KR101458558B1 - 전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단 방법 - Google Patents

전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링하는 방법 및 줄기세포의 노화를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극을 구비하여 상기 전극 상에서 배양되는 줄기세포 및 배양액의 응답전위를 발생하는 세포 칩 상에 세포를 배양하고 상기 배양된 세포와 배양액 및 전극으로부터 총 임피던스를 측정하여 분석함으로 노화를 모니터링하고, 특정 계대수의 줄기세포 및 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포에 대해 상기 과정을 수행하여 각각에 대하여 측정된 총 임피던스 값을 비교하여 대상 줄기세포의 노화를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 이용하면 비파괴적인 방법으로 배양되는 세포의 노화 수준을 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로, 상기 배양되는 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 치료제의 품질관리에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단 방법{Real-time monitoring or diagnostic method for the stem cell senescence by measuring the electric cell-substrate impedance}
본 발명은 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링하는 방법 및 줄기세포의 노화를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극을 구비하여 상기 전극 상에서 배양되는 줄기세포 및 배양액의 응답전위를 발생하는 세포 칩 상에 세포를 배양하고 상기 배양된 세포와 배양액 및 전극으로부터 총 임피던스를 측정하여 분석함으로 노화를 모니터링하고, 특정 계대수의 줄기세포 및 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포에 대해 상기 과정을 수행하여 각각에 대하여 측정된 총 임피던스 값을 비교하여 대상 줄기세포의 노화를 진단하는 방법에 관한 것이다.
줄기 세포는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화능과 장기간의 조직 재생 능력을 가지고 있기 때문에 전 세계적으로 줄기세포 이식 및 조직공학에 기반한 새로운 치료전략을 활발히 연구하고 있다. 기존 임상에서 시도해온 줄기세포 치료는 성체 줄기세포를 골수에서 추출하여 체외에서 증식한 후 특정 조직에 이식하는 방식이나 최근에는 골수를 추출하는 침습적인 절차 대신에 상대적으로 고통을 줄이는 지방 조직이나 제대혈에서 줄기세포를 추출하는 방식이 사용되고 있다.
이러한 줄기세포의 증식능력과 다분화능은 추출조직의 종류와 연령에 따라 좌우되므로 줄기세포를 추출하는 동안 세포의 증식능력과 다분화능에 대한 표준화된 품질 관리 방법 및 측정이 필요하다.
한편, 중간엽 줄기 세포는, 다른 인체 초대배양 세포와 유사하게, 체외(in vitro) 배양시 텔로미어 소실(telomere shortening)과 무관한 조기 노화(premature senescence) 기전에 의해 세포의 분열이 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. 이러한 조기 노화 현상은, 그 기전이 아직 명확히 밝혀진 것은 아니나, 장기간의 체외 배양에 의한 환경적 스트레스의 축적으로 p16INK4A라는 Cdk 저해 단백질이 발현되고 누적되어, 세포의 성장을 담당하는 Cdk 단백질의 활성 억제가 주요 원인으로 지적되고 있다. 또한 배양 중에 FGF-2를 처리하여 p21(Cip1), p53, 및 p16INK4A의 mRNA 발현을 억제함으로써, 중간엽 줄기 세포의 G1 세포 성장 정지(G1 cell growth arrest)를 억제하는 것이 보고된 바 있다.
줄기세포 노화에 따라 좌우되는 세포 크기, 거동 및 증식률의 검출과 같은 민감한 세포환경과 지속적인 세포관찰을 요구하는 조건에서 전통적인 세포 분석 기술인 형광표지 분석과 같은 광학적인 방법은 한계가 있고, 또한 줄기세포의 품질 보증을 위해 세포 특성을 변화시킬 수 있는 형광표지 분석 기법 대신에 비파괴적이고 실시간으로 세포 상태와 능력을 모니터링할 수 있는 분석 기술의 적용이 필요하다.
