WO2018116902A1 - 細胞培養基材 - Google Patents

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大英 中熊
綾子 一色
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate.
  • Patent Document 2 a large-scale apparatus such as electron beam irradiation is required by using a base material in which a block copolymer having a structure in which a water-insoluble polymer segment and a temperature-responsive polymer segment are bonded is coated on the surface of the base material. It has been proposed that it is possible to immobilize the warm responsive polymer on the surface of the base material.
  • the block copolymer disclosed in Patent Document 2 has insufficient water resistance, and has a problem that elution from the substrate surface occurs and a problem that cell detachability is insufficient.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture substrate capable of culturing animal cells with high efficiency and capable of separating and recovering the cultured cells while they are alive.
  • the cell culture substrate contains a block polymer of a segment having a lower critical solution temperature and a hydrophobic segment, and the polymerization degree of the segment having the lower critical solution temperature is 400- It has been found that the above-mentioned problems can be solved by providing a cell culture substrate characterized by being 10,000.
  • a cell culture substrate in which the hydrophobic segment is obtained by polymerizing a monomer represented by the following formula (1).
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a phenyl group, a carboxyalkyl group having 1 to 8 alkyl carbon atoms, a carboxyaralkyl group having 7 to 8 aralkyl carbon atoms, It represents any one of the group represented by 2) and the group represented by the following formula (3).
  • n 2 or 3
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the total carbon number of R 4 and R 5 is 5 or more. .)
  • the cell culture substrate of the present invention can cultivate animal cells with high efficiency and can be detached and recovered from the substrate while the cultured cells remain alive.
  • the present invention relates to a cell culture substrate containing a block polymer of a segment having a lower critical solution temperature and a hydrophobic segment, wherein the segment having the lower critical solution temperature has a degree of polymerization of 400 to 10,000. It provides a cell culture substrate characterized.
  • the segment having the lower critical solution temperature in the present invention is a segment in the block polymer, and the segment is a segment composed of a polymer that dissolves at a certain temperature or lower.
  • the segment having the lower critical solution temperature in the present invention is a polymer that dissolves in water when the temperature falls below a certain temperature as described below.
  • Examples of the polymer having the lower critical solution temperature include the following 1) and 2). 1) A polymer obtained by polymerizing a monomer in which a homopolymer has a lower critical solution temperature. 2) Copolymer of hydrophobic monomer and hydrophilic monomer
  • Monomers having a lower critical solution temperature for homopolymers include, for example, N-isopropyl (meth) acrylamide, Nn-propyl (meth) acrylamide, N-cyclopropyl (meth) acrylamide, N-ethoxyethyl (meth) acrylamide, N -Tetrahydrofurfuryl (meth) acrylamide, N-ethylacrylamide, N-ethyl-N-methylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, Examples are N-acryloylpiperidine and N-acryloylpyrrolidine. These monomers may be used alone or in combination of two or more.
  • the segment obtained by polymerizing the monomer having the lower critical solution temperature of the homopolymer (1) can easily produce a polymer having the lower critical solution temperature.
  • these monomers have low adhesion to the plastic surface, and there is a problem that the applied polymer layer is easy to peel off when exposed to water.
  • the cell culture substrate of the present application has a hydrophobic segment. Therefore, the culture substrate can be used without peeling off.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 represents an alkylene group having 2 to 3 carbon atoms
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 represents an alkylene group having 2 to 3 carbon atoms.
  • n an integer of 2 to 20.
  • hydrophilic amide monomer (b) examples include dimethylacrylamide, acrylamide, methylacrylamide, and ethylacrylamide.
  • the hydrophobized monomer is a monomer that is water-soluble at the time of monomer but becomes insoluble in an aqueous solvent upon polymerization. When such a monomer is contained in the copolymer, it can be used as a cell culture substrate that is excellent in water resistance and hardly peeled off from the support.
  • the hydrophobic monomer the compound represented by the above formula (1), as the hydrophobic monomer, the compound represented by the above formula (1), diacetone acrylic amide, (meth) acrylic acid polypropylene glycol, Examples thereof include methoxydiethylene glycol acrylate and methoxytriethylene glycol acrylate. These may be used alone or in combination.
  • 2 methoxyethyl acrylate, 2 ethoxyethyl acrylate, and 3 methoxypropyl acrylate are preferable, and 2 methoxyethyl acrylate and 2 ethoxyethyl acrylate are particularly preferable.
