JP6796332B2 - 細胞培養器、細胞構造体の製造方法 - Google Patents
細胞培養器、細胞構造体の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6796332B2 JP6796332B2 JP2017525483A JP2017525483A JP6796332B2 JP 6796332 B2 JP6796332 B2 JP 6796332B2 JP 2017525483 A JP2017525483 A JP 2017525483A JP 2017525483 A JP2017525483 A JP 2017525483A JP 6796332 B2 JP6796332 B2 JP 6796332B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- temperature
- responsive polymer
- cell incubator
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 36
- 229920000208 temperature-responsive polymer Polymers 0.000 claims description 177
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 122
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 119
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 118
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 89
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 77
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 76
- HMLSBRLVTDLLOI-UHFFFAOYSA-N 1-(dimethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical group CN(C)C(C)OC(=O)C(C)=C HMLSBRLVTDLLOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 52
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 50
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 14
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 14
- -1 alkali metal salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 12
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 claims description 12
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethenamine Chemical compound NC=CC1=CC=CC=C1 UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 5
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 4
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000172 poly(styrenesulfonic acid) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 229940005642 polystyrene sulfonic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims description 3
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims description 3
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 claims description 2
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 377
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 57
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 49
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 33
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 24
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 16
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 15
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 15
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 12
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 11
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 10
- CNHDIAIOKMXOLK-UHFFFAOYSA-N toluquinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1O CNHDIAIOKMXOLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enamide Chemical compound CC(C)=CC(N)=O WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 5
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N hydroquinone methyl ether Natural products COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 229940088644 n,n-dimethylacrylamide Drugs 0.000 description 5
- YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C=C YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 4
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 4
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 4
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 4
