KR20190127383A - 알지네이트 그라프트 공중합체를 포함하는 생체적합성 하이드로젤 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로, 상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고, 상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합성과 기계적 강도가 향상된 하이드로젤 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 이를 이용하여, 약물 방출성이 향상된 생체적합성 하이드로젤 또는 세포생존성을 향상시키는 생체적합성 하이드로젤을 얻을 수 있으며, 이를 조직공학 지지체, 주사용 젤, 3D 프린팅용 소재, 약물전달체 등 다양한 분야에 적용하는 것을 목적으로 한다.

Description

알지네이트 그라프트 공중합체를 포함하는 생체적합성 하이드로젤 및 이의 제조방법{HYDROGEL CONTAINING ALGINATE GRAFTCOPOLYMER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 알지네이트 그라프트 공중합체를 포함하는 생체적합성 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로, 상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고, 상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합성 하이드로젤 및 이를 이용한 제조방법에 관한 것이다.

하이드로젤은 수분 함량이 높고, 화학적 또는 물리적 특성을 조절하여 다양한 분야에 적용할 수 있다는 점에서 주목받고 있는 조성물 중 하나이다. 특히 하이드로젤의 생체적합성을 조절하면 인체의 뼈, 연골, 피부 재생, 약물 전달 및 상처의 치료 등에 사용될 수 있어 조직재생 및 세포치료제로 적용에 있어 그 수요가 날로 높아지는 추세이다.

또한, 하이드로젤은 손상된 인체 조직의 치유를 목적으로 하는 조직공학 기질의 제조에 유용한 후보물질로 알려져 있다. 하이드로젤에 의해 형성되는 3차원 구조는 스캐폴드(scaffold) 또는 지지체라고도 불리며, 이와 같은 지지체는 다양한 조직공학 재료로 사용되고 있다.

고분자 하이드로젤은 유동성 고체로, 친수성을 띄고 있으며, 천연 또는 합성 고분자로 각각 또는 이들의 조합으로 구성되어 가교제에 의해 가교 결합된 삼원공중합 단위체로 젤 고분자 네트워크를 형성한다. 형성된 젤 고분자 네트워크는 하이드로젤 내부에 많은 양의 수분을 보유할 수 있도록 한다. 특히 천연 고분자 기반의 하이드로젤은 합성 고분자 기반의 하이드로젤에 비해 생체 적합성, 생분해성, 조직재생성 및 생물학적 특성이 높아 생물 의학 분야에 주로 응용될 수 있다. 또한, 구조적인 측면에서도 하이드록시기(-OH), 아민기(NH₂), 카르복실기(-COOH)와 같은 작용기를 많이 가지고 있으므로, 생체조직과 유사한 물리적 특성을 지녔으며, 변형이 용이하여 화학적 특성의 제어가 가능하다는 장점이 있다.

이와 같은 하이드로젤의 소재로 이용할 수 있는 물질 중, 알지네이트(Alginate)를 하이드로젤에 적용하는 연구가 점점 증가하고 있다. 알지네이트는 자연산 다당류 고분자로 미역, 다시마와 같은 갈조류 또는 해조류의 세포벽을 구성하는 주요 성분이며, 만누로네이트(β-(1→4)-D-Mannuronate)와 글루로네이트(α-(1→4)-L-guluronate)가 연결된 화학구조를 가지고 있다. 또, 알지네이트는 생체적합성이 뛰어나고 세포독성이 낮으며, 지혈효과를 가진다. 따라서, 알긴산을 섭취할 시, 중성지질이나 콜레스테롤의 침착을 억제하여 혈류 개선, 콜레스테롤 저하, 고혈압 예방, 효소의 활성화 등 여러 생리활성을 가진다.

알지네이트를 포함하여 형성된 하이드로젤은 생체활성물질, 성장인자, 세포, 단백질, 영양성분, 효소 등 다양한 물질들을 함입한 후, 함입된 물질을 신체의 원하는 장기로 안정적으로 수송하는데 사용될 수 있으며, 효소의 경우 고정화 효소를 만드는데 이용될 수 있다. 또한, 알지네이트 하이드로젤은 천연물질에서 유래하였기 때문에, 체내의 안전성과 흡수율을 향상시켜 약물 발현에 최적화 되어 있으며, pH에 따른 약리물질 전달 속도의 조절이 가능하므로 외부 자극으로부터 민감성을 지닌 약물전달체로서 이용될 수 있다. 그러나 이와 같은 알지네이트의 장점에도 불구하고, 알지네이트를 약물 전달에 사용하는 경우, 소수성 약물의 침출 또는 높은 pH환경에서의 급속한 용해 등 그 사용에 있어 제한이 있으며, 약물의 봉입률이 낮아 봉입된 단백질 약물이 급격하게 방출되는 문제를 초래할 수 있다. 또, 알지네이트를 하이드로젤에 적용하여 지지체로 사용하는 경우, 점성을 유지하기가 어렵고, 제작 후에는 세포의 증식과 분화에 적당한 젤의 상태를 유지가 어려울 수 있다. 이와 같은 이유로, 알지네이트를 바이오 프린팅 재료로 하여 3차원 구조물을 만들기 위해, 세포 성장에 적당한 농도를 찾고자 다양한 선행 연구가 이루어져 왔으나, 알지네이트는 인체 내에서 분해하는 효소가 따로 존재하지 않으므로, 3D 프린팅에 사용되는 다른 재료에 비해 상대적으로 생체 적합성이 낮다는 단점이 있다. 따라서, 알지네이트를 포함하는 하이드로젤의 생체적합성을 높여 제조하기 위해서는 일반적으로 칼슘이온과 같은 2가의 이온들과 이온결합을 유도하여 하이드로젤을 제조하고, 이온들이 젤로부터 방출되는 과정에서 젤이 분해되도록 유도하는 방법을 사용하고 있으나, 이러한 방법으로 제조된 하이드로젤은 기계적 강도가 낮은 단점이 있다. 이처럼, 전술한 내용의 단점을 극복하기 위해 현재까지도 다수의 연구가 진행중에 있으나, 아직까지 알지네이트를 적용한 하이드로젤은 용도특성과 물성을 모두 만족하는 결과가 전무한 실정이다.

