포의 손실을 막아주는 장점 또한 가진다.
또한, 실시간으로 세포의 상태를 관찰함으로써 최적의 상태에서 세포 시트를 전사인쇄할 수 있기 때문에, 치료의 효과를 극대화할 수 있다. 이렇게 제작된 활성화된 세포 시트를 새롭게 개발된 전사인쇄 기법을 통해 100%에 근접한 높은 수율로 원하는 생체 조직에 전사인쇄함으로써 손상된 조직의 재생을 극대화할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 지지체이고(우측 상단의 삽입도는 구불구불한 모양의 버클링된 금 전극의 확대도), 상기 지지체는 저모듈러스 PDMS 시트 상에 패터닝된 그래핀 나노리본(상부 층) 및 금 나노멤브레인 임피던스/온도 센서(하부 층)으로 이루어져 있으며, 도 1b는 상기 지지체의 각 구성요소의 확대도이고, C2C12 세포는 상기 패터닝된 그래핀 상에 배양되며, 도 1c는 본 발명의 신축성 전자 지지체에 대한 4 가지의 주요한 응용, 즉 i) C2C12 근모세포의 정렬, ii) 증식 및 분화의 인 시튜 모니터링, iii) 시험관 내, 새로운 나노물질 및 약물의 효과 평가, 및 iv) 생체 내에서 동물 모델의 표적 부위로의 배양된 세포의 전사인쇄를 보여 준다.
도 2a는 본 발명의 신축성 있는 전자 지지체의 제조 방법의 개략도이고, 도 2b는 패터닝된 그래핀 나노리본과 함께, 임피던스 및 온도 센서에 대한 오토캐드 설계를 보여 준다.
도 3a는 피브로넥틴 분자 및 그래핀 사이의 부착력 측정 결과(좌측 프레임은 피브로넥틴으로 코팅된 AFM 팁을 사용한 AFM 부착력 측정의 개략도를 나타내고, 우측 프레임은 포스 맵(force map)을 나타낸다)이고, 도 3b는 패터닝된 그래핀의 생체친화적이고 세포친화적인 표면을 보여주는 사진이며, 도 3c는 패터닝된 그래핀 나노리본 상에 정렬된 C2C12 근모세포의 사진(배선 및 간격 모두 약 5 μm의 폭)이고, 도 3d는 다른 그래핀 피처 크기(feature size)에 대한 배양 시간의 함수로서의 세포 정렬비(cell alignment ratio)를 보여주며(작은 피처 크기(배선 및 간격 모두 약 5 μm의 폭)는 큰 피처 크기에 비해 더 잘 정렬된다), 도 3e는 수평(상단) 및 수직(하단) 패턴이 공존하는 패터닝된 그래핀 상의 세포 정렬(좌측 프레임) 및 적색 및 청색 점선 박스 영역의 확대된 사진(우측 프레임)을 보여 주고, 도3f 내지 3h는 PDMS(P), 그래핀(G) 및 패터닝된 그래핀(PG)을 포함하며 다른 기판 상에서 배양한 지 7일 후의 근모성 분화를 통한 근관의 형성을 보여 주며(백색 화살표는 근관의 정렬 방향을 나타낸다), 도 3i는 다른 기판상에서의 근관 면적 및 정렬비의 플롯을 보여 준다.
도 4a는 PDMS 상의 패터닝된 그래핀의 AFM 위상(topology) 사진이고(켄틸레버(TESP, Bruker probes)의 스프링 계수는 42 N/m이고, 모든 AFM 데이터는 탭핑 모드(tapping mode)로 측정되었다. 데이터를 나노스코프 분석 소프트웨어(NanoScope Analysis software)(Bruker)로 시각화하였다), 도 4b는 PDMS 상에 패터닝된 그래핀의 AFM 위상 그래프이며, 도 4c는 다양한 기판(PDMS, 그래핀, 패터닝된 그래핀(배선 및 간격의 폭; 5 μm), 및 커버글라스)의 물 접촉각이다.
도 5는 패턴 크기 및 배양 시간에 대한 세포 정렬의 위상차 현미경 사진이다. 도 5에서, 세포 정렬을 위한 최적의 패턴 폭을 찾기 위하여, C2C12 근모세포를 배선 및 간격 폭(0, 3, 5, 10, 20, 50, 및 100 μm)이 다른 7 개의 다른 그래핀 패턴 상에 배양하였다. 각 샘플을 다른 시각(상기 배양 후, 24, 48, 및 72시간)에서 위상차 현미경으로 관찰하였다.
도 6은 5 μm의 배선 및 간격을 갖는 그래핀 나노리본 상의 C2C12 근모세포의 실시간 모니터링 결과이다.
도 7a는 PDMS 기판 상에 집적된 임피던스 및 온도 센서이고, 도 7b는 온도 센서의 교정 곡선이며(온도의 함수로서 정규화된 저항(normalized resistance)(% R 변화). 적색 화살표는 배양하는 동안의 상기 성장 배지의 온도를 나타낸다), 도 7c는 상기 성장 배지 내 37℃에서 임피던스 센서의 전기적 특성을 보여 주고(임피던스 곡선을 0.01 V의 바이어스 전압에서 1 Hz부터 1 MHz까지 측정하였다. 삽입도는 적색 점선 영역의 확대도이다), 도 7d는 기울기가 전도도인 전류-전압(I-V) 곡선이며(삽입도는 확대도를 나타낸다. 반복된 측정 값으로 상기 센서의 안정성을 확인하였다), 상기 임피던스 곡선은 증식(도 7e) 및 분화(도 7f)가 진행함에 따라 변하였고, 도 7g는 배양이 진행됨에 따라, 17.7 kHz에서 측정된 임피던스 값을 보여 주며(적색 및 청색의 곡선은 각각 성장 및 분화 배지 내의 세포를 나타낸다. 대조군(흑색)으로서 인간 진피 섬유아세포를 사용하였다), 도 7h는 -0.1 내지 +0.1 V 까지 범위의 I-V 곡선으로부터 계산된 전도도 값이고, 도 7i는 ROS를 제거하는 세리아 나노입자의 개략도 및 TEM 사진(백그라운드 사진)이며(상기 세리아 나노입자(Ceria NP)를 올레일아민 및 메톡시-PEG로 기능화(functionalize)하였다), 도 7j는 H2O2/Ceria NP 처리 30분 후, C2C12 근모세포(칼세인 AM으로 염색된)의 형광 사진이고, 도 7k는 형광 사진으로부터 얻은 상대 생존력(relative viability) 플롯이며, 도 7l은 다른 처리군에서 시간의 함수로서의 임피던스 플롯이다.