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000012690 ionic polymerization Methods 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- XUDBVJCTLZTSDC-UHFFFAOYSA-N 2-ethenylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C=C XUDBVJCTLZTSDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000010560 atom transfer radical polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000010559 graft polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013033 iniferter Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- DCBBWYIVFRLKCD-UHFFFAOYSA-N n-[2-(dimethylamino)ethyl]-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)CCNC(=O)C(C)=C DCBBWYIVFRLKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- PTPLXVHPKMTVIW-FPLPWBNLSA-N (Z)-hydroxyimino-oxido-phenylazanium Chemical compound O\N=[N+](/[O-])c1ccccc1 PTPLXVHPKMTVIW-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBSXSAXOLABXMF-UHFFFAOYSA-N 4-Vinylaniline Chemical group NC1=CC=C(C=C)C=C1 LBSXSAXOLABXMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920002558 Curdlan Polymers 0.000 description 1
- 239000001879 Curdlan Substances 0.000 description 1
- 229920001174 Diethylhydroxylamine Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- BGNXCDMCOKJUMV-UHFFFAOYSA-N Tert-Butylhydroquinone Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(O)=CC=C1O BGNXCDMCOKJUMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 125000005620 boronic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- DKVNPHBNOWQYFE-UHFFFAOYSA-N carbamodithioic acid Chemical compound NC(S)=S DKVNPHBNOWQYFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012986 chain transfer agent Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019316 curdlan Nutrition 0.000 description 1
- 229940078035 curdlan Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- FVCOIAYSJZGECG-UHFFFAOYSA-N diethylhydroxylamine Chemical compound CCN(O)CC FVCOIAYSJZGECG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012990 dithiocarbamate Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010551 living anionic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010550 living polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000005397 methacrylic acid ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- DFENKTCEEGOWLB-UHFFFAOYSA-N n,n-bis(methylamino)-2-methylidenepentanamide Chemical compound CCCC(=C)C(=O)N(NC)NC DFENKTCEEGOWLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADTJPOBHAXXXFS-UHFFFAOYSA-N n-[3-(dimethylamino)propyl]prop-2-enamide Chemical compound CN(C)CCCNC(=O)C=C ADTJPOBHAXXXFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002061 nanopillar Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001083 polybutene Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005992 thermoplastic resin Polymers 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/10—Petri dish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
- C08F20/52—Amides or imides
- C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F20/56—Acrylamide; Methacrylamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/22—Petri dishes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/02—Membranes; Filters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明の細胞培養器は、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域を複数有し、前記第一被覆領域の表面ゼータ電位が、0〜50mVであり、前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であり、前記各第一被覆領域の面積が、0.1〜30mm 2 であり、
前記第一被覆領域間の距離が、0.1〜10mmである、ことを特徴とする。
ここで、本発明の細胞培養器は、前記第一被覆領域に対する水の接触角が、50〜90°であることが好ましい。
また、本発明の細胞培養器では、前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記第一被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー;N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー;2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)及び/又はその誘導体の重合体と、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(トリス)と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される1種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物;からなる群から選択される少なくとも1種の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記アニオン性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも1種の基を有するビニル誘導体からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記カチオン性モノマーは、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリルアミド、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリレート、アミノスチレン、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリルアミド、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリレートからなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器は、前記第一被覆領域に、細胞接着性物質で更に被覆された第二被覆領域を有し、該第二被覆領域は前記第一被覆領域の内側にあるものとしてもよい。
