KR102133244B1 - 다중 디스크 형태 ito 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법 - Google Patents

다중 디스크 형태 ito 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법을 개시한다. 본 발명은 세포칩, 임피던스 측정부, 및 제어부를 포함한다. 세포칩은 ITO 기판 위에 패터닝된 작용전극, 공통전극, 단자패드, 및 전극들 위에 부착된 세포 배양 챔버를 구비한다. 작용전극은 동일 형상의 전극이 반복하여 배열된 어레이 전극으로 제작된다. 임피던스 측정부는 작용전극과 공통전극 사이에 교류신호를 인가하는 교류신호 발생기와, 작용전극과 공통전극 사이의 교류응답을 측정하는 교류신호 증폭기를 구비한다. 제어부는 교류신호 발생기의 교류 주파수를 조정할 수 있는 주파수 조정기와, 교류신호 증폭기로부터 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여한 경우의 교류응답 측정값을 전달받아 임피던스값을 계산하고 상기 세포의 세포생존도를 평가하는 데이터 분석기를 구비한다. 본 발명에 의하면, 표지 없이 실시간으로 세포독성 평가를 할 수 있으며, 저투여량에서도 보다 민감하게 측정할 수 있다.

Description

다중 디스크 형태 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법{CYTOTOXICITY EVALUATION DEVICE USING IMPEDANCE CHARACTERIZATION WITH MULTIDISC-ITO ELECTRODE ARRAY AND METHOD THEREOF}
본 발명은 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다중 디스크 형태의 전극 어레이를 이용하여 표지 없이 실시간으로 세포독성을 평가할 수 있는 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 기존 단일 디스크 전극 센서보다 넓은 면적에 분포하는 세포들의 세포독성 효과를 측정할 수 있어서, 저투여량의 세포독성 효과도 민감하게 측정할 수 있다.
키토산(chitosan)은 아래 화학식 1에 나타낸 것처럼, β-(1→4)-결합된 글루코사민과 N-아세틸 글루코사민으로 구성된 긴 선형 폴리 사카라이드(polysaccharide)이다. 주로 게, 새우 등의 갑각류의 껍질에 존재한다. 이 생체 고분자는 셀룰로오스와 유사한 구조를 가지고 있으나, 아미노기(-NH2)를 가지고 있으므로 셀룰로오스에 비해 상대적으로 높은 비율(%)의 질소를 함유하고 있다.
[화학식 1]
Figure 112018065407544-pat00001
키토산은 분자량과 탈아세틸화 수준에 의해 특성이 조금씩 달라지지만, 생분해성 및 생체 적합성으로 인해 식품, 의약품 및 생체재료 산업에서 널리 사용되고 있다. 특히, 키토산과 그 유도체는 항균, 항종양 및 항암 효과가 있어서, 상처 치유를 위한 약물 운반체, 지혈용 드레싱, 조직공학용 골격으로 사용될 수 있다. 따라서 키토산을 붕대의 재료, 항균제, 종양 및 암세포의 세포독성 제제 등과 같은 생의학 분야에 적용하는 연구가 다양하게 진행되고 있다.
세포의 증식 또는 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법은 생명과학 분야, 특히 종양 생물학에서 필수적인 기법중의 하나이다. 새로운 항암제 개발을 위한 효능검색이나 기존에 개발된 항암제의 감수성을 알아보기 위하여 동물실험 등 생체에의 적용 단계 이전에 생체 밖에서의 약물의 종양세포 성장 억제력을 알아보는 과정이 필요하다.
약물 후보 물질의 약물 검사(drug screening) 및 세포독성 시험(cytotoxicity test)은 현미경 분석, 효소결합 면역흡착 분석, MTT 분석 등과 같은 전통적인 방법에 의해 수행할 수 있다.
현미경분석은 세포에 trypan blue등을 처리한 후 현미경과 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포를 세는 방법은 직접적인 방법이지만, 시간과 노력이 너무 많이 요구되어 검체수가 많을 경우에는 사용할 수가 없다. 따라서 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하는 방법이 필요하다. 96-well plate를 사용하여 많은 시료를 간단히 빠르고 객관성 있게 판독할 수 있는 MTT 분석법은 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 많이 사용되는 방법중 하나이다.
MTT 분석법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium 을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 그러나 측정할 well의 세포의 농도가 너무 낮거나 높은 범위에 있으면 살아있는 세포의 농도와 흡광도 사이의 직선적인 비례관계가 성립되지 않게 되므로 최적의 세포농도를 결정하는 과정을 거쳐야 한다. 이러한 종래의 광학 기반 검사는 광표지자의 사용으로 민감한 분석이 어려운 문제점이 있다.
한편, ITO 전극을 이용하여 줄기세포의 노화를 실시간으로 모니터링하는 전기임피던스 측정법에 대해서는 공개특허공보 제10-2014-0047877호 “전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단 방법”에 개시되었다.
또한, 공개특허공보 제10-2018-0024388호 “세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서”에는 빗살형 핑거 구조를 가진 ICE 전극을 사용하는 세포독성 분석 방법이 개시되었다. 그러나 투명전극이 아니어서 실시간으로 외관을 확인하여야 하는 측정에는 적용하기 곤란하다.
그러나 라벨을 사용하지 않고 실시간으로 세포독성 시험을 할 수 있으면서도, 넓은 면적의 세포에 대하여 독성물질의 저투여량에 대한 세포독성 효과에 대하여 보다 민감하고 신속하게 약물의 영향을 탐지할 수 있는 세포독성 평가 장치와 방법에 대한 연구가 필요하다. 본 특허는 기존 공개특허공보 제10-2014-0047877호에서 사용한 단일 디스크 ITO 전극에 비해 다중 디스크 전극을 사용함으로써 보다 넓은 면적에서 세포를 비표지 및 실시간으로 분석할 수 있는 방법을 제시하고 있으며 다중 디스크 전극 사용시 보다 향상된 민감도를 갖는 것을 실시예를 통해 보이고 있다.
