JP5388092B2 - スフェロイド含有ハイドロゲルおよびその製造方法、ならびにスフェロイド含有ハイドロゲル積層体 - Google Patents
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Description
本発明は、スフェロイド含有ハイドロゲルおよびその製造方法、ならびにスフェロイド含有ハイドロゲル積層体に関する。
近年の細胞工学の発展および再生医療への注目と相まって、生体外にて細胞を適切な形で培養し、治療への応用および生体反応のシュミレーターとして使用する試みが現在活発に行われている。このような目的において、培養される細胞は各種臓器機能の担い手である実質細胞が中心であるが、一般に生体外にて実質細胞の機能を維持した状態で長期の培養を行うことは困難であり、この点を解決するための様々な試みがなされている。
例えば、多数の細胞の三次元的凝集状態を作って培養を行うスフェロイド（細胞凝集塊）培養系は、細胞極性および細胞間相互作用の維持という観点から、生体外における優れた実質細胞培養系として、様々な報告がなされており、膵細胞、骨芽細胞、肝細胞、など多種の細胞に適用された例が存在する。いずれも単層培養系とは異なった生物学的応答を示し、分化マーカーが高レベルで維持されている例も報告されている。
スフェロイド形成の手法としては、細胞接着性Ｕ字底を有する９６穴プレートに細胞数を定めて細胞を播種することによってサイズをコントロールしたスフェロイドを形成する手法（例えば、非特許文献１参照）などが報告されている。
また、ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質中にスフェロイドを形成する方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。
特開平８−１４０６７３号公報
Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４７（２００１）１６５−１７１
また、ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質中にスフェロイドを形成する方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。
しかしながら、非特許文献１に記載の方法ではスフェロイド形成の培養面積当たりの効率が極めて低いという問題点があった。また特許文献１に記載の方法では、ゲル中に形成される各々のスフェロイドの大きさを制御することが困難であり、均一な大きさのスフェロイドの集合体を形成することが困難であった。
本発明は、内包される２以上のスフェロイドが互いに接触しないように配置された機能維持性が良好なスフェロイド含有ハイドロゲルおよびその積層体、ならびに、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するハイドロゲルの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
本発明は、内包される２以上のスフェロイドが互いに接触しないように配置された機能維持性が良好なスフェロイド含有ハイドロゲルおよびその積層体、ならびに、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するハイドロゲルの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
本発明の第１の態様は、ハイドロゲルと、前記ハイドロゲル内に互いに接触しないように配置された、直径７０μｍ〜４００μｍの均一な大きさを有する２以上のスフェロイドと、を含み、前記ハイドロゲルは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有するハイドロゲル形成用マクロモノマーに由来する高分子化合物を含み、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される、スフェロイド含有ハイドロゲルである。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。
前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の４以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基とを有し、重量平均分子量が１００００以上であることが好ましく、重合度が５０〜５０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することがより好ましい。また、一般式（５）におけるｉが１又は２であり、Ｒ ５ がそれぞれ独立にニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基及びニトロソ基からなる群より選択されることがより好ましい。
また本発明の第２の態様は、前記スフェロイド含有ハイドロゲルの２以上が積層されたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体である。
本発明の第３の態様は、基材ならびに前記基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種する工程と、播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成するスフェロイド形成工程と、前記基板上の前記スフェロイドが形成された側にハイドロゲルを配置してハイドロゲル複合体を形成するハイドロゲル複合体形成工程と、前記ハイドロゲル複合体から前記基板を剥離して、スフェロイド含有ハイドロゲルを得る工程と、を含み、前記ハイドロゲル複合体形成工程は、親水性高分子を含む感光性組成物を、前記基板上の前記スフェロイドが形成された側に配置して前記スフェロイドと接触させる工程と、前記感光性組成物を硬化させる工程と、を有し、前記感光性組成物は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有するハイドロゲル形成用マクロモノマーを含み、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される、スフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法である。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。
また前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の４以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基とを有し、重量平均分子量が１００００以上であることが好ましく、重合度が５０〜５０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することがより好ましい。また、一般式（５）におけるｉが１又は２であり、Ｒ ５ が一般式（５）におけるＲ ５ がそれぞれ独立にニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基及びニトロソ基からなる群より選択されることがより好ましい。
また前記播種された細胞を培養する工程における細胞の培養を、少なくとも５日間行うことが好ましい。
また前記基材上の親水性領域は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体に由来するポリマーを含むことが好ましい。
また前記親水性領域は、温度応答性層上に形成されていることが好ましい。
さらに前記疎水性領域は前記基材上にアレイ状に形成されていることもまた好ましい。
また前記基材上の親水性領域は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体に由来するポリマーを含むことが好ましい。
また前記親水性領域は、温度応答性層上に形成されていることが好ましい。
さらに前記疎水性領域は前記基材上にアレイ状に形成されていることもまた好ましい。
本発明によれば、内包される２以上のスフェロイドが互いに接触しないように配置された機能維持性が良好なスフェロイド含有ハイドロゲルおよびその積層体、ならびに均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するハイドロゲルの効率的な製造方法を提供することができる。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルは、ハイドロゲルと、前記ハイドロゲル内に互いに接触しないように配置された、直径７０〜４００μｍの均一な大きさを有する２以上のスフェロイドとを含むスフェロイド含有ハイドロゲルである。
スフェロイドがハイドロゲル中に内包され、特定の均一な大きさであることによりスフェロイドの機能維持性が良好かつ均質にそろったスフェロイド含有ハイドロゲルを構成することができる。
スフェロイドがハイドロゲル中に内包され、特定の均一な大きさであることによりスフェロイドの機能維持性が良好かつ均質にそろったスフェロイド含有ハイドロゲルを構成することができる。
本発明においてハイドロゲルに内包されるスフェロイドの直径は、７０μｍ〜４００μｍであるが、スフェロイドの機能維持性の観点から、７０μｍ〜３００μｍであることが好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。スフェロイドの大きさが４００μｍを超えるとスフェロイドの生存が困難になる。また大きさが７０μｍ未満ではスフェロイドとしての機能を発揮できない。
また本発明においては、ハイドロゲルに含まれる２以上のスフェロイドの大きさが均一である。ここで、均一であるとは大きさが等しいことに加えて、各々のスフェロイドの大きさに有意差がなく、スフェロイドの生体機能性も均質であることも含むものである。
また本発明においては、ハイドロゲルに含まれる２以上のスフェロイドの大きさが均一である。ここで、均一であるとは大きさが等しいことに加えて、各々のスフェロイドの大きさに有意差がなく、スフェロイドの生体機能性も均質であることも含むものである。
また本発明においてハイドロゲルに内包される２以上のスフェロイドは、互いに接触しないように配置されている。２つのスフェロイド間の距離には特に制限はないが、スフェロイドの機能維持の観点から、３０μｍ以上であることが好ましく、３０μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、５０μｍ〜１５０μｍであることがさらに好ましい。ここでスフェロイド間の距離とは、２つのスフェロイドの最外郭間の最小距離を意味する。
尚、本発明におけるスフェロイド含有ハイドロゲルの詳細については、スフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法と併せて後述する。