도 8a 및 8b는, 각각, 과산화 수소 및 세리아 나노입자(Ceria NP)의 농도에 따른 세포의 상대 생존력 플롯이고, 도 8c는 5 mM 및 10 mM의 H2O2로 처리한 세리아 나노입자의 농도 대 세포의 상대 생존력 그래프이다. 최적화된 ROS의 농도는, H2O2 처리된 C2C12 근모세포의 수가 30분 내에 50 %로 감소할 때 정해진다. H2O2 및 세리아 나노입자 처리 후, 상기 샘플을 MTT 용액(Amresco)에서 3시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(SpectraMax M3, Moelcular Device)를 사용하여 데이터를 정량화하였다.
도 9a는 상기 세포 시트 전사인쇄 과정에 대한 사진이고, 도 9b는 상기 단백질 패터닝된 유리 기판 상의 헤마톡실린으로 염색된 전사된 세포 시트의 사진이며(삽입도는 칼세인 AM(녹색) 및 에티디움 호모다이머-1(적색)로 염색된 LIVE/DEAD 생존력 분석 사진을 나타낸다), 도 9c는 미오신 중쇄(myosin heavy chain)가 상기 세포 시트 전사 후에도 유지되다었다는 점을 보여 주고(백색 화살표는 정렬된 방향을 나타낸다), 도 9d 및 9e는, 각각, 전사 단계에서 접촉 시간의 함수로서 및 배양 시간의 함수로서 세포 시트의 전사 수율의 플롯이며(삽입도는 전사된 세포 시트의 사진을 나타낸다), 도 9f는 헤마톡실린으로 염색된 세포 시트의 5 x 5 cm의 사진 및 이의 확대도(삽입도)이고, 도 9g는 직교 방향 적층구조인 3 개의 전사된 세포 시트의 개략도이며, 도 9h는 상기 3층(three-layered) 세포 시트의 공초점 사진이다(사진은 6 μm의 깊이 간격으로 캡쳐되었다. 백색 화살표는 세포 정렬 방향을 나타낸다).
도 10a는 두 가지 다른 박리력 하에서, 에너지 방출률 G 대 균열 길이 a의 분석(곡선) 및 FEM(중실원) 결과이고, 도 10b는 제조 단계 없이, 단백질로 코팅된 유리에 세포 시트를 직접 전사했을 때, 상기 세포-유리 계면을 따른 균열이 전파되기 위한 임계력(critical force)이 세포-그래핀 계면에 따른 것에 비해 작았고, 이는 상기 세포 그래핀의 부착이 더 강하다는 점을 보여 주며, 도 10c는 상기 제조 단계 동안에, 상기 세포 시트의 가장자리가 PDMS 층을 박리하는 동안, 상기 균열 선단에서 응력 집중(stress concentration)에 의해 손상되었다는 점을 보여 주고, 도 10d는 상기 세포 시트 내 손상을 제조 단계 후, 위상차 현미경으로 볼 수 있다는 점을 보여 주며, 도 10e는 최종 전사 단계 동안에, 상기 제조 단계 동안에 도입된 비교적 긴 세포-그래핀 계면의 결함이 세포-유리 경계면에 비해, 이러한 계면에 따른 균열을 전파하기 위한 임계력을 낮춘다는 점을 보여 주고, 도 10f는 PDMS의 가장자리가 없는 경우, 즉, 상기 전체 PDMS 표면이 그래핀으로 덮인 경우, 상기 세포-그래핀 계면 결함 영역은 더욱 작아지고, 따라서 상기 세포-그래핀에 따른 균열을 전파하기 위한 힘이 성공적으로 전사하기에 충분할 만큼 감소하지 아니하였다는 점을 보여 준다.
도 11a는 마우스의 상처난 다리 근육에 적용된 세포 시트 전사인쇄의 사진이고, 도 11b는 세포 추적자(DiD)로 표지한 5층 C2C12 세포 시트의 전사인쇄 후 1 일(좌) 및 7 일(우)에서의 생체 내 형광 영상화이며, 도 11c는 이식 7일 후 상기 수술 부위의 전사인쇄된 세포(GFP-발현 C2C12 근모세포)의 증식을 보여 주고, 도 11d는 상기 수술한 마우스의 CT 사진(좌측에서 우측으로 수술 전, 수술 후, 세포 시트(5층) 이식 7일 후, 및 음성 대조군(negative control)(세포 시트 이식 안함), 백색 화살표는 상기 수술 부위를 나타낸다. 삽입도는 상기 음성 실험군의 수술 전 사진을 나타낸다)이며, 도 11e 및 11f는 형태학적 관찰을 위한, 상기 세포 시트(5층)의 이식 7일 후, 수술한 다리(도 11e) 및 상기 세포 시트를 이식하지 아니한(도 11f) 음성 대조군의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과(적색 점선 박스는 확대도를 나타낸다)이고, 도 11g는 GFP의 발현에 의해 나타난 바와 같이, 손상된 근육 주위에서의 상기 세포 시트의 증식을 보여 주며, 도 11h는 손상된 근육 주위의 상기 세포 시트의 분화를 보여 주고, 도 11i는 이식 7일 후, 상기 전사된 세포 시트 부위 내의 혈과신생(흑색 화살표)을 보여 준다.
