KR101862642B1 - 세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서 - Google Patents

세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정 센서에 관한 것으로서, 전극 구조 전반에 걸쳐 균일한 측정감도를 가지는 신규한 전극의 구조를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 전극 구조 전반에 걸쳐 균일한 측정감도를 가지는 신규한 전극구조를 제공함으로써, 에지 효과(edge effect)에 따라 전기장이 집중되는 현상을 감소시키는 효과가 있다. 또한, 전극 주변의 에지효과를 감소시킴으로써, 전극 전체에서 균일한 임피던스 측정감도를 가지는 전극을 제공하는 효과가 있다.
신규한 전극구조를 포함하는 세포 임피던스 측정 센서는 비표지 및 실시간으로 세포의 운동성 및 개체수를 측정하는 것이 가능하다. 또한, 세포를 파괴하지 않고 세포생장, 세포괴사 및 세포자살과 같은 세포 특성을 확인할 수 있는 효과가 있다.
또한, 신규한 전극구조를 포함하는 세포 임피던스 측정센서는 약물 스크리닝, 질병진단, 세포독성분석 및 상처치료에 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서{Electrode enhanced cell-substrate measurement sensitivity and sensor for cell-substrate impedance measurement using thereof}
본 발명은 세포 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정 센서에 관한 것이다.
전기 임피던스 분광법을 이용한 세포 임피던스 측정은 세포의 생리 및 형태적인 변화와 세포활동(유착, 증식, 탈착)을 반영하는 세포-기질의 전기적 임피던스를 측정하여 이로부터 세포의 상태와 반응을 실시간 비파괴적으로 정량하는 기술이다. 세포 임피던스 분석은 전극을 통해 미약한 교류 전류가 흐를 때 세포의 부착 및 증식에 따라 전류가 방해를 받게 되고, 측정되는 임피던스가 변화하는 원리로 Giaver와 Keese에 의해 1984년 에 최초로 시도되었다.
ECIS(Electronic cell-substrate impedance sensing)는 살아있는 세포의 운동성 및 개체수를 측정하기 위한 방법이다. 상기 ECIS는 비표지, 실시간으로 세포의 운동성 및 개체수를 측정하는 것이 가능하다. 또한, ECIS는 세포를 파괴하지 않고 세포생장, 세포괴사 및 세포자살과 같은 세포특성을 확인 할 수 있다.
종래 IDE(Interdigitated electrode)는 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)의 구조가 사각형의 형태인 것을 사용해 왔다. 전기장(electric field)은 에지효과(edge effect)에 의해 전극 모서리에 집중되는 경향을 가진다. 따라서 종래 사각형의 형태인 인터디지테이트 핑거로 측정 된 임피던스 값은 전극 모서리에 위치 된 분석물에 의해 결정되어, 검출영역에 있어서 측정 된 임피던스의 불균형을 초래한다.
관련 선행기술로는 한국공개특허 제10-2008-0024944호 ‘셀센서 및 이를 이용하여 세포의 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법’ 및 한국 공개특허 제10-2012-0114411호 ‘전기 세포-기질 임피던스 측정에 의한 줄기세포 노화의 실시간 모니터링 또는 진단방법’이 있다.
본 발명의 목적은, 전극 구조 전반에 걸쳐 균일한 측정감도를 가지는 신규한 전극구조를 제공함으로써, 에지효과(edge effect)에 따라 전기장이 집중되는 현상을 감소시키는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 형태에 따른 ICE(Interdigitated Chain-shaped Electrode)전극은 둥근 고리가 연결 된 사슬 형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함한다. 상기 ICE전극은 복수개의 인터디지테이트 핑거가 서로 이격되어 배열된 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 인터디지테이트 핑거는 10 내지 100μm간격으로 배열되어있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 일 형태에 따른 세포 임피던스 측정 센서는 기판 및 상기 기판상에 형성 된 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함하는 ICE(Interdigitated chain-shaped electrode)전극을 포함한다. 상기 인터디지테이트 핑거는 10 내지 100μm 간격으로 배열되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 세포임피던스 측정 센서는 기판상에 부착 된 세포배양용 웰(well)을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명 또 다른 일 형태에 따른 세포독성 분석 방법은 기판 및 상기 기판 상에 형성 된 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함하는 ICE(Interdigitated chain-shaped electrode)을 포함하는 세포 임피던스 측정센서를 이용한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 전극 구조 전반에 걸쳐 균일한 측정감도를 가지는 신규한 전극구조를 제공함으로써, 에지 효과(edge effect)에 따라 전기장이 집중되는 현상을 감소시키는 효과가 있다. 또한, 전극 주변의 에지효과를 감소시킴으로써, 전극 전체에서 균일한 임피던스 측정감도를 가지는 전극을 제공하는 효과가 있다.