尚、本発明におけるスフェロイド含有ハイドロゲルの詳細については、スフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法と併せて後述する。
また本発明のスフェロイド含有ハイドロゲル積層体は、前記スフェロイド含有ハイドロゲルの２以上を積層して構成される。これにより均一な大きさを有する複数のスフェロイドが３次元的に配置されたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体を得ることができる。
積層の方法としては、特に制限はなく通常の方法を適宜用いることができる。例えば、基板を剥離した側同士が接触するように積層しても、基板を剥離した側とその反対側とが接触するように積層してもよい。また、積層するスフェロイド含有ハイドロゲルの数についても特に制限はなく、目的に応じて積層数を適宜選択することができる。
このようにして得られたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体は、均一な大きさのスフェロイドが３次元的に配置されているので、例えば、移植片として用いた場合に、組織様の挙動をとりやすい。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法は、基材ならびに前記基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種する工程と、播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成する工程と、前記基板上の前記スフェロイドが形成された側にハイドロゲルを配置してハイドロゲル複合体を形成するハイドロゲル複合体形成工程と、前記ハイドロゲル複合体から前記基板を剥離して、スフェロイド含有ハイドロゲルを得る工程と、を含む。
かかる構成であることにより、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するハイドロゲルを効率的に製造することができる。
かかる構成であることにより、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するハイドロゲルを効率的に製造することができる。
また、スフェロイドを含有するハイドロゲルは、酸素だけでなくさまざまな物質が透過、拡散しやすい材料であり、また柔らかい材料である。したがってハイドロゲル中に複数の細胞凝集塊（スフェロイド）が形成された場合でも、細胞に物理的損傷を与えることなく、各々のスフェロイドを効率的に維持することが可能となる。更に複数のスフェロイドを含むハイドロゲルを積層することで、スフェロイドを３次元的に配置した状態で維持、培養することが可能となる。
以下、本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法について詳細に説明する。
以下、本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法について詳細に説明する。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法は、基材ならびに前記基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種する工程を含む。
前記基板における基材としては、通常用いられる基材を特に制限なく用いることができる。基材の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、基材と架橋体との接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。
前記基板における基材としては、通常用いられる基材を特に制限なく用いることができる。基材の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、基材と架橋体との接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。
また本発明における基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材であることが好ましい。これにより、基材とその上に形成された架橋体との結合安定性を向上させることができる。
また、前記基材は、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で表面処理された基材であることもまた好ましく、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材を、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で更に表面処理した基材であることがより好ましい。
細胞接着性タンパク質で表面処理された基材を用いて、基板を構成することにより、例えば、基板上で細胞を培養する場合に、より効率的に細胞集合体を形成することができる。
ここで、細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン及びエラスチン等を挙げることができ、中でも、細胞集合体の形成性の観点から、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラチンがより好ましい。
細胞接着性タンパク質で表面処理された基材を用いて、基板を構成することにより、例えば、基板上で細胞を培養する場合に、より効率的に細胞集合体を形成することができる。
ここで、細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン及びエラスチン等を挙げることができ、中でも、細胞集合体の形成性の観点から、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラチンがより好ましい。
本発明において前記基材は、温度応答性層が配置されたものであることが好ましい。これにより、基板からハイドロゲルへのスフェロイド転写をより効率的に行うことができる。
前記温度応答性層は、下限臨界溶解温度以上で疎水性を示し、下限臨界溶解温度以下で親水性を示す温度応答性ポリマーを含んで構成することができる。本発明においては、細胞培養温度下（通常、３７℃）では疎水性を示し、ハイドロゲル複合体から基板を剥離する温度条件下では親水性を示す温度応答性ポリマーであることが好ましい。
前記下限臨界溶解温度は、特に限定されないが、スフェロイドの転写性の観点から、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。
前記温度応答性層は、下限臨界溶解温度以上で疎水性を示し、下限臨界溶解温度以下で親水性を示す温度応答性ポリマーを含んで構成することができる。本発明においては、細胞培養温度下（通常、３７℃）では疎水性を示し、ハイドロゲル複合体から基板を剥離する温度条件下では親水性を示す温度応答性ポリマーであることが好ましい。
前記下限臨界溶解温度は、特に限定されないが、スフェロイドの転写性の観点から、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは、培養細胞への障害性の観点から、下限臨界溶解温度が０〜８０℃であることが好ましく、０〜５０℃であることがより好ましい。
前記温度応答性ポリマーの具体例としては、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
前記温度応答性ポリマーの具体例としては、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
また前記温度応答性層は、その他のポリマーを含んでいてもよい。具体的には例えば、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。
これらの温度応答性ポリマーは、例えばモノマーの単独重合体の下限臨界溶解温度が０〜８０℃を有するようなモノマーの単独または共重合により調製される。モノマーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−(またはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられる。
また、培養する細胞の種類によって下限臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、温度応答性層と基材との相互作用を高める必要が生じた場合や、温度応答性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してもよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である
また、培養する細胞の種類によって下限臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、温度応答性層と基材との相互作用を高める必要が生じた場合や、温度応答性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してもよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である
本発明において基材上に温度応答性層を配置する方法としては特に制限はない。例えば、基材としてガラスを用いる場合、ガラス基材をシランカップリング剤で表面処理した後、ガラス基材上に温度応答性ポリマーを構成するモノマーを含む感光性組成物層を形成し、光照射等によってモノマーを重合することで、ガラス基材上に温度応答性ポリマーを含む温度応答性層を形成することができる。
前記シランカップリング剤で表面処理する方法としては、例えば、ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）を用いて、表面処理する方法等を挙げることができる。
また、モノマーの重合方法としては、通常のラジカル重合であっても、ＲＡＦＴ重合（Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization）等であってもよい。
前記シランカップリング剤で表面処理する方法としては、例えば、ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）を用いて、表面処理する方法等を挙げることができる。
また、モノマーの重合方法としては、通常のラジカル重合であっても、ＲＡＦＴ重合（Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization）等であってもよい。
また本発明においては、前記温度応答性層を設けた基材を、さらに前述した細胞接着性タンパク質で表面処理してもよい。これによって、より効率的にスフェロイドを形成することができる。
