JP2017014324A - 温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の製造方法、細胞培養器 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、広く応用することが可能な、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する温度応答性ポリマーを製造することを目的とする。
【解決手段】Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーとを重合させることを特徴とする、温度応答性ポリマーの製造方法、該製造方法により製造された温度応答性ポリマー、該温度応答性ポリマーを用いた細胞培養器の製造方法、及び該製造方法により製造された細胞培養器。
【選択図】図１

Description

本発明は、特に、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する温度応答性ポリマーの製造方法、該製造方法により製造された温度応答性ポリマー、該温度応答性ポリマーを用いた細胞培養器の製造方法、及び該製造方法により製造された細胞培養器に関する。

温度応答性ポリマーは、所定の温度（下限臨界溶液温度：Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）未満では水に溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、という物性を備えるポリマーである。

２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の重合体である、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）は、約３２℃の曇点を有する温度応答性ポリマーとして知られている。

ここで、ＰＤＭＡＥＭＡの側鎖に結合する、カチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基を含むエステル基の一部を、加水分解によりアニオン性のカルボキシル基に変換することによって、物性を変化させたＰＤＭＡＥＭＡ由来のポリマーを製造する需要も存在していた。

かかる需要に応えるべく、ＤＭＡＥＭＡを水存在下でラジカル重合させることによって、カチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基、及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ基を含むエステル基が加水分解されてなるアニオン性のカルボキシル基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを製造する方法が報告されている（特許文献１参照）。

特開２０１４−１６２８６５号公報

しかしながら、上記従来の温度応答性ポリマーの製造方法により製造される温度応答性ポリマーには、応用範囲の更なる拡大を可能にする余地があった。
そこで、本発明は、広く応用することが可能な、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する温度応答性ポリマーを製造することを目的とする。

本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーとを重合させることを特徴とする。

また、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、前記重合が、ラジカル重合、イニファーター重合、イオン重合からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、
前記第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、
前記第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、
を含むことを特徴とする。

また、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、前記カチオン性モノマー単位の、前記アニオン性モノマー単位に対する割合（Ｃ／Ａ比）が、０．５〜３２であることが好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの使用量の、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、前記カチオン性モノマー、前記アニオン性モノマーの使用量の合計に対するモル割合が０．９以上であることが好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、前記カチオン性モノマーが、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法では、前記アニオン性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の温度応答性ポリマーは、上記の本発明の温度応答性ポリマーの製造方法により製造されることを特徴とする。

本発明の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含むことを特徴とする。

また、本発明の温度応答性ポリマーは、前記カチオン性モノマー単位の、前記アニオン性モノマー単位に対する割合（Ｃ／Ａ比）が、０．５〜３２であることが好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーは、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単位の、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単位、前記カチオン性モノマー単位、前記アニオン性モノマー単位の合計に対するモル割合が０．９以上であることが好ましい。

本発明の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのホモポリマーブロックと、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックと、を含むことを特徴とする。

また、本発明の温度応答性ポリマーでは、前記ホモポリマーブロックの数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーでは、前記カチオン性モノマーが、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

更に、本発明の温度応答性ポリマーでは、前記アニオン性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の細胞培養器の製造方法は、上記の本発明の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、
前記曇点以下の温度を有する前記温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、
前記温度応答性ポリマーが前記培養面に流延された前記細胞培養器を、前記曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、
を含むことを特徴とする。

本発明の細胞培養器は、上記の本発明の細胞培養器の製造方法により製造されたことを特徴とする。

本発明の細胞培養器は、上記の本発明の温度応答性ポリマーを被覆してなることを特徴とする。

本発明の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、広く応用することが可能な、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する温度応答性ポリマーを製造することができる。
本発明の温度応答性ポリマーによれば、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間を顕著に遅延させることができ、また、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
本発明の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養器を、簡便な方法で製造することができる。
本発明の細胞培養器によれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作を可能とすることができ、また、管腔状や塊状の構造を有する細胞構造体を、簡便に製造することができる。

本発明の細胞培養器を用いて培養された、管腔状（チューブ状）の構造を有するラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。

以下、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法、本発明の温度応答性ポリマー、本発明の細胞培養器の製造方法、及び本発明の細胞培養器の実施形態について詳細に例示説明する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
本発明の実施形態の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。

Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。

カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。

ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。

ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ²であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ²であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。

この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ²であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ²であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。

更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

（温度応答性ポリマー）
本発明の実施形態の温度応答性ポリマーは、上記本発明の実施形態の製造方法により製造される。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。

例えば、特許文献１に記載の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡはポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記特許文献１の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。

一方、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
本発明の実施形態の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
本発明の実施形態の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、前述の本発明の好適な実施形態の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、本発明の実施形態の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

本発明の実施形態の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

（細胞培養器の製造方法）
本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法は、上記の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、温度応答性ポリマーが培養面に流延された細胞培養器を、曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、を含む。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法では、まず、上記の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する（冷却工程）。
この工程では、例えば、温度応答性ポリマーを約４℃の冷蔵庫に入れることによって、上記温度応答性ポリマーを曇点以下の温度まで冷却することができる。