이에 본 발명자는 종래의 세포 성분 분석을 통한 세포 노화 진단이 침습적인 방법으로, 분석 시간과 비용이 소모되는 단점이 있기에 경제적인 전기전자회로 시스템을 이용해 비파괴 및 실시간으로 줄기세포의 노화를 진단할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 줄기세포가 부착된 투명전극의 전기 임피던스 값을 측정하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화 수준을 실시간으로 모니터링하는 방법 및 특정 계대수의 줄기세포에 대해 측정된 임피던스 값과 노화를 진단하고자 하는 미지의 줄기세포에 대해 측정된 임피던스 값을 비교하는 단계를 포함하는 줄기세포의 노화를 진단하는 방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극을 구비하여 상기 전극 상에서 배양되는 줄기세포 및 배양액의 응답전위를 발생하는 세포 칩; 상기 세포 칩과 전기적으로 연결되어 상기 응답전위를 수신하여 상기 배양액, 배양세포 및 측정전극의 총 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부; 및 상기 총 임피던스 값을 인가받아 상기 배양세포의 노화상태를 분석하는 전기적 분석부;를 구비한 분석장치에 100 Hz 내지 100 kHz의 주파수를 갖는 교류를 인가하여 수행되는 것이 특징인 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극 상에서 배양되는 특정 계대수의 줄기세포 및 배양액에 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제1단계; 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포를 상기 제1단계와 동일한 조건에서 배양하고, 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제2단계; 및 제2단계의 총 임피던스 값이 제1단계의 총 임피던스 값보다 낮으면 대상 줄기세포가 제1단계의 줄기세포보다 노화된 줄기세포로 판단하는 제3단계를 포함하는 줄기세포의 노화를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극을 구비하여 상기 전극 상에서 배양되는 줄기세포 및 배양액의 응답전위를 발생하는 세포 칩; 상기 세포 칩과 전기적으로 연결되어 상기 응답전위를 수신하여 상기 배양액, 배양세포 및 측정전극의 총 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부; 및 상기 총 임피던스 값을 인가받아 상기 배양세포의 노화상태를 분석하는 전기적 분석부;를 구비한 분석장치에 100 Hz 내지 100 kHz의 주파수를 갖는 교류를 인가하여 수행되는 것이 특징인 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 분석장치는 한국등록특허 제10-1100604호에 기재된 투명전극 기반의 배양세포 특성 분석 장치를 사용할 수 있다.
본 발명의 세포를 비파괴, 실시간 및 정량적으로 분석하는 방법인 전기 임피던스 측정을 이용하는 세포 분석법은 높은 전기 저항성의 지질 이중층(lipid-bilayer)으로 구성된 세포막이 전극표면에 흡착시 전극을 통과하는 전류의 흐름에 영향을 미치는 현상에 바탕을 둔다.
본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포"는 증식률이 높고 다분화 능력을 가지므로 장기간의 조직 재생 능력을 가지고 있는 세포이다. 따라서, 조직 재생을 위한 세포치료제 등으로 활용 가능성이 높은 세포이다. 한편, 상기 줄기세포의 증식능력 및 다분화능은 추출조직의 종류 및 연령 등에 따라 좌우되며, 추출된 세포의 증식을 위한 배양조건 등에 의해 추후 세포 상태가 크게 좌우될 수 있으므로 이러한 줄기세포를 세포치료제로서 사용하기 위해서는 줄기세포의 표준화를 위한 품질관리 방법 및 적합성에 대한 적절한 판단 기준이 필요하다. 일반적으로 줄기세포는 추출 후 배양 초기에는 기하급수적인 증식률을 나타내지만 계대배양을 거듭할수록 증식률이 감소하는 경향이 있다. 따라서, 이러한 세포 증식률의 증감 정도가 줄기세포의 상태를 판단하는 하나의 지표가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "노화"는 줄기세포의 계대배양을 거듭함에 따라 세포 증식률이 감소하는 현상을 의미한다. 상기한 바와 같이 일반적으로 줄기세포는 계대배양을 거듭함에 따라 증식률이 감소하고 이에 따라 증식률이 감소하고 분화능도 감소한다. 그러나 이러한 증식률 및 분화능은 계대수에 의해서만 영향을 받는 것이 아니라 세포의 종류, 배양 및 유지조건 등에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서 상기 노화라는 개념은 절대적으로 계대수가 높다고 해서 노화되었다고 단정할 수 있는 것이 아니라 세포의 상태로서 판단되어야 할 것이다.
본 발명의 세포 및 배양액을 담지한 세포 칩에 대해 측정되는 총 임피던스는 계면 전극 임피던스, 배지저항성 및 전극 상에 부착된 세포층의 정전 용량과 병렬인 세포 저항성으로 표현되는 세포 임피던스의 합으로 표현된다. 이때, 계면 전극 임피던스는 전극/전해질 계면의 전기적 특성을 나타내며 주파수 의존적인 성분으로 전극의 재질 및 표면 상태 등에 따라 결정된다. 상기 세포 임피던스는 세포의 종류에 따른 전기적 특성, 기질에 대한 부착능력 등의 차이로 인해 달라질 수 있는 것으로 또한 주파수의 영향을 받는다. 저주파수의 전류가 인가되는 경우 이중층 지질막으로 구성된 세포막을 쉽게 투과하지 못하고 미세한 간격을 갖는 세포-전극 및 세포-세포간 접합부를 통해 흐르게 되는데 이는 세포외질의 저항으로 나타낼 수 있다. 반면, 고주파수의 교류전류는 지질 세포막을 통과할 수 있게 되고 해당 주파수 영역 대에서 세포막 임피던스의 분산(dispersion)이 관측되며 따라서 세포막의 전기 임피던스 특성은 저주파수 성분과 고주파수 성분을 포함하고 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 보편적으로 정도의 차이는 있겠으나, 인가되는 전류의 주파수가 너무 낮거나 높은 경우 세포 존재시와 부재시 총 임피던스의 차이가 감소하는 경향이 있다. 따라서, 적정 범위의 주파수를 갖는 교류를 인가하는 것이 바람직하다.