신규한 전극구조를 포함하는 세포 임피던스 측정 센서는 비표지 및 실시간으로 세포의 운동성 및 개체수를 측정하는 것이 가능하다. 또한, 세포를 파괴하지 않고 세포생장, 세포괴사 및 세포자살과 같은 세포 특성을 확인할 수 있는 효과가 있다.
또한, 신규한 전극구조를 포함하는 세포 임피던스 측정센서는 약물 스크리닝, 질병진단, 세포독성분석 및 상처치료에 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인터디지테이트 핑거의 너비 및 간격이 20μm인 ICE전극(a) 및 등가 회로 모델(b)을 도시한 것이다.
도 2는 0.1V의 전압을 입력하였을 때, ICE전극에 형성 된 전기장을 도시한 것이다. ICE전극의 전기전도도(σ)는 45.6X106S/m, 유전상수(εr)는 0.994이다. 또한, 배지(medium)의 전기전도도(σ)는 1.6S/m, 유전상수(εr)는 80이다.
도 3은 0 내지 1%NaCl을 포함하는 증류수에서 측정 된 ICE전극의 임피던스의 실수부(a) 및 허수부(b)를 도시한 것이다.
도 4는 ICE전극에서 3일간 배양한 HEK293/GFP 세포주의 위상차현미경 사진(a) 및 배양기간 동안의 측정한 임피던스의 실수부(b)를 도시한 것이다.
도 5는 ICE전극에서 세포배양 동안 측정 된 정규화 된 임피던스의실수부(a) 및 감지영역이 0.01, 0.57, 0.88mm2(n=4) 및 43.4kHz 조건에서 세포배양 동안 측정 된 임피던스의 정규화 된 실수부(b)를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 형태에 따른 ICE(Interdigitated Chain-shaped Electrode)전극은 둥근 고리가 연결 된 사슬 형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함한다. 종래 사각형 모양의 전극은 전기장이 모서리 쪽으로만 집중되는 에지효과(edge effect)로 인해, 전극 몸통은 전류가 집중되지 않아 전기장의 불균형을 초래하므로 측정 감도가 낮다는 문제가 있다. 상기 본 발명의 일 형태에 따른 ICE전극은 신규한 전극 구조로, 인터디지테이트 핑거에 모난부분이 없이 둥근 형태이므로 에지효과를 감소시킬 수 있다. 이에 따라, 상기 ICE 전극 주변에 균일한 전기장(electric field)이 형성되고, 센싱범위 전체에서 균일한 임피던스 측정 감도를 가진다.
상기 ICE전극은 복수개의 인터디지테이트 핑거가 서로 이격되어 배열된 것이 바람직하다. 2전극 시스템(two-electrode system)은 작업전극(woking electrode) 및 상대전극(counter electrode)으로 구성된다. 2전극 시스템 중comb-structure IDE(Interdigitated electrode)는 전극이 이격되어 배열되어 있다. 상기 comb-structure IDE는 인터디지테이트 핑거의 너비 또는 간격을 조절함으로써 전기장의 분배 및 투과 깊이를 조정할 수 있어 임피던스 측정 감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 인터디지테이트 핑거의 간격은 10 내지 100μm인 것이 바람직하며, 너비 및 간격이 20μm인 것이 더욱 바람직하다. 상기 인터디지테이트 핑거의 간격은 세포 종류 및 크기에 따라 핑거간격이 5 내지 100μm인 전극을 제작할 수 있다. 상기 인터디지테이트 핑거의 너비 및 간격이 20μm인 전극은 핑거의 너비 및 간격으로 인해 형성되는 균일한 전기장의 분배 및 투과 깊이를 근거로 10 내지 20μm 크기인 동물세포의 임피던스 측정에 적절하다.
또한, 상기 ICE전극의 감지영역은 0.31 내지 0.88mm2인 것이 바람직하다. 상기 ICE전극의 감지영역은 최소화 할수록 측정 민감도는 상승한다. 다만, 일정 수치 미만의 감지영역을 갖게 되면 전극 계면 임피던스가 증가하여 다시 측정 민감도가 감소하는 현상이 발견된다.