  • the lower critical solution temperature of the obtained copolymer segment can be widely controlled by the type and ratio of the monomer. It is preferable because the cells can be cultured with different cell types and ratios and better cell adhesion and proliferation. For example, as the ratio of the monomer (b, c, or d) is increased with respect to the monomer (a), the lower critical solution temperature of the resulting copolymer shifts to the higher temperature side. This ratio and the lower critical solution temperature are in a substantially linear relationship. Since the cell culture temperature is usually 37 ° C., it is preferable to prepare so that the lower critical solution temperature of the obtained copolymer is about 20 to 32 ° C.
  • the degree of polymerization of the segment having the lower critical solution temperature is 400-10000. When it is less than 400, the cell detachability is poor, and when it is more than 10,000, the cell culture substrate is inferior in water resistance, so that the substrate is easily detached from the support.
  • the preferred polymerization is 1000 to 8000. Within this range, the balance between cell detachability and culture efficiency is excellent. Particularly preferred is 3000-6000.
  • the block polymer of the present invention is characterized by having a hydrophobic segment.
  • “hydrophobic” in the segment of the block polymer means that the polymer composed of the segment has a solubility in water at 25 ° C. of less than 0.5 g / 100 mL.
  • the hydrophobic segment includes at least a monomer unit of a hydrophobic monomer. Since the block polymer of the present invention has a hydrophobic segment, even if it has a segment having a lower critical solution temperature that is inferior in water resistance, the block polymer has excellent water resistance and excellent adhesion to a support.
  • the hydrophobic monomer is not particularly limited as long as it is a monomer that becomes hydrophobized after polymerization, and preferably includes monomers represented by the following formulas (1) to (3). In addition, these hydrophobic monomers may be used independently or may be used in combination of 2 or more type.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a phenyl group, a carboxyalkyl group having 1 to 8 alkyl carbon atoms, a carboxyaralkyl group having 7 to 8 aralkyl carbon atoms, It represents any one of the group represented by 2) and the group represented by the following formula (3).
  • n 2 or 3
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the total carbon number of R 4 and R 5 is 5 or more. .)
  • the monomer represented by the above formula (1) is preferable because the obtained polymer segment is hydrophobic and is excellent in water resistance and support adhesion of the cell culture substrate.
  • ethyl acrylate, butyl acrylate, and styrene are preferable, and butyl acrylate is particularly preferable.
  • the block polymer of the present invention is a polymer having a segment having the lower critical solution temperature and a hydrophobic segment.
  • the block polymer of the present invention may be an AB diblock type, or an ABA or BAB triblock type polymer having a larger number of segments. It doesn't matter.
  • the diblock type or triblock type is preferable, and the diblock type is particularly preferable.
  • the production method of the block polymer is not particularly limited, and a known method can be adopted. Of these, precision radical polymerization is preferable, and reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, atom transfer radical polymerization (ATRP), and nitroxide-mediated polymerization (NMP) are more preferable, and RAFT polymerization is preferable. Is more preferable.
  • precision radical polymerization is preferable, and reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, atom transfer radical polymerization (ATRP), and nitroxide-mediated polymerization (NMP) are more preferable, and RAFT polymerization is preferable. Is more preferable.
  • the cell culture substrate of the present invention may have a compound in addition to the block polymer.
  • a compound in addition to the block polymer For example, preservatives and antibacterial agents, coloring agents, fragrances, enzymes, sugars, proteins, peptides, amino acids, cells, DNAs, salts, water-soluble organic solvents, surfactants, polymer compounds, leveling agents, etc. But it doesn't matter.
  • the shape of the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited as long as cell culture can be performed and cultured cells can be easily detached by low-temperature treatment.
  • the thickness of the cell culture substrate of the present invention is preferably 1000 nm or less, more preferably 500 nm or less in a state where the film is sufficiently dried at a temperature equal to or higher than the lower critical temperature.
  • the cell culture substrate of the present invention may be used alone, but is preferably used as a cell culture device having a substrate formed on a support. This is because cell culture equipment is excellent in convenience of transportation and storage, and can be used as it is as a culture container or culture carrier.
  • the material of the support on which the cell culture substrate of the present invention is laminated is such that the culture substrate can be sufficiently adhered, cell culture can be performed on the adhered culture substrate, and cultured cells can be easily detached by low-temperature treatment If it is, it will not be specifically limited.