상기 분석장치를 이용하여 임피던스를 측정하는 경우 인가되는 전류는 바람직하게 100 Hz 내지 100 kHz의 주파수를 갖는 교류, 보다 바람직하게는 1 내지 5 kHz의 주파수를 갖는 교류일 수 있으나, 세포를 포함하지 않는 전극에서 측정된 총 임피던스 값과 세포를 포함하는 전극에서 측정된 총 임피던스 값이 상이하게 제공될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서는 동일한 조건으로 배양한 동일한 종류의 줄기세포에 대하여 높은 계대수를 갖는 노화된 줄기세포보다 낮은 계대수를 갖는 줄기세포의 총 임피던스 값이 현저히 높아짐을 확인하였는 바, 총 임피던스 값 측정 및 비교를 통해 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링할 수 있다. 또한, 1 내지 5 kHz의 주파수를 갖는 교류를 인가할 때, 줄기세포의 노화정도에 따른 총 임피던스 값의 변화에서의 차이가 가장 크게 나타남을 확인하였는 바, 해당 범위의 주파수를 인가하여 줄기세포의 노화정도를 가장 민감하게 측정할 수 있다. 이때, 상기 교류는 세포를 손상시키지 않도록 바람직하게 1 pA 내지 1 μA의 낮은 세기로 인가될 수 있다.
본 발명에 따른 노화를 모니터링하는 방법을 적용할 수 있는 줄기세포는 바람직하게 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체줄기세포(adult stem cell; ASC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 체세포 핵치환(somatic cell nuclear transfer; SCNT) 줄기세포일 수 있다. 상기 성체줄기세포의 바람직한 예로는 지방, 제대혈, 골수, 탯줄 또는 말초혈액 유래 줄기세포를 포함할 수 있다. 그러나, 전극 표면에 부착하여 배양 및 증식될 수 있는 세포는 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 노화를 모니터링하는 방법은 광학적 측정부를 추가로 구비한 분석장치를 이용하여 수행될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 초기에는 크기가 작고 세포질이 적고 핵이 세포크기의 대부분을 차지하는 반면, 계대수를 거듭할수록 크기가 커지고 세포 중 세포질이 차지하는 비중이 증가하는 등의 육안적인 소견을 보인다. 또한 계대수가 증가함에 따라 발현되는 유전자의 종류 및 수준이 변화하므로 이를 특이적으로 표지할 수 있는 형광마커 등을 이용하면 형광신호에 의한 검출이 또한 가능하다. 따라서, 본 발명의 모니터링 방법은 투명한 기판 상에 투명한 전극이 패터닝된 세포 칩을 이용하므로 광학적 측정부를 추가로 구비한 분석장치에 적용하여 전기적인 측정뿐만 아니라 동시에 육안으로 관찰하는 것이 가능하다. 바람직하게 상기 광학적 측정부는 광학 현미경 또는 형광 현미경 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 노화를 모니터링하는 방법은 투명 전극을 제외한 부분은 절연층이 코팅되고, 상기 절연층의 상부에 격벽을 포함하여 세포 및 배양액을 담지할 수 있는 공간을 제공할 수 있는 세포 칩을 이용하는 방법이다. 상기 절연층은 전극들과 전송선들의 절연을 유지하여 전송신호를 보존하기 위하여 증착된다. 상기 세포 및 배양액을 담지할 수 있는 공간을 제공할 수 있도록 절연층 상부에 도입되는 격벽은 세포독성을 나타내지 않는 생체적합성 접착물질을 이용하여 폴리스티렌 등의 소재로 제조된 상부가 개방되고 사방이 폐쇄된 일정 높이를 갖는 구조물을 접착시켜 형성할 수 있다.