공개특허공보 제10-2014-0047877호 “전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단 방법” 공개특허공보 제10-2018-0024388호 “세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서”
본 발명의 목적은, 표지 없이 실시간으로 세포독성 효과를 평가할 수 있는 전기 임피던스 측정을 이용한 세포독성 측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 유방암 세포에 대한 키토산의 세포독성 평가를 민감하게 할 수 있는 ITO 전극을 구비한 세포칩을 포함하는 전기 임피던스 측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 세포독성 물질을 조금 투여한 경우에도 세포독성 효과를 파악할 수 있는 다중 디스크 형태의 전극 어레이를 구비한 전기 임피던스를 이용한 세포독성 측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 세포독성 평가 장치에 있어서, 세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포가 부착될 수 있는 작용전극과, 상기 작용전극 위에 배치되어 상기 세포를 포함하는 배양액이 시딩되는 세포 배양 챔버와, 상기 작용전극과의 사이에 교류신호가 인가되는 공통전극과, 상기 작용전극과 공통전극에 교류신호를 인가할 수 있는 단자패드를 구비하는 세포 칩; 상기 단자패드에 연결되어 작용전극과 공통전극 사이에 교류신호를 인가하는 교류신호 발생기와, 상기 단자패드에 연결되어 작용전극과 공통전극 사이의 교류응답을 측정하는 교류신호 증폭기를 구비하는 임피던스 측정부; 및 상기 교류신호 발생기의 교류 주파수를 조정할 수 있는 주파수 조정기와, 상기 교류신호 증폭기로부터 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여한 경우의 교류응답 측정값을 전달받아 임피던스값을 계산하고 상기 세포의 세포생존도를 평가하는 데이터 분석기를 구비하는 제어부;를 포함한다.
상기 작용전극은, 동일 형상의 전극이 반복하여 배열된 어레이 전극을 사용할 수 있다.
상기 작용전극은, ITO 재질이고, 원형 디스크가 3 x 3 어레이 형태로 배열된 다중 디스크 형태를 가진 어레이 전극을 사용할 수 있다.
상기 제어부는, 상기 교류신호 증폭기로부터 주파수에 따른 임피던스의 크기를 입력받아, 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어 정규화 임피던스 크기를 구하고, 상기 정규화 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 기준주파수를 선택하는 기준주파수 선택기를 더 구비할 수 있다.
상기 데이터 분석기는, 상기 독성물질의 농도에 따른 상기 세포의 세포생존도 데이타에 대하여 시그모이드 피팅을 실시하여 세포생존도가 50% 에 해당하는 상기 독성물질의 농도를 CC50 값으로 결정할 수 있다.
상기 데이터 분석기는, 세포생존도를 하기 수학식 1로 구할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112018065407544-pat00002
(여기에서, Zcell free 는 세포가 없는 경우에 측정된 임피던스의 크기이며, Zcell covered 는 키토산에 노출되지 않은 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이고, Zchi 는 키토산에 노출된 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이다.)
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 세포독성 평가 방법에 있어서, 디스크 형태의 전극이 다중으로 배열된 작용전극 위에 부착된 세포 배양 챔버에 세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포를 포함하는 배양액을 시딩하는 단계; 상기 세포가 상기 작용전극 위에 부착할 수 있도록, 상기 세포 배양 챔버를 배양환경에 보관하여 세포를 배양하는 단계; 상기 배양액에 세포독성 평가를 위해 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여하는 단계; 상기 작용전극과 공통전극 사이에 기준 주파수의 교류신호를 인가하고 응답으로 발생한 교류응답을 이용하여 배양액, 세포, 전극의 전체 임피던스를 구하는 단계; 및 상기 임피던스로부터 상기 독성물질에 대한 상기 세포의 세포생존도를 구하는 단계;를 포함한다.
상기 세포독성 평가 방법은, 유리기판 위에 증착된 ITO 층에 레이저 어블레이션 공정을 적용하여 ITO 기판 위에 작용전극 및 공통전극을 패터닝하는 단계; 작용전극과 단자패드를 제외한 부분에 절연층을 코팅하는 단계; 및 세포 배양 배지를 수용할 수 있도록 세포배양 챔버를 상기 작용전극 위쪽에 부착하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 세포독성 평가 방법은, 상기 교류신호의 주파수를 변경시키면서, 상기 교류신호에 대한 응답으로 발생하는 교류응답을 측정하는 단계; 상기 교류응답으로부터 주파수에 따른 임피던스의 크기와 위상을 구하는 단계; 배양시간에 따라 측정한 임피던스의 크기를 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어, 임피던스 크기를 정규화하는 단계; 및 상기 정규화된 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 기준 주파수를 찾는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 세포독성 평가 방법은, 상기 독성물질의 농도에 따른 상기 세포의 세포생존도 데이타에 대하여 시그모이드 피팅을 실시하는 단계; 및 세포생존도가 50% 에 해당하는 상기 독성물질의 농도를 CC50 값으로 결정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 세포생존도는 하기 수학식 1로 구할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112018065407544-pat00003
(여기에서, Zcell free 는 세포가 없는 경우에 측정된 임피던스의 크기이며, Zcell covered 는 키토산에 노출되지 않은 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이고, Zchi 는 키토산에 노출된 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이다.)
본 발명에 따른 다중 디스크 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법은, 표지 없이 실시간으로 세포독성 효과를 평가할 수 있으므로, 다양한 약물 후보 또는 독소에 대한 세포독성 영향 평가와 관련된 세포 기반 분석에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 다중 디스크 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법은, 다중 디스크 형태의 전극 어레이를 구비하여 넓은 면적의 세포 반응을 보다 큰 감도로 측정할 수 있어서, 보다 빠르게 임피던스의 변화를 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 다중 디스크 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법은, 독성물질의 농도가 낮은 경우에도 세포생존도의 변화를 파악할 수 있으므로, 독성물질의 영향을 보다 빠른 시간 안에 파악할 수 있다.
본 발명에 따른 다중 디스크 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법은, 유방암 세포에 대한 키토산의 세포독성 평가를 민감하게 할 수 있으므로, 키토산의 저투여량이 유방암 세포에 미치는 영향을 보다 정밀하게 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기적 임피던스 모니터링 시스템의 개략적인 구성도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 어레이를 나타내는 사진이다.