본 발명은 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로, 상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고, 상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합하고, 물성이 강화된 하이드로젤 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 종래의 이온결합에 의한 알지네이트 하이드로젤과는 달리, 공유결합에 의한 화학적 결합을 형성하는 알지네이트 하이드로젤을 발명하는데 다른 목적이 있다. 또한, pH와 같은 외부 환경에 의해 하이드로젤의 팽윤도를 조절함으로써 약물 방출 거동을 조절할 수 있는 하이드로젤을 제조하는데 또 다른 목적이 있다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 및 폴리(에틸렌 글리콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로, 상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고, 상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합성 하이드로젤이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 삼원공중합 단위체는 Alg-g-pHEA-x-PEGDA인, 생체적합성 하이드로젤 일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 아크릴레이트 단량체는 하이드록시 에틸 아크릴레이트(HEA) 또는 하이드록시 에틸 메타크릴레이트(HEMA)인 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 젤 고분자 네트워크는, 가교 결합에 의해 형성되는 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 삼원공중합 단위체는 라디칼 중합에 의한 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 젤 고분자 네트워크는 가교제의 함량에 따라 공극의 크기가 조절될 수도 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계; (b)라디칼 중합 개시제를 첨가하는 단계; 및 (c) 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 가교제로 첨가하여 삼원공중합 단위체를 합성하는 단계를 포함하는 생체적합성 하이드로젤의 제조방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 (b)단계의 라디칼 중합 개시제는 과황산칼륨(potassium persulphate, KPS)일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에 의해 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 형성하는 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계는 물 50 ml당 0.25g 내지 0.75g 의 알지네이트 및 2.5 ml 내지 4.0 ml의 HEA를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 하이드로젤은 알지네이트를 주 고분자로 하고, 아크릴레이트계 단량체 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)와 젤 고분자 네트워크로 이루어지는 삼원공중합 단위체를 하이드로젤의 성분으로 사용함으로써, 하이드로젤 내부 및 외부에서의 세포 부착을 향상시켜 세포의 생존성을 높일 수 있다. 또, 본 발명의 제조방법을 사용함으로써, 생체 내에서 약물 서방출성이 향상된 생체 적합성 하이드로젤 또는 세포 생존력을 높인 생체 적합성 하이드로젤을 얻을 수 있다. 또한, 삼원공중합 단위체의 조성을 조절하여 기계적 물성을 향상시키고, 하이드로젤의 이화학적 특성을 조절함으로써 조직공학 지지체, 주사용 젤, 3D 프린팅용 소재, 약물 전달체 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.

그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 제조방법을 반응 단계에 따라 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 TGA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 전자현미경을 통해 확인한 생체적합성 하이드로젤의 SEM 이미지를 도시한 것이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 pH 조건별 팽윤도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 생체적합성을 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 약물 방출 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 특성 및 용도를 나타낸 개략도이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로, 상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고, 상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합성 하이드로젤이 제공된다.

상기 알지네이트는 천연 고분자로 생체적합성이 뛰어나고 독성이 낮으며, 쉽게 구할 수 있다는 장점에도 불구하고, 생체재료로 적용하기에는 물성이 적합하지 않다는 단점이 있다. 따라서, 아크릴레이트계 단량체와 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 이용하여 삼원공중합 단위체를 구성함으로써 기계적 물성이 보완된 하이드로젤을 제공할 수 있다.