본 발명에 이용되는 세포 칩은 투명기판 상에 투명전극을 패터닝하여 제조되는 것이 특징이다. 이와 같이 투명한 기판과 전극을 사용함으로 상기 전술한 바와 같이 추가로 구비한 광학적 측정부를 이용하여 전기적인 측정과 육안 관찰을 동시에 수행할 수 있다. 바람직하게 상기 투명기판은 투명유리, 투명석영 또는 투명플라스틱일 수 있으나 지지체로서 광학적 검출을 가능하게 하는 것이면 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 투명전극은 투명 전도성 산화물(transparent conducting oxide; TCO), 전도성 고분자(conducting polymer), 나노소재(nano material) 또는 이들의 혼합물을 재료로 형성되는 것일 수 있다. 상기 투명 전도성 산화물은 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 인듐 아연 산화물(indium zinc oxide; IZO), 알루미늄 아연 산화물(aluminum zinc oxide; AZO), 아연 주석 산화물(zinc tin oxide; ZTO), 갈륨 아연 산화물(gallium zinc oxide; GZO), 안티모니 주석 산화물(antimony tin oxide; ATO), 철 주석 산화물(iron tin oxide; FTO), A-IGZO(In2O3:Ga2O3:ZnO) 이산화티탄(TiO2), 산화인듐(In2O3), 산화아연(ZnO) 또는 산화주석(SnO2)일 수 있으며, 상기 전도성 고분자는 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole) 또는 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene); PEDOT)일 수 있고, 상기 나노소재는 그라핀(graphene), 탄소나노튜브(CNT; carbon nano tube) 또는 금속 나노선(metal nano wire)일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 투명전극은 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO)일 수 있고, 상기 절연층은 페럴린 C(parylene C)를 증착시켜 형성되는 것일 수 있다.
상기 ITO는 산화인듐과 산화주석의 혼합물로 보통은 90:10의 중량비를 가진다. 보통 투명하고 무색인 박막이지만, 벌크형태는 노란회색을 띤다. 전기전도도와 광학적 투과성이 우수하고 박막으로의 성형이 용이하다는 점에서 투명전극으로 널리 사용된다. 다른 투명전도성필름과 마찬가지로 전도성과 투과성은 상호 절충적이어서, 두께가 증가하면 전하운반체의 농도가 증가하여 전도도가 증가하는 반면 투과도가 감소하므로 목적에 따라 두께를 조절하여 제조할 수 있다.
상기 페럴린 C는 절연체로 사용되는 폴리(p-자일릴렌)중합체인 패럴린 중 절연능력, 비용 및/또는 다른 공정상의 이점으로 인하여 가장 널리 사용되는 물질이다. 중합반응에 있어서 용매나 촉매를 필요로 하지 않으며, 개시제를 필요로 하지 않고 종결그룹을 필요로 하지 않는다. 인쇄회로기판(printed circuit; PCB) 및 의료기기에 널리 사용되며 생체적합성이 높아 스텐트, 제세동기, 심장박동기 등 체내로 영구히 이식되는 장치들을 위한 코팅재료로 가장 적합한 물질이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극 상에서 배양되는 특정 계대수의 줄기세포 및 배양액에 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제1단계; 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포를 상기 제1단계와 동일한 조건에서 배양하고, 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제2단계; 및 제2단계의 총 임피던스 값이 제1단계의 총 임피던스 값보다 낮으면 대상 줄기세포가 제1단계의 줄기세포보다 노화된 줄기세포로 판단하는 제3단계를 포함하는 줄기세포의 노화를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 진단방법을 이용하여 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포는 제1단계의 특정 계대수의 줄기세포와 동일한 종류의 줄기세포 또는 상기 제1단계에 사용된 세포를 추가로 계대배양한 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 측정된 총 임피던스 중 세포 임피던스 및 계면 전극 임피던스는 본 발명의 목적인 계대수 또는 노화정도뿐만 아니라 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 상기 노화 진단의 기준이 되는 제1단계에 사용되는 특정 계대수의 줄기세포는 제2단계의 대상 줄기세포와 동일한 종류의 줄기세포인 것이 바람직하다. 한편, 노화가 진행되지 않은 양질의 줄기세포는 세포치료제 등으로써 활용가능성이 높으므로, 전술한 노화를 실시간으로 모니터링하는 방법을 이용하여 세포를 계대배양하면서 각 계대에서 일정시간 배양한 후에 측정되는 임피던스 값을 기록하고 이전 계대에서의 수치와 비교하여 증감을 확인하므로 세포치료제의 품질에 관련되는 줄기세포의 노화 진행 정도를 확인할 수 있다. 예컨대, 이전 계대에 비해 증식률이 감소하기 시작하면 해당 세포의 세포치료제로서의 활용 가능성이 낮아짐을 의미하므로, 상기 진단방법을 통한 세포치료제의 원료가 되는 줄기세포의 품질관리가 가능하다.