更に、本発明の細胞培養器は、前記細胞接着性物質は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。
本発明の細胞構造体の製造方法は、本発明の細胞培養器の前記培養面に細胞を播種し、播種した細胞を培地中で培養し、培地交換を行い、前記培養面に接着した細胞をさらに培養し、細胞構造体を得ることを特徴とする。
また、本発明の細胞構造体の製造方法では、細胞構造体のサイズが50〜1,500μm径であることが好ましい。
上記と同様の理由から、表面ゼータ電位は、好適には0〜35mVであり、更に好適には10〜25mVである。
これは、上記特定の範囲の表面ゼータ電位とすることによって、細胞培養器の培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができるものと推測される。
一方、本発明の実施形態の細胞培養器で作製された細胞構造体(スフェロイド)は、培養面上に速やかに接着し、増殖しながら伸展するという経過を経たうえで形成されるものであるため、細胞間に産生された細胞外マトリックスが豊富に存在する。そのため、細胞構造体自体のバイアビリティ(活性)が極めて高い。
細胞構造体のサイズは、微小サイズ(例えば、数百μm以下のサイズ)とすることができ、50〜1,500μm径としてよく、50〜200μm径であることが好ましい。
なお、第一被覆領域に対する水の接触角とは、第一被覆領域内の任意の数点において、JIS R3257に準拠して、測定される接触角の平均値を指す。
なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞(例えば、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞等)が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。
かかる構成によれば、培養面のうちの第一被覆領域以外の非被覆領域に、播種された細胞が接着することを抑制することができる。接着しなかった細胞は、培地交換等の簡便な操作により、細胞培養器から除去することができ、これらの細胞によるアポトーシスやヒートショックプロテインの産生等の、接着した細胞の生育に対する悪い影響を抑制することが可能となる。また、細胞培養器の培養面を細胞非接着性とすれば、各第一被覆領域に播種された細胞が、接触することがなく、別々に細胞構造体を作製することが可能になる。
ここで、上記ポリスチレン等の材質の細胞培養器に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を被覆すると、ポリマー又はポリマー組成物の厚み(すなわち、被覆前の培養面からの距離)の二乗の分だけポリスチレン等の材質の表面のゼータ電位が減衰され、被覆後の培養面の表面のゼータ電位がよりプラス側に振れることとなる。そのため、被覆処理の場合、細胞の接着に有利となる。
なお、「第一被覆領域間の距離」とは、第一被覆領域間の培養面上における最短距離をいう。
0.1mm以上とすれば、隣接する第一被覆領域間で、それぞれの領域に播種された細胞どうしが接着してしまうことを抑制することができる。10mm以下とすれば、大量の細胞構造体(スフェロイド等)を効率良い作製することができる。
円形の第一被覆領域の直径としては、10μm〜10mmであることが好ましく、30μm〜1500μmであることが更に好ましい。
これらの形状は、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
一方、本実施形態の細胞培養器は、前述の第一被覆領域の内側に後述の第二被覆領域を有するものとしてもよく、この場合、細胞培養器は、マイクロプレート(例えば、96穴プレート等)をベースとして作製されてよく、例えば、創薬の分野(特に、薬剤スクリーニング)において好適に用いることができる。
ペプチドとしては、分子内にアルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を少なくとも1組含むもの、アルギニンを8分子以上連続した配列を含むもの、リジンが10分子以上連続した配列を含むもの等が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、アミノスチレン等が挙げられる。
これらの中でも、細胞接着性が高い、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンが好ましい。
また、上記列挙の細胞接着性物質を含む試薬も好適に用いることができ、かかる試薬としては、当業者に周知の、ヒト、ウシ、イヌ、ブタ、魚類の血清、無血清培地等が挙げられる。
また、本発明における第一被覆領域も第二被覆領域も、無色透明で、肉厚は、極めて薄く、平滑であるため、当該両領域を透過する光は、屈折、反射、吸収されることがほとんどなく、細胞培養器をそのまま測定(光学測定等)に適用することが可能となる。
従来公知の複数のウェルを備える細胞培養器を用いて細胞培養を行う場合、ウェルのサイズに応じて播種すべき細胞の数が定まってしまう。
そして、播種すべき細胞数に伴って、1個1個の細胞に対する必要栄養量や細胞全体を物理的に浸漬することが可能な体積等を考慮して、細胞構造体を培養するために必要な培養スケールが定まり、培養に要する培地の量、更には、試験に用いる薬剤の量も定まることとなる。
昨今のiPS細胞実験等の効果な実験を小スケールで行いたいという欲求は当該技術分野において高まっており、現在のところ国際規格品の中で最小サイズである384ウェルの細胞培養器を用いた場合であっても、実験コストが十分に低減されないこともある。
ここで、本実施形態の第二被覆領域を有する細胞培養器によれば、多数の細胞構造体(スフェロイド)を、それぞれを隔壁等により独立した空間に隔離することなく、同じ空間に共存させることが可能となる。このため、細胞構造体を分化させるのに用いられる分化誘導因子や、スクリーニングされる薬剤等を培地に含め、この培地を多数の細胞構造体が共存する系に一度に加える(必要に応じて、適宜攪拌する)だけで、全ての細胞構造体を同じ条件下におくことができる。また、細胞構造体が分泌する生理活性物質も、系中に均一に拡散させることができる。
円形の第二被覆領域の直径としては、0.01mm〜10mmであることが好ましく、
10〜1,000μmであることが更に好ましい。
これらの形状は、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
ここで、上記(A)としては、例えば、(A−1)DMAEMAを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、(A−2)主としてDMAEMAを含むポリマーブロック(重合鎖α末端)と、主としてDMAEMAとアニオン性モノマー(重合鎖ω末端)とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本発明の実施形態において、これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
(A−1)の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)を含む混合物を調製する(調製工程)。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
水の混合物に対する重量割合は、1.0%〜50%であることが好ましく、9.0%〜33%であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたDMAEMAに対する、側鎖が加水分解されていないDMAEMAの割合(共重合割合)が1.0〜20程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
反応時間としては、7時間〜24時間であることが好ましく、17時間〜21時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、(A−1)の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式(I)で表される繰り返し単位(A)
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、(A−1)の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ(2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート)由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