도 2b는 작용전극과 공통전극 사이의 전기장 분포를 유한요소법으로 계산한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극이 세포로 덮인 경우에 대한 등가회로 모델이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 어레이를 이용하여 세포생존도를 구하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 어레이를 이용하여 정규화된 임피던스를 구하여 기준주파수를 설정하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 위에서 세포를 배양하는 동안, 10 Hz에서 100 kHz의 주파수 범위에서 측정된 임피던스의 크기와 위상을 나타내는 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 위에서 세포를 배양하는 동안, 10 Hz에서 100 kHz의 주파수 범위에서 측정된 정규화된 임피던스의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극과 단일 디스크 형태의 ITO 전극에서 세포를 배양하는 동안, 21.4 kHz의 주파수에서 측정된 정규화된 임피던스의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 ITO 전극 상에 배양되는 유방암 세포에 다양한 농도의 키토산-P를 투여하고 2일 경과후의 위상차 현미경 사진이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 ITO 전극 상에 배양되는 유방암 세포에 다양한 농도의 키토산-P를 투여하고 측정한 임피던스의 정규화된 크기를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예인 임피던스 측정법과 종래의 MTT법을 사용하여 구한, 키토산의 농도에 따른 세포생존도를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부한 도면들 및 후술되어 있는 내용을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예들을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되어지는 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급되지 않는 한 복수형도 포함된다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자가 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
임피던스 측정법(electrical cell-substrate impedance sensing; ECIS)은 전극 부위와 세포의 행동을 평가하기 위해, 약한 교류 전기장을 인가하고, 감지 전극에 부착된 세포의 전기적 특성을 측정한다.
임피던스 측정법(ECIS)을 이용하면, 부착(adhesion), 분열증식(proliferation), 미세운동(micromotion), 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis), 분화(differentiation) 등과 같은 세포의 행동을 라벨 없이 비파괴적이면서 실시간으로 모니터링 할 수 있다.
임피던스 측정법에서는 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO)을 재료로 한 ITO 전극을 사용하여 세포의 광학적, 전기적 특성을 측정할 수 있다. 이는 ITO 전극이 그 생체 적합성과 투명성을 가지고 있기 때문이다. 단일 디스크 형태의 전극을 사용할 수도 있으나, 다중 디스크 형태의 ITO 전극 어레이가 보다 넓은 면적에 분포하는 세포에 대한 임피던스 측정을 고감도로 할 수 있다.
이하, 도면을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 ITO 전극 어레이의 전기임피던스를 이용한 세포독성 평가 장치 및 방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기적 임피던스 모니터링 시스템의 개략적인 구성도이다.
전기 임피던스 모니터링 시스템은 세포칩(110), 임피던스 측정부(140), 제어부(180)를 포함한다. 세포칩은 세포독성 평가의 대상인 세포가 배양되는 곳이다. 세포칩은 작용전극과 공통전극을 구비하여 그 사이에 배양되는 세포에 전기신호를 인가하거나 측정할 수 있다.
임피던스 측정부(140)는 교류신호 발생기(120)와 교류신호 증폭기(130)를 포함한다. 교류신호 발생기(120)는 세포칩에 연결되어 세포칩의 작용전극과 공통전극 사이에 교류신호를 인가할 수 있다. 세포칩의 작용전극과 공통전극 사이의 교류응답은 교류신호 증폭기(130)를 통해서 측정할 수 있다.
제어부(180)는 주파수 조정기(150), 데이터 분석기(160), 기준주파수 선택기(170) 등을 포함한다. 주파수 조정기(150)는 교류신호 발생기(120)에서 발생하는 교류의 주파수를 조정할 수 있다. 데이터 분석기(160)는 교류신호 증폭기(130)로부터 측정된 교류응답에서 임피던스 측정값을 분석할 수 있으며, 기준주파수 선택기(170)는 배양 세포의 임피던스 변화가 가장 큰 주파수를 선택할 수 있다.
기준주파수 선택기(170)가 기준주파수를 선택하기 위해서 데이터 분석기(160)로부터 세포배양 시간에 따른 임피던스 데이터를 입력받는다. 입력받은 임피던스 크기를 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어 정규화 임피던스 크기를 구한다. 기준주파수 선택기(170)는 정규화 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 주파수를 기준주파수로 선택할 수 있다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 어레이를 나타내는 사진이다.
도 2a의 왼쪽 사진을 참조하면, 세포칩(110)은 작용전극(211), 배양챔버(미도시), 공통전극(213), 단자패드(215)를 포함한다.
세포칩은 유리기판 위에 증착된 ITO 층을 이용하여 제작할 수 있다. 작용전극(211), 공통전극(213), 단자패드(215), 전송선 등은 ITO 기판 위에 레이저 어블레이션 공정을 적용하여 패터닝하여 형성할 수 있다. ITO 전극은 투명하기 때문에, 전기 임피던스 모니터링을 하는 동시에 배양되는 세포의 외관을 확인할 수 있는 효과가 있다.
작용전극과 단자패드를 제외한 부분에는 절연층을 코팅하고, 그 위에 세포 배양 배지를 수용할 수 있도록 세포 배양챔버(미도시)를 형성한다.
작용전극(211)은 세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포가 배양되고 부착되는 곳이다. 작용전극을 밑면으로 하는 배양챔버(미도시)는 배양액을 보관할 수 있도록 작용전극 위에 작용전극을 둘러싸도록 배치된다. 그 결과 배양챔버에 배양하려는 세포와 함께 배양액을 시딩하면, 배양액의 세포는 배양챔버의 바닥면에 있는 작용전극에 부착하면서 배양될 수 있다.
교류신호 발생기(120)를 세포칩의 단자패드(215)에 연결하여, 작용전극과 공통전극 사이에 교류신호를 인가할 수 있다. 단자패드(215)에 인가된 교류신호는 전송선을 통해서 작용전극(211)과 공통전극(213) 사이에 인가되고, 작용전극(211)과 공통전극(213) 사이의 배양액 및 세포에도 교류 신호가 전달된다.
교류신호 발생기를 저항 및 단자패드와 직렬로 연결하여 단자패드에 교류 전류를 인가할 수 있다. 단자패드에 인가하는 교류신호로 교류 전류를 사용하는 경우, 교류신호 발생기와 단자패드 사이에 과전류를 방지하기 위해 전류제한 저항을 직렬로 구비하여 교류 전류가 세포에 미치는 영향을 최소화 할 수 있다.