여기서, 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시 에틸아크릴레이트(HEA) 또는 하이드록시 에틸메타크릴레이트(HEMA) 중 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 2-하이드록시 에틸 아크릴레이트(2-HEA)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일 측에 따르면, 상기 삼원공중합 단위체는 Alg-g-pHEA-x-PEGDA 일 수 있다. 우선적으로, 알지네이트와 아크릴레이트계 단량체가 라디칼 중합되어 Alg-g-pHEA가 생성하게 되는데, 일 측에 따르면, 상기 가교제에 의한 가교 결합으로 젤 고분자 네트워크가 형성될 수 있다. 먼저, 라디칼 중합 반응으로 라디칼 중합체가 형성되고, 이후, 가교제에 의해 라디칼 중합체간의 네트워크가 생성된다. 이 때, 라디칼 중합 반응은 라디칼 중합 개시제에 의한 것으로, 개시제의 종류는 어느 하나에 한정되지는 않으나, 수용성의 과황산칼륨(Potassium persulphate, KPS)을 사용함이 바람직하다.

앞서 설명한 내용으로 생성되는 공중합체인 Alg-g-pHEA는 하기의 구조식 1과 같이 나타낼 수 있다.

[구조식 1]

구조식 1과 같이 합성된 Alg-g-pHEA 은 이후 첨가되는 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)에 의해 가교 결합되는데, 이러한 가교 결합은 중합체 간의 결합을 가능하게 한다. 가교제는 상기 공중합 단위체 간의 더욱 밀집된 구조를 형성하여 최종적으로 유효 가교밀도(effective crosslinking density)를 가진 하이드로젤의 네트워크를 형성하기 위한 것이며, 이를 통해 생성되는 하이드로젤은 다공성 구조를 조절할 수 있다. 이 때, 반응에 참여하는 가교제의 함량을 달리하면, 공극의 크기 역시 달라지므로 생성되는 네트워크의 밀도와 가교사이의 거리를 조절할 수 있다. 가교제의 함량을 높일수록 형성되는 공극의 크기는 감소하게 되는데, 이로 인해 정해진 부피의 하이드로젤의 내부에 더 많은 양의 네트워크가 형성되면서 열 안정성이 높은 하이드로젤이 생성될 수 있다. 또, 공극의 수를 조절함으로써, 하이드로젤 내부의 수용할 수 있는 수분의 양이 조절될 수 있으므로, 공극의 수를 조절하면 다양한 물성의 하이드로젤을 제조할 수도 있다.

위와 같이 제조된 하이드로젤은 가교된 젤 고분자 네트워크 구조에 따라 내부에 약물을 담지할 수 있는 약물 전달체 및 스캐폴드(Scaffold) 등에 적용될 수 있으며, 그 외에도 3D 프린팅용 소재, 주사용 젤 등의 분야에도 적용될 수 있다. 전술한 원리를 적용하여 제조되는 하이드로젤의 제조방법은 실시예에서 보다 자세히 후술하기로 한다.

또한, 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)는 가교제로서의 역할 뿐 아니라, 중합 반응에 직접 참여함으로써 알지네이트(Alginate) 및 2-하이드록시 에틸 아크릴레이트(2-HEA)와 반응하여 삼원공중합 단위체인 Alg-g--pHEA-x-PEGDA를 형성하게 된다. 형성된 Alg-g--pHEA-x-PEGDA는 하기의 구조식 2와 같이 나타낼 수 있다.

[구조식 2]

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 생체적합성 하이드로젤은 (a) 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계; (b) 라디칼 중합 개시제를 첨가하는 단계; 및 (c) 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 가교제로 첨가하여 삼원공중합 단위체를 형성하는 단계를 포함하는 제조방법에 의한 것일 수 있다. 상기 제조방법은 이후 실시예에서 보다 자세히 설명하도록 한다.

일 측에 따르면, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법에서 상기 (b)단계의 라디칼 중합 개시제는 과황산칼륨(potassium persulphate, KPS)임이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

일 측에 따르면, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법은 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에 의해 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)가 형성될 수 있다. 이러한 그라프트 공중합체의 형성은 선형 공중합체에 비해 밀집된 분자구조를 형성함으로써, 알지네이트의 기계적 특성을 향상시키고, 표면 형상을 조절할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계는, 물 50 ml당 0.25g 내지 0.75g 의 알지네이트 및 2.5 ml 내지 4.0 ml의 HEA가 용해되는 단계일 수 있다. 구체적으로는, 6.31 x 10^-4 몰의 알지네이트 0.25g 및 2.84 x 10^-2 몰의 HEA 3 ml 가 사용될 수 있다. 이 경우, 형성된 그라프트 공중합체를 가교하기 위한 가교제로 4.87 x 10^-4 몰의 PEGDA 0.25 ml, 9.74 x 10^-4 몰의 PEGDA 0.5 ml 또는 19.48 x 10^-4 몰의PEGDA 1 ml을 사용함이 바람직하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 하이드로젤의 제조방법을 반응 단계에 따라 나타낸 것이다.

도 1과 같이 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계; (b) 라디칼 중합 개시제를 첨가하는 단계; 및 (c) 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 가교제로 첨가하여 삼원공중합 단위체를 합성하는 단계를 포함하는, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법이 제공된다. 상기 (a) 단계에서는 알지네이트와 아크릴레이트계 단량체가 혼합될 수 있다. 상기 (b) 단계의 개시제가 먼저 첨가된 후에 (a) 단계가 진행될 수도 있으나, 반드시 그 순서를 따라야 하는 것은 아니다.