前記基材上に、複数の親水性領域および疎水性領域を形成する方法としては、特に制限なく通常用いられる方法を適用することができる。具体的には例えば、プラズマエッチングを用いる方法や、フォトリソグラフィーを用いる方法等を挙げることができる。
前記プラズマエッチングを用いる方法としては、例えば、前記基材上に親水性高分子を含む親水性組成物層を形成し、該親水性組成物層の少なくとも一部を、メタルマスクを用いたプラズマエッチング等で除去することで前記基材が露出した疎水性領域を形成することで、基材上に親水性組成物層が残存した親水性領域と疎水性領域とを形成する方法が挙げられる。
また、フォトリソグラフィーを用いる方法としては、例えば、前記基材上に親水性高分子を含む感光性組成物層を形成し、通常のフォトリソグラフィーの手法を用いて、前記感光性組成物層が硬化して形成された親水性領域と、未硬化の感光性組成物層を除去して形成された疎水性領域とを基材上に形成する方法等を挙げることができる。
前記親水性組成物層または前記感光性組成物層に含まれる親水性高分子としては、親水性基を含む高分子化合物であれば特に制限なく用いることができる。また、前記親水性基はカチオン性基であっても、アニオン性基であっても、ノニオン性基であってもよい。
本発明における親水性高分子としては、スフェロイドの形成性の観点から、親水性基としてノニオン性基を含む高分子であることが好ましく、ポリアルキレングリコール基を含む高分子であることがより好ましい。
本発明における親水性高分子としては、スフェロイドの形成性の観点から、親水性基としてノニオン性基を含む高分子であることが好ましく、ポリアルキレングリコール基を含む高分子であることがより好ましい。
前記ポリアルキレングリコール基を含む高分子としては、ポリアルキレングリコールそのものであっても、２以上のポリアルキレングリコール基を有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体であってもよい。
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体としては、例えば、日油（株）製のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等を挙げることができる。
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体としては、例えば、日油（株）製のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等を挙げることができる。
本発明においては、基材上に複数の親水性領域および疎水性領域を形成する方法としては、基板の作製効率の観点から、フォトリソグラフィーを用いる方法であることが好ましい。また前記親水性領域は、基板上でのスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体に由来するポリマーを含むことが好ましい。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有することが好ましい。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って細胞が３次元的凝集状態を形成した細胞凝集塊（スフェロイド）を維持することができる。また形成されるスフェロイドは、疎水性領域に応じた大きさとなるため、均一な大きさを有するスフェロイド集合体を容易に形成することができる。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って細胞が３次元的凝集状態を形成した細胞凝集塊（スフェロイド）を維持することができる。また形成されるスフェロイドは、疎水性領域に応じた大きさとなるため、均一な大きさを有するスフェロイド集合体を容易に形成することができる。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は３以上であることが好ましい。前記ポリアルキレングリコール基の含有数を３以上とすることで、形成された親水性領域の細胞非接着性の経時安定性がより良好になり、区画化された細胞集合体を長期間維持することが容易になる。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体に親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基は、少なくとも３つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端と結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。
また、ｉは１又は２を表す。
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
また、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、経時安定性とスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましい。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、３以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて、前記基材上に親水性領域を形成する方法としては、例えば、分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を用いて基材上に感光性組成物層を形成し、架橋反応により親水性領域を形成することができる。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて、前記基材上に親水性領域を形成する方法としては、例えば、分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を用いて基材上に感光性組成物層を形成し、架橋反応により親水性領域を形成することができる。
本発明における感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有することが好ましい。かかる感光性組成物を用いることで、例えば、基材上に高精度かつ均一な大きさに区画化された親水性領域と疎水性領域とを形成することができる。
前記感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また前記感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。
前記感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また前記感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。
前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９が好ましい。
前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を溶解可能であれば特に制限はない。ここでいう溶解可能とは前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を質量基準で０．１％以上溶解できることをいう。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
前記感光性組成物における前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の含有率としては、例えば０．１〜５０質量％とすることができ、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
本発明における基板を作製する方法は、例えば、基材上に前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を付与して感光性組成物層を形成する工程と、前記感光性組成物層を、露光処理する硬化工程とを含むことができる。これにより、基材上に、前記架橋体が形成された基板を作製することができる。
前記基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。
前記基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。
本発明において、基材上に感光性組成物層を形成する工程には、特に制限なく通常の薄膜形成方法を適用することができ、例えば、塗布法、ディップコート法、スピンコート法等を好適に適用することができる。
基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。本発明においては、スフェロイドの形成性と維持性の観点から、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。本発明においては、スフェロイドの形成性と維持性の観点から、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
前記基材上に感光性組成物層を形成する工程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶剤を除去する工程を含むことができる。前記溶剤を除去する工程としては、前記溶剤に応じて適宜その条件を選択することができ、常温乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。例えば、３０〜１５０℃で１分〜１０時間とすることができ、好ましくは３５〜１２０℃で３分〜１時間である。
前記硬化工程における露光処理は、前記感光性組成物層を全面露光する工程であっても、所望のパターン様に部分露光する工程であってもよい。本発明においては、所望のパターン様に部分露光する工程であることが好ましく、前記部分露光する工程後に更に現像工程を含むことがより好ましい。これにより、前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が形成されていない疎水性領域とが、パターン様に基材上に形成された基板を作製することができる。
前記所望のパターン様に部分露光する工程は、所望のパターン様に光透過性を有するマスク（フォトマスク）を介して、部分露光する工程であることが好ましい。また、前記マスクを感光性組成物層に密着させて部分露光を行うことにより、より高精度でパターン様に露光することができる。
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であれば特に制限はない。光源として例えば、Ｘ線、電子線、エキシマレーザー、キセノンランプ、メタルハライドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ランプ等を挙げることができる。中でも低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、２８０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、２８０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。