  • styrene resin such as polystyrene, polyolefin resin such as polypropylene, polyurethane resin, polycarbonate, polyethylene terephthalate (PET), polysulfone resin, fluorine resin, polysaccharide natural polymer such as cellulose, glass, Inorganic materials such as ceramics and metal materials such as stainless steel and titanium are preferably used.
  • the shape of the support is not particularly limited as long as it can be a support for the cell culture substrate of the present invention.
  • the shape may be a combination of these, or may be a support having an indefinite shape that does not have a specific shape.
  • the cell culture substrate of the present invention may be used as a cell culture device by being integrated with the support, or may be used alone after being peeled off from the support.
  • a preferable method for forming the cell culture substrate of the present invention includes a method of applying the coating agent containing the block polymer of the present invention on the above-mentioned support.
  • the coating agent includes a block polymer and a solvent.
  • additives and the like may be included as necessary.
  • the block polymer Since the above-mentioned block polymer is used, the description thereof is omitted here.
  • the block polymer may contain only 1 type and may contain 2 or more types of block polymers which have a different structure.
  • the content of the block polymer is preferably 0.01 to 90% by mass and more preferably 0.1 to 50% by mass with respect to the total mass of the coating agent. It is preferable that the content of the block polymer is 0.01% by mass or more because the obtained coating film easily exhibits surface hydrophilicity. On the other hand, when the content of the block polymer is 90% by mass or less, the viscosity is low, which is preferable because the coating suitability is enhanced.
  • the solvent that can be contained in the coating agent is not particularly limited, and known solvents can be used.
  • the solvent include water or an organic solvent.
  • the organic solvent include alcohol solvents such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, butanol, sec-butanol, iso-butanol and tert-butanol; ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; cyclohexanone and methyl isobutyl ketone.
  • Ketone solvents such as acetonitrile; nitrile solvents such as acetonitrile; amide solvents such as dimethylformamide and dimethylacetamide; dimethyl sulfoxide; dioxirane; pyrrolidone and the like.
  • an alcohol solvent is preferably used, and methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, and tert-butanol are more preferably used.
  • the solvent is preferably water or an alcohol solvent, and more preferably methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, or tert-butanol.
  • the above-mentioned solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the solvent in the coating agent is preferably 10 to 99.99% by mass, more preferably 50 to 99.9% by mass, and more preferably 80 to 99.9% by mass with respect to the total mass of the coating agent. More preferably, it is 5 mass%.
  • the solvent content is 10% by mass or more, the viscosity of the coating agent solution is lowered, and therefore, it is preferable from the viewpoint of excellent coating suitability.
  • the content of the solvent is 99.99% by mass or less, the thickness of the coated film after coating is preferably not too thin.
  • the coating agent may contain an additive depending on the purpose of use.
  • the additive is not particularly limited, and known ones can be used. Specifically, excipients, Surfactants, plasticizers, antifoaming agents, pigments, antioxidants, antibiotics, ultraviolet absorbers, crystal nucleating agents, crystallization accelerators, stabilizers, antibacterial agents and the like can be mentioned. These additives may be used alone or in combination of two or more.
  • the method for applying the coating agent is not particularly limited, and examples thereof include spray coating, flow coating, and dipping. Moreover, when a base material is tube shape, the method etc. which let a coating agent flow are mentioned. At this time, after the liquid is passed, the solvent is usually passed to remove excess coating agent inside the tube.
  • the drying conditions are not particularly limited, and may be natural drying or heat drying.
  • the drying temperature in the case of heat drying varies depending on the coating agent used, but is preferably 30 to 70 ° C, more preferably 40 to 60 ° C. In addition, by controlling the drying, a coating film in which a part of the solvent remains can be obtained.
  • the cell culture substrate of the present invention can suitably culture animal cells.
  • Animal cells may be derived from animals, and examples thereof include humans, mice, monkeys, and the like.
  • epithelial cells such as corneal epithelial cells
  • endothelial cells such as human umbilical vein endothelial cells
  • fibroblasts such as human skin fibroblasts, mouse fibroblasts
  • blood cells Contractile cells (skeletal muscle cells, cardiomyocytes, etc.), blood and immune cells (erythrocytes, macrophages, etc.), neurons (neurons, glial cells, etc.), pigment cells (retinal pigment cells, etc.), hepatocytes, chondrocytes, bones
  • blast cells and stem cells ES cells, iPS cells, hematopoietic stem cells, skin stem cells, germ stem cells, EC cells, EG cells, neural stem cells).