이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실시예 1. 전자 지지체의 제조
그래핀을 화학 기상 증착(CVD) 성장 방법(Li, X. et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science 324, 1312-1314 (2009))을 이용하여 합성하였고, 1000℃에서 메탄(20 sccm, 1.6 torr) 및 수소(8.4 sccm, 0.8 torr)의 혼합물과 함께 구리 호일(Alfa Aesar, 6 cm x 6 cm 구획으로 절단) 상에서 성장시켰다. 상기 전자 지지체의 제조 방법 및 상기 센서의 오토캐드(AutoCAD) 설계를 각각 도 S1a 및 S1b에 나타내었다. 희생층(sacrificial layer)으로서 니켈(30 nm)을 열 증착법(thermal evaporation)으로 실리콘 웨이퍼(테스트 등급, 4Scinece) 상에 증착시켰다. 다음으로, 7 nm의 크롬(부착 층) 및 150 nm의 금을 열 증착법으로 니켈이 증착된 실리콘 웨이퍼 상에 증착시켰고, 포토리소그래피로 패터닝하였으며, 습윤 에칭(wet etching)하였다. 다음으로, 상기 그래핀을 샘플 상에 전사하였고, 포토리소그래피 및 O2 플라즈마(100 sccm의 O2 유속, 챔버 압력 100 mtorr, 150 W의 RF 전력 25 초간)를 이용한 반응성 이온 에칭(reactive ion etching, RIE)을 통해, 5 μm 간격(line) 및 5 μm 여백(space)으로 패터닝하였다. 상기 샘플을 3000 rpm에서 30 초간, 폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA; A4, Microchem; 약 300 nm)로 스핀코팅(spin coat)하였고, 이어서, 30 분간 니켈 식각액(etchant)에 침지(immerse)하였다. 상기 샘플을 저 모듈러스 PDMS(Sylgard 527, Dow Corning; part A 에서 B의 비율 1:2; 600 μm의 두께)에 전사하였고, 10 분간 70 ℃의 오븐에서 건조시켰다. 마지막으로, 상기 PMMA를 아세톤으로 제거하였다. 상기 샘플의 탄성 계수를 디지털 포스 미터(digital force meter, Mark-10)로 측정하였다. 임피던스 및 온도 센서에 의한 전기적 측정(Electrical measurement)을 각각 이방성 도전 필름(anisotropic conductive film, ACF)과 연결된, 일렉트로케미칼 워크스테이션(CHI660E, CH Instrument) 및 파라미터 분석기(B1500A, Agilent)로 수행하였다(Son, D. et al. Multifunctional wearable devices for diagnosis and therapy of movement disorders. Nat. Nanotechnol. 9, 397-404 (2014)).
본 실시예에서, 생체적합성 저모듈러스(low-modulus)(약 36.2 kPa) 폴리디메틸실록산(PDMS) 계면 상에, 신축성 있는 나노멤브레인(nanomembrane) 전자 소자 및 패터닝된 그래핀 나노리본 얼라이너(patterned graphene nanoribbon aligner)를 포함하는, 전자계장화된(electronically instrumented) 유연한 지지체를 제조하였다(도 1a 및 1b). 상기 저모듈러스 PDMS 기판은 본래의 골격 근육 조직(native skeletal muscle tissue)과 양립가능한 최적의 유연성(softness)을 제공한다. 구불구불하고(serpentine), 버클링된(buckled) 금 나노멤브레인에 기반한, 신축성 있는 생리(physiology)(임피던스 및 온도) 센서를 포토리소그래피를 이용하여 제조하였다(도 2a 및 2b). 이방성으로(Anisotropically) 마이크로패터닝된(약 5μm 배선 및 공간) 그래핀 나노리본은 세포 부착(cell adhesion)을 촉진하고, 세포를 정렬하며, 증식 및 분화를 용이하게 하였다. PDMS 위에 금 나노멤브레인 및 그래핀 나노리본을 추가하면 상기 시스템의 모듈러스가 36.2 kPa에서 42.1 kPa로 약간 증가할 뿐이었다. 이러한 신축성 있는 전자 지지체는 다음의 4 개의 주요 기능을 가지고 있다(도 1c): i) 패터닝된 그래핀 나노리본상의 세포를 정렬하여 근육 세포 분화를 촉진, ii) 증식 및 분화하는 동안, 통합된 센서에 의한 세포의 실시간 생리적 모니터링, iii) 시험관 내 머슬-온-어-칩(muscle-on-a-chip) 플랫폼으로서 새로운 나노물질 또는 약물을 시험하기 위한 역할, 및 iv) 무지지체 세포 시트 치료(scaffold-free cell sheet treatment)를 위한 세포 층의 생체 내 전사인쇄(transfer printing).
실시예 2. 그래핀의 단백질 상호작용력( interaction force ) 측정
피브로넥틴 분자와 그래핀 간의 부착력을 기술하는 모든 데이터를 원자력 현미경(atomic force microscope, AFM)(Dimension Icon, Bruker)으로 얻었다. 상기 AFM 팁(tip)을 피브로넥틴으로 기능화하기 위하여, 상기 팁을 3분 동안 UV/오존 클리너(Yuil Ultra Violet System)로 세척하였고, 이어서 아세톤으로 추가적인 세척을 하였다. 다음으로, 상기 팁을 피브로넥틴 용액(증류수 내 5 μg/mL; Invitrogen)에 침지하였고, 실온에서 완전히 건조시켰다. 켄틸레버(cantilever)의 스프링 상수(ScanAsyst-Air, Bruker probes)를 온도 조정 함수를 사용하여 보정하였고, 모든 AFM 실험을 피크포스(PeakForce) QNM 모드로 수행하였다.
실시예 3. 세포 배양
C2C12 근모세포(CRL-1772; ATCC) 및 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)(PCS-201-012; ATCC)를 실험에 사용하였다. C2C12 근모세포를 다음과 같은 두 종류의 배지에서 배양하였다: 10%의 우태아 혈청(FBS, Gibco) 및 1 %의 페니실린-스트렙토마이신(PS, Gibco)이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)로 구성된 증식 배지; 및 5%의 말 혈청(HS, Gibco) 및 1%의 PS가 보충된 DMEM으로 구성된 분화 배지(근관의 형성을 유도). 인간 진피 섬유아세포를 10% FBS 및 1% PS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 상기 세포를 37 ℃ 및 5% CO2의 표준 배양 조건 하에 배양하였다. 샘플 상에 세포를 배양하기 전, 상기 제조된 샘플을 70% 에탄올로 멸균하고 UV에 노출하였다. 상기 세포를 상기 지지체에 각 실험에 따라 다음과 같은 다른 농도로 접종하였다: 상기 패터닝된 그래핀 나노리본 상의 세포 거동(cellular behavior)의 관찰(도 3) 및 전기적 신호 측정(도 7e 내지 7h)을 위해 2 x 104 세포/cm2, 또는 머슬-온-어-칩(도 7i 내지 7l) 및 세포 시트의 전사 인쇄를 구현하기 위한 5 x 104 세포/cm2(도 9 및 11; 도 9e에 대하여, 세포를 2 x 104 세포/cm2 의 평판(plate) 배양하였다).