상기 아크릴레이트계 단량체는 하이드록시 에틸아크릴레이트(HEA) 또는 하이드록시 에틸메타크릴레이트(HEMA)인 것일 수 있고, 바람직하게는 2-하이드록시 에틸아크릴레이트(2-HEA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 (b) 단계에서는 라디칼 중합 개시제를 첨가하여 알지네이트와 아크릴레이트계 단량체 간의 그라프트 중합 반응을 개시할 수 있다. 구체적으로는, 상기 라디칼 중합 개시제는 과황산칼륨(potassium persulphate, KPS)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 과산화벤조일(benzoyl peroxide) 등의 라디칼 중합 반응을 개시할 수 있는 수용성 개시제이면 어느 것이든 사용될 수 있다. 상기 라디칼 중합 반응을 통해 삼원 공중합 단위체의 젤 고분자 네트워크의 기본 단위가 형성된다.

상기 라디칼 중합 개시제는 알지네이트의 양성자를 분리함으로써 알지네이트 라디칼을 형성할 수 있다. 상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계에 의해, 형성된 알지네이트 라디칼은 아크릴레이트계 단량체와 반응하여 그라프트 중합 반응을 진행함으로써 그라프트 공중합체를 형성할 수 있다.

상기 (c) 단계에서는 알지네이트와 아크릴레이트계 단량체 간의 그라프트 중합 반응에 의해 생성된 그라프트 공중합체에 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 가교제로 첨가하여 삼원공중합 단위체를 합성할 수 있다.

이 때, 생성되는 삼원공중합 단위체는 Alg-g-pHEA-x-PEGDA일 수 있으며, 상기 삼원공중합 단위체는 6.31 x 10^-4 몰의 알지네이트 0.25g 및 2.84 x 10^-2 몰의 HEA 3 ml 를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 최종 생성물인 생체적합성 하이드로젤은 상기 생성된 그라프트 공중합체를 가교제로 가교결합시킨 형태로 제조될 수 있으며, 상기 가교결합에 의해 복수 개의 젤 고분자 네트워크가 형성될 수 있다. 이 과정을 통해, 상기 생체적합성 하이드로젤은 다공성 구조를 가질 수 있으며, 이에 따라 내부에 약물을 담지하는 약물 전달체로서의 기능을 할 수도 있다. 또한, 상기 생체적합성 하이드로젤은 적절한 점탄성의 특성과 기계적 물성을 보유하고 있어, 3D 프린팅용 소재, 주사형 젤, 스캐폴드(Scaffold)와 같은 조직공학 지지체 등으로 적용될 수 있으나, 그 용도가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로써, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 알지네이트 기반의 삼원공중합 단위체의 합성

6.31 x 10^-4 몰의 알지네이트 0.25g을 녹인 수용액 50 ml을 50 ℃에서 400rpm으로 6시간 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 온도를 75 ℃까지 증가시킨 뒤, 질소가스를 30분 동안 용액 내로 주입하여 활성을 억제시켰다. 이후, 라디칼 중합 개시제인 KPS 수용액 5 ml (0.147 x 10^-4 몰의 KPS 0.004g)를 활성 억제된 알지네이트 수용액에 첨가했다. 20분이 지난 후, 상기 개시제가 첨가된 알지네이트 수용액에 아크릴레이트계 단량체인 2.84 x 10^-2 몰의 HEA 3 ml를 주입하여 혼합액을 만든 뒤, 혼합액의 점도가 증가함을 확인하고, PEGDA를 첨가했다. 상기 혼합액의 점도가 증가하는 것은 알지네이트와 HEA가 라디칼 중합 개시제에 의해 그라프트 공중합체를 형성했기 때문이다. 이 때, 하이드로젤의 다공성 구조를 조절하기 위해 PEGDA의 함량을 달리하여 반응에 사용했다. PEGDA를 첨가한 후, 반응을 2시간동안 지속시킨 뒤, 생성된 생성물은 25 ℃에서 2일동안 증류수로 투석하는 과정을 거치며 정제하였다. 정제 후 획득된 샘플은 삼원공중합 단위체인 Alg-g-pHEA-x-PEGDA로 명명하고, 영하 56 ℃의 동결건조기에서 7일간 건조시켰다. 삼원공중합 단위체 Alg-g-pHEA-x-PEGDA를 제조하는 과정에서 사용한 구체적인 화합물의 함량은 하기의 표1 에 나타내었다. 표 1의 샘플 1 내지 샘플 3는 동일한 몰 농도의 부피만 다른 PEGDA를 사용한 하이드로젤 3종으로, 모두 동일한 조건에서 제조 되었으며, 샘플 1 내지 샘플 3으로 후술한 실험예의 실험들을 진행하여 본 발명을 검증하였다.