전술한 바와 같이 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체줄기세포(adult stem cell; ASC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 체세포 핵치환(somatic cell nuclear transfer; SCNT) 줄기세포일 수 있다. 바람직하게 성체줄기세포, 보다 바람직하게 지방 유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 상기 본 발명의 노화를 진단하는 방법은 기지의 계대수를 갖는 동일한 종류의 줄기세포를 대조군으로 하여 임피던스 값을 얻은 후, 노화를 측정하고자 하는 대상 줄기세포의 임피던스 값을 측정하여 비교하여 노화를 판단하는 것이므로, 전극 상에 부착하여 증식하는 줄기세포에 제한없이 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 성체줄기세포 중 비침습적인 방법으로 채취가능한 지방 유래 줄기세포를 이용하여 노화진단을 수행하였다. 각기 계대수가 다른 9계대와 31계대의 세포를 이용하여 본 발명의 줄기세포 노화 진단방법을 이용하여 각 계대에서의 노화상태를 확인하였다. 9계대에 비해 31계대의 줄기세포는 동일한 시간동안 배양한 후 임피던스를 측정하였을 때 현저히 낮은 배양시간에 따른 임피던스 증가를 보였다(도 5). 이는 다른 육안적 소견(도 1 내지 3)에 따른 계대수 증가에 따른 증식률 감소 및 노화관련 유전자 발현의 증가(도 1c)와 일치함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 노화진단 방법은 파괴적인 유전자 검사 방법 등을 이용하지 않고 단순한 육안소견으로 관찰되는 형태적 특성 외에 객관적인 노화에 대한 진단 기준을 제시할 수 있으므로, 세포치료제 등을 위한 양질의 줄기세포 배양을 위한 품질관리에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 투명전극이 구비된 세포 칩을 이용하여 상기 세포 칩 상에 배양된 세포, 배양액 및 전극으로부터의 임피던스 값을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 줄기세포 노화 수준을 실시간으로 모니터링할 수 있다. 또한 상기 방법은 줄기세포에 손상을 주거나 파쇄하는 과정을 필요로 하지 않는 비파괴적인 방법이므로 세포의 소모없이 배양된 줄기세포의 노화 수준을 관찰하고 이후 목적에 따라 이용할 수 있는 장점이 있다. 한편, 줄기세포 또는 이의 추출물을 포함하는 치료제는 줄기세포의 노화 정도가 치료제의 품질의 영향을 미치는 바, 본 발명의 방법을 이용하면 비파괴적인 방법으로 배양되는 세포의 노화 수준을 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로, 상기 배양되는 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 치료제의 품질관리에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 표준화된 배양 접시에서 배양된 9 계대(P9, a) 및 31 계대(P31, b) 지방 유래 줄기세포의 형태 및 유전자 p16INK4A mRNA 발현의 양적 실시간 중합효소 연쇄반응(c)을 나타내는 그래프이다. 각 막대는 평균±표준편차(n=3/군)를 나타낸다(***: p<0.001).
도 2는, 9 계대(P9) 및 31 계대(P31)의 지방 유래 줄기세포의 성장곡선을 나타내는 그래프이다. 각 막대는 평균±표준편차(n=3/군)를 나타낸다(***: p<0.001).
도 3은, ITO 작업 전극에 흡착된 9계대(도 3d, 3e, 3f) 및 31계대(도 3a, 3b, 3c), 및 배양시간이 다른(100 h: 도 3a, 3d; 200 h: 도 3b, 3e; 300 h: 도 3c, 3f) 지방 유래 줄기세포의 위상차 이미지를 나타낸다.
도 4는, 100 Hz 내지 100 kHz 범위의 전기장에 9계대의 지방 유래 줄기세포(304h) 유무에 따라 ITO 전극 임피던스의 실수 및 허수부분(점으로 표시)을 상기 수학식 1을 사용하여 얻어진 맞춤선(fitted line)과 함께 나타내는 그래프이다.
도 5는, (a) 100 h, 160 h, 220h 또는 304 h 배양시간에 측정된 세포 없이 아무것도 덮여 있지 않은 전극(임피던스의 보정된 실제 부분)의 저항성에 대해 9 계대 지방줄기세포가 있는 ITO 전극의 비율 및 (b) 9 계대(P9) 또는 31 계대(P31)지방줄기세포로 측정한 2.15 kHz 주파수에서의 임피던스의 보전된 실수부를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±표준편차(n = 4/군)를 포함하여 나타냈다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 세포 준비 및 평가
0계대 STEMPRO® 인간 지방 유래 줄기세포 및 MesenPROTM 배지를 인비트로진(Invitrogen, Carlsbad, USA)에서 구입하여 시험관 내(in vitro)에서 증폭시켰다. 각 계대 별 세포를 6웰 배양접시의 ㎠ 당 1×104 세포씩 시딩하여 주 2회 배지를 교환하면서 7일 동안 분열하도록 하였다. 각 그룹으로부터 세포를 매일 회수하여 세포 수를 측정하였다(그룹별 3회 실시).
실시예 1-1. 지방 유래 줄기세포의 계대 별 형태
상기 방법에 의해 배양된 9계대의 지방 유래 줄기세포 형태는 크기가 작고, 모양이 원추형인 반면, 31계대 세포는 보다 더 크고 편평한 모양으로 배양 접시에 단단하게 부착되어 증식하였다(도 1a 및 1b).