작용전극과 공통전극 사이에서 발생하는 교류응답은 단자패드에 연결된 교류신호 증폭기(130)로 측정할 수 있다. 교류 응답으로 교류 전압을 측정하는 경우, 교류신호 증폭기는 락인증폭기(Lock-In Amplifier) 등을 사용할 수 있다. 이 경우, 교류신호 증폭기는 단자패드에 대하여 교류신호 발생기와 병렬로 배치한다.
도 2a의 오른쪽 위 사진은 작용전극(211)이 다중 디스크 형태의 어레이로 배치된 것을 확대한 현미경 사진을 나타낸다. 도 2a의 오른쪽 아래 사진은 디스크 어레이의 면적의 합과 동일한 면적을 가지는 단일 디스크 형태의 작용전극을 확대한 현미경 사진이다.
도 2b는 작용전극과 공통전극 사이의 전기장 분포를 유한요소법으로 계산한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b의 위쪽 그래프는 본 발명의 일 실시예에 따른 작용전극(211)이 다중 디스크 형태의 어레이 형태로 배치된 경우의 ITO 작용전극(WE)과 공통전극(CE) 사이의 전기장 분포를 나타낸다. 도 2b의 아래쪽 그래프는 종래의 작용전극(211)이 단일 디스크 형태인 경우의 ITO 작용전극과 공통전극 사이의 전기장 분포를 나타낸다. 두 경우의 디스크 면적의 합은 동일하게 설정하었다.
단일 디스크 형태의 전극에서, 감지 전극 면적이 증가하면, 전극 위에 있는 더 많은 수의 셀을 임피던스 측정법(ECIS)으로 측정할 수 있다. 그러나, 넓은 명적에 신호가 인가되므로 측정 감도가 감소하게 된다.
그래프에서 붉은 색은 공통전극(CE)을 기준으로 작용전극(WE)의 전위가 미치는 범위를 보여주는데, 아래쪽의 단일전극에서는 작용전극의 주위로만 붉은 색이 분포한다. 반면에, 위쪽의 다중 디스크 형태의 작용전극(WE)에서는 붉은 색 영역이 단일 디스크의 경우보다 훨씬 더 넓은 면적에 미치는 것을 알 수 있다.
따라서 다중 전극의 총 노출 면적을 단일 전극의 면적과 동일하게 설계하는 경우, 단일전극과 동일한 측정 감도를 유지하면서도 단일전극보다 넓은 면적의 세포 반응을 측정할 수 있다. 즉, 다중 전극을 사용하는 경우, 동일면적의 세포 반응을 보다 큰 감도로 측정할 수 있다.
즉, 다중 디스크 형태로 작용전극을 형성하는 경우에 보다 넓은 영역에서 균일하게 전위를 인가할 수 있어서 보다 넓은 영역에서 임피던스 측정이 가능하게 된다.
작용전극은, 원형 디스크 뿐만 아니라 사각형, 육각형, 팔각형 등 동일 형상의 전극을 반복 배열하여 어레이 형태로 제작할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극이 세포로 덮인 경우에 대한 등가회로 모델이다.
등가회로 모델은 용액의 저항(Rsolution), 저항(Rcell)과 커패시턴스(Ccell)가 병렬로 연결된 세포의 임피던스, 그리고 전극 계면 임피던스에 대한 상수 위상 요소(CPE)로 구성할 수 있다.
데이터 분석기(160)는 교류신호 증폭기(130)에서 측정된 교류 응답으로부터 등가회로 모델의 각 회로요소에 대한 임피던스, 즉 배양액 저항, 배양세포의 임피던스(저항 및 커패시턴스), 상수 위상 요소의 임피던스 값을 분석할 수 있다.
또한, 데이터 분석기(160)는 배양세포를 독성물질에 노출시켰을 경우, 세포의 생존도를 전기 임피던스 측정결과로부터 아래 수학식 1과 같이 구할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112018065407544-pat00004
여기에서, Zcell free 는 세포가 없는 경우에 측정된 임피던스의 크기이며, Zcell covered 는 키토산에 노출되지 않은 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이고, Zchi 는 키토산에 노출된 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이다.
배양세포에 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여하고 각 경우에 대한 임피던스 측정값을 전달받는 경우, 데이터 분석기(160)는 전달받은 독성물질의 다양한 농도에 대한 배양세포의 세포생존도를 계산한다. 그리고 데이터 분석기는 독성물질의 다양한 농도에 대한 세포생존도에 대하여 시그모이드(sigmoid) 함수로 피팅을 실시하여 CC50 값을 구할 수 있다. CC50 값은 세포생존도가 50% 에 해당하는 독성물질의 농도로 설정할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 어레이를 이용하여 세포생존도를 구하는 방법을 나타내는 순서도이다.
디스크 형태의 전극이 다중으로 배열된 작용전극 위에 부착된 세포 배양 챔버에 세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포를 포함하는 배양액을 시딩한다(S810). 배양액은 복수의 셀에 배양하여, 다양한 실험을 할 수 있도록 준비한다. 배양하려는 세포가 상기 작용전극 위에 부착할 수 있도록, 세포 배양 챔버를 배양환경에 보관하여 세포를 배양한다(S820).
배양액에 세포독성 평가를 하려는 세포독성 물질을 투여한다. 이때 세포독성물질은 서로 다른 농도로 제조하여 복수개를 별개의 배양액에 투여한다(S830). 세포칩의 작용전극과 공통전극 사이에 기준 주파수의 교류신호를 인가하고(S840), 응답으로 발생한 교류응답을 이용하여 배양액, 세포, 전극의 전체 임피던스를 구한다(S850).
구해진 임피던스로부터 투여한 독성물질에 대한 배양 세포의 세포생존도를 앞에서 언급한 수학식 1을 이용하여 구한다(S860). 독성물질의 농도에 따른 배양 세포의 세포생존도 데이타에 대하여 시그모이드 피팅을 실시한다(S870). 시그모이드 피팅 결과를 이용하여, 세포생존도가 50% 에 해당하는 독성물질의 농도를 CC50 값으로 결정할 수 있다(S880).