  • the culture can be carried out by allowing a medium and cells to coexist on the present cell culture substrate and maintaining a temperature suitable for the culture.
  • a medium suitable for the cell type may be selected as the medium.
  • the medium may be selected as appropriate depending on the culture period.
  • the medium may be in a stationary state or a perfusion state, and a method suitable for cultured cells may be selected.
  • NIPAM N-isopropylacrylamide
  • t-butanol t-butanol
  • 5.54 g of water was sufficiently bubbled with nitrogen, and then added to the above reaction solution.
  • the mixture was stirred at 70 ° C. for 20 hours.
  • 66.7 g of methanol was added to the reaction solution to obtain an AB type temperature-responsive block polymer solution.
  • Table 1 shows the results of measuring the water gel fraction of this block polymer by the test method described later.
  • Example 1 The block polymer 1 obtained in Synthesis Example 1 was diluted with methanol to prepare a 0.5% solution, and 60 ul was added to a 35 mm polystyrene petri dish (TCPS, manufactured by IWAKI). Thereafter, the cell culture substrate 1 was obtained by drying at 80 ° C. for 30 minutes and further washing by repeatedly immersing in pure water for 10 minutes three times and drying at 40 ° C. overnight. Table 1 shows the results of evaluating the cell culture properties and peelability of the cell culture substrate using the test methods described later.
  • TCPS polystyrene petri dish
  • Evaluation of cell culture Medium is 500 mL of Eagle's minimal essential medium (E-MEM, manufactured by GIBCO), 50 mL of fetal calf serum MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X (manufactured by GIBCO), 1 mL, L-Glutamine G, B Made) was added. With 2 mL of the medium, mouse Balb3T3 cells (JCRB cell bank) were seeded so that the cell density was 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2, and the culturing property after 3 days from the seeding was observed and evaluated under a microscope. ⁇ : The culture results and culture properties of only the TCPS without a substrate are equivalent. (Triangle
  • Balb3T3 cells were cultured on the cell culture substrate 1, and a cell detachment test was performed 3 days after seeding. After removing the culture medium during culture, 1 mL of a 4 ° C. cold medium was added and left at room temperature of 25 ° C. for 20 minutes. After the detached cells and the medium were removed, the culture substrate was washed with phosphate buffered saline (PBS (-)). 1 mL of HistoChoice MB Tissue Fixative (manufactured by Amresco) was added to the cell culture substrate after washing, and the remaining cells were fixed at room temperature for 30 minutes and then removed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Comparative block polymer 1 was applied to TCPS according to the same method as in Example 1 to prepare comparative cell culture substrate 1.
  • the cell culture property / peelability was evaluated in the same manner as in Example 1, it was as shown in Table 1.
  • the cell culture substrate of the present invention is to provide a cell culture substrate capable of culturing animal cells with high efficiency and capable of peeling and collecting the cultured cells while they are alive.