실시예 1-2. 지방 유래 줄기세포의 계대 별 성장률
계대가 다른 지방줄기세포의 성장률을 비교하기 위하여 세포증식이 연속적으로 이루어지는 1주일 동안 성장 속도를 분석하였다.
상기 9계대와 31계대의 지방 유래 줄기세포의 성장속도를 분석한 결과, 지방줄기세포의 분열시간이 계대 별 대략 2배 차이를 나타내었고 9계대 세포의 성장률이 31계대 세포의 성장률보다 현저히 높게 나타났다(도 2).
실시예 2. 양적 실시간 중합효소 연쇄반응
지방 유래 줄기세포의 노화수준 및 상태를 진단하기 위하여 양적 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하여 도 1c에 나타내었다.
트리졸 시약(Gibco)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 지방 유래 줄기세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 오염된 게놈 DNA를 가능한 제거하기 위하여 DNase로 처리하였다. RNA의 정량은 ND-100 분광광도계를 이용하여 실시하였다. Prime ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)를 이용하여 2 ㎍ RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction; qPCR)은 1×Power SYBR-Green Master-mix (Applied-Biosystems, Foster City, CA), 각각 600 내지 750 nM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 및 50ng cDNA를 포함하는 반응혼합물에서 수행하였다. PCR 증폭은 Applied-Biosystems Prism 7900HT Real-Time PCR sequence detection system을 이용하여 실시하였고 40회 순환(프로그램: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 그리고 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분의 40회 순환)하고 중단하였다. 상대적인 유전자 발현수준은 비교 CT 방법(comparative CT method)을 사용하여 인간 시클로필린(cyclophilin)으로 표준화하였다. 상기 qPCR 프라이머 서열은 하기 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같다.
Figure 112012083668581-pat00001
Figure 112012083668581-pat00002
노화와 관련된 유전자발현은 in vitro 증폭기간 동안 지속적으로 증가하고 세포주기 조절자인 p16INK4A의 발현은 세포노화 및 줄기세포 노화에 원인이 되는데 상기 실험결과, p16INK4A mRNA 발현이 9계대에서 보다 31 계대에서 상당히 높게 나타났다(도 1c). 즉, 본 발명의 결과는 31계대에서 p16INK4A mRNA 발현 증가가 세포증식을 감소시키는 원인이 될 수 있음을 나타내었다.
실시예 3. ITO 전극을 기반으로 한 세포 칩 구조물 제작 및 배양된 세포의 형태 및 성장 행동 분석
실시예 3-1. ITO 전극을 기반으로 한 세포 칩 구조물 제작
ITO로 코팅되고 4 Ω/sq의 시트저항(sheet resistance)을 갖는 유리슬라이드(75 mm×25 mm×1.1 mm; Taeyoung Optics, Incheon, Korea)를 구입하였다. 각각에 대한 해당 전송선 및 터미널 패드를 갖는 작업전극 및 상대전극을 패턴화하기 위해 전도성 ITO 층을 레이저(전력: 100 W, 파장 1080 nm)로 제거시켰다. 상기 레이저 빔은 약 30 μm의 반경을 갖도록 초점을 맞추어, 400 mm/s의 속도로 스캔하였다(μ-Fab, KORTherm Science, Incheon, Korea).
미국 약전 Class Ⅵ의 생체적합성 요건에 부합하는 페럴린-C(parlyene-C)를 화학증기 증착법으로 상기 패터닝된 ITO 기판 위에 증착시켰다(PDS 2010, Specialty Coating System Inc., Indianapolis, IN, USA). 페럴린-C(parlyene-C)의 부착력을 향상시키기 위하여 부착 촉진제(adhesion promoter)인 A-174 실란(silane)을 증기상(vapor phase)에 적용하였다. 열분해에 의해 반응성 단량체로 전환된 페럴린-C(parlyene-C)를 실온에서 12 내지 16 mTorr 압력으로 전극기판에 증착시켰다. 페럴린-C의 증착률은 14 nm/분, 두께는 550 nm였다. 증착 후, 작업전극, 상대전극, 및 터미널 패드 사이트의 표면을 포토리소그래피(photolithography) 및 반응성 이온 식각(reactive ion etching, RIE, ADE-4600, A-Tech System, Incheon, Korea)에 노출시켰다. 최종 작업전극 영역은 직경 400 μm의 원형이었고, 작업 전극은 상대적으로 큰 상대전극으로부터 2 mm를 초과하도록 격리되었다.