前記現像工程は、前記感光性組成物層における未露光領域を基材上から除去できる方法であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を用いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げることができ、本発明においては、溶剤として水を用いる洗浄及び水への浸漬であることが好ましい。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、疎水性領域を円状、三角形をはじめとする多角形状、楕円状、ストライプ状等に形成することができる。また親水性領域及び疎水性領域の大きさについても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明における基板に形成される疎水性領域を、円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５μｍ〜１０００μｍとすることが好ましく、５０μｍ〜５００μｍとすることがより好ましい。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０μｍ〜５００μｍであることが好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。更に前記親水性領域における層の厚みとしては、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで構成することにより、機能性の高いスフェロイドをより効率的に作成することができ、更により長期に渡って維持することが可能となる。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状及び大きさは、上述の硬化工程における露光処理を、マスクを介した露光処理とすることで、容易にかつ高い精度で制御することができる。
親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで構成することにより、機能性の高いスフェロイドをより効率的に作成することができ、更により長期に渡って維持することが可能となる。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状及び大きさは、上述の硬化工程における露光処理を、マスクを介した露光処理とすることで、容易にかつ高い精度で制御することができる。
本発明において前記基板上に播種する細胞としては、接着性細胞であれば、種および由来組織は特に限定されない。例えば、生体より採取した直後の細胞および癌化した樹立細胞系等を挙げることができ、好ましくは特定の臓器の機能発現および病態に関連する細胞である。より具体的には、薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制御に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する骨芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神経幹細胞、発毛に関連する毛母細胞、がん細胞、繊維芽細胞、および様々な細胞へ分化誘導できる胚性幹細胞、及び間葉系幹細胞等を挙げることができる。またこれら細胞と相互作用する非実質細胞も用いることができる。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法は、前記基板上に播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成する工程を含む。
基材上に複数の親水性領域と疎水性領域とが形成された基板を用いることで、疎水性領域にのみ細胞が配置され、親水性領域に細胞が接着しないことにより、基板上の疎水性領域にのみスフェロイドが形成される。
基材上に複数の親水性領域と疎水性領域とが形成された基板を用いることで、疎水性領域にのみ細胞が配置され、親水性領域に細胞が接着しないことにより、基板上の疎水性領域にのみスフェロイドが形成される。
本発明において基板上で細胞を培養する方法としては、通常の細胞培養方法を制限なく適用することができる。例えば、前記基板上に細胞培養培地を配置し、前記細胞培養培地へ所望の細胞を播種した後、所望の細胞に応じて選択される培養条件を適用することで、基板上の疎水性領域に所望の細胞を選択的に配置することができる。
各種細胞の通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ１６４０等を挙げることができ、培養対象となる細胞種に応じて適宜選択される。またこれらの培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５〜１０容量％とすることができる。
また各種細胞の培養条件は、細胞に応じて適宜選択できるが、例えば、５％ＣＯ２、３７℃とすることができる。
また、倍地中の細胞の播種濃度としては例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることでき、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
また各種細胞の培養条件は、細胞に応じて適宜選択できるが、例えば、５％ＣＯ２、３７℃とすることができる。
また、倍地中の細胞の播種濃度としては例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることでき、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
本発明においては、必要に応じて前記疎水性領域に予めフィーダー細胞を配置することができる。すなわち本発明においては、前記基板上の疎水性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成されたフィーダー細胞層上で、細胞を培養することができる。
予めフィーダー細胞層を形成することで、培養細胞のスフェロイド形成がより効率的に進行し、スフェロイドの安定性が向上する。前記フィーダー細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を挙げることができる。
予めフィーダー細胞層を形成することで、培養細胞のスフェロイド形成がより効率的に進行し、スフェロイドの安定性が向上する。前記フィーダー細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を挙げることができる。
本発明において基板上で細胞を培養する期間としては、細胞が基板上の疎水性領域にスフェロイドを形成可能な期間以上であれば特に制限はない。スフェロイドの形成に要する期間としては、通常の培養条件であれば例えば、数十分〜４８時間である。
本発明においては、スフェロイドのハイドロゲル中における保持性の観点から、スフェロイドを形成した後も、細胞培養を継続することが好ましい。したがって細胞培養は、細胞を播種してから少なくとも５日間行うことが好ましく、７〜３０日間であることがより好ましい。
細胞培養を５日間以上行うことで、スフェロイドが生体内機能に近い状態になり、スフェロイドの基板からハイドロゲルへの転写性が向上し、スフェロイドのハイドロゲル中における保持性がより良好になる。
本発明においては、スフェロイドのハイドロゲル中における保持性の観点から、スフェロイドを形成した後も、細胞培養を継続することが好ましい。したがって細胞培養は、細胞を播種してから少なくとも５日間行うことが好ましく、７〜３０日間であることがより好ましい。
細胞培養を５日間以上行うことで、スフェロイドが生体内機能に近い状態になり、スフェロイドの基板からハイドロゲルへの転写性が向上し、スフェロイドのハイドロゲル中における保持性がより良好になる。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法は、前記基板上の前記スフェロイドが形成された側にハイドロゲルを配置してハイドロゲル複合体を形成するハイドロゲル複合体形成工程を含む。
基板上のスフェロイドが形成された側に、ハイドロゲルとスフェロイドとが接触するようにハイドロゲルを配置することで、基板とスフェロイドとハイドロゲルとを含み、基板上のスフェロイドがハイドロゲル中に転写されたハイドロゲル複合体が形成される。
基板上のスフェロイドが形成された側に、ハイドロゲルとスフェロイドとが接触するようにハイドロゲルを配置することで、基板とスフェロイドとハイドロゲルとを含み、基板上のスフェロイドがハイドロゲル中に転写されたハイドロゲル複合体が形成される。
前記ハイドロゲルとしては、親水性高分子を、例えば架橋することで水に不溶化したものを水で膨潤させたものであれば特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、ポリオキシアルキレングリコール、各種のポリオキシアルキレングリコール誘導体等の合成高分子であっても、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、多糖類（セルロース）等の天然高分子、天然高分子を化学修飾した高分子、あるいは前記高分子からなるいずれかの混合体等を挙げることができる。
またハイドロゲルを基板上に配置する方法としては、ハイドロゲルと基板上のスフェロイドが接触できれば特に制限なく、通常用いられる方法を適用することができる。
またハイドロゲルを基板上に配置する方法としては、ハイドロゲルと基板上のスフェロイドが接触できれば特に制限なく、通常用いられる方法を適用することができる。
本発明において前記ハイドロゲル複合体形成工程は、親水性高分子を含む感光性組成物を前記基板上の前記スフェロイドが形成された側に配置して前記スフェロイドと接触させる工程と、前記感光性組成物を硬化させる工程とを含むことが好ましい。これにより、ハイドロゲル複合体をより効率的に形成することができる。
前記親水性高分子としては、架橋によって水に対して不溶化できるものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、ポリオキシアルキレングリコール、各種のポリオキシアルキレングリコール誘導体等の合成高分子であっても、ゼラチン、多糖類（セルロース）等の天然高分子であっても、天然高分子を化学修飾した高分子であってもよい。
また、親水性高分子の架橋方法は、親水性高分子の種類に応じて適宜選択することができる。