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Abstract

本発明は、下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００－１００００であることを特徴とする細胞培養基材を提供する。　さらに、疎水性セグメントが、特定の構造を有するモノマーを重合して得られるものである、細胞培養基材を提供する。　また、支持体上に積層されたことを特徴とする、細胞培養基材を提供する。　さらに、平均膜厚が１０００ｎｍ以下である、細胞培養基材を提供する。

Description

細胞培養基材
　本発明は、細胞培養用の基材に関する。
　近年、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞自身やその産生物等は研究用途や医療用途に幅広く用いられている。動物細胞を生体外で培養しようとするときは、足場となる何らかの基材に付着させることが必要となり、その場合、細胞から出た接着性タンパク質あるいは事前にコートした足場剤によって細胞と基材間は接着されている。従って、この細胞を基材から剥離する場合には、例えば酵素処理などを用いて細胞と基材間のタンパク質を破壊する必要があり、細胞へのダメージなどが問題となっていた。
　このような背景のもと、温度応答性のポリマーを基材表面に固定化した細胞培養基材が提案されている。このような基材では、細胞培養温度ではタンパク接着性であるが、低温に下げることで細胞培養基材の表面状態が変わってタンパク接着性が低下するため、酵素処理なしで細胞を剥離することが可能となる。（例えば、特許文献１）
　また、特許文献２では、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーを基材表面に被覆した基材を用いることで、電子線照射のような大掛かりな装置を必要せず温感応答性ポリマーを基材表面に固定化することが可能なことが提案されている。
しかし、特許文献２で開示されているブロックコポリマーは耐水性が不足しており、基材表面からの溶出が起こるという課題と、細胞剥離性が不十分であるという課題が存在した。
特開平２－２１１８６５号公報 ＷＯ２０１２／０２９８８２
　本発明の課題は、動物細胞が高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を生存させたまま剥離させ回収することが可能な細胞培養基材を提供することにある。
　発明者らは鋭意検討した結果、下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００－１００００であることを特徴とする細胞培養基材を提供することで、前記課題を解決できることを見出した。
　また、前記疎水性セグメントが、下記式（１）で表されるモノマーを重合して得られるものである、細胞培養基材を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１～８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７～８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（２）
（上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１～３のアルキル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（３）
（上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が５以上であることを表す。））
　本発明の細胞培養基材は、動物細胞を高効率で培養可能な上、培養後の細胞を生存させたまま基材から剥離させ、回収することができる。
　本発明は、下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００－１００００であることを特徴とする細胞培養基材を提供するものである。
［下限臨界溶解温度を有するセグメント］
　本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントとは、ブロックポリマーにおけるセグメントであって、該セグメントは、ある一定温度以下になると溶解する重合体で構成されたセグメントのことをいう。
　本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントとは、以下のようなある一定温度以下になると水に溶解する重合体である。下限臨界溶解温度を有する重合体としては、下記１）及び２）が挙げられる。
　１）ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体　
　２）疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体
　１）は、ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーのみを重合させて得られる重合体セグメントである。ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーとしては、例えばＮ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルピペリディン及びＮ－アクリロイルピロリディンが例示される。これらのモノマーは、単独でも複数種を同時に利用してもかまわない。
　１）であるホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られるセグメントは、簡便に下限臨界溶解温度を有する重合体を製造することが可能である。しかしこれらのモノマーは、プラスチック表面との間に接着性が低く、水に触れると、塗布された重合体層が剥離しやすいと言う課題があるが、本願の細胞培養基材は、疎水性セグメントを含有することから、耐水性に優れるため、培養基材が剥離せずに使用することができる。
　２）は、疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体である。疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体が下限臨界溶解温度を有するためには、
　２－１）親水性モノマーが、ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーである場合と、
　２－２）下記式（１）で表されるモノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、前記またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）、が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２～３のアルキレン基、Ｒ３は炭素原子数１～２のアルキル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基、Ｒ５は炭素原子数２～３のアルキレン基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、ｎは２～２０の整数を表す。）