例えば、DMAEMA及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、(A−1)の温度応答性ポリマーに含めることができる。
(A−1)の温度応答性ポリマーは、上記(A−1)の製造方法により製造される。
(A−1)の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
(A−2)の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)を含む第一混合物に紫外線を照射する(第一重合工程)。
ここで、第一混合物は、DMAEMA以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、N,N−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、N−イソプロピルアクリルアミド、3−N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、N,N−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、N−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のDMAEMAの使用量に対する割合(モル数)は、0.001〜1とすることが好ましく、0.01〜0.5とすることが更に好ましい。
紫外線の照射強度としては、0.01〜50mW/cm2であることが好ましく、0.1〜5mW/cm2であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度(時間)で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
反応時間としては、10分〜48時間であることが好ましく、60分〜24時間であることが更に好ましい。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒(トルエン、ベンゼン、メタノール等)等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したPDMAEMAの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)や光散乱法(SLS)等の当業者に周知の方法により、測定することができる。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
(A−2)の温度応答性ポリマーは、上記(A−2)の製造方法により製造される。
好適には、(A−2)の温度応答性ポリマーは、DMAEMAのホモポリマーブロックと、DMAEMAとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
(B)の温度応答性ポリマーの製造方法は、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)(以下、「モノマー(A)」ともいう。)と、カチオン性モノマー(以下、「モノマー(B)」ともいう。)と、アニオン性モノマー(以下、「モノマー(C)」ともいう。)とを重合させるものである。任意選択的に、上記3種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリルアミド、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリレート、アミノスチレン、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリルアミド、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−メタクリルアミドは、中性域のpHで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらは、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合、原子移動ラジカル重合(ATRP)、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。
この製造方法の一例では、まず、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)を含む第一混合物に紫外線を照射する(第一重合工程)。
ここで、第一混合物は、DMAEMA以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
紫外線の照射強度としては、0.01〜50mW/cm2であることが好ましく、0.1〜5mW/cm2であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
反応時間としては、反応時間としては、10分〜48時間であることが好ましく、60分〜24時間であることが更に好ましい。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
紫外線の照射強度としては、0.01〜50mW/cm2であることが好ましく、0.1〜5mW/cm2であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
反応時間としては、反応時間としては、10分〜48時間であることが好ましく、60分〜24時間であることが更に好ましい。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。
(B)の温度応答性ポリマーは、上記(B)の製造方法により製造される。
好適には、(B)の温度応答性ポリマーは、主としてN−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック(重合鎖α末端)と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、(B)の温度応答性ポリマーは、NIPAMのホモポリマーブロックと、NIPAMとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてDMAEMAに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のpHの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達(DDS)に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。DDSの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記特許文献1の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいDMAEMAを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。
(B)の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のpHを容易に調整することが可能である。
(B)の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達(DDS)に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、NIPAM単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合(モル)が、0.001〜0.2であることが好ましく、0.01〜0.1であることが更に好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。
(C)の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する(混合物調製工程)。具体的には、(1)2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)及び/又はその誘導体の重合体と、(2)2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(トリス)と、(3)核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する((2)トリスは任意選択的に含む。)。
上記組成物では、DMAEMA及び/又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用(例えば、架橋する作用)して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