한편, 세포칩은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 우선, 유리기판 위에 증착된 ITO 층에 레이저 어블레이션 공정을 적용하여 ITO 기판 위에 작용전극 및 공통전극을 패터닝한다. 그리고 작용전극과 단자패드를 제외한 부분에 절연층을 코팅한다. 세포 배양 배지를 수용할 수 있도록 세포배양 챔버를 상기 작용전극 위쪽에 부착하여, 세포를 배양하면서 전기적 특성을 측정할 수 있는 세포칩을 제조할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 어레이를 이용하여 정규화된 임피던스를 구하여 기준주파수를 설정하는 방법을 나타내는 순서도이다.
교류신호의 주파수를 변화시키면서, 세포 배양 셀에 교류 신호를 인가한다(S910). 그리고 교류신호에 대한 응답으로 발생하는 교류응답을 측정한다(S920). 주파수를 최소 주파수부터 최대 주파수로 증가시키면서, 교류응답 측정을 반복한다(S930).
교류응답으로부터 주파수에 따른 임피던스의 크기와 위상을 구한다(S940). 배양시간에 따라 측정한 임피던스의 크기를 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어, 임피던스 크기를 정규화한다(S950). 정규화된 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 주파수를 기준주파수로 설정한다(S960). 이렇게 설정한 기준주파수로 세포독성 평가를 실시하면 보다 빠르고 정확하게 세포독성 평가를 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
이하의 실시예에서는 유방암 세포인 MCF-7에 대한 키토산의 세포독성 효과를 조사한다. 키토산은 분자량이 6 kDa 내지 8 kDa 인 키토산-P(CTSN-P)를 사용하고, 세포독성 효과는 전기 임피던스법(ECIS)으로 평가한다.
<실시예 1> 다중 디스크 형태의 ITO 전극 어레이의 제작
도 2a와 같은 모양으로 다중 디스크 형태의 전극 어레이를 제작한다. 우선, 유리 기판(75×25 mm2)의 표면을 세정한 후, 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO)을 480 nm의 두께로 증착시킨다. 레이저 어블레이션(laser ablation)으로 ITO 층에 직접 패턴을 형성하여, 작용전극(working electrodes; WE), 커다란 공통전극(common counter electrodes; CE), 전송선, 그리고 단자 패드를 만들 수 있다.
네거티브 포토레지스트 재료인 SU-8(2002, Microchem, Newton, MA, USA)을 스핀 코터를 이용하여 패턴이 형성된 ITO 전극에 2 μm 두께로 코팅할 수 있다. 다음으로, 포토레지스트층 위에 마스크 필름을 놓고 UV 광에 노출시킨 후, 포토레지스트층을 현상액으로 현상하여 작용전극 및 단자 패드를 노출시킨다.
노출된 작용전극(WE)은 원형 디스크의 중심간 거리가 333.33 μm 인 3×3 배열을 가지는 어레이로 제작한다. 원형 디스크 하나의 반경은 83.33 μm 로, 총 9개의 다중 디스크 작용전극(WE)을 가진 어레이의 전극 면적은 π×(83.33×10-3 mm)2×9 = 0.19633 mm2 이 된다. 한편, 250 μm의 반경을 갖는 단일 전극의 면적도 π×(250×10-3 mm)2×1 = 0.19635 mm2 이므로, 9개의 다중 디스크 형태로 구성된 전극 어레이의 노출된 영역은 250 μm의 반경을 갖는 단일 디스크 전극의 노출된 영역과 거의 동일하다. 이러한 경우의 전기장 분포를 유한요소법으로 시뮬레이션한 결과는 도 2b의 위쪽 그래프에 나타나있다.
ITO 전극기반 칩에, 세포 배양 배지를 수용할 수 있도록 8개의 폴리스티렌 세포배양 챔버를 접착성 실리콘을 사용하여 부착할 수 있다.
<실시예 2> 키토산-P(CTSN-P)의 제조
탈아세틸화도가 95 % 이고, 분자량이 200 kDa 인 고분자량 키토산 (high-molecular weight chitosan; HMWC)을 시그마(Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용한다.
키토산 중합체 2.0 g 을 2 % 아세트산 수용액 0.1 L 에 용해시키고, 스트렙토미케스 그리세우스균(Streptomyces griseus, Sigma)에서 얻은 키토산 분해효소(chitosanase) 2.0 U 를 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 배양하여 키토산 중합체를 부분적으로 분해시킬 수 있다.
그 다음에 효소작용을 중지시키기 위해, 반응 혼합물을 100 ℃에서 5 분간 끓여서 키토산 분해효소를 변성시킨다. 그 후, 상대원심력(relative centrifugal force; RCF)을 26,452×g 로 설정하고 10 분 동안 원심분리하여, 비활성화된 키토산 분해효소와 분해되지 않은 고분자량 키토산(HMWC)을 제거한다.
부분적으로 분해된 키토산 중합체를 차가운 에탄올로 침전시키고, 26,452×g 로 10 분 동안 다시 원심분리하면 가수분해물을 얻을 수 있다. 그 다음, 가수 분해물에서 0.3 에서 1.2 kDa 의 크기를 갖는 저분자량 키토산을 제거하기 위해, 겔-여과 컬럼(Φ 1.0 cm × L 30 cm)을 장착한 Bio Gel-P 4 beads(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 분별할 수 있다.
이러한 과정을 거쳐서 얻어진 키토산 중합체의 평균 분자량은, 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC) 분석에서 얻은 주요 피크의 면적비와 검량선을 사용하여 결정할 수 있다.
세포독성 시험을 위해 사용한 키토산 중합체는, 분별에 의해 얻어진 것 중에서 분자량이 6 kDa 내지 8 kDa의 범위의 분획을 선택하여 사용할 수 있다. 이러한 크기의 키토산 중합체를 키토산-P(CTSN-P)로 명명한다.
탈이온수(deionized water; DI water)를 사용하여, 다양한 농도 (0.001 % ~ 1 %)의 키토산-P(CTSN-P) 샘플을 제조할 수 있다.
<실시예 3> 다중 디스크 형태의 ITO 전극 어레이의 성능 평가
104 개의 유방암 세포(MCF-7)를 함유한 배양액 450 μL 를 ITO 전극에 시딩(seeding)하고, 37 ℃ 와 5 % CO2 환경에서 배양한다. 배양하는 중에 실시간으로 ITO 전극을 이용하여 전기 임피던스를 측정할 수 있다.