親水性のアミド系モノマー（ｂ）としては、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メチルアクリルアミド、エチルアクリルアミドなどが例示される。
　疎水化モノマーとは、モノマー時は水溶性であるが重合すると水性溶媒に不溶化するモノマーである。このようなモノマーが共重合体に含有されている場合、耐水性に優れ支持体から剥がれにくい細胞培養基材とすることができる。
　疎水化モノマーとしては、前記式（１）で表される化合物や、　疎水化モノマーとしては、前記式（１）で表される化合物や、ジアセトンアクリルアアミド、（メタ）アクリル酸ポリプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレートが挙げられる。これらは単独でも複数種を同時に使用してもかまわない。中でも、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチル、アクリル酸３メトキシプロピルが好ましく、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチルが特に好ましい。
　２－２）で開示される共重合体セグメントの場合、得られる共重合体セグメントの下限臨界溶解温度が、モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、細胞の種類に応じて、適宜モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できることから好ましい。例えば、モノマー（ａ）に対し、モノマー（ｂまたはｃ、またはｄ）の比率を増えるにつれ、得られる共重合体の下限臨界溶解温度が高温側へシフトする。この比率と下限臨界溶解温度がほぼ直線関係にある。細胞培養温度は通常３７℃であるため、得られる共重合体の下限臨界溶解温度は２０～３２℃付近になるように調製することが好ましい。
　本発明のブロックポリマーにおいて、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度は、４００－１００００である。４００未満である場合、細胞剥離性が不良となり、１００００より大きい場合は、細胞培養基材の耐水性に劣るため基材が支持体から剥離しやすくなる。
　好ましい重合としては１０００－８０００であり、この範囲であれば細胞剥離性と培養効率のバランスに優れる。特に好ましくは３０００―６０００である。
［疎水性セグメント］
　本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することを特徴とする。なお、本明細書において、ブロックポリマーのセグメントにおける「疎水性」とは、セグメントからなる重合体について、水中における２５℃での溶解度が０．５ｇ／１００ｍＬ未満であることを意味する。疎水性セグメントは、少なくとも疎水性モノマーのモノマー単位を含む。
　本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することから、耐水性に劣る下限臨界溶解温度を有するセグメントを有していても、耐水性に優れ支持体との密着性に優れる。
　疎水性モノマーとしては、重合後に疎水化するモノマーであれば特に制限はされないが、好ましくは下記式（１）～（３）で表されるモノマーが挙げられる。なお、これらの疎水性モノマーは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１～８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７～８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（２）
（上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１～３のアルキル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　　　　　　　　　　　　　　・・・（３）
（上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が５以上であることを表す。））
　この中でも、上記式（１）で表されるモノマーであれば、得られる重合体セグメントが疎水性となり、細胞培養基材の耐水性と支持体密着性に優れるため好ましい。
　その中でも好ましくは、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、スチレンであり、特に好ましくはブチルアクリレートである。
［ブロックポリマー］
　本発明のブロックポリマーは、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとを有するポリマーである。下限臨界溶解温度を有するセグメントをＡ、疎水性セグメントをＢとした時に、本発明のブロックポリマーはＡＢのジブロックタイプでもよく、ＡＢＡまたはＢＡＢのトリブロックタイプでも、それ以上のセグメント数を有するポリマーであってもかまわない。好ましくは、ジブロックタイプまたはトリブロックタイプであり、特に好ましくはジブロックタイプである。
［ブロックポリマーの製造方法］
　ブロックポリマーの製造方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。このうち、精密ラジカル重合であることが好ましく、可逆的付加－開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）であることがより好ましく、ＲＡＦＴ重合であることがさらに好ましい。
［その他の配合物］
　本発明の細胞培養基材は、ブロックポリマーのほかに、配合物を有していても良い。例えば防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、糖類、たんぱく質、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含んでもかまわない。
［細胞培養基材］
　本発明の細胞培養基材の形状は、細胞培養でき、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、フィルム状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、太さ５ｎｍ～５ｍｍの糸状または棒状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）、粒径が好ましくは１０～２０００μｍ、より好ましくは１００～５００μｍの球状のものなどが挙げられる。
　また、本発明の細胞培養基材の膜厚としては、下限臨界温度以上の温度で十分に乾燥させた状態で、１０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましい。
　本発明の細胞培養基材は、単体で用いてもよいが、支持体上に基材を形成した細胞培養器材として用いる事が好ましい。細胞培養器材とした場合、輸送や保管等の利便性に優れるほか、そのまま培養容器や培養用担体として用いることもできるからである。
　本発明の細胞培養基材が積層される支持体の材質は、培養基材が十分接着でき、且つ接着された培養基材上で細胞培養ができ、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリスチレンのようなスチレン系樹脂、ポリプロピレンのようなポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスルホン系樹脂、フッ素系樹脂、セルロースのような多糖類天然高分子、ガラスやセラミックスのような無機材料、ステンレス、チタンのような金属類材料が好適に用いられる。