特に、DNAとしては、iPS細胞、ES細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞を分化細胞、特に、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、に分化誘導できるDNAが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
なお、割合((2)/(1))は、重量割合であるものとする。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
上記割合を0.1以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
なお、本願明細書では、C/A比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、C/A比は、(1)DMAEMA及び/又はその誘導体の重合体のモル数をN1、(3)アニオン性物質のモル数をN3としたときに、{(重合体1分子当たりの正電荷)×N1}/{(アニオン性物質1分子当たりの負電荷)×N3}という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をDNAとした場合、アニオン性物質1分子当たりの負電荷数は、DNAの塩基対の数(bp数)×2で計算し、分子量(Da)は、bp数×660(ATペア及びCGペアの平均分子量)で計算するものとする。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
図1に、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の一例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例の概略と共に示す。
本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例は、第一被覆領域のみを有し、第二被覆領域を有しないものである。
本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例では、まず、細胞培養器を準備する(図1(i)参照)。
なお、図1に示す例では、細胞培養器の培養面を、細胞非接着性としている。
ここで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置(スポット)手法としては、例えば、8連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。
また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を水溶液の状態で使用する場合には、その曇点以下の温度まで冷却して用いてよい。
図1に示す例では、4箇所に、温度応答性ポリマーの水溶液を塗布している。
この製造方法の一例では、温度応答性ポリマーを細胞培養器の培養面に(相互作用、非共有結合、共有結合等を介して、)結合させる(図1(iii)参照)。
図1に示す例では、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させている。
ここで、塗布量としては、0.005〜200μLとしてよく、好適には、1〜50μLである。
播種される細胞の密度が、1,500個/mm2以下(培養面の面積が200mm2である24ウェル細胞培養プレートに1.0mLの細胞浮遊液を加えることにより播種する場合、3.0×105個/mL以下)であることが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
上記細胞密度とすれば、第一被覆領域に接着した細胞が、塊状(ペレット状)の構造を有する細胞構造体を形成しやすい。
この細胞培養方法の一例は、血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞等間葉系の細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。
このとき、図1(v)に示す通り、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しない。
このとき、図1(vi)に示す通り、培養面に接着しなかった細胞が細胞培養器から除去される。
このとき、特定の範囲の表面ゼータ電位を有する第一被覆領域において、塊状(ペレット状)の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。
本発明の実施形態の細胞培養器の別の例は、第一被覆領域の内側に第二被覆領域を備えるものである。
ここで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置(スポット)手法としては、例えば、8連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。
図8に示す例では、4箇所の第一被覆領域において、それぞれ1箇所に、細胞接着性物質の水溶液を塗布している。
ここで、塗布量としては、0.01〜100μLとしてよく、好適には、0.1〜10μLである。
具体的には、再生医療では再生を望む部位における細胞ソース、DDSではサイトカインの分泌体といった用途が考えられる。
具体的には、高価なiPS細胞を用いた小スケールでの薬剤スクリーニングといった用途が考えられる。
本発明の実施形態の細胞構造体培養槽は、細胞構造体を活性の高い状態で培養し、細胞構造体に所望の物質や生物材料(例えば、成長因子、ペプチド、糖、タンパク質、サイトカイン、その他生理活性物質、エクソソーム、マイクロRNA等)を産生させ、かかる物質や生物材料を得るために、好適に用いられる。
本発明の実施形態の細胞構造体培養槽によれば、接着性細胞の場合であっても、細胞を培養面に接着させた状態で培養することが可能となり、且つ、培地の撹拌を要することがないために容器内の空間を有効に利用しつつ、細胞の細菌への感染リスクも低減することが可能となる。
ここで、培養シートには、細胞構造体をアンカリングさせる上記箇所が、シートの縦方向及び横方向に行列をなすことが、培養環境を均一にする観点から、好ましい。
ここで、排出された培地に、水分蒸発濃縮、凍結乾燥、エタノール沈殿、フェノール処理、抗体固定磁気ビーズ処理、抗体固定蛍光ビーズ処理、ゲル濾過、遠心分離、傾斜比重薬、透析、濾過、電気泳動、酵素処理、液液抽出等の当業者に周知の方法で、所望の物質や生物材料を抽出してよい。
なお、排出された培地は、潅流させてよく、また、任意選択的に、透析してアンモニア等代謝物を除去したり、酸素バブリングをして溶存酸素濃度を高めたりしたうえで、再利用してよい。なお、投入する培地は新たな培地としてもよい。
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
(試験1−1)ポリマーの製造−1
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造(実施例製法1−1)
容量50mLの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)10.0gを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。
そして、この混合物(液体)に対してG1グレードの高純度(純度:99.99995%)の窒素ガスを10分間パージ(流速:2.0L/分)することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この混合物に対して、丸型ブラック蛍光灯(NEC社製、型番:FCL20BL、18W)を用いて5時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。
数平均分子量が5,000以上であることを確認した直後に、バイアル瓶に不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、メタクリル酸1.4gを加えて、再度磁気撹拌器を用いて撹拌した。なお、ここで加えるメタクリル酸に対しては予め不活性ガスでバブリングを行なった。
このポリマーの数平均分子量(Mn)を、GPC(島津社製、型番:LC−10vpシリーズ)を用いて、ポリエチレングリコール(Shodex社製、TSKシリーズ)を標準物質として測定し、Mn=450,0000(Mw/Mn=2.2)と決定した(実施例ポリマー1−1)。
1H−NMR(in D2O)δ 0.8−1.2(br,3H,−CH2−C(CH3)−),1.6−2.0(br,2H,−CH2−C(CH3)−),2.2−2.4(br,6H,−N(CH3)2),2.5−2.7(br,1.9H,−CH2−N(CH3)2),4.0−4.2(br,1.9H,−O−CH2−).