또한, 본 발명의 다른 일 형태에 따른 세포 임피던스 측정 센서는 기판 및 상기 기판상에 형성 된 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함하는 ICE(Interdigitated chain-shaped electrode)전극을 포함한다. 상기 인터디지테이트 핑거의 간격은 10 내지 100μm인 것이 바람직하며, 너비 및 간격이 20μm인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 ICE전극의 감지영역은 0.31 내지 0.88mm2인 것이 바람직하다. 또한, 상기 세포임피던스 측정 센서는 기판상에 부착 된 세포배양용 웰(well)을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명 또 다른 일 형태에 따른 세포 임피던스 측정센서를 이용한 세포독성 분석 방법은 기판 및 상기 기판 상에 형성 된 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함하는 ICE(Interdigitated chain-shaped electrode)를 이용한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. ICE( Interdigitated chain-shaped electrode)전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서의 제작
유리기판(75mmX25mmX1.1mm)은 70%메탄올에서 sonication하여 세척한다. ICE전극의 리프트-오프(lift-off)를 위한 희생층은 세척 된 유리기판에 negative photoresist을 코팅하였으며, 포토리소그래피(photolithography)로 패터닝시켜 형성되었다. 상기 희생층이 형성 된 기판에 Ti 및 Au를 각각 25nm 및 50nm의 두께로 증착시켰으며, 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함하는 ICE(Interdigitated chain-shaped electrode)전극은 희생층이 제거 된 후 나타났다. 그 후, 희생층이 제거 된 ICE 기판 상에 insulating photoresist를 코팅하였으며, 감지영역 및 콘택트 패드를 노출시키기 위해 상기 희생층이 제거 된 ICE 기판을 패터닝시켜 ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서를 제작하였다.
상기 제작 된 ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서에 세포를 배양하기 위한 폴리스티렌(polystyrene) 멀티웰(multi-well)을 부착하였다.
ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서의 노출된 감지영역은 0.12 내지 0.88mm2 이며, 제작 된 인터디지테이트 핑거의 너비 및 간격은 각각 20μm이다(도 1a).
실시예2 . ICE전극의 전기장 측정
실시예1에서 제조한 ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서에 Multiphysics software(COMSOL, Brurlinto, MA, USA)를 이용하여 0.1V의 전압을 입력하여 측정하였다.
세포 임피던스 측정 센서에 포함 된 ICE전극의 전기장 측정 결과는 도 2에 도시하였다. 상기 결과로부터, ICE전극의 인터디지테이트 핑거들 사이의 전기장은 비교적 균일한 것을 확인하였다. 또한, 상기 결과는 ICE전극에서 세포의 임피던스가 전체 전극범위에 걸쳐 균일하게 측정할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예3 . ICE전극을 이용한 임피던스 측정
3-1 ICE전극을 이용한 전해질 농도에 따른 임피던스 측정
실시예1에서 제작한ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서를 이용하여, NaCl 수용액의 농도에 따른 임피던스를 측정하였다. 상기 NaCl 수용액의 농도는 0 내지 1%이다.
ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서를 이용한 NaCl 수용액의 농도에 따른 임피던스 측정 결과는 도 3에 도시하였다.
상기 결과에 따르면, 1kHz 이하의 낮은 진동수에서, NaCl 수용액의 임피던스는 전극 계면 임피던스에 의한 허수부에 의해 결정되었다. 진동수의 증가는 NaCl 수용액의 저항 및 ICE전극의 커패시턴스는 NaCl의 농도에 의존적이었다.
적합분석으로 추론한 NaCl 수용액의 저항 값은 NaCl 수용액의 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1 및 1% 농도일 때 각각 295.41, 82.72, 8.84, 2.66, 1.56 및 0.52kΩ이다.
측정 진동수 범위에서, 측정 된 임피던스의 실수부 및 허수부는 적합분석으로 추론한 값과 일치하므로 실시 예1 에서 제작한 ICE전극은 잘 제작된 것임을 알 수 있다.
3-2 ICE전극을 이용한 세포 임피던스 측정
세포의 임피던스 측정을 위하여, 배지 500μl 당 세포의 농도가 1X105cells이 되도록 HEK293/GFP세포주를 준비하였다. 준비 된 세포를 실시예1에서 제작한 ICE전극을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서에서 배양하였다. 배양조건은 온도 37℃, 5% CO2이다.
접종 된 HEK293/GFP세포주는 ICE전극 상에 부착되었으며, 증식하였다(도 4a).
세포배양 과정 중 임피던스는 임피던스 분석기를 사용하여 측정하였다.