실시예 4. 패터닝된 그래핀 상의 세포 특성
세포 거동에 대한 패터닝된 그래핀의 효과를 관찰하기 위하여, 상기 지지체 상의 세포를, 성장 배지 내 0.5 μM 칼세인 AM 및 5 μM 에티디움 호모다이머-1(ethidium homodimer-1)를 사용한 LIVE/DEAD 생존력 키트(Life Technologies)로 염색하였고, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon)을 사용해 관찰하였다. 패터닝된 그래핀상의 상기 세포의 정렬 비를 측정하기 위하여, 그래핀 상의 다양한 패턴 크기(간격/여백 크기: 3/3, 5/5, 10/10, 20/20, 50/50, 또는 100/100 μm)를 상기 저모듈러스 PDMS상에 제조하였다. 상기 샘플 상에 배양된 상기 C2C12 근모세포를 위상차 현미경(CKX41, Olympus)으로 3 일 동안 관찰하였다. 4 개의 대표 이미지를 각 군으로부터 캡쳐하였고, 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 상기 정렬 비를 얻었다. 세포골격 액틴(cytoskeletal actin)의 정렬을 관찰하기 위하여, 상기 세포를 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidine)(Life Technologies)으로 대조 염색(counter stain)하였고, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon)으로 관찰하였다. 상기 배양된 세포를 10분 동안 인산염완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 희석된 4% 파라포름알데히드 용액(Sigma-Aldrich)으로 고정시켰고, 세포골격(cytoskeleton, CSK) 버퍼(150 mM 자당(sucrose), 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 50 mM 트리즈마 베이스(Trizma-base), 및 0.5% Triton X-100, pH 6.8)에서 5분 동안 투과성을 증가시켰다. 다음으로, 상기 세포를 비특이적 결합 부위를 차단하기 위하여, 2 시간 동안 차단 완충액(10% FBS 및 0.1% PBS 내 Tween-20)에서 배양하였고, 이어서, 37℃에서 1 시간 동안 팩실린(1:100; Invitrogen)에서 배양하였다. 세척 후, 상기 샘플을 DAPI로 대조 염색하였고, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon)으로 관찰하였다.
도 3은 상기 패터닝된 그래핀을 조직 공학용 지지체에 적용한 세포 정렬(cell alignment)의 세부 사항을 나타낸다(도 2a). 상기 정렬된 그래핀 나노리본을 저모듈러스 PDMS 기판 상에 전사하였다. 시트 저항은 약 1kΩ/sq이었고(4-포인트 프로브 시스템[CMT-100MP, Advanced instrument Technology]을 사용하여 측정), 상기 그래핀의 물 접촉각(water contact angle)은 약 112.38°이었다(도 4a 내지 4c; 다른 특성 포함). 상기 그래핀의 π-π 상호작용 및 소수성, 2 차원 탄소 나노시트는, 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 팁을 사용한 원자력 현미경(AFM) 분석에 나타난 바와 같이, PDMS 단독에 비해 6 배 강한 단백질 부착을 야기하였다(도 3a). 상기 강하게 부착된 그래핀 상의 ECM 단백질의 특성은 세포 부착을 용이하게 하였다. 배양 3 일 후, C2C12 근모세포(myoblast)는 상기 그래핀 나노리본 상에 바람직하게 증식하였다(도 3b; 형광 현미경 이미지, 칼세인 AM으로 염색).
상기 그래핀 나노리본의 라인 앤드 스페이스(line and space)는 세포 정렬에 중요하다. C2C12 근모세포를 3일 동안 그래핀 나노리본 기판상에 다른 피쳐 사이즈(feature size)로 배양하였다(도 5). 배양하는 동안의 세포 정렬을 모니터링하기 위하여 위상차 현미경을 이용하였다(도 3c, 공초점현미경에 의한 실시간 모니터링 결과를 도 6에 나타내었다). 상기 세포 방향이 리본 방향에 대하여 -10° 내지 +10° 범위 내에 있을 때, 세포가 그래핀 나노리본 패턴을 따라 정렬된 것으로 간주하였다. 나노리본의 라인 앤드 스페이스가 약 5μm 이하인 그래핀 패턴은, 10 μm 내지 50 μm의 경우에 비해 더 높은 정렬비(alignment ratio)를 나타내는 반면, 100 μm에서는 거의 정렬되지 않음을 나타낸다(도 3d). 도 3e는 수평(위) 및 수직(아래) 패턴이 서로 인접하는 그래핀 나노리본 상의 세포 정렬을 나타낸다. 우측 프레임은 이의 확대도를 나타낸다. C2C12 근모세포 분화는, 미오신 중쇄(myosin heavy chain, MHC) 면역염색으로 표시된 바와 같이, 패터닝된 그래핀 나노리본에 의해 향상되었다(도 3f 내지 3h). C2C12 근모세포는 PDMS 또는 패터닝되지 아니한 그래핀에서의 성장에 비해 패터닝된 그래핀에서 성장할 때(도 3i), 더 큰 근관 면적(larger myotube area) 및 높은 정 비를 나타내었다.
실시예 5. 근관 형성의 관찰
상기 분화된 C2C12 세포에 형성된 근관(myotube)의 면적 및 정렬비를 결정하기 위하여, 상기 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시켰고, CSK 버퍼로 투과성을 증가시켰으며, 차단 완충액으로 차단시켰다. 다음으로, 상기 세포를 항미오신 중쇄 항체(anti-myosin heavy chain antibody)(1:100 희석; Abcam)와 함께 배양한 후, 37℃에서 1 시간 동안, 알렉사 플루오르 488 동키 안티마우스 IgG(Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG)(1:100 희석; Abcam)와 함께 배양하였다. 세척 후, 상기 세포를 DAPI로 대조 염색하였고, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon)으로 관찰하였다. 4 개의 대표 이미지를 각 군으로부터 캡쳐하였고, 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 각 이미지의 상기 근관의 면적 및 정렬비를 측정하였다.