また、親水性高分子の架橋方法は、親水性高分子の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明における前記親水性高分子としては、ハイドロゲルの形成性およびそのハンドリング性、スフェロイドの維持性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の４以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基とを有し、重量平均分子量が１００００以上のハイドロゲル形成用マクロモノマーであることが好ましい。
本発明におけるハイドロゲル形成用マクロモノマー（以下、「分岐ポリアルキレングリコール誘導体」ということがある）において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は、スフェロイドの保持性と維持性の観点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、８以上１６以下であることが更に好ましい。
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エチレン性不飽和結合を有する基であることがより好ましい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エチレン性不飽和結合を有する基であることがより好ましい。
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明におけるハイドロゲル形成用マクロモノマーに親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基は、少なくとも４つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端とそれぞれ結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよいが、ハイドロゲルの安定性の観点から共有結合であることが好ましい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、ハイドロゲル形成用マクロモノマーの架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。
また、ｉは１又は２を表す。
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
また、本発明におけるハイドロゲル形成用マクロモノマーは、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは２〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは２〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。
本発明において前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、スフェロイドの保持性と維持性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましく、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表され、ｍが２であってｎが５０〜５００であって、前記重合性置換基が前記一般式（３）で表されるものであることがより好ましい。
本発明におけるハイドロゲル形成用マクロモノマーの具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、下記具体例中のポリアルキレングリコールの重合度（ｎ）はハイドロゲル形成用マクロモノマーの重量平均分子量から算出される平均重合度を意味する。また、ハイドロゲル形成用マクロモノマーの重量平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、例えば、４以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。
前記感光性組成物における前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーの含有率としては、例えば、０．１〜５０質量％とすることができ、１〜２０質量％であることが好ましい。
本発明において前記感光性組成物は、親水性高分子（好ましくは、前記ハイドロゲル形成用マクロモノマー）の少なくとも１種を含み、必要に応じてその他の成分を含んで構成することができる。
その他の成分としては、例えば、光重合開始剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を挙げることができる。
その他の成分としては、例えば、光重合開始剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を挙げることができる。
本発明において前記感光性組成物は、ハイドロゲルの形成性とスフェロイドの保持性の観点から、細胞培養液、緩衝液、生理食塩水および水の少なくとも１種を含むことが好ましい。
また前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９が好ましい。
本発明において基板上に感光性組成物を配置する方法には、特に制限なく通常の液体付与方法を適用することができる。例えば、塗布法、滴下法等を好適に適用することができる。
基板上に付与された感光性組成物が形成する感光性組成物層の層厚としては、基板上のスフェロイドが感光性組成物によって被覆される層厚以上であれば特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。例えば、５０〜３０００μｍとすることができる。中でも、５０μｍ〜１０００μｍとすることが好ましく、５０μｍ〜３００μｍであることがより好ましい。
基板上に付与された感光性組成物が形成する感光性組成物層の層厚としては、基板上のスフェロイドが感光性組成物によって被覆される層厚以上であれば特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。例えば、５０〜３０００μｍとすることができる。中でも、５０μｍ〜１０００μｍとすることが好ましく、５０μｍ〜３００μｍであることがより好ましい。
前記感光性組成物を硬化させる方法としては、感光性組成物を硬化可能であれば特に制限はないが、露光処理であることが好ましい。
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であって、生細胞に対する障害が少ない光源であることが好ましい。光源としては例えば、低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量については、生細胞に対する障害が少ない条件であれば特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、３２０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、１〜２００ｍＷ／ｃｍ２とすることができ、５〜１００ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることがより好ましい。
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であって、生細胞に対する障害が少ない光源であることが好ましい。光源としては例えば、低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量については、生細胞に対する障害が少ない条件であれば特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、３２０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、１〜２００ｍＷ／ｃｍ２とすることができ、５〜１００ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることがより好ましい。
本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法は、前記ハイドロゲル複合体から前記基板を剥離して、スフェロイド含有ハイドロゲルを得る工程を含む。ハイドロゲル複合体を形成した後に基板のみを剥離することで、スフェロイド含有ハイドロゲルをより効率よく作製することができる。
ハイドロゲル複合体から基板を剥離する方法としては、特に制限なく通常の方法を適用することができる。例えば、ハイドロゲルをピンセットでつまんで基板から剥離することができる。基板上に形成されたスフェロイドは基板からハイドロゲルへ転写されているのでハイドロゲルゲルをはがすだけでスフェロイドもハイドロゲル内に回収される。
また基板上の疎水性領域に温度応答性ポリマーを配置した場合、スフェロイド基板上でハイドロゲルを形成した後に、温度を下げることによって、スフェロイドは基板から効率的に剥離されてハイドロゲルへ転写することができる。これによりハイドロゲルをはがすことによってスフェロイドはより効率的にハイドロゲル内に回収される。
また、ハイドロゲル複合体を形成してから基板を剥離するまでの時間については特に制限はないが、スフェロイドの保持性の観点から、複合体形成直後から７２時間以内であることが好ましく、２４時間以内であることがより好ましい。
また基板上の疎水性領域に温度応答性ポリマーを配置した場合、スフェロイド基板上でハイドロゲルを形成した後に、温度を下げることによって、スフェロイドは基板から効率的に剥離されてハイドロゲルへ転写することができる。これによりハイドロゲルをはがすことによってスフェロイドはより効率的にハイドロゲル内に回収される。
また、ハイドロゲル複合体を形成してから基板を剥離するまでの時間については特に制限はないが、スフェロイドの保持性の観点から、複合体形成直後から７２時間以内であることが好ましく、２４時間以内であることがより好ましい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
まず、本発明に用いられる分岐ポリアルキレングリコール誘導体、および該ポリアルキレングリコールを含む感光性組成物を用いて作製された基板について具体的に説明する。
（参考例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).
（参考例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた４−アジド−安息香酸クロリド３６３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表１に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、参考例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表１に示した。
（参考例２）
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).