실시예 3-2. ITO 전극을 기반으로 한 세포 칩에서 배양된 세포의 형태 및 성장 행동 분석
지방 유래 줄기세포를 ITO 전극에 부착시키고 증식시킨 다음, 줄기세포의 형태 및 성장행동을 표준화된 배양 접시에서 자란 지방 유래 줄기세포의 것과 비교 분석하였다. 도 3은 ITO 작업 전극에 흡착된 9계대(도 3d, 3e, 3f) 및 31계대(도. 3a, 3b, 3c), 및 배양시간이 다른((100 h: 도 3a, 3d, 200 h: 도 3b, 3e, 300 h: 도 3c, 3f) 지방 유래 줄기세포의 위상차 이미지를 나타낸 그림이다. 상기 ITO 작업전극의 원형 노출지역에 있는 9계대 지방 유래 줄기세포의 수는 대부분 빠르게 증가하는 반면에, 31계대의 세포 수는 상당히 느리게 증가하였다.
실시예 4. 전기 임피던스 측정
접착성 실리콘 고무를 사용하여 폴리스티렌 챔버를 전극 기판에 결합시켜 세포 칩을 제조한 후, 상기 챔버에 1×103 개의 지방 유래 줄기세포와 800 ㎕ 배양액을 분주하였다. 상기 세포 칩은 디지털 로크인 증폭기(lock-in-amplifier, SR830, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA)를 전극기판의 터미널 패드(terminal pads)와 연결하는 홈메이드 전기 어댑터에 고정시켰다.
유입전류의 진폭은 로크인 증폭기의 내부 함수 발전기(internal function generator)에 100 kΩ의 저항기를 연속적으로 연결하여 100 nA로 제한하였고, 그 결과 작업 전극에서 79.6 ㎂/㎠ 미만의 최대 전류 밀도를 제공할 수 있었다. 전기 임피던스 값은 100 Hz 내지 100 kHz 주파수 범위에서, 적용된 유입전류에 대하여 측정된 동상(in-phase) 및 이상(out-of-phase) 전위반응의 비율을 계산하여 확인하였다.
세포가 덮여 있는 전극의 총 임피던스 스펙트럼(Z total, total impedance spectrum)은 계면 전극 임피던스(CPE el, interfacial electrode impedance)에 대한 CPE(constant phase element), 세포층 정전용량(C cl, cell layer capacitance)에 병렬로 존재하는 세포층 저항성(R cl, cell layer resistance)을 이용하여 모델화한 세포 임피던스 및 배지의 저항성(R m, resistance of the medium)의 합으로 계산하였다. 구체적인 수학식은 하기와 같다.
Figure 112012083668581-pat00003
상기 수학식에서 i 는 (-1)1/ 2 이며, ω는 2πf(f: 전기장의 주파수)를 나타낸다. 상기 수학식 1의 파라미터는 측정된 임피던스 스펙트럼들과 수학식 1 사이의 제곱편차의 합을 최소화하기 위하여 비선형 곡선 피팅으로 조정하였다. 도 4는 100 Hz 내지 100 kHz 범위의 전기장에 9계대의 지방 유래 줄기세포(304h) 유무에 따라 ITO 전극 임피던스의 실수 및 허수부분(점으로 표시)을 상기 수학식 1을 사용하여 얻어진 맞춤선(fitted line)과 함께 나타낸 것이다. 곡선 피팅에 의해 추정된 상기 지방 유래 줄기세포의 R cl(cell layer resistance) 및 C cl(cell layer capacitance) 값은 CPE el 및 R m 값이 각각 4.28 x 107 / (iω)0.92 Ω 및 978 Ω일 때, 3210 Ω 및 1.26 nF으로 각각 나타났다.
세포 없이 아무것도 안 덮인 ITO 전극에서 측정된 임피던스 스펙트럼은 CPE el(CPE el, interfacial electrode impedance) 및 일련의 R m(R m, resistance of the medium)의 값으로 결정되었다. 저 주파수에서, 임피던스의 허수부는 임피던스의 실수부보다 더 높았다. 그러나, 전극 임피던스의 용량성 리액턴스는 주파수의 증가로 감소하였고, 20 kHz 이상의 주파수에서 용량성 리액턴스는 저항값보다 더 낮게 나타났다. 세포가 덮여 있는 전극 임피던스 스펙트럼들의 경우에, 임피던스의 실수부분은 세포가 없는 전극과 비교해볼 때, 주파수 중간범위에서 증가한 반면, 임피던스의 허수부분은 세포막의 절연성 때문에 10 kHz 이상의 주파수에서 세포가 없는 경우보다 더 높게 나타났다.
도 5a는 세포 없이 아무것도 안 덮여 있는 전극의 저항성에 대해 9계대 지방줄기세포가 있는 ITO 전극의 저항성 비율을 100 h, 160 h, 220h 또는 304 h 배양시간에 100 Hz 내지 100 kHz 주파수 범위로 측정한 값을 나타낸 것이다. 상기 보정된 값은 배양시간과 더불어서 증가하였고, 보정된 값 증가의 정도는 주파수에 따라 달라졌다. 세포 성장시기 동안 보정된 값의 가장 큰 변화는 1 kHz 내지 5 kHz 사이에서 관찰되었다.