임피던스 및 온도 센서 또한 상기 저모듈러스 PDMS 기판 상에 통합되었지만, 세포 활동의 인 시튜 모니터링(in situ monitoring)이 가능한, 상기 패터닝된 그래핀 나노리본의 하단에 통합되었다(도 7a). 세포 증식 및 분화는 전극 주변의 전기화학적 환경을 변경하고, 이러한 변화는 임피던스 또는 전도도의 변화로서 검출될 수 있다. 상기 임피던스 센서의 경우에 있어서, 교류 전류(AC)는, 배양 배지 내에서 600 μm 만큼 간격이 있는 두 구불구불한 전극 사이에 흐른다. 상기 온도 센서의 경우, 구불구불한 금 나노멤브레인에 기반한 저항 온도 감지기를 사용하였다. 도 7b 내지 7d는 온도, 임피던스, 및 전도도 센서의 교정곡선(calibration curve)을 나타낸다. 도 7e 및 7f는 C2C12 근모세포의 증식 및 분화하는 동안의 각 임피던스 변화를 나타낸다. 전극 상의 상기 세포는 상기 전극과 전도성 배지(conductive media) 사이의 접촉을 방해하는 절연 장벽(insulating barrier)으로서 작용하여, 세포를 증식시켜 측정 임피던스를 증가시켰다(도 7e). 근모성 분화(myogenic differentiation)가 일어나는 동안의 근관의 형성으로 인해 전도도가 증가하였고, 따라서 임피던스가 감소하였다(도 7f). 도 7g는 시간에 따른 17.7 kHz에서의 세포 생리 변화에 대한 임피던스의 변화를 나타낸다. 관형 구조(tubular structure)를 형성하지 않는 섬유아세포를 대조군으로서 사용하였다. 이러한 비교는, 증식이 임피던스를 증가시키는는 반면에 분화는(성장 배지 또는 분화 배지 내) 임피던스를 감소시킴을 예증하였다. 상응하는 전도도 측정값은 반대 경향을 나타내었다(도 7h).
실시예 6. 세리아 나노입자의 제조
세리아 나노입자를 합성하기 위하여, 1 mM (0.4 g)의 세륨(III) 아세테이트(98 %, Sigma-Aldrich) 및 12 mM (3.2 g)의 올레일아민(C18 함량 약 80 % 내지 90 %, AcrosOrganics)을 15 mL의 자일렌(98.5 %, Sigma-Aldrich)에 첨가하였다. 상기 혼합 용액을 실온에서 15 분 동안 초음파 처리(sonicate)하였고, 다음으로, 90 ℃로 가열하였다. 90 ℃에서 격렬한 교반 하에 1 밀리미터의 증류수를 상기 용액에 주입하였고, 상기 용액의 색이 상기 반응이 일어난 것을 나타내는 회백색(off-white)으로 변화하였다. 상기 생성된 혼합물을 90 ℃에서 3 시간 동안 숙성시켰고, 이어서, 실온으로 냉각시킨 밝은 황색 콜로이드 용액을 수득하였다. 아세톤(100 mL)를 상기 침전된 세리아 나노입자에 첨가하였다. 상기 침전물을 원심분리기를 사용하여 아세톤으로 세척하고, 상기 생성된 세리아 나노입자를 예를 들어, 클로로포름과 같은 유기 용매에 용이하게 분산시켰다. 인지질-PEG-캡핑된(phospholipid-PEG-capped) 세리아 나노입자를 합성하기 위하여, 클로로포름에 분산된 상기 세리아 나노입자를 PEG-인지질 쉘(shell)로 캡슐화하였다. 먼저, 3 mL의 CHCl3 내 세리아 나노입자(10 mg/mL)를 30 mg의 mPEG-2000 PE를 함유한 3 mL의 CHCl3 용액과 혼합하였다. 다음으로, 상기 용매를 회전 증발기를 사용하여 증발시켰고, 상기 클로로포름을 완전히 제거하기 위하여, 70℃의 진공 상태에서 1 시간 동안 배양하였다. 5 mL의 증류수를 첨가하여 맑고 밝은 연황색(light-yellowish) 현탁액을 수득하였다. 여과 후, 과량의 mPEG-2000 PE를 초원심분리기(ultracentrifugation)를 사용하여 제거하였다. 정제된 인지질-PEG-캡핑된 세리아 나노입자을 증류수에 분산시켰다.
실시예 6. 머슬 -온-어-칩의 적용
시간에 따른 상기 세포의 생존력을 관찰하기 위하여, 세포를 5 mM H2O2 및/또는 0.1 mM의 세리아 나노입자로 처리하였다. 이어서, 5 개의 시점(0, 300, 600, 900, 또는 1800 초)에서 선택된 세포들을 LIVE/DEAD 생존력 분석 배지(성장 배지 내 0.5 μM 칼세인 AM 및 5 μM 에티디움 호모다이머-1)에서 30분 동안 배양하였고, 형광 현미경(Nikon)으로 시각화하였다. 4 개의 대표 이미지를 각 군으로부터 캡쳐하였고, 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 생존 세포(녹색)의 면적을 측정하였다. 전기적 신호의 모든 데이터는 일렉트로케미칼 워크스테이션(CHI660E, CH Instrument)을 사용하여 수집하였다. 상기 샘플을 실험 용액(37℃)에 배치하였고,상기 임피던스를 30분 동안 지속적으로 측정하였다. 각 실험의 재현성을 확인하기 위하여, 각 군에 대한 상기 실험을 3회 반복하였다.
전자 센서가 장착된 지지체 상에서의 목표 조직의 배양 및 이러한 조직에 대한 새로운 물질의 효과 테스트는, 생물학적 시스템에 대한 유용한 정보를 제공하고 동물이 희생되는 것을 방지한다. 실증으로서, 본 발명자들은 C2C12 근모세포를 사용하여 골격 근육 허혈 모델(skeletal muscle ischemia model)을 설계하였다. 허혈-유도된 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포 생존력을 감소시키고, 염증을 발생시킨다; 따라서, ROS 소거(scavenging)는 이러한 시스템 내에서 중요하다. 여러 가지 나노물질 및 분자가 ROS 생성을 억제하기 위하여 제안되었다(Karakoti, A., Singh, S., Dowding, J.M., Seal, S. & Self, W.T. Redox-active radical scavenging nanomaterials. Chem. Soc. Rev. 39, 4422-4432 (2010)). 세리아 나노입자(Ceria nanoparticle)는 이러한 목적에 대한 매력적인 후보물질이다(도 7i). 관련된 H2O2 및 세리아 나노입자의 농도는 도 8a 내지 8c에 나타난 바와 같이 최적화되었다. 이어서, C2C12 근모세포를 5 mM 과산화수소(H2O2)에 노출시켜 허혈-유도된 ROS를 모사하였고, 형광 이미지(도 7j)를 얻어 세리아 나노입자의 적용성을 분석하였다. 이러한 나노입자를 사용하여 세포 생존력을 향상시켰고, 생존 세포의 정량 비교(도 7k)가 ROS 제거에 대한 세리아 나노입자의 효과를 확인시켜 주었다.