세포 성장 동안, 디지털 락인 증폭기 SR830(Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA)을 이용하여, 100 Hz 내지 100 kHz 의 주파수 범위에서 전기 임피던스 스펙트럼을 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 위에서 세포를 배양하는 동안, 10 Hz에서 100 kHz의 주파수 범위에서 측정된 임피던스의 크기와 위상을 나타내는 그래프이다.
도 6의 (A)는 임피던스의 ‘크기’를 나타내는 그래프이다. 배양시간이 증가함에 따라, 세포가 성장하면서 다중 디스크 전극 상에 부착되고 증식되므로, 임피던스의 크기는 1 Hz ~ 100 kHz 의 주파수 구간에서 증가하는 것을 보여준다.
세포에 의해 전극이 덮이면, 임피던스의 실수부분인 저항이 증가하는데, 이는 다중 디스크 전극 위에서 세포가 성장하는 동안 세포막의 손상이 없어서 전도도가 낮아지기 때문이다.
도 6의 (B)는 임피던스의 ‘위상’을 나타내는 그래프이다. 배양시간이 증가함에 따라, 세포가 성장하면서 다중 디스크 전극 상에 부착되고 증식되므로, 임피던스의 위상은 100 Hz ~ 4 kHz의 주파수 구간에서 증가하는 것을 보여준다.
이러한 결과는 세포가 성장하여 전극에 부착함에 따라 세포-기판 간격이 감소하여, 세포 저항(Rcell)의 증가 및 세포 커패시턴스(Ccell)의 감소를 일으키기 때문이다.
도 3의 등가회로 모델의 각 파라미터 값을 구하기 위하여, 세포 성장 동안 구해진 도 6의 (A)와 (B)의 임피던스 크기 및 위상 측정값에 비선형 곡선 피팅을 실시할 수 있다. 이렇게 구한 등가회로의 각 파라미터 값을 표 1에 정리하여 보여준다.
배양
시간
(hr) 		상수 위상 요소(CPE) 세포
저항
(Ω) 		세포
커패시턴스
(F) 		용액
저항
(Ω)
T (Ω -1 , s P ) P
12 2.5516×10-8 0.96207 1474 3.214×10-9 1005
24 2.5344×10-8 0.96684 6529 1.621×10-9 1102
36 2.6491×10-8 0.96368 8650 1.456×10-9 1124
48 2.5682×10-8 0.96982 9210 1.357×10-9 1145
상수 위상 요소(CPE)의 임피던스는, 표 1의 상수위상요소(CPE)의 T값과 P값을 이용하여 ZCPE = 1/[T(jω)P]로 나타낼 수 있다. 이때, j는 허수이고, ω는 각주파수이다.
세포로 덮인 전극에서 측정된 전기적 임피던스의 데이터는 도 6의 (C)에 도시된 등가회로 모델에서 구한 값으로 피팅한 값과 거의 일치하므로, 세포로 덮인 전극에 대해 등가회로 모델로 설명할 수 있음을 알 수 있다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극 위에서 세포를 배양하는 동안, 10 Hz에서 100 kHz의 주파수 범위에서 측정된 정규화된 임피던스의 크기를 나타내는 그래프이다.
배양시간에 따라 측정된 주파수별 임피던스의 크기를, 배양 시작 후 처음(2시간 경과한 때) 측정한 임피던스의 크기로 나누어 주면, 배양시간에 따라 측정된 주파수별 임피던스의 크기를 정규화(normalization)할 수 있다. 즉, 처음 측정한 임피던스의 크기를 1로 하였을 때, 배양시간에 따라 처음의 임피던스의 크기에 비해 임피던스 크기의 변화된 정도를 손쉽게 파악할 수 있다.
세포 성장 동안, 임피던스 크기의 가장 큰 변화는 21.4 kHz에서 관찰되었다. 낮은 주파수에서는, 임피던스 크기는 세포의 임피던스보다 전극 계면 임피던스에 의해 결정된다. 주파수가 증가함에 따라 용량성인 전극 임피던스가 감소하므로, 세포의 전기적 임피던스 특성이 두드러지게 나타난다. 따라서, 세포독성 평가에 사용하는 기준 주파수로 21.4 kHz 를 설정할 수 있다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 형태의 ITO 전극과 단일 디스크 형태의 ITO 전극에서 세포를 배양하는 동안, 21.4 kHz의 주파수에서 측정된 정규화된 임피던스의 크기를 나타내는 그래프이다.
그래프에서 임피던스 크기는 다중 디스크 전극과 단일 디스크 전극에 대하여 각각 6 번 측정한 평균 및 표준 오차로 표시되었다. 단일 디스크 전극과 비교할 때, 다중 디스크 전극의 경우에 세포 성장에 따른 임피던스 크기의 변화가 더 크기 때문에, 다중 디스크 전극이 세포의 임피던스 모니터링에 더 적합한 것을 알 수 있다.
도 7b에서 ‘*’로 표시된 시간(세포 배양 후 약 44시간)은, 두 그룹 간의 평균을 비교할 때 스튜던트 시험(Student 's test)의 p 값이 0.05 이하인 시점을 나타낸다.
<실시예 4> 세포독성에 대한 임피던스 시험
104 개의 유방암 세포(MCF-7)를 함유한 배양액 450 μL를 ITO 전극에 시딩(seeding)하고, 37 ℃ 와 5 % CO2 환경에서 48 시간 배양한 후, 다양한 농도(0.001 % ~ 1 %)의 키토산-P(CTSN-P) 용액 50 μL씩을 투여한다.
유방암 세포가 키토산-P에 노출되었을 때, 전극에 대한 세포의 부착성은 키토산-P의 농도가 클수록 더욱 약화되었다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 ITO 전극 상에 배양되는 유방암 세포에 다양한 농도의 키토산-P를 투여하고 2일 경과후의 위상차 현미경 사진이다.
투여한 키토산-P의 농도가 각각 0(미투여), 10, 100, 그리고 1000 μg/mL 인 경우에 대하여, 다중 디스크 ITO 전극 상에 배양되는 세포의 부착상태를 확인할 수 있다.
100 μg/mL 이하의 농도로 키토산-P가 투여된 세포는, 비록 투여되지 않은 세포보다 적게 증가하지만, 계속 성장하여 전극 기판에 부착된다. 그러나 세포에 투여된 키토산-P의 농도가 1000 μg/mL 인 경우에는 전극 기판으로부터의 분리가 현저하게 일어난 것을 확인할 수 있다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 디스크 ITO 전극 상에 배양되는 유방암 세포에 다양한 농도의 키토산-P를 투여하고 측정한 임피던스의 정규화된 크기를 나타내는 그래프이다.