次いで、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法では、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる（流延工程）。
この工程では、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面を傾けることによって、又はスパチュラを用いてポリマーを延ばすことによって、温度応答性ポリマーを流延させることができる。

細胞培養器としては、市販の細胞培養用のプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ガラス等が挙げられる。

そして、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法では、温度応答性ポリマーが培養面に流延された細胞培養器を、曇点超の温度まで加熱する（加熱工程）。
この工程は、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって、上記温度応答性ポリマーを曇点超の温度まで加熱することができる。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを細胞培養器の表面に被覆するための特別な処理、例えば、放射線グラフト重合などを施すことを要しない。すなわち、本発明の実施形態の細胞培養器の調製は、該培養器を用いる研究者自身により、簡便な方法で（特殊な装置を要することなく）、低コストで行うことができる。

（細胞培養器）
本発明の実施形態の細胞培養器は、上記の本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法により製造される。

この細胞培養器によれば、一般的な３７℃のインキュベーター中で細胞を培養して、組織を形成させた後、曇点以下の条件にすることにより、トリプシン処理等の細胞剥離操作を行うことなく、例えば、細胞シート状の構造を有する細胞を回収することができる。
そのため、この細胞培養器を用いて細胞を培養すれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作が可能となる。

更に、本発明の実施形態の細胞培養器によれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。
これは、上記温度応答性ポリマーが側鎖に有する疎水性基及びカチオン性基が、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えていると推定される。また、カチオン性基とアニオン性基とを有する温度応答性ポリマーは、正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にしているものと推定される。
また、この細胞培養器によれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

本発明の実施形態の細胞培養器では、該細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する、本発明の温度応答性ポリマーの量が、５．０〜５０ｎｇ／ｍｍ²であることが好ましく、１５〜４０ｎｇ／ｍｍ²であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

（細胞培養方法）
以下に、本発明の実施形態の温度応答性ポリマー、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法について記載する。
上記細胞培養方法は、上記の本発明の実施形態の細胞培養器に細胞を播種する播種工程と、播種された細胞を培養する培養工程とを含む。播種条件及び培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。そして、この細胞培養方法は、細胞種に限定されることなく、血管細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、心筋細胞、腎細胞、神経細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞等の様々な細胞に適用することができる。

ここで、一例の細胞培養方法では、播種される細胞の密度が１，５００個／ｍｍ²以下（培養面の面積が２００ｍｍ²である２４ウェル細胞培養プレートに１．０ｍＬの細胞浮遊液を加えることにより播種する場合、３．０×１０⁵個／ｍＬ以下）であることが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
上記細胞密度とすれば、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

上記一例の細胞培養方法は、血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞など間葉系の細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（試験１）ポリマーの製造
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造（実施例製法１）
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）３．３５ｇと、トルエン５．０ｍＬとを加えて、磁気撹拌器を用いて１０分間撹拌しながら、これらを均質に溶解させた。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。その後、この混合物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、４時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。

そして、バイアル瓶に不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、ここへ、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（カチオン性モノマー、ＤＭＡＥＭＡ）０．５ｍＬ、及びメタクリル酸（アニオン性モノマー、ＭＡ）０．０３ｍＬを加えて、再度磁気撹拌器を用いて撹拌した。

この混合物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて６時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。
反応物は、４時間後に粘性を帯び、６時間後に固化した。固化後、更に１時間の紫外線照射を行って、重合体を反応生成物として得た。この反応生成物を５０ｍＬのトルエンに溶解させ、次いで、溶液を５００ｍＬのジエチルエーテル中に少量ずつ加えることによって、重合物を再沈殿させ、そして、上澄みを除去し、最後に、残った沈殿物を少量のジエチルエーテルで洗浄した。このトルエンへの溶解からジエチルエーテルでの洗浄までの再沈殿操作を更に５回繰り返して、重合体を精製した。

精製した反応生成物である重合体を適量の水に溶解させた。そして、溶液をセルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることによって、ＮＩＰＡＭとＤＭＡＥＭＡとの共重合体からなる温度応答性ポリマーが得られた（収率５６％）。
このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝９０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２）と決定した（実施例ポリマー１）。

実施例ポリマー１の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水素化メタノール（ＣＤ₃ＯＤ）を溶媒に使用して測定した。下記には、実施例ポリマー１に共通する代表的なピークを示す。
¹H-NMR (in CD₃OD) δ 0.8-1.2 (br, -CH₂-C(CH ₃)- of DMAEMA, MA and CH(CH ₃)₂ of NIPAM), 1.6-2.0 (br, -CH ₂-C(CH₃)- of DMAEMA, MA and -CH ₂-CH₂- of NIPAM and CH(CH₃)₂ of NIPAM), 2.2-2.4 (br, -N(CH ₃)₂ of DMAEMA), 2.5-2.7 (br, -CH ₂-N(CH₃)₂ of DMAEMA), 3.6-4.2 (br, -O-CH ₂-.of DMAEMA and C(O)-NH- of NIPAM)
ここで、ＮＭＲのプロトン積分値からＮＩＰＡＭの側鎖が有するメチル基の官能基数と、ＤＭＡＥＭＡの側鎖が有するジメチルアミノ基の官能基数と、のＭＡの側鎖が有するメチル基の官能基数との比を算出した。
その結果、実施例ポリマー１の場合ＮＩＰＡＭ：ＤＭＡＥＭＡ：ＭＡ＝１０：1．０：０．１となった。Ｃ／Ａ比は、１０であった。