ICE전극에서 세포의 전기적 특성은 도 1b의 등가회로 모델에 따라 디자인 되었다. 상기 등가회로는 constant-phase element(CPEel); 세포의 저항(Rcl) 및 커패시턴스(Ccl); 용액의 저항(Rs); 직렬로 평행한 인터디지테이트 커패시턴스(Cid)로 구성된다. 상기 인터디지테이트 커패시턴스는 전극의 수, 배열, 인터디지테이트 핑거의 간격 및 너비에 의해 결정 된다. 회로 파라미터 값은 nonlinear curve fitting analysis을 통해 계산 하였다. 또한, 감지영역의 범위에서, ICE전극의 세포 임피던스 측정 감도는 임피던스의 정규화 된 실수부를 사용하여 측정하였다.
상기 결과에 따르면, 임피던스의 실수부는 도 4b에 도시한 것과 같이 배양 일수에 따라 변화하였다. 세포배양이 진행됨에 따라, 전기전도도가 낮은 막을 가지는 세포는 ICE전극의 감지영역을 덮었다. 임피던스 실수부의 증가는 진동수 1kHz이상에서 관찰되었다. 배양 1, 2 및 3일차에서, 적합분석으로 추론 된 세포의 저항(Rcl)은 각각 0.64, 1.23 및 1.72kΩ이다.
상기 적합분석으로 추론 된 세포의 저항(Rcl)을 정규화한 임피던스의 실수부는 도 5a에 도시하였다. 상기 정규화 된 임피던스 실수부 값의 가장 큰 변화는 진동수 46.4kHz에서 확인 되었다. 따라서, ICE전극에서 임피던스의 모니터링은 진동수 46.4kHz에서 가장 좋은 측정 감도를 가진다는 것을 알 수 있다.
또한, ICE전극의 감지영역의 범위에 따른 진동수 46.4kHz에서 정규화 된 임피던스 실수부 값은 도 5b에 도시하였다. 배양 일수 및 ICE전극의 감지영역의 넓이에 따른, 46.4kHz에서의 정규화 된 임피던스 실수부의 평균 및 표준편차는 표 1과 같다.
배양 일수 및 ICE전극의 감지영역의 넓이에 따른, 46.4kHz에서의 정규화 된 임피던스 실수부의 평균 및 표준편차
0.31mm2 0.57mm2 0.88mm2
배양 1일차 1.4±0.15 1.27±0.04 1.3±0.03
배양 2일차 2.83±0.3 2.22±0.16 2.09±0.1
배양 3일차 3.6±0.12 2.81±0.11 2.46±0.03
상기 도 5b 및 표 1에 따르면, 전극의 감지영역의 넓이가 작을수록 임피던스 실수부의 변화율이 증가하였다. 이는 전극의 감지영역의 넓이가 작을 ?, 세포 저항의 구성요소인 cell/cell gap의 수가 적기 때문이다. 따라서, ICE전극을 이용한 세포의 임피던스 측정에 있어서, ICE전극의 감지영역 넓이의 감소는 세포 임피던스 측정 감도를 향상시킨다는 것을 알 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitate finger)를 포함함으로써 센싱범위 전체에서 균일한 임피던스 측정값을 제공하고 임피던스 측정 민감도가 향상된 ICE(Interdigitated Chain-shaped Electrode)전극.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 ICE전극은 복수개의 인터디지테이트 핑거가 서로 이격되어 배열된 것인 ICE전극.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 인터디지테이트 핑거는 10 내지 100μm 간격으로 배열되어 있는 것인 ICE전극.
  4. 기판; 및
    상기 기판상에 형성 된 둥근 고리가 연결 된 사슬형태인 인터디지테이트 핑거(Interdigitated finger)를 포함함으로써 센싱범위 전체에서 균일한 임피던스 측정값을 제공하고 임피던스 측정 민감도가 향상된 ICE(Interdigitated Chain-shaped Electrode)전극;
    을 포함하는 세포 임피던스 측정 센서.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 인터디지테이트 핑거는 10 내지 100μm간격으로 배열되어 있는 것인 세포 임피던스 측정 센서.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 세포 임피던스 측정 센서는 기판 상에 부착 된 세포배양용 웰(well)을 더 포함하는 세포 임피던스 측정 센서.
  7. 제4항에 따른 세포 임피던스 측정센서를 이용한 세포독성 분석 방법.
KR1020160110497A 2016-08-30 2016-08-30 세포의 임피던스 측정 감도가 향상 된 전극 및 이를 이용한 세포 임피던스 측정센서 KR101862642B1 (ko)

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박진수, "Electric Cell-Substrate Impedance Sensing 민감도 향상을 위한 Interdigitated and Chain-Shaped Electrode 설계 및 제조", 가천대학교 바이오나노대학 석사학위논문 (2016.01)

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