得られた５−アジド−サリチル酸５ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を塩化チオニル５０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−サリチル酸クロリド３５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）１．７７ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例３）
参考例２において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
参考例２において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例４）
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).
得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸クロリド４１７ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）１．８１（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例５）
参考例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は参考例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
参考例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は参考例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例６）
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を用意し、そのまま５分攪拌を続けた後、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）へゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を用意し、そのまま５分攪拌を続けた後、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）へゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例７）
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
（参考例８）
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−４００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ４０Ｋ）を得た。
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−４００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ４０Ｋ）を得た。
（参考例９）
〜基板の作製〜
以下の作業は、すべてイエロールーム内で行った。
参考例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（マルチアームＰＥＧ−アジド：４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
〜基板の作製〜
以下の作業は、すべてイエロールーム内で行った。
参考例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（マルチアームＰＥＧ−アジド：４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１０）
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、アミノプロピルシランコートガラス（松浪硝子工業（株）製。ＡＰＳコートＮＯ．１カバーガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＡＰＳコートガラス」と略す）を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、アミノプロピルシランコートガラス（松浪硝子工業（株）製。ＡＰＳコートＮＯ．１カバーガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＡＰＳコートガラス」と略す）を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１１）
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１２）
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にコラーゲンをさらにコーティングした「コラーゲンコートガラス」を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、コラーゲンコートガラスは、ＰＬＬコートガラス上にブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．１％水溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥する工程を２回繰り返して作製した。
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にコラーゲンをさらにコーティングした「コラーゲンコートガラス」を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、コラーゲンコートガラスは、ＰＬＬコートガラス上にブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．１％水溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥する工程を２回繰り返して作製した。
（参考例１３）
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にゼラチンをさらにコーティングした「ゼラチンコートガラス」を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、ゼラチンコートガラスは、ＰＬＬコートガラスを用い、ゼラチン（新田ゼラチン社製）の０．１％溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥して作製した。
参考例９において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にゼラチンをさらにコーティングした「ゼラチンコートガラス」を用いた以外は、参考例９と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、ゼラチンコートガラスは、ＰＬＬコートガラスを用い、ゼラチン（新田ゼラチン社製）の０．１％溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥して作製した。
（参考例１４）
参考例１３において、コラーゲンコートガラスの作製方法を、ＰＬＬコートガラスをブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．０２％水溶液に３時間浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させる方法に変更した以外は、参考例１３と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例１３において、コラーゲンコートガラスの作製方法を、ＰＬＬコートガラスをブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．０２％水溶液に３時間浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させる方法に変更した以外は、参考例１３と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１５）
参考例９において、感光性組成物Ａに代えて、マルチアームＰＥＧ−アジド（４ＰＡ２０Ｋ）の濃度を０．５％とした感光性組成物Ｂを用いた以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、感光性組成物Ａに代えて、マルチアームＰＥＧ−アジド（４ＰＡ２０Ｋ）の濃度を０．５％とした感光性組成物Ｂを用いた以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１６）
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋに代えて、参考例２〜５で合成した各種の分岐ポリアルキレングリコール誘導体をそれぞれ用いた以外は参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋに代えて、参考例２〜５で合成した各種の分岐ポリアルキレングリコール誘導体をそれぞれ用いた以外は参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１７）
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件として高圧水銀灯（２００Ｗ）で３秒間とした以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件として高圧水銀灯（２００Ｗ）で３秒間とした以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１８）
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例９において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例９と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例１９）
参考例１０〜１４において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例２で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）又は参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例１０〜１４とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例１０〜１４において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例２で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）又は参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例１０〜１４とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（参考例２０）
参考例６及び参考例７で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ、８ＰＤ２０Ｋ）の濃度が１％であって、光重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるようにトルエンに溶解して、感光性組成物Ｄを調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ｄを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、いずれの分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
参考例６及び参考例７で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ、８ＰＤ２０Ｋ）の濃度が１％であって、光重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるようにトルエンに溶解して、感光性組成物Ｄを調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ｄを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、いずれの分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
（実施例１）
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＭＥＭα（血清としてＦＢＳ（ウシ胎児血清）を１０容量％含む。以下、使用した培地は全て同様に血清を含んでいる）を添加し、そこに骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさを有する骨芽細胞スフェロイドのアレイが形成された。形成された骨芽細胞スフェロイドのアレイを位相差光学顕微鏡（倍率×４０）により観察した様子を図１に示す。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する骨芽細胞スフェロイドのアレイが形成された。