상기 배양의 임피던스로 표현되는, 세포 생존력 또한, 상기 전자 지지체에 의해 모니터링하였다(도 7l). 분화된 C2C12 세포를 5 M H2O2로 처리하자 대부분의 세포가 즉시 사멸하였고, 이로써 임피던스의 급격하고 극적으로 증가하였다. 이어서 사멸된 세포가 점차 기판으로부터 분리되고, 전도성 배지가 죽은 세포와 전극 사이에 흐름으로써, 임피던스가 30분 이상에 걸쳐 천천히 감소하였다. 5 mM H2O2로 처리해도 유사하지만, 임피던스가 보다 천천히 변하였다. 그러나, 세리아 나노입자의 존재하의 5 mM H2O2 처리는 단지 최소의 임피던스 변화만을 가져왔다.
실시예 7. C2C12 세포 시트의 전사 인쇄
배양된 C2C12 근모세포를 포함한 지지체를, 30초간 등각 접촉(conformal contact)으로 뒤집히도록(upside down) 조직 배양 폴리스티렌(Corning)에 배치하였다. 상기 지지체를 상기 조직 배양 폴리스티렌으로부터 천천히 박리하였고, 이어서, 상기 지지체의 상단을 손가락으로 몇 초간 부드럽게 두드림으로써, 원하는 기판(도 9의 단백질 코팅된 유리 또는 도 11의 마우스의 근육)에 등각 접촉으로 뒤집히도록 배치하였다. 90초 후, 상기 지지체를 모서리부터 시작하여 천천히 박리시켰고, 이어서, 상기 세포 시트를 상기 기판에 전사하였다. 상기 전사된 세포 시트를 시각화하기 위하여, 상기 기판 상에 전사된 세포 시트를 헤마톡실린 용액(Mayer’s hematoxylin solution, ScyTek)으로 염색하였다. 전사 인쇄 후 세포의 생존력을 측정하기 위하여, 상기 세포를 성장 배지 내, 0.5 mM 칼세인 AM 및 5 mM 에티디움 호모다이머-1의 LIVE/DEAD 생존력 키트(Life Technologies)를 사용하여 염색하였고, 형광 현미경(Nikon)으로 관찰하였다. 상기 전사 수율을 결정하기 위하여, 전사인쇄 이전의 상기 지지체 상의 세포 시트 면적에 대한 전사된 세포 시트 면적의 비율을 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 계산하였다. 다중층의 세포 시트를 구성하기 위하여, 3 개의 세포 시트 샘플을 상기 지지체 상에 제조하였다. 상기 각 세포 시트는 미리 형광 염료로 염색되었으며, DID(적색; 두개의 샘플; Invitrogen) 또는 DIO(녹색; 하나의 샘플; Invitrogen)로 착색되었다. 각 세포 시트를 적색, 녹색, 적색의 순서로 전사하였고, 시트를 서로의 상단에 적층하였다. 상기 다중층 세포 시트의 배열은 공초점 현미경(TCS SP8 STDE, Leica)을 사용하여 관찰하였다. 각 세포 시트를 분명하게 시각화하기 위하여, 상기 캡쳐된 이미지의 색상 강도를 라이카 어플리케이션 스위트(the Leica Application Suite)(Leica)를 사용하여 개선하였다.
전자 지지체 상에서 배양 및 분화된 세포 시트는 생체내 무지지체(scaffold-free) 국소 치료에 적용될 수 있다. 세포 시트를 제조하는 동안 세포의 지속적인 모니터링을 통하여, 전사 인쇄를 사용하여 수행할 수 있는 세포 시트의 생물학적 시스템에의 적용 전에, 상기 세포 상태 및 분화도(degree of differentiation)를 확인할 수 있다. 상기 지지체로부터 수용기판(receiving substrate)(단백질로 코팅된 유리)으로의 상기 세포 시트의 전사인쇄 과정은 도 9a에 나타나있다. 상기 전체 과정은 제조 단계(조직 배양 폴리스티렌 상에서 30초) 및 전사 단계(수용 기판상에서 90초)의 두 단계로 이루어진다. 전사된 C2C12 세포 시트의 잘 구조화된 구성(well-structured configuration) 및 높은 생존력은, 헤마톡실린 세포 염색 및 생존 분석을 수행함으로써 관찰되었다(도 9b 및 삽입도). 분화 특성 또한 전사 인쇄 후 유지되었다(도 9c). 도 9d 및 9e는 각각 상기 전사 단계(세포와 단백질 간 부착의 변화) 동안의 접촉 시간 및 세포 배양 시간(세포 밀도의 변화)의 전사 수율(transfer yield)에 대한 효과를 나타낸다. 도 10에 설명된 바와 같이, 90 초 이상의 접촉 시간 및 6일 이상의 배양 시간과 함께, 높은 전사 수율(약 90%)을 얻었다. 도 9f는 임상 적용(human applications)을 위한 임계치의, 넓은 면적(5 cm x 5 cm)의 세포 시트 전사를 나타내고, 도 9g 및 9h는 각각 다중 전사인쇄를 사용한 삼중층 세포 시트의 개략도 및 상기 시트의 공초점 현미경 사진을 제공한다.