　支持体の形状には特に限定はなく、本発明の細胞培養基材の支持体となりうる形状であればよい。例えばフィルム状のもの、膜状のもの、板状のもの、球状のもの、多角形状のもの、棒状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、針・糸状のもの、繊維状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）等が挙げられる。これらを組み合わせた形状でも良いし、特定の形状を有さない不定形状の支持体であっても良い。
　更に、本発明の細胞培養基材が、支持体と一体化して細胞培養器材として使用されるのは勿論のこと、支持体から剥がして単独に使用してもよい。
　本発明の細胞培養基材を形成させる好ましい方法として、本発明のブロックポリマーを含むコーティング剤を上述した支持体上に塗布する方法が挙げられる。
＜コーティング剤＞
　前記コーティング剤は、ブロックポリマーと、溶媒と、を含む。その他、必要に応じて、添加剤等を含んでいてもよい。
［ブロックポリマー］
　ブロックポリマーとしては、上述したものが用いられることからここでは説明を省略する。
　なお、ブロックポリマーは１種のみを含んでいてもよいし、異なる構成を有する２種以上のブロックポリマーを含んでいてもよい。
　ブロックポリマーの含有量は、コーティング剤の全質量に対して、０．０１～９０質量％であることが好ましく０．１～５０質量％であることがより好ましい。ブロックポリマーの含有量が０．０１質量％以上であると、得られる塗膜が表面親水性を発現しやすいことから好ましい。一方、ブロックポリマーの含有量が９０質量％以下であると、粘度が低いことから塗工適性が高まることから好ましい。
　［溶媒］
　コーティング剤に含有されうる溶媒としては、特に制限されず公知のものが使用されうる。
　溶媒の具体例としては、水または有機溶媒が挙げられる。
　前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒；シクロヘキサノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド；ジオキシラン；ピロリドン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒としてはアルコール系溶媒を用いることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ－ブタノールを用いることがより好ましい。
　上述のうち、溶媒は、水、アルコール系溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ－ブタノールであることがより好ましい。
　上述の溶媒は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　コーティング剤中の溶媒の含有量は、コーティング剤の全質量に対して、１０～９９．９９質量％であることが好ましく、５０～９９．９質量％であることがより好ましく、８０～９９．５質量％であることがさらに好ましい。溶媒の含有量が１０質量％以上であると、コーティング剤溶液の粘度が低くなるため、塗工適正に優れることから好ましい。一方、溶媒の含有量が９９．９９質量％以下であると、コーティング後の塗膜の厚さが薄くなりすぎず好ましい。
　［添加剤］
　コーティング剤は、使用目的に応じて添加剤を含有してもよい。
　当該添加剤としては、特に制限されず、公知のものが使用されうる。具体的には、賦形剤、
界面活性剤、可塑剤、消泡剤、顔料、抗酸化剤、抗生物質、紫外線吸収剤、結晶核剤、結晶化促進剤、安定化剤、抗菌剤等が挙げられる。これらの添加剤は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
　コーティング剤の塗布方法は、特に制限はなく、スプレーコート法、フローコート法、浸漬法等が挙げられる。
　また、基材がチューブ状である場合には、コーティング剤を通液させる方法等が挙げられる。この際、通液後は、通常、溶媒を通液させてチューブ内部の余分なコーティング剤を除去する。
　乾燥条件についても特に制限されず、自然乾燥であっても加熱乾燥であってもよい。加熱乾燥である場合の乾燥温度は、使用するコーティング剤によっても異なるが、３０～７０℃であることが好ましく、４０～６０℃であることがより好ましい。なお、乾燥を制御することで、一部溶媒を残存させた塗膜を得ることができる。
〔動物細胞〕
　本発明の細胞培養基材は、動物細胞を好適に培養することが可能である。動物細胞としては、由来は動物であればよく、ヒト、マウス、サル等が挙げられる。細胞種としては特に限定は無いが、上皮細胞（角膜上皮細胞など）、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞など）、線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、マウス線維芽細胞など）、血球細胞、収縮性細胞（骨格筋細胞、心筋細胞など）、血液と免疫細胞（赤血球、マクロファージなど）、神経細胞（ニューロン、グリア細胞など）、色素細胞（網膜色素細胞など）、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、神経幹細胞）等が挙げられる。
　本細胞培養基材で動物細胞を培養する場合、本細胞培養基材に培地と細胞を共存させ、培養に適した温度に保つことで培養を行うことができる。培地としては細胞種に適した培地を選択すればよい。培養中、培地は培養期間に応じて交換してもしなくても適宜選択すればよい。また培地は静置状態であっても潅流状態であってもかまわず、培養細胞に好適な方法を選択すればよい。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
＜合成例１＞
ブロックポリマー１の合成
　ブチルアクリレート（和光純薬株式会社製）０．５９ｇ、ＲＡＦＴ剤として２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．００６５ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　２，２’－ａｚｏｂｉｓ（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００３６ｇ、ｔブタノール９．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは８１％であった。
次いで、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（以下ＮＩＰＡＭ、株式会社ＫＪケミカル製）１０・５３ｇ、ｔブタノール４９．８６ｇ、水５．５４ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール６６．７ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９９％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２２００００、Ｍｗ＝７６００００であった。後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。