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＭＥＭα（血清としてＦＢＳ（ウシ胎児血清）を１０容量％含む。以下、使用した培地は全て同様に血清を含んでいる）を添加し、そこに骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさを有する骨芽細胞スフェロイドのアレイが形成された。形成された骨芽細胞スフェロイドのアレイを位相差光学顕微鏡（倍率×４０）により観察した様子を図１に示す。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する骨芽細胞スフェロイドのアレイが形成された。
上記で得られたスフェロイドアレイ培養基板について、２１日間培養を継続した（培地は２日毎に交換した）。その後、スフェロイドアレイ培養基板を取り出して、テフロン（登録商標）プレートの上に乗せた。この培養基板上に０．０５％の重合開始剤(ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９)共存下、１０％の分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）を含むＭＥＭα培地溶液(０．２２μmのフィルターを通したもの)を１４０μｌ滴下した。次いでフィルター（シグマ光機（株）製、紫外透過可視吸収フィルター、ＵＴＶＡＦ−５０Ｓ−３６Ｕ）を被せ、高圧水銀ランプを照射し（２５ｍＷ/ｃｍ２、３５秒）ゲル化させて、ハイドロゲル複合体を形成した。
ハイドロゲル複合体を形成して１時間後に、形成したハイドロゲル複合体から、ハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。スフェロイド含有ハイドロゲルの培養８日後の状態を図２に示す。
ハイドロゲル複合体を形成して１時間後に、形成したハイドロゲル複合体から、ハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。スフェロイド含有ハイドロゲルの培養８日後の状態を図２に示す。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、下記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。スフェロイド含有ハイドロゲルをＭＴＴ染色した様子を図３に示す。
−ＭＴＴ染色−
ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide、和光純薬製）の０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｍｅｍα：ＧＩＢＣＯ社製）を調製した。
１２ウェルプレートの底面にセットしたスフェロイド含有ハイドロゲルに上記ＭＴＴ溶液２ｍｌを加えて、３時間インキュベートした。
ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide、和光純薬製）の０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｍｅｍα：ＧＩＢＣＯ社製）を調製した。
１２ウェルプレートの底面にセットしたスフェロイド含有ハイドロゲルに上記ＭＴＴ溶液２ｍｌを加えて、３時間インキュベートした。
（実施例２）
実施例１において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、８ＰＤ２０Ｋの代わりに４ＰＤ２０Ｋを含む培地溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
同様にＭＴＴ染色にて、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
実施例１において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、８ＰＤ２０Ｋの代わりに４ＰＤ２０Ｋを含む培地溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
同様にＭＴＴ染色にて、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例３）
実施例１において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、８ＰＤ２０Ｋの代わりに８ＰＤ４０Ｋを含む培地溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
同様にＭＴＴ染色にて、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
実施例１において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、８ＰＤ２０Ｋの代わりに８ＰＤ４０Ｋを含む培地溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
同様にＭＴＴ染色にて、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例４）
〜スフェロイド含有ハイドロゲル積層体の作製〜
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１日間継続した。その後、基板を剥離した側同士が接触するように２層を積層してスフェロイド含有ハイドロゲル積層体を作製した。得られたハイドロゲル積層体について、さらに１０日培養を継続した。
また、基板を剥離した側とその反対側とが接触するように５層を積層してハイドロゲル積層体を作製した。得られたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体について、さらに１０日培養を継続した。
いずれのスフェロイド含有ハイドロゲル積層体においても、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
〜スフェロイド含有ハイドロゲル積層体の作製〜
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１日間継続した。その後、基板を剥離した側同士が接触するように２層を積層してスフェロイド含有ハイドロゲル積層体を作製した。得られたハイドロゲル積層体について、さらに１０日培養を継続した。
また、基板を剥離した側とその反対側とが接触するように５層を積層してハイドロゲル積層体を作製した。得られたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体について、さらに１０日培養を継続した。
いずれのスフェロイド含有ハイドロゲル積層体においても、スフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例５）
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＤＭＥＭを添加し、そこにウシ膝関節軟骨細胞を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有するウシ膝関節軟骨細胞スフェロイドのアレイが形成された。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有するウシ膝関節軟骨細胞スフェロイドのアレイが形成された。
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＤＭＥＭを添加し、そこにウシ膝関節軟骨細胞を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有するウシ膝関節軟骨細胞スフェロイドのアレイが形成された。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有するウシ膝関節軟骨細胞スフェロイドのアレイが形成された。
上記で得られたスフェロイドアレイ培養基板について、１４日間培養を継続した。その後、スフェロイドアレイ培養基板を取り出して、テフロン（登録商標）プレートの上に乗せた。この培養基板上に０．０５％の重合開始剤(ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９)共存下、１０％の分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ４０Ｋ）を含むＤＭＥＭ培地溶液(０．２２μmのフィルターを通したもの)を１４０μｌ滴下した。次いでフィルターを被せ、高圧水銀ランプを照射し（２５ｍＷ/ｃｍ２、３５秒）ゲル化させて、ハイドロゲルを形成した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＤＭＥＭを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＤＭＥＭを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例６）
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ培地を添加し、そこに肝細胞を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する肝細胞スフェロイドのアレイが形成された。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する肝細胞スフェロイドのアレイが形成された。
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットした。培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ培地を添加し、そこに肝細胞を細胞濃度１×１０６cells／ｍＬにて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する肝細胞スフェロイドのアレイが形成された。
また、同様にして他の参考例で作製した基板を用いた場合においても、同様に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並び、均一な大きさ（約１００μｍ）を有する肝細胞スフェロイドのアレイが形成された。
上記で得られたスフェロイドアレイ培養基板について、２１日間培養を継続した。その後、スフェロイドアレイ培養基板を取り出して、テフロン（登録商標）プレートの上に乗せた。この培養基板上に０．０５％の重合開始剤(ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９)共存下、１０％の分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ４０Ｋ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ培地溶液(０．２２μmのフィルターを通したもの)を１４０μｌ滴下した。次いでフィルターを被せ、高圧水銀ランプを照射し(２５ｍＷ/ｃｍ２、３５秒）ゲル化させて、ハイドロゲルを形成した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例７）
白切スライドガラス（松浪硝子工業（株）製、丸型２１ｍｍφ）をオゾン洗浄（１５分×２回）した。これをカップリング剤ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）１ｍｌ、クロロホルム８ｍｌ、メタノール１ｍｌ、濃塩酸８５μｌの混合溶液に３０分浸した。その後、７０℃で３０分乾燥させ、クロロホルム、メタノール、ミリＱ水で順次で洗浄後、デシケーターで減圧乾燥した。
これを無垢テフロン（登録商標）容器にいれ、１時間アルゴンガスでバブリングした４ｍｏｌ／ｌのＩＰＡＡｍ(イソプロピルアクリルアミド)のＴＨＦ溶液で満たした。空気が入らないように石英ガラスを被せて２５ｍＷ/ｃｍ２で１０分間、ＵＶ照射した。その後、メタノール、ミリＱ水で順次洗浄し、乾燥させた。
次いで０．１５％のゼラチン水溶液に２時間浸漬後、乾燥してゼラチンコートを行った。
以上のようにして温度応答性層を有するガラス基材を得た。
白切スライドガラス（松浪硝子工業（株）製、丸型２１ｍｍφ）をオゾン洗浄（１５分×２回）した。これをカップリング剤ＤＡＴＥＳ（(N,N’-diethylamino)dithiocarbamoylpropyl(triethoxy)silane）１ｍｌ、クロロホルム８ｍｌ、メタノール１ｍｌ、濃塩酸８５μｌの混合溶液に３０分浸した。その後、７０℃で３０分乾燥させ、クロロホルム、メタノール、ミリＱ水で順次で洗浄後、デシケーターで減圧乾燥した。
これを無垢テフロン（登録商標）容器にいれ、１時間アルゴンガスでバブリングした４ｍｏｌ／ｌのＩＰＡＡｍ(イソプロピルアクリルアミド)のＴＨＦ溶液で満たした。空気が入らないように石英ガラスを被せて２５ｍＷ/ｃｍ２で１０分間、ＵＶ照射した。その後、メタノール、ミリＱ水で順次洗浄し、乾燥させた。
次いで０．１５％のゼラチン水溶液に２時間浸漬後、乾燥してゼラチンコートを行った。
以上のようにして温度応答性層を有するガラス基材を得た。
参考例９において、ＰＬＬコートスライドガラスの代わりに、上記で得られた温度応答性層を有するガラス基材を用いた以外は、参考例９と同様にして、基材上に複数の親水性領域および疎水性領域が形成された基板を作製した。