ここで、α位に結合したメチル基(δ 0.8−1.2)のプロトン数(DMAEMAユニットの場合もメタクリル酸ユニットの場合も3個)Aと、側鎖のエステル結合の酸素に結合しているエチル基(δ 4.0−4.2)のメチルプロトン数(DMAEMAユニットの場合は2個で、メタクリル酸ユニットの場合は0個)Bとから、DMAEMAの側鎖が有するアミノ基の官能基数と、メタアクリル酸の側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、実施例ポリマー1−1の場合94:6となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む2成分混合系におけるイオン複合体で言うC/A比に換算すると、C/A比=15.6となる。
実施例ポリマー1−1の3%水溶液を調製し、この水溶液の660nmにおける吸光度を、20℃〜40℃の間で測定した。
その結果、20℃〜30℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ0であったが、31℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、32℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約32℃の曇点を有することを確認した。
なお、実施例ポリマーを37℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温(25℃)で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは4℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。
実施例ポリマー1−1を20℃の液体とし、静的光散乱装置(シスメックス社製、型番:ゼーターセイザー・ナノ)を用いて、光散乱により、ポリマー分子の凝集体の粒子径を測定したところ、250nmであった。曇点未満の温度である20℃においても、比較的粒子径の大きい凝集体、すなわち、沈殿しやすく、沈殿後に拡散しにくい凝集体を形成していることが示唆された。実施例ポリマー1は、細胞培養器に容易に被覆することができる可能性が示唆された。
細胞培養器として、ポリスチレン製の35mm細胞培養プレート(イワキ社製、型番:3000−035−MYP、1ウェル当たりの底面積:9cm2)を用いた。
培養面を、非イオン性界面活性剤(旭電化社製、プルロニックF−68)でコーティングして、細胞非接着性とした。
1箇所あたりの円形の第一被覆領域の直径は、約2,000μmであり、また、第一被覆領域間の距離は、約1,000μmであった。
そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させた。
こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域を設けた。
細胞培養プレートの小片に(試験4)の手順と同様の手順に従って設けた第一被覆領域の表面ゼータ電位を、ゼータ電位計(大塚電子社製、型番:ELSZ)及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス(粒子径:約500nm)をヒドロキシプロピルセルロース(Mw=30,000)で被覆した粒子(ゼータ電位:−5mV〜+5mV)を用いた。また、溶媒として、10mMの塩化ナトリウム水溶液をpH=7、37℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Smoluchowski式を用いて算出した。
非被覆の細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は−68mVであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった。
一方、温度応答性ポリマーにより被覆された細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は、+20mVであった。
なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±10%程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。
細胞培養プレートの第一被覆領域に対する水の接触角を、JIS R3257に準拠して、接触角計(商品名:DMs−400、協和界面科学社製)を用いて測定したところ、70°±10°であった。
ここで、GFPでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の間葉系脂肪幹細胞2.5×106個を、完全培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎児血清(FBS)溶液、DMEM:ギブコ社製、型番:11995−065、FCS:インビロトジェン社製、ロット番号:928696)中に浮遊させ、細胞密度が2.5×106個/プレートとなるように播種した。
この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、37℃、5%CO2雰囲気の細胞培養インキュベーター中で3時間培養した。
このとき、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しなかった。
3時間培養後、新たなDMEM+10%FCS溶液を用いて培地交換を行った。
図3(a)〜(d)、図4(a)〜(d)に、それぞれ、培地交換から、0時間後(培地交換直後)、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、8時間後、12時間後の様子を示す。
培地交換から2時間後に、接着していた細胞のうち、特に、第一被覆領域の外縁に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた(図3(b)参照)。
培地交換から3時間後〜6時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、第一被覆領域の外縁側から第一被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した(図3(c)、図3(d)、図4(a)、図4(b)参照)。
培地交換から8時間後に、遂には、各第一被覆領域における培養から、第一被覆領域の数だけ、塊状(ペレット状)の構造を有する細胞構造体が形成した(図4(c)参照)。
培地交換から12時間後、塊状の細胞構造体は、自発的に第一被覆領域から剥離し、細胞培養器の培養面上を移動し始めた。いくつかの細胞構造体は、互いに接着を始めていた(図4(d)参照)。
図5及び図6に、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