구분	온도(℃)	알지네이트(g)	KPS(g)	HEA( ml)	PEGDA( ml) [mol]
샘플 1	75	0.25	0.004	3	0.25 [4.87 x 10-4mol]
샘플 2	75	0.25	0.004	3	0.5 [9.74 x 10-4mol)
샘플 3	75	0.25	0.004	3	1.0 [19.48 x 10-4mol]

2. 삼원공중합 단위체의 특성 검증 실험

본 발명의 제조 방법에 따른 삼원공중합 단위체인 Alg-g-pHEA-x-PEGDA의 특성을 검증하기 위해 표 1의 샘플 1 내지 샘플 3을 이용한 실험을 진행했으며, 그 내용은 실험예 1 내지 실험예 7에서 자세히 설명하도록 한다. 이후 실험예 1 내지 실험예 7에서 언급하는 샘플 1, 샘플 2 및 샘플 3은 표 1의 함량에 따라 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 하이드로젤을 의미한다.

실험예 1: IR 결과 분석

전술한 제조방법으로 제조된 하이드로젤의 화학적 구조를 확인하기 위해 샘플 1 내지 샘플 3를 ATR-FTIR 분광기(Travel IR, Smiths Detection, USA)를 이용하여 분석하였고, 그 결과 스펙트럼을 도 2에 도시하였다.

도 2를 참고하면, (a) 는 알지네이트, (b)는 HEA, (c)는PEGDA의 스펙트럼이고, (d) 내지 (f)는 PEGDA의 함량을 달리하여 제조된 Alg-g-pHEA-x-PEGDA 하이드로젤의 스펙트럼을 나타낸 것으로, 각각 (d)는 샘플 1, (e)는 샘플 2, (d)는 샘플 3의 스펙트럼이다.

도 2 의 (a)를 살펴보면, 알지네이트의 스펙트럼은 3254, 1597, 1405, 1082 및 1026 cm^-1 에서 피크가 나타나고 있다. 도2의 (b)를 살펴보면, HEA의 스펙트럼은 3428, 2953, 2885, 1715, 1633, 1274, 1188 및 1057 cm^-1 에서 피크를 나타낸다. 도 2의 (c) 를 살펴보면, PEGDA는 각각 2870, 1723, 1633, 1271, 1192 및 1100 cm^-1 에서 피크가 나타나고 있다. 도 2의 (d) 내지 (f)를 살펴보면, 상기 도 2의 (a) 내지 (c) 의 피크가 모두 확인되고 있어, 샘플 1내지 샘플 3은 알지네이트, HEA 및 PEGDA를 모두 포함하는 화합물임을 확인할 수 있었다.

실험예 2: TGA(Thermogravimetric analysis) 결과 분석

샘플 1 내지 샘플 3의 열 특성을 확인하기 위해, 열중량분석기(DTG-60, Shimadzu, Japan)를 이용하여 질소를 처리한 상태로 5 ℃/분의 스캔속도로 TGA 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참고하면, 약 180℃ 내지 344℃ 온도 범위에서 플롯의 중량손실은 알지네이트 네트워크 파괴를 의미하고, 약 344℃ 내지 450℃ 온도범위에서 플롯의 중량손실은 가교 결합된 네트워크의 파괴를 의미한다. 또, 온도가 증가함에 따라 각 샘플의 중량 손실은 샘플 1, 샘플 2, 샘플 3 순으로 적은 것으로 나타나고 있어, 이를 통해 삼원 공중합 단위체의 젤 고분자 네트워크는 PEGDA의 함량이 많을수록 열 안정성이 향상된다는 것을 확인할 수 있었다. 이는, PEGDA의 함량이 높으면 공유결합을 통해 중합체 네트워크에서 더 많은 몰 수의 PEGDA와의 결합을 증가시켜 더 강한 젤 고분자 네트워크의 형성이 가능함을 의미한다.

실험예 3: 하이드로젤 구조 관찰

샘플 1 내지 샘플 3 각각의 미세구조를 확인하기 위해, 각 샘플을 주사전자현미경(SEM, TESCAN VEGA3, Tescan Korea)을 통해 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4를 참고하면, 도 4의 (a) 및 (b)은 샘플 1 의 이미지, 도 4의 (c) 및 (d)는 샘플 2의 이미지, 도 4의 (e) 및 (f)는 샘플 3의 이미지를 나타낸 것으로, 도 4의 (a), (c) 및 (e)는 각 샘플의 왼쪽면을 관찰한 이미지이고, 도 4의 (b), (d) 및 (f)는 각 샘플의 오른쪽을 관찰한 이미지를 도시한 것이다. SEM 이미지를 보면, 각 샘플은 가교결합으로 인해 다공성 형태를 갖고 있으며, PEGDA의 함량이 상대적으로 높은 샘플 3에서 가장 작은 크기의 공극이 형성됨을 확인할 수 있었다. 즉, 공극의 크기와 젤 고분자 네트워크의 수는 PEGDA 양에 의존적으로 형성되므로, PEGDA의 함량을 조절하여 젤 고분자 네트워크의 구조를 제어할 수 있음을 의미한다.

실험예 4: pH조건별 팽윤율 확인 실험

샘플 1 내지 샘플 3 의 pH조건별 팽윤율을 확인하기 위한 실험을 진행하였고, 그 결과 데이터를 도 5 에 도시하였다.