도 10은 세포 시트 전사 인쇄에 대한 통합된 이론적 설명을 보여 준다. 파괴 역학(fracture mechanics)의 관점에서, 균열 전파 기준(crack propagation criterion)은 G = Γ이고, 상기 G는 에너지 방출 속도, 즉, 새롭게 균열된 표면의 단위 면적당 균열 도중에 소멸된 스트레인 에너지(strain energy)이고, Γ는 계면 인성(interface toughness)이다. 그래핀 및 세포 시트 모두는 상기 PDMS 기판에 비해 매우 얇기 때문에, G를 계산할 때, 이들은 무시할만한(negligible) 에너지를 저장하기 때문에 이들 모두를 고려하지 아니할 수 있다. 따라서, 도 10a에 PDMS 두께 h1, 계면 균열 크기 a, 및 수직 박리력(peel force) F로 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 유리 위의 PDMS에 대해 간단한 2D 평면 스트레인 모델을 구축했다. 상기 유리를 강성 기판으로 간주할 때, 상기 G(F, a) 관계에 대한 해석적 및 유한 요소 모델(finite element modeling, FEM) 결과를 도 10a의 그래프로 나타내었다. 두 결과는 G가 a 및 F에 따라 단조 증가함을 나타낸다.
도 10b는 상기 세포 시트가 왜 단백질로 코팅된 유리에 직접 전사될 수 없는지를 설명한다. 도 10b에서 그래핀 및 상기 세포 시트를 의도적으로 보이게 하였다. 세포가 그래핀 위에 응집하기 때문에, 상기 PDMS의 가장자리는 그래핀에 의해 덮이지 않으므로, 세포는 주변부 크기(margin size)와 동일한 초기 균열 크기 a0를 갖는 상기 유리 기판으로부터 미리박리된(pre-delaminated)것으로 간주될 수 있다. Γc/ graph > Γc/ glass로 가정할 때, 상기 세포-유리 계면을 박리하기 위하여 요구되는 박리력(F1 D)은, 세포-그래핀 계면에 대한 박리력(F2 D)에 비해 작으며, 이는 상기 세포 시트는 상기 세포-유리 계면을 따라 박리되기 쉽고, 따라서, 상기 유리에 성공적으로 전사될 수 없음을 암시한다.
세포 시트를 단백질 코팅된 유리에 전사하기 전에 도 10c에 나타낸 제조 단계를 수행한 경우, 상기 결과는 달라질 수 있다. Γc/ graph > Γc/ polystyrene로 가정할 때, 상기 제조 단계 동안에, 도 10b에 설명한 바와 동일한 이유로, 상기 세포 시트가 폴리스티렌으로 전사되지 않을 것이다. 그러나, 도 10d의 위상차 현미경 사진에 의해 입증되는 바와 같이, 상기 박리 과정 동안 가장자리 손상(edge damage)이 상기 세포 시트에서 발견될 수 있다. 도 10e에서 적색 선으로 강조한 바와 같이, 생체(living matter)로서, 가장자리에 근접해 있는 손상된 세포는 수축(contract) 또는 롤업(roll up)되는 경향이 있고, 이로써 상기 세포 시트 및 그래핀 사이에 계면 전단 균열(interfacial shear crack)을 남긴다. 따라서, 상기 제조 단계 후 최종 전사인쇄가 수행될 때, 상기 새로운 균열의 길이는 a1 F 및 a2 F이 되고, 가장 중요하게, a2 F는 a1 F에 비해 상당히 크다. 결과적으로, F2 F < F1 F이며, 이는 상기 세포-그래핀 계면은 작은 박리력으로 박리될 수 있다는 것을 의미하고, 따라서, 상기 세포 시트는 단백질로 코팅된 유리에 성공적으로 전사될 수 있다.
PDMS의 가장자리가 존재하지 아니할 때, 즉, PDMS 표면이 그래핀으로 완전히 덮였을 때, 상기 제조 단계 도중에 상기 세포의 가장자리 손상은 상당히 줄어들고, 따라서, 도 10f에 나타난 바와 같이, a2 M은 a1 M에 비해 약간 크다. 도 10e의 그래프에 따르면, F1 M < F2 M이고, 따라서, 상기 세포-유리 계면이 먼저 박리될 것이다. 이러한 가설은 도 10f의 우측 패널에 나타난 실험 결과에 의해 검증되며, 이는 세포 시트 전사의 성공을 위하여, 합리적인 PDMS 가장자리 크기를 유지하는 것이 왜 중요한지 설명한다.
실시예 8. 마우스의 상처난 근육 모델( mouse scarred muscle model )
동물에 대한 모든 실험은 서울대학교 병원의 동물 보호 위원회에서 승인받았다. 졸라제팜(zolazepam) 및 자일라진(xylazine)의 혼합물을 복강 내 주사하여 6주령 수컷 BALB/c 누드 마우스를 마취시켰다. 수술용 피부 절개면(1.5 cm)을 서혜부 근처부터 시작하여 우측 대퇴의 복부 측면에 만들었다. 이어서, 상기 내측 대퇴 근육(medial thigh muscle)을, 심부 대퇴지(deep femoral branch) 근처 5 mm에서 심부 대퇴지를 따라서 해부하였다. 대퇴 신경, 동맥 및 정맥 다발로부터 횡방향으로 5 mm에서 이를 따라 상기 해부를 계속하였다. 상기 전체 내측 대퇴 근육을 절제(excise)하였다. 상기 수술 면적을 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)으로 평가하였다.
뒷다리의 상처난 근육으로의 상기 세포 시트 이식(1 층, 5 층, 또는 없음; 각 군 N=4) 후, 상기 치료 효과를 시간에 따라 마이크로 CT로 모니터링하였다. 상기 마이크로-CT를 콘빔형 상업적 임상 CT 스캐너(cone-beam type commercial preclinical CT scanner)(NFRPolaris- G90C, NanoFocusRay)를 사용하여, 다음의 영상화 파라미터로 수행하였다: 관 전압, 50 kVp; 관 전류, 100μA; 시야, 35 mm x 35 mm; 매트릭스, 512 x 512; 슬라이스 두께, 0.054 mm. 3 차원으로 재구성된 이미지를 오시릭스(OsiriX)(version 4.0, 32 bit, OsiriX Foundation)를 사용하여 얻었다.
형광 영상화를 위하여, Balb/c 누드 마우스(암컷, 6주령 내지 8주령)에 세포 트레이서(DiD)-표지된 GFP-발현 세포 시트 수술을 실시하였고, 복강 내 주사하여 마취시켰다. 마우스의 영상화는 이식 후 1일 부터, 각각, 이비스 스펙트럼 기기(IVIS Spectrum instrument)(IVIS, Perkin Elmer)로, 여기 및 방출에 대한 644 nm 및 665 nm 필터가 장착된 형광 모드에서 수행하였다. 각 세포 시트로부터의 상기 형광 신호의 측정은 리빙 이미지 소프트웨어 4.0(Living Image Software 4.0)(Perkin Elmer)을 사용하여 이루어졌다.