유방암 세포 배양 2일(48시간) 후에, 다양한 농도의 키토산-P를 투여하고, 정규화 임피던스의 크기를 시간에 따라 나타낸다.
100 μg/mL 이하의 농도로 키토산-P가 투여된 세포의 경우에는, 비록 투여되지 않은 세포보다 조금 적게 증가하지만, 계속 임피던스의 크기가 증가하므로 세포가 계속 성장하고 전극 기판에 부착됨을 알 수 있다.
그러나 세포에 투여된 키토산-P의 농도가 500 μg/mL 보다 크면, 임피던스가 감소한 후 더 이상 증가하지 않는 것을 알 수 있다. 임피던스의 감소는 세포막의 파괴 또는 세포가 감지 전극으로부터 분리될 때 일어나기 때문에, 농도가 500 μg/mL 이상인 키토산-P를 투여하면 세포의 파손 및 전극 기판으로부터의 분리가 현저하게 증가함을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예인 임피던스 측정법과 종래의 MTT법을 사용하여 구한, 키토산의 농도에 따른 세포생존도를 나타내는 그래프이다.
도 9의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 임피던스 분석으로 구한 키토산-P가 투여된 유방암 세포의 세포생존도를 나타내는 그래프이다.
세포생존도는 정상적인 세포의 임피던스에 대한 키토산 처리된 세포의 임피던스 비에 해당하는 임피던스 인덱스로 구할 수 있다. 즉, 세포생존도는 앞의 수학식 1의 세포의 임피던스 인덱스(Zcell)로 구할 수 있다.
세포 생존도의 지표로 사용되는 50% 세포독성 농도(cytotoxic concentration; CC50)는 세포생존도가 50%가 되는 독성물질의 농도이다.
세포가 50% 생존하는 키토산 농도값 CC50 은 도 9의 (A)의 임피던스 인덱스, 즉 세포생존도 데이터를 시그모이드(sigmoid) 곡선으로 피팅하여 구할 수 있다. 도 9의 (A)에서는 CC50 값으로 543.17 μg/mL 를 얻을 수 있다.
<비교예> 세포독성에 대한 MTT 시험
세포독성에 대한 임피던스 측정 결과를 비교하기 위해 일반적인 MTT 분석으로 세포독성 실험을 하여 그 결과를 비교할 수 있다.
소의 태아 혈청 10 %, 페니실린 100 IU/mL 를 포함하는 RPMI 1640 배양배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 90 μL씩 시딩한다. 그리고 각 웰에는 2×103 개의 유방암 세포(MCF-7)를 삽입한다. 그 후, 96-웰 플레이트를 37 ℃ 와 5 % CO2 환경에서 보관하여 세포를 배양한다.
48 시간 동안 배양 후, 다양한 농도(0.001 % 내지 1 %)의 키토산-P(CTSN-P) 용액 10 μL 를 세포 배양 배지에 첨가한다. 그 다음에, MTT 시약(CellVia, Young In Fortier, Seoul, Korea) 10 μL 를 첨가한 후, 2 시간 동안 배양한다.
파장 450 nm에서의 흡광도를 Synergy H1 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek, Winooski, VT, USA)로 측정하여 키토산-P의 농도에 따른 MCF-7 세포의 MTT 세포생존도(%)를 구할 수 있다.
도 9의 (B)는 종래의 MTT 분석으로 측정한 키토산-P 농도에 따른 유방암 세포의 세포생존도 그래프이다. 세포생존도 데이터를 시그모이드(sigmoid) 곡선으로 피팅하여 세포가 50% 생존하는 키토산 농도값 CC50 을 구할 수 있다. 도 9의 (B)에서는 CC50 값으로 1266.60 μg/mL 를 얻을 수 있다.
도 9의 (A)와 (B) 모두에서, 키토산 농도가 늘어날수록 유방암 세포의 세포생존도가 감소하는 것을 나타낸다. 다만, MTT 분석으로 얻은 CC50 값이 1266.60 μg/mL 인데 반해서, 본 발명의 일 실시예에 따른 임피던스 분석으로 얻은 CC50 값은 543.17 μg/mL 으로 훨씬 적은 값을 보인다. 이는 키토산-P의 투여량이 적은 경우에도 세포의 행동 또는 형태가 변화할 수 있고, 상당한 세포 사멸이 유발되지는 않더라도 임피던스 측정으로 이러한 변화를 감지할 수 있음을 나타낸다. 즉, 임피던스 측정법을 이용하면 MTT 분석에서 측정할 수 있는 것 보다, 더욱 낮은 투여량에서 세포독성 영향을 파악할 수 있다.
본 발명의 실시예에 의하면, 키토산-P에 대한 유방암 세포(MCF-7)의 반응을 넓은 영역에 걸쳐 파악하기 위해 다중 전극 배열이 사용되었다. 다중 전극 배열로는 3 x 3 다중 디스크 ITO 전극 어레이를 제작하여 사용하였다. 세포로 덮인 다중 디스크 전극은 이론적으로 등가 회로 모델로 설명할 수 있는 임피던스 특성을 나타내었고, 세포가 성장하는 동안 세포의 행동을 감시할 수 있다. 따라서 유방암 세포에 대한 키토산의 세포독성 효과를 라벨 없이 비파괴적이고 실시간으로 조사할 수 있었다.
배양중인 세포에 키토산-P를 투여하면, 전극 기판상의 세포 생존율을 저하시키고, 세포가 전극 표면에서 분리되어, 결국 투여된 키토산의 농도에 따라 임피던스가 감소한다. 임피던스 측정법에서 얻어진 CC50값은 543.17 μg / mL으로 MTT 시험에서 얻어진 CC50값보다 작은 값을 얻을 수 있었다. 즉, 다중 디스크 전극을 가진 임피던스 측정법을 이용하면, 낮은 키토산 투입량에 대해서도 암세포에 미치는 세포독성 영향을 민감하게 검출할 수 있다.