［実施例１］
　前記合成例１で得られたブロックポリマー１をメタノールで希釈して０．５％溶液を作成し、３５ｍｍポリスチレンシャーレ（ＴＣＰＳ、ＩＷＡＫＩ製）に６０ｕｌ添加した。その後、８０℃にて３０分間乾燥させ、さらに純水に１０分間浸漬させる操作を三回繰り返して洗浄し、４０℃にて一晩乾燥させることで、細胞培養基材１を得た。この細胞培養基材を後述する試験法を用いて細胞培養性・剥離性の評価を行った結果を表１に示す。
（水ゲル分率）
　前記培養基材０．１ｇを２００メッシュのステンレス金網で包み、４℃の水中で２０時間放置前後のサンプルを１３０℃の熱風乾燥機で２時間乾燥させた重量をそれぞれ測定し、冷水中に静置した前後の重量減少率を調べた。この値が高いほど、培養基材の耐水性が高く、培養基材からの水による溶出が起こり難いと言える。
　（細胞培養性の評価）
　培地はＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｅ－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製）５００ｍＬに５０ｍＬ　牛胎児血清ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　１００Ｘ（ＧＩＢＣＯ社製）を１ｍＬ，　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，　２００　ｍＭ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加した。当該培地２ｍＬと共に、細胞密度１．０×１０４　ｃｅｌｌ／ｃｍ２　となるようマウスＢａｌｂ３Ｔ３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）を播種し、播種３日後の培養性を顕微鏡下で観察し評価した。
○：基材無しＴＣＰＳのみでの培養結果と培養性が同等。
△：基材無しＴＣＰＳのみでの培養結果よりも培養性が悪い。
×：細胞が全く育たない。
［細胞剥離性の評価］
前記細胞培養基材１上で、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞を培養し、播種３日後に細胞剥離試験を行った。培養中の培地を除去後、４℃の冷培地を１ｍＬ加え、２５℃の室温で２０分放置した。剥離した細胞ごと培地を除去後、培養基材をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））で洗浄した。洗浄後の細胞培養基材に対し、ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ　ＭＢ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ　（ａｍｒｅｓｃｏ製）を１ｍＬ加え、室温で３０分残存細胞を固定化後、除去した。その後、１０％ギムザ染色液を１ｍＬ加え室温で１時間染色し、染色液を除去した後、水道水で洗浄し乾燥させた。ギムザ染色された細胞は目視で計測した。
○：細胞が完全に剥離した。
△：細胞が一部剥離した。
×：細胞が全く剥離しなかった。
［比較ブロックポリマー１の合成］
ブチルメタクリレート（和光純薬製）１．９２ｇ、ＲＡＦＴ剤として２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０６ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　２，２’－ａｚｏｂｉｓ（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．０１２ｇ、ｔブタノール１０．８ｇ、水１．２ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して第１の反応液を得た。この段階におけるブチルメタクリレートのコンバージョンは８８％であった。
次いで、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（株式会社ＫＪケミカル製）６．１２ｇ、ｔブタノール１８ｇ、水２．１８ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルメタクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは１００％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝３４０００、Ｍｗ＝５１０００であった。このポリマーの水ゲル分率の測定結果を表１に示す。
　［比較例１］
比較ブロックポリマー１を実施例１と同様の方法に従ってＴＣＰＳに塗布し、比較細胞培養基材１を作成した。その細胞培養性・剥離性を実施例１と同様に評価したところ、表１のようになった。
　［比較例２］
細胞培養基材を塗布しない状態の３５ｍｍポリスチレンシャーレ（ＴＣＰＳ、ＩＷＡＫＩ製）に対し、細胞培養性・剥離性の評価を実施例１と同様に評価したところ、表１のようになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明の細胞培養基材は、動物細胞が高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を生存させたまま剥離させ回収することが可能な細胞培養基材を提供することにある。

Claims (5)

  1. 　　下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００－１００００であることを特徴とする細胞培養基材。
  2. 　前記疎水性セグメントが、下記式（１）で表されるモノマーを重合して得られるものである、請求項１に記載の細胞培養基材。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
    （上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１～８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７～８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　　　　　　　　　　　　　　・・・（２）
    （上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１～３のアルキル基を表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　　　　　　　　　　　　　　・・・（３）
    （上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が５以上であることを表す。））
  3. 　支持体上に積層されたことを特徴とする、請求項１から２のいずれかに記載の細胞培養基材。
  4. 　平均膜厚が１０００ｎｍ以下である、請求項３に記載の細胞培養基材。
  5. 　支持体と請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養基材とを有する細胞培養容器。
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