このようにして作製した基板を用いた以外は、実施例１と同様にしてハイドロゲル複合体を形成した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、２５℃の温度条件下で、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
このようにして作製した基板を用いた以外は、実施例１と同様にしてハイドロゲル複合体を形成した。
ハイドロゲル複合体を形成して２４時間後に、２５℃の温度条件下で、ハイドロゲル複合体からハイドロゲルをピンセットで剥離したところ、スフェロイドが基板からハイドロゲルに転写されたスフェロイド含有ハイドロゲルが得られた。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＭＥＭαを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
また、上記においてゼラチンコートの代わりに、フィブロネクチンまたはコラーゲンをコートした基材を用いた場合においても同様の結果が得られた。
また、上記においてゼラチンコートの代わりに、フィブロネクチンまたはコラーゲンをコートした基材を用いた場合においても同様の結果が得られた。
（実施例８）
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。
このＢＡＥＣがパターン状に培養された基板に、培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＢＡＥＣ上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
このスフェロイドが形成された基板を用いて、実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
参考例９で作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。
このＢＡＥＣがパターン状に培養された基板に、培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＢＡＥＣ上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
このスフェロイドが形成された基板を用いて、実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例９）
パターン化基板を滅菌処理し、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。このＮＩＨ−３Ｔ３がパターン状に培養された基板に、培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＮＩＨ−３Ｔ３上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
このスフェロイドが形成された基板を用いて、実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
パターン化基板を滅菌処理し、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ。このＮＩＨ−３Ｔ３がパターン状に培養された基板に、培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅ（血清としてＦＢＳを１０容量％含む）を用い、ラット初代肝細胞を細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、２４時間以内にパターン化されたＮＩＨ−３Ｔ３上に均一な大きさを有する肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。
このスフェロイドが形成された基板を用いて、実施例１と同様にしてスフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルは、１２ウェルプレートの底面にセットして培地としてＷｉｌｌｉａｍｓ‘Ｅを添加し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を１４日間継続した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約１００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例１０）
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径２００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約２００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径２００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約２００μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（実施例１１）
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径７０μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約７０μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径７０μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイドが均一な大きさ（約７０μｍ）を維持したまま生存していることが確認された。
（比較例１）
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径５００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイド（大きさ約５００μｍ）は生存性が極めて低いことが確認された。
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径５００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイド（大きさ約５００μｍ）は生存性が極めて低いことが確認された。
（比較例２）
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径５０μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイド（大きさ約５０μｍ）は細胞凝集性が悪く、生存性も極めて低いことが確認された。
参考例９における基板の作製において、直径１００μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクの代わりに、直径５０μｍの円形パターンの石英ガラスフォトマスクを用いて基板を作製した。これを用いて実施例１と同様にして、スフェロイド含有ハイドロゲルを作製した。
得られたスフェロイド含有ハイドロゲルについて、上記のようにしてＭＴＴ染色による生死判定を行ったところ、スフェロイド含有ハイドロゲル中のスフェロイド（大きさ約５０μｍ）は細胞凝集性が悪く、生存性も極めて低いことが確認された。
以上から、本発明のスフェロイド含有ハイドロゲルの作製方法によって、均一な大きさを有する複数のスフェロイドを含有するスフェロイド含有ハイドロゲルが効率よく作製できたことが分かる。
また、ハイドロゲル中のスフェロイドの大きさを特定の範囲とすることでスフェロイドの機能維持性が良好になること分かる。
また、ハイドロゲル中のスフェロイドの大きさを特定の範囲とすることでスフェロイドの機能維持性が良好になること分かる。
Claims (13)
- ハイドロゲルと、
前記ハイドロゲル内に互いに接触しないように配置された、直径７０μｍ〜４００μｍの均一な大きさを有する２以上のスフェロイドと、を含み、
前記ハイドロゲルは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有するハイドロゲル形成用マクロモノマーに由来する高分子化合物を含み、
前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される、スフェロイド含有ハイドロゲル。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。 - 前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の４以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基とを有し、重量平均分子量が１００００以上である請求項１に記載のスフェロイド含有ハイドロゲル。
- 前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、重合度が５０〜５０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する請求項２に記載のスフェロイド含有ハイドロゲル。
- 前記ｉが１又は２であり、Ｒ ５ がそれぞれ独立にニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基及びニトロソ基からなる群より選択される、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲル。
- 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの２以上が積層されたスフェロイド含有ハイドロゲル積層体。
- 基材ならびに前記基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域を含む基板上に、細胞を播種する工程と、
播種された細胞を培養して、培養された細胞に由来するスフェロイドを前記基板上の疎水性領域に形成するスフェロイド形成工程と、
前記基板上の前記スフェロイドが形成された側にハイドロゲルを配置してハイドロゲル複合体を形成するハイドロゲル複合体形成工程と、
前記ハイドロゲル複合体から前記基板を剥離して、スフェロイド含有ハイドロゲルを得る工程と、を含み、
前記ハイドロゲル複合体形成工程は、
親水性高分子を含む感光性組成物を、前記基板上の前記スフェロイドが形成された側に配置して前記スフェロイドと接触させる工程と、
前記感光性組成物を硬化させる工程と、を有し、
前記感光性組成物は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有するハイドロゲル形成用マクロモノマーを含み、
前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される、スフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
一般式（５）中、Ｌ ５ は単結合又は２価の連結基を表し、ｉは０、１又は２を表し、Ｒ ５ は一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であり、ｉが２の場合、２つのＲ ５ は同一でも異なっていてもよい。 - 前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の４以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する４価以上の連結基とを有し、重量平均分子量が１００００以上である請求項６に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記ハイドロゲル形成用マクロモノマーは、重合度が５０〜５０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する請求項７に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記ｉが１又は２であり、Ｒ ５ がそれぞれ独立にニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基及びニトロソ基からなる群より選択される、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記スフェロイド形成工程における細胞の培養を、少なくとも５日間行う請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記基材上の親水性領域は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体に由来するポリマーを含む請求項６〜請求項１０のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記親水性領域は、温度応答性層上に形成されている請求項６〜請求項１１のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
- 前記疎水性領域は前記基材上にアレイ状に形成されている請求項６〜請求項１２のいずれか１項に記載のスフェロイド含有ハイドロゲルの製造方法。
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