（試験２）ポリマーの曇点の測定
実施例ポリマー１の３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、１５℃〜５０℃の間で測定した。昇温速度は０．５℃／分とした。
その結果、１５℃〜３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
なお、実施例ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。

（試験３）ポリマーの凝集体の粒子径測定
実施例ポリマー１を２０℃の液体とし、静的光散乱装置（シスメックス社製、型番：ゼーターセイザー・ナノ）を用いて、光散乱により、ポリマー分子の凝集体の粒子径を測定したところ２５０ｎｍであった。曇点未満の温度である２０℃においても、比較的粒子径の大きい凝集体、すなわち、沈殿しやすく、沈殿後に拡散しにくい凝集体を形成していることが示唆された。実施例ポリマー１は、細胞培養器に容易に被覆することができる可能性が示唆された。

（試験４）細胞培養器の製造
実施例ポリマー１の水溶液を調製し（最終濃度、ポリマー：５μｇ／２００μＬ）、この水溶液を４℃まで冷却した。この水溶液を、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ²）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）中で６時間インキュベートした。こうして、培養面であるウェルに実施例ポリマー１を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。

（試験５）細胞培養
実施例ポリマー１を用いて製造した上記の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、室温条件下において、ラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞（初代培養細胞）を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５、ＦＣＳ：インビトロゲン社製、ロット番号８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を３．７５〜１５×１０⁴個／ｍＬに調整した培養液を１ｍＬずつ加えた（１．８７×１０³〜７．５０×１０³個／ｍｍ²）。この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で７日間培養した。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、プレート表面の露出が確認されるようになった。５日目に、上記露出する領域は、肉眼で確認できるようになり、一方、互いに集まった細胞は、二次元平面で見て網目状の構造を形成した。この網目状の構造を、更に詳細に観察したところ、図１に示す通り、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認され、これらの細胞が、あたかも血管を形成するかのように自発的に集合していることを示した（図１参照）。図１に、管腔状（チューブ状）の構造を有するラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真を示す。

本発明の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、広く応用することが可能な、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する温度応答性ポリマーを製造することができる。
本発明の温度応答性ポリマーによれば、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間を顕著に遅延させることができ、また、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
本発明の細胞培養器の製造方法によれば、温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養器を、簡便な方法で製造することができる。
本発明の細胞培養器によれば、室温程度の条件下での細胞培養の操作を可能とすることができ、また、管腔状や塊状の構造を有する細胞構造体を、簡便に製造することができる。

Claims (19)

1. Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーとを重合させることを特徴とする、温度応答性ポリマーの製造方法。
2. 前記重合が、ラジカル重合、イニファーター重合、イオン重合からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
3. Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、
   前記第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、
   前記第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
4. 前記カチオン性モノマー単位の、前記アニオン性モノマー単位に対する割合（Ｃ／Ａ比）が、０．５〜３２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
5. 前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの使用量の、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、前記カチオン性モノマー、前記アニオン性モノマーの使用量の合計に対するモル割合が０．９以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
6. 前記カチオン性モノマーが、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
7. 前記アニオン性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーの製造方法。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーの製造方法により製造されることを特徴とする、温度応答性ポリマー。
9. Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含むことを特徴とする、温度応答性ポリマー。
10. 前記カチオン性モノマー単位の、前記アニオン性モノマー単位に対する割合（Ｃ／Ａ比）が、０．５〜３２である、請求項８又は９に記載の温度応答性ポリマー。
11. 前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単位の、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単位、前記カチオン性モノマー単位、前記アニオン性モノマー単位の合計に対するモル割合が０．９以上である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマー。
12. Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのホモポリマーブロックと、
    カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックと、
    を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマー。
13. 前記ホモポリマーブロックの数平均分子量が５０００Ｄａ以上である、請求項１２に記載の温度応答性ポリマー。
14. 前記ホモポリマーブロックの数平均分子量が２００００Ｄａ以上である、請求項１３に記載の温度応答性ポリマー。
15. 前記カチオン性モノマーが、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマー。
16. 前記アニオン性モノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマー。
17. 請求項８〜１６のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーを、その曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、
    前記曇点以下の温度を有する前記温度応答性ポリマーを、細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、
    前記温度応答性ポリマーが前記培養面に流延された前記細胞培養器を、前記曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、
    を含むことを特徴とする、細胞培養器の製造方法。
18. 請求項１７に記載の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞培養器。
19. 請求項８〜１６のいずれか一項に記載の温度応答性ポリマーを被覆してなることを特徴とする、細胞培養器。