실험 결과는 다중 디스크 전극을 이용한 임피던스 측정법을 이용하여 암세포에 대한 저투여량 효과를 비파괴적이고 실시간으로 검출할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과를 이용하면, 임피던스 측정법을 다양한 약물 후보 또는 독소의 저 투여량에 대한 세포독성 영향 평가와 관련된 세포 기반 분석에 사용할 수 있다.
이상에서 대표적인 실시 예를 통하여 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시 예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태에 의하여 정해져야 한다.
110 : 세포칩
120 : 교류신호 발생기
130 : 교류신호 증폭기
140 : 임피던스 측정부
150 : 주파수 조정기
160 : 데이터 분석기
170 : 기준주파수 선택기
180 : 제어부
211 : 작용전극
213 : 공통전극
215 : 단자패드

Claims (10)

  1. 전기임피던스를 이용하여 키토산의 농도에 따른 세포독성을 실시간으로 모니터링할 수 있는 세포독성 평가 장치에 있어서,
    세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포가 부착될 수 있는 작용전극과, 상기 작용전극 위에 배치되어 상기 세포를 포함하는 배양액이 시딩되는 세포 배양 챔버와, 상기 작용전극과의 사이에 교류신호가 인가되는 공통전극과, 상기 작용전극과 공통전극에 교류신호를 인가할 수 있는 단자패드를 구비하는 세포 칩;
    상기 단자패드에 연결되어 작용전극과 공통전극 사이에 교류신호를 인가하는 교류신호 발생기와, 상기 단자패드에 연결되어 작용전극과 공통전극 사이의 교류응답을 측정하는 교류신호 증폭기를 구비하는 임피던스 측정부; 및
    상기 교류신호 발생기의 교류 주파수를 조정할 수 있는 주파수 조정기와, 상기 교류신호 증폭기로부터 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여한 경우의 교류응답 측정값을 전달받아 임피던스값을 계산하고 상기 세포의 세포생존도를 평가하는 데이터 분석기를 구비하는 제어부;를 포함하며,
    상기 작용전극은,
    ITO 재질이고, 동일 형상의 원형 디스크 전극이 3 x 3 어레이 형태로 반복하여 배열된 다중 디스크 형태의 전극이며,
    상기 데이터 분석기는,
    상기 독성물질의 농도에 따른 상기 세포의 세포생존도 데이터에 대하여 시그모이드 피팅을 실시하여 세포생존도가 50% 에 해당하는 상기 독성물질의 농도를 임피던스 측정 기반 CC50 값으로 결정하는 것 을 특징으로 하는 세포독성 평가 장치.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제어부는,
    상기 데이터 분석기로부터 주파수에 따른 임피던스의 크기를 입력받아, 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어 정규화 임피던스 크기를 구하고, 상기 정규화 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 기준주파수를 선택하는 기준주파수 선택기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 세포독성 평가 장치.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 데이터 분석기는, 세포생존도를 하기 수학식 1로 구하는 것을 특징으로 하는 세포독성 평가 장치.
    [수학식 1]
    Figure 112018065407544-pat00005

    (여기에서, Zcell free 는 세포가 없는 경우에 측정된 임피던스의 크기이며, Zcell covered 는 키토산에 노출되지 않은 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이고, Zchi 는 키토산에 노출된 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이다.)
  6. 전기임피던스를 이용하여 키토산의 농도에 따른 세포독성을 실시간으로 모니터링할 수 있는 세포독성 평가 방법에 있어서,
    디스크 형태의 전극이 다중으로 배열된 작용전극 위에 부착된 세포 배양 챔버에 세포독성 평가의 대상으로 사용하는 세포를 포함하는 배양액을 시딩하는 단계;
    상기 세포가 상기 작용전극 위에 부착할 수 있도록, 상기 세포 배양 챔버를 배양환경에 보관하여 세포를 배양하는 단계;
    상기 배양액에 세포독성 평가를 위해 서로 다른 농도를 가진 복수의 독성물질을 투여하는 단계;
    상기 작용전극과 공통전극 사이에 기준 주파수의 교류신호를 인가하고 응답으로 발생한 교류응답을 이용하여 배양액, 세포, 전극의 전체 임피던스를 구하는 단계; 및
    상기 임피던스로부터 상기 독성물질에 대한 상기 세포의 세포생존도를 구하는 단계;를 포함하며,
    상기 작용전극은,
    ITO 재질이고, 동일 형상의 원형 디스크 전극이 3 x 3 어레이 형태로 반복하여 배열된 다중 디스크 형태의 전극이고,
    상기 독성물질의 농도에 따른 상기 세포의 세포생존도 데이터에 대하여 시그모이드 피팅을 실시하는 단계; 및
    세포생존도가 50% 에 해당하는 상기 독성물질의 농도를 임피던스 측정 기반 CC50 값으로 결정하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징 으로 하는 세포독성 평가 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    유리기판 위에 증착된 ITO 층에 레이저 어블레이션 공정을 적용하여 ITO 기판 위에 작용전극 및 공통전극을 패터닝하는 단계;
    작용전극과 단자패드를 제외한 부분에 절연층을 코팅하는 단계; 및
    세포 배양 배지를 수용할 수 있도록 세포배양 챔버를 상기 작용전극 위쪽에 부착하는 단계;를 더 포함하는 세포독성 평가 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 교류신호의 주파수를 변경시키면서, 상기 교류신호에 대한 응답으로 발생하는 교류응답을 측정하는 단계;
    상기 교류응답으로부터 주파수에 따른 임피던스의 크기와 위상을 구하는 단계;
    배양시간에 따라 측정한 임피던스의 크기를 배양 초기에 측정한 임피던스의 크기로 나누어, 임피던스 크기를 정규화하는 단계; 및
    상기 정규화된 임피던스 크기가 가장 크게 변화하는 기준 주파수를 찾는 단계;를 더 포함하는 세포독성 평가 방법.
  9. 삭제
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 세포생존도는 하기 수학식 1로 구하는 것을 특징으로 하는 세포독성 평가 방법.
    [수학식 1]
    Figure 112018065407544-pat00006

    (여기에서, Zcell free 는 세포가 없는 경우에 측정된 임피던스의 크기이며, Zcell covered 는 키토산에 노출되지 않은 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이고, Zchi 는 키토산에 노출된 세포가 있는 경우에 측정된 임피던스의 크기이다.)
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