모든 조직을 파라핀에 내장(embed)하였고, 4 μm의 두께로 절단하였다. 형태학적 시각화(morphology visualization)를 위한 조직학적 샘플을 표준 프로토콜을 사용해, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 면역 형광 염색의 경우, 상기 제조된 파라핀 절편을, 탈랍화(dewax), 수화(hydrate), 및 PBS 내에서, 20분 동안 37℃에서 0.01 %의 단백질 분해 효소 XXIV(Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 다음으로, 상기 표본을 제조사의 지시에 따라, 1차 항-GFP 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 염색하였다. 단백질 발현을 알렉사 플루오르 488 복합 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibodies)(Invitrogen)로 시각화하였다. 모든 이미지는 도립형(invert) 형광 현미경(DM5500 B, Leica)을 사용하여 얻었다. 상기 세포 시트로부터 조직화된 조직의 혈관 신생을 검출하기 위하여, 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 다음 단계의 항-CD31 항체(Novus Biologicals)를 이용하여 수행하였다. 먼저, 비특이적 항체 결합을 방지하기 위하여, 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase) 및 단백질을 0.3% H2O2 및 염소 혈청 용액(Dako)으로 차단하였다. 30분 후, 상기 조직을 1 시간 동안 상기 1차 항-CD31 항체와 함께 배양하였고, 세척하였으며, 1 시간 동안 HRP(horseradish peroxidase)-접합 염소 항토끼 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit secondary antibodies)(Santa Cruz biotechnology)와 함께 배양하였다. 추가적인 세척 후, 3,3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB) 퍼옥시다제 기질(Dako)로 염색하여 혈관 신생을 평가하였다.
마우스의 상처난 근육 상에 생체 내 세포 시트 전사인쇄의 치료 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 조직의 조직체(tissue organization)를 평가하기 위한 녹색 형광 단백질을 핵내주입한(green fluorescent protein,9 (GFP)-transfect) C2C12 근모세포 및 영상화 방식(imaging modality)을 사용하였다. 본 발명자들은 마우스의 뒷다리 상의 상처 영역에 1층(1-layered) 또는 5층(5-layered)의 C2C12 세포 시트를 이식했다(도 11a). 상기 세포 시트 전사인쇄 동안의 온도 변화를 전자 지지체의 온도 센서에 의해 측정하였다. 빠른 전사인쇄(약 90초)는 최소한의 체온 변화(약 1.5℃)를 일으킨다.
이식된 세포 시트를 세포 추적자(cell tracer)(DiD)로 표지하였고, 형광을 측정함으로써 시간의 경과에 따라 모니터링하였다. 7일이 지난 후에도, 형광이 상기 상처 영역에서 검출된 반면, 반대편 뒷다리 부위에서는 신호가 관찰되지 않았다(5층 세포 시트의 형광 데이터는 도 11b). 핵내주입된 부위(transfected site)로부터 절개된 조직 슬라이스의 형광 현미경 사진은 전사인쇄 7일 후의 상기 이식된 5층 세포 시트의 성장을 보여주고(도 11c), 이는 생체 내 형광 영상화(fluorescence imaging) 결과와 동등하다. 상기 조직체를 유지하기 위한 능력 및 이식된 세포 시트의 기능은 상처 부위에서의 국소적 세포 치료의 치료 효과를 최대화할 수 있다.
또한, 마이크로 컴퓨터 토모그래피(Micro-computed tomography, micro-CT)도 이식된 부위 내 근육 조직의 성장을 확인시켜준다(도 11d). 백색 화살표는 수술 부위를 나타낸다. 도 11d의 첫번째 및 두번째 프레임의 비교는 제거된 근육 조직을 강조한다. 중요한 것은, 상기 세포 시트의 이식 7일 후, 근육 조직이 재생된 반면에(도 11d 세번째 프레임), 상기 수술 후 세포 시트 전사 없이는 아무런 회복이 없음을 관찰하였다(도 11d 첫번째 프레임; 삽입도는 음성(negative) 실험군의 수술 전 사진을 보여준다). 헤마톡실린 및 에오신 염색의 저배율 사진은 5층 세포 시트가 전사된 부위에서 성장한 것을 보여준다(도 11e). 반면에, 근육 내 위축성 변화가 세포 시트 이식을 하지 않은, 상기 상처난 근육에서 발생하였다(도 11f). 또한, 상기 1층 세포 시트도 상기 상처 부위에서 치료 효과를 보였다. 도 11g 및 11h에 나타난 바와 같이, 상처난 근육 부위에 전사된 5층 세포 시트 내의 C2C12 근모세포의 풍부한 증식 및 분화를 GFP 발현의 검출을 통하여 관찰하였다. 또한, 혈관신생(vascularization)을 CD31 염색(도 11i)에 의해 관찰하였다.

Claims (15)

  1. 지지층:
    상기 지지층 위에 배치되는 제1 센서; 및
    상기 지지층 위에 상기 제1 센서와 인접하게 배치되고, 세포를 부착시켜 배양하는 그래핀 나노리본 패턴을 포함하는 세포 시트 제조용 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 지지층 위에 상기 제1 센서와 인접하게 배치되는 제2 센서를 더 포함하는 세포 시트 제조용 장치.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 제1 센서는 임피던스 센서이고, 상기 제2 센서는 온도 센서인 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 제1 센서 및 상기 제2 센서는 상기 그래핀 나노리본 패턴 위에서의 상기 세포의 성장 및 증식 상태를 실시간으로 확인하는 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 제1 센서 및 상기 제2 센서는 구불구불한 금속 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 금속 패턴 및 상기 그래핀 나노리본 패턴은 같은 방향으로 신장하는 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노리본 패턴 중 적어도 일부는 상기 금속 패턴 위에 배치되는 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노리본 패턴은 일정 방향으로 신장하고 서로 이격된 복수개의 마이크로 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 지지층은 실리콘 고무로 형성된 것을 특징으로 하는 세포 시트 제조용 장치.
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