도 5를 참고하면, 동일한 조건에서 pH만 조건을 달리하여 실험한 결과를 비교하여 나타낸 것으로, 도 5a는 pH 2.5 의 조건에서 샘플 1 내지 샘플 3의 팽윤율을 측정한 것이고, 도 5b는 pH 7.4의 조건에서 샘플 1 내지 샘플 3의 팽윤율을 측정한 것이다. 두 조건에서의 실험을 위해 샘플 1내지 샘플 3을 각각 1 ml씩 24-웰 플레이트에 넣어 동결 건조기에서 96시간동안 건조시켰다. 이후, 건조된 샘플들을 각각 37 ℃, 100 ml의 완충용액(pH 2.5 및 pH 7.4)에 넣어 15시간 동안 침지 시켰다. 소정의 시간이 지나고, 침지했던 습윤된 샘플들을 꺼내고, 표면의 물기를 티슈로 제거하였다. 일정 시간 간격으로, 각 샘플의 무게를 측정하고, 평형에 도달하여 더 이상 무게의 변동이 없을 때까지 측정을 반복하였다.

팽윤율은 아래의 수식 1에 의해 계산되었다.

[수식 1]

결과 데이터를 보면, pH조건을 달리한 도 5a 및 도 5b의 샘플들은 모두 14시간이 지나면서 팽윤 평형에 도달한 것으로 나타났다. 또, 도 5a 보다 도 5b에서 월등히 높은 팽윤율이 나타나, 하이드로젤의 팽윤율은 매질의 pH에 의존적임이 확인되었다. 각 샘플별로 비교해보면, 도 5a의 경우에는 샘플별로 팽윤율의 차이가 거의 없었으나, 도 5b의 경우에는 샘플 3에 비해 샘플 1 및 샘플 2의 경우, 팽윤율이 더 높은 것으로 확인되었다. 이는, 공극의 크기가 작을수록 팽윤율이 낮아지게 되기 때문이다. 즉, 알지네이트 하이드로젤은 pH 2.4일 때 보다 pH 7.4 일 때 팽윤율이 높았으며, 또, PEGDA의 함량이 낮을수록 팽윤율이 높아짐이 확인되었다.

실험예 5: 하이드로젤의 세포 독성 실험

샘플 1 내지 샘플 3 의 세포 독성을 확인하기 위해, MC3T3(조골 전구 세포, Sigma Aldrich)세포, MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 분석, BrdU(Bromodeoxyuridine) 분석 및 중성 적염색(Natural Red) 분석이 이용되었으며, 분석한 결과는 도 6에 도시하였다.

세포 독성 연구는 MC3T3를 샘플 1 내지 샘플 3의 추출물에 배양하는 방법으로 진행되었다. 먼저, 멸균된 테플론 시트(직경 1cm), 라텍스(직경 1cm) 및 샘플 1 내지 샘플 3의 하이드로젤 필름(직경 1cm)을 각각 1.5 ml씩 추출하여 배양 배지로 3일동안 배양하였다. 이 때, 테플론과 라텍스는 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로 사용되었으며, 각 배지별로 배양된 결과는 도 6에 도시하였다.

먼저, 도 6a는 MC3T3의 세포 생존여부를 확인하기 위해 MTT, BrdU 및 중성 적염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 6a에 도시한 바와 같이, MTT 및 BrdU 분석을 통해, 샘플 1 내지 샘플 3 추출물에서 배양된 세포의 생존률이 테플론 및 라텍스에서의 생존률보다 높은 것으로 관찰되었다. 또, 중성 적염색 분석한 결과, 샘플 1내지 샘플 3의 추출물에서 배양된 세포의 생존률은 음성 대조군인 라텍스에서의 생존률보다 높았으며, 전반적인 생존률은 90% 이상임을 확인할 수 있었다. 또, 샘플 1 내지 샘플 3의 추출물 중에서는 상대적으로 샘플 3의 추출물의 세포 생존률이 더 높은 것으로 나타났다.

도 6b는 각기 다른 추출물에서 소정시간동안 세포를 배양하여, 형광현미경으로 세포 생존여부를 확인한 것이다. 먼저, 도 6b의 (a)는 별도의 추출물을 추가하기 전, (b)는 테플론 추출물을, (c)는 라텍스 추출물을, (d)는 샘플 1의 추출물을, (e)는 샘플 2의 추출물을, (f)는 샘플 3의 추출물을 추가하여 하루동안 배양한 후, 관찰한 형광 이미지로, 음성 대조군인 (c)의 경우를 제외하고는, 모든 세포가 생존한 것으로 나타났다. 또, (b), (d), (e) 및 (f)의 세포 밀도는 추출물을 넣기 전인 (a) 보다 증가하는 것으로 나타났다.