도 5b는 9계대 또는 31계대 지방 유래 줄기세포로 측정한 2.15 kHz 주파수에서의 임피던스의 보정된 실수부를 나타내고 있다. 데이터는 평균(기호) 및 표준편차(수직 막대)(n = 4/그룹)를 포함하여 나타내었다. 보정 값은 세포가 성장하는 동안 증식하여 전극표면을 덮기 때문에 증가하였다. 9계대 젊은 세포의 증식이 31계대 늙은 세포의 증식보다 빠르기 때문에 전극에서 성장하는 9계대 지방 줄기세포와 관련된 보정된 저항값은 31계대 지방 줄기세포의 후기 값(약 150시간 이후)과 차이를 보였다.
상기 실험결과는 지방 줄기세포가 본 발명에서 제조된 ITO 전극에서 쉽게 성장하고, 지방 줄기세포가 덮여 있는 ITO 전극의 전기적 특성이 등가 회로 파라미터에 의해 결정될 수 있음을 제시하고 있다. 또한 본 발명은 세포 성장 시기 동안 임피던스 모니터링을 통해 지방 줄기세포의 상이한 계대 수가 전극에 미치는 영향을 알 수 있었다. 이와 같은 본 발명의 결과는 생화학이나 유전학적 방법을 사용하는 대신 세포의 연령에 의해 결정되는 지방줄기세포의 성장률을 제공하기 위한 실시간 특성화 방법의 가능성을 제시하고 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극 상에서 배양되는 특정 계대수의 줄기세포 및 배양액에 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제1단계;
    노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포를 상기 제1단계와 동일한 조건에서 배양하고, 전류를 인가하여 총 임피던스 값을 측정하는 제2단계; 및
    제2단계의 총 임피던스 값이 제1단계의 총 임피던스 값보다 낮으면 대상 줄기세포가 제1단계의 줄기세포보다 노화된 줄기세포로 판단하는 제3단계를 포함하는 줄기세포의 노화를 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은 투명기판 상에 패터닝된 투명 전극을 구비하여 상기 전극 상에서 배양되는 줄기세포 및 배양액의 응답전위를 발생하는 세포 칩; 상기 세포 칩과 전기적으로 연결되어 상기 응답전위를 수신하여 상기 배양액, 배양세포 및 측정전극의 총 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부; 및 상기 총 임피던스 값을 인가받아 상기 배양세포의 노화상태를 분석하는 전기적 분석부;를 구비한 분석장치에 100 Hz 내지 100 kHz의 주파수를 갖는 교류를 1 pA 내지 1 μA의 세기로 인가하여 수행되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    1 내지 5 kHz의 주파수를 갖는 교류를 인가하여 수행하는 것이 특징인 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체줄기세포(adult stem cell; ASC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 체세포 핵치환(somatic cell nuclear transfer; SCNT) 줄기세포인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분석장치는 광학적 측정부를 추가로 구비하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 칩은 상기 투명 전극을 제외한 부분은 절연층이 코팅되고, 상기 절연층의 상부에 격벽을 포함하여 세포 및 배양액을 담지할 수 있는 공간을 제공할 수 있는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 투명기판은 투명유리, 투명석영 또는 투명플라스틱인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 투명전극은 투명 전도성 산화물(transparent conducting oxide; TCO), 전도성 고분자(conducting polymer), 나노소재(nano material) 또는 이들의 혼합물을 재료로 형성되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 투명 전도성 산화물은 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 인듐 아연 산화물(indium zinc oxide; IZO), 알루미늄 아연 산화물(aluminum zinc oxide; AZO), 아연 주석 산화물(zinc tin oxide; ZTO), 갈륨 아연 산화물(gallium zinc oxide; GZO), 안티모니 주석 산화물(antimony tin oxide; ATO), 철 주석 산화물(iron tin oxide; FTO), A-IGZO(In2O3:Ga2O3:ZnO) 이산화티탄(TiO2), 산화인듐(In2O3), 산화아연(ZnO) 및 산화주석(SnO2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 전도성 고분자는 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole) 및 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene); PEDOT)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 나노소재는 그라핀(graphene), 탄소나노튜브(CNT; carbon nano tube) 및 금속 나노선(metal nano wire)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 절연층은 페럴린 C(parylene C)로 형성되는 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서,
    상기 노화를 진단하고자 하는 대상 줄기세포는 제1단계의 특정 계대수의 줄기세포와 동일한 종류의 줄기세포 또는 상기 제1단계에 사용된 세포를 추가로 계대배양한 세포인 것인 방법.
  15. 삭제
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