도 6a 및 도 6b의 실험 결과를 통해, 샘플 1 내지 샘플 3의 하이드로젤이 세포 독성이 없음을 확인했으며, 특히, PEGDA의 함량이 더 많은 하이드로젤에서 세포의 생존률이 더 높음을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 생체적합성 검증 실험

샘플 1 내지 샘플 3 의 생체적합성 검증하기 위해, MC3T3(조골 전구 세포, Sigma Aldrich) 및 형광 현미경(Leica D mlB, Watzlar, Germany)이 이용되었으며, 그 결과는 도 7에 도시하였다.

생체적합성을 확인을 위한 연구는, MC3T3가 샘플 1 내지 샘플 3 하이드로젤 필름상에서 세포 증식하는 정도를 관찰하는 방법으로 진행되었다. 먼저, 0.1 ml로 투석된 샘플 1 내지 샘플 3의 하이드로젤을 커버 슬립에 넣고 72시간동안 오븐에 보관하였다. 이후, 커버슬립을 함유한 둥근 형태의 각 샘플별 필름(직경 1cm)을 121℃에서 15분동안 멸균시켰다. 이후, MC3T3를 24-웰 플레이트(well plate) 상의 샘플 1 내지 샘플 3 의 필름 표면에 씨딩(Seeding)하고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 넣고, 37 ℃에서 20분간 배양하였다. 이 후, 10% 의 소 태아 혈청(Fetal Bovine serum) 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 함유하는 1 ml 의 α-MEM 배지를 상기 배양된 플레이트의 웰(well) 각각에 추가한 뒤, 7일간 세포배양 하였다. 배양 시작 이후 24시간이 경과시, 세포 배양 배지에서 변화가 생기기 시작했으며, 각 기간별 세포 증식 수준을 제조사의 프로토콜에 따른 CCK-8 분석법으로 계산하였다. 세포의 생존여부를 확인하기 위해 죽은 세포 및 생존 세포 각각을 염색(ethidium homodimer1/calcein AM)하여 형광현미경으로 확인하였으며, 확인 결과는 도 7에 도시한 바와 같다.

먼저, 도 7a및 도7B는 MC3T3의 세포 증식 정도를 기간별, 샘플별로 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 7a 는 MC3T3세포를 각각 샘플 1 내지 샘플 3 의 하이드로젤 필름에서 배양1일차, 배양 3일차, 배양 7일차의 결과를 비교한 것으로, 대조군과 모든 샘플에서 광학 밀도가 증가하는 것으로 나타나고 있어, 모든 샘플에서 세포가 증식하는 것으로 확인되었다. 또, 도 7b는, 배양 1일차 대비 배양 7일차의 세포 증식 속도는 배양 1일차 대비 배양 3일차의 증식 속도보다 더 빠른 것으로 나타나고 있어, 샘플 1 내지 샘플 3이 세포의 성장 및 증식을 위한 적합한 환경임을 검증할 수 있었다. 또한, 배양 1일차 대비 배양 7일차의 세포 증식속도를 각 샘플별로 비교해 보면, 샘플 1 및 샘플 2에서의 증식속도보다 PEGDA의 함량이 상대적으로 많은 샘플 3에서의 증식속도가 더 빠른 것을 알 수 있는데, 명확하게는 도 7c와 같은 형광 이미지를 통해 확인할 수 있었다.

도 7c는 배양된 세포의 생존여부를 확인하기 위해, 죽은 세포 및 생존 세포를 형광 염색하여 형광현미경으로 관찰한 이미지를 도시한 것이다. 도 7c의 (a), (e) 및 (i)는 대조군이고, (b), (f) 및 (j)는 샘플 1에서의 배양을, (c), (g) 및 (k)는 샘플 2에서의 배양을, (d), (h) 및 (l)은 샘플 3에서의 배양을 한 세포의 형광 이미지이고, 배양기간에 따라서는, (a) 내지 (c)는 배양 1일차, (e) 내지 (h)는 배양 3일차, (i) 내지 (l)은 배양 7일차의 세포 증식을 나타내고 있다. 도 7c를 참고하면, 배양시간이 길어질수록 세포가 모두 증식하고 있으며, PEGDA 의 함유량이 상대적으로 적은 샘플 1 및 샘플 2에서의 배양과 비교해 볼 때, PEGDA의 함유량이 상대적으로 많은 샘플 3에서의 세포 증식이 더 활발하게 일어났음을 알 수 있었다. 이는, PEGDA의 함량이 증가할수록 공극의 크기가 작아지고, 더 강한 젤 고분자 네트워크를 생성한다는 사실을 또 한번 입증하는 결과로, 공극의 크기가 작아질수록 젤 고분자 네트워크의 수가 증가하므로 세포가 접착할 수 있는 표면적이 증가하고, 증식을 위해 세포를 원활히 이동시킬 수 있는 적합한 환경이 조성될 수 있기 때문이다. 즉, 본 발명의 제조 방법으로 알지네이트 하이드로젤을 제조함에 있어, PEGDA의 함량을 조절함으로써 세포 증식 속도 역시 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 약물 방출성 실험

하이드로젤 샘플 1 내지 샘플 3 각각의 pH조건별 약물 방출성을 평가 확인하기 위해, UV-Vis 분광 광도계(BioMATE 3,Thermo Scientific, USA) 를 사용하여 측정했다.

소 알부민 혈청(BSA)과 5-아미노 살리실산(5-ASA)을 동일 몰 수(2 μmol)로 혼합하여 만든 용액을 샘플1 내지 샘플3 각각에 2 ml씩 넣고, 30분 내지 45분간 혼합 하였다. 이후, 혼합한 샘플은 영하 56 ℃의 동결 건조기에서 72시간동안 건조시키고, 건조된 혼합물 각각에서 BSA 및 5-ASA 약물 방출 실험을 진행했다.

약물 방출 실험은, BSA/5-ASA가 로딩된 샘플 1 내지 샘플 3을 37 ℃, 100 ml 완충용액(pH 2.5 및 pH 7.4)에 넣어 분취하고, 일정 시간마다 분취액 일부를 꺼내어 UV-Vis 분광 광도계로 흡광도를 측정하는 방법으로 진행되었으며, 측정 결과는 도 8에 도시하였다.

앞선 실험예를 통해 확인한 바에 따르면, PEGDA의 함량이 증가한 샘플일수록 젤 고분자 네트워크의 공극의 크기가 감소하고, pH 2.4의 조건일 때보다 pH 7.4의 조건에서 팽윤율이 증가하는 것으로 나타났었다. 이를 토대로, 약물 방출 실험 전에 샘플의 공극의 크기가 크고, 팽윤율이 클수록 약물 방출성이 높을 것이라는 예상을 할 수 있었으며, 실제 실험을 통해 예상한 내용을 입증하는 결과를 얻을 수 있었다.

도 8a는 5-ASA의 방출을, 도 8b는 BSA의 방출을 실험한 결과 데이터로, 두 그래프 모두 5-ASA 및 BSA의 방출속도가 pH 7.4의 조건에서 더 빠른 것으로 나타났으며, PEGDA 양이 증가할수록 5-ASA 및 BSA의 방출속도가 더 느려지는 것으로 나타났다.

추가적으로, 도 8a 및 도 8b를 보면, 5-ASA 방출속도는 BSA 방출 속도보다 전체적으로 빠른 것으로 나타났다. 즉, 약물의 분자량이 작을수록 방출속도가 더 빠르며, 5-ASA는 30시간 이상, BSA는 5일 이상 약물 방출이 가능함을 확인할 수 있었다.

전술한 실시예와 같이 제조된 하이드로젤은 삼원공중합 단위체로 구성된 생체적합성 하이드로젤 Alg-g-pHEA-x-PEGDA (Alginate-2-hydroxyethyl acrylate-poly(ethylene glycol) diacrylate terpolymeric gel)로서, 도 9와 같이 활용될 수 있다. 앞서 실시예에서 검증한 바와 같이, 무독성, 비침습적으로 생체 내 조직재생을 위한 재료로 활용될 수 있으며, 단백질, 생체활성물질 및 약물 등의 안정적인 전달체로도 활용이 가능하다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (10)

1. 알지네이트, 아크릴레이트계 단량체, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA) 가교제로 이루어지는 삼원공중합 단위체로,
   상기 알지네이트(alginate)는 상기 삼원공중합 단위체의 주 고분자이고,
   상기 삼원공중합 단위체는 젤 고분자 네트워크로 이루어지는, 생체적합성 하이드로젤.
2. 제1항에 있어서,
   상기 삼원공중합 단위체는, Alg-g-pHEA-x-PEGDA 인, 생체적합성 하이드로젤.
3. 제1항에 있어서,
   상기 아크릴레이트계 단량체는, 하이드록시 에틸아크릴레이트(HEA) 또는 하이드록시 에틸메타크릴레이트(HEMA)인, 생체 적합성 하이드로젤.
4. 제1항에 있어서,
   상기 젤 고분자 네트워크는, 가교 결합에 의해 형성되는, 생체적합성 하이드로젤.
5. 제1항에 있어서,
   상기 삼원공중합 단위체는, 라디칼 중합에 의한 것인, 생체적합성 하이드로젤.
6. 제1항에 있어서,
   상기 젤 고분자 네트워크는, 가교제의 함량에 따라 공극의 크기가 조절되는, 생체적합성 하이드로젤.
7. (a) 알지네이트에 아크릴레이트계 단량체를 혼합하는 단계;
   (b) 라디칼 중합 개시제를 첨가하는 단계; 및
   (c) 폴리(에틸렌 글라이콜) 다이아크릴레이트(PEGDA)를 가교제로 첨가하여 삼원공중합 단위체를 합성하는 단계;
   를 포함하는, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 라디칼 중합 개시제는, 과황산칼륨(potassium persulphate, KPS)인, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계에 의해 그라프트 공중합체(graft-polymerized copolymer)를 형성하는, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법.
10. 제7항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 혼합은, 물 50 ml당 0.25g 내지 0.75g 의 알지네이트 및 2.5 ml 내지 4.0 ml의 HEA를 포함하는 것인, 생체적합성 하이드로젤의 제조방법.

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