図5(a)〜(d)、図6(a)〜(d)に、それぞれ、塊状の細胞構造体が自発的に第一被覆領域から剥離し、浮遊した後、細胞培養器を適当に転倒・混和させることによって浮遊物を人為的に細胞培養器の中央部に集めて、細胞構造体同士を接触させてから、0時間後、5時間後、8時間後、12時間後、17時間後、22時間後、25時間後、34時間後の様子を示す。
前述の(試験4)と同様に、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域を設けた。
次いで、第一被覆領域に、超微量計量ピペッター(NICHIRYO社製、デジフィット)を用いて、培養面上の28箇所に設けられた円形の第一被覆領域に、ヒト血漿由来フィブロネクチン水溶液(BDファルコン社製、濃度:1mg/mL、ロット番号:3353663)0.2μLずつを、それぞれ円形状に塗布した。ここで、第一被覆領域の円形と、第二被覆領域の円形とは、同心円状になるようにした。
1箇所あたりの円形の第二被覆領域の直径は、約250μmであった。
そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した細胞接着性物質の水溶液を乾燥させた。
こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域の内側に第二被覆領域を設けた。
ここで、前述の(試験4)と同様に、GFPでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞2.5×106個を、完全培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎児血清(FBS)溶液、DMEM:ギブコ社製、型番:11995−065、FCS:インビロトジェン社製、ロット番号:928696)中に浮遊させ、細胞密度が2.5×106個/プレートとなるように播種した。
この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、37℃、5%CO2雰囲気の細胞培養インキュベーター中で3時間培養した。
このとき、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しなかった。
3時間培養後、新たなDMEM+10%FCS溶液を用いて培地交換を行った。
それぞれ、培地交換から、0時間後(培地交換直後)、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、8時間後、12時間後の様子は、図3及び図4とほぼ同様となった(図示せず)。
培地交換から2時間後に、接着していた細胞のうち、特に、第一被覆領域の外縁に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた(図3(b)参照)。
培地交換から3時間後〜6時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、第一被覆領域の外縁側から第一被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した(図3(c)、図3(d)、図4(a)、図4(b)参照)。
培地交換から8時間後に、遂には、各第一被覆領域における培養から、第一被覆領域の数だけ、塊状(ペレット状)の構造を有する細胞構造体が形成した(図4(c)参照)。
図10に、図9に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に10cm/秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。(a)〜(d)は、揺動開始から、0秒後、0.5秒後、1.0秒後、1.5秒後の様子を示す。
図11に、図9に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に10cm/秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。(a)〜(d)は、揺動開始から、2.0秒後、2.5秒後、3.0秒後、3.5秒後の様子を示す。
図10及び図11に見られる通り、揺動中、細胞培養皿上の6つの塊状の細胞構造体(図中、培養面の上参照)は、細胞培養皿に関して変位していないのに対して、細胞培養皿上の細胞構造体以外の細胞(図中、培養面の右下参照)は、細胞培養皿に関して変位していることがわかる。
更に、下記の表1に記載の通り条件を変えて、実施例1と同様に、試験1〜試験9に記載の操作と同様の操作を行った。
・低接着性プレート(35mm):Prime Surface(登録商標)(住友ベークライト社)
・ガラスシャーレ(50mm):BROSIL(アズワン社製)
・汎用滅菌(大腸菌用)シャーレ(90mm):GD90−15(アズワン社)
・実施例ポリマー1−2:下記(試験1−2)により調製。
(試験1−2)ポリマーの製造−2
容量50mLの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)10.0g、及び水5,000μLを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物(液体)に対してG1グレードの高純度(純度:99.99995%)の窒素ガスを10分間パージ(流速:2.0L/分)することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたDMAEMAには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン(MEHQ)が0.5重量%含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯(NEC社製、型番:FCL20BL、18W)を用いて、22時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、5時間後に粘性を帯び15時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を2−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を72時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の0.2μmフィルター(東洋濾紙社製、型番:25AS020)で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた(収量:6.8g、転化率:68%)。このポリマーの数平均分子量(Mn)を、GPC(島津社製、型番:LC−10vpシリーズ)を用いて、ポリエチレングリコール(Shodex社製、TSKシリーズ)を標準物質として測定し、Mn=100,000(Mw/Mn=10.0)と決定した。
なお、ポリマーの曇点及び粒子径は、実施例ポリマー1−1の場合と同様であった。
・実施例ポリマー1−3:(試験1−2)において、窒素ガスのパージ時間を10分間から20分間に変更した。重合よりも加水分解がより進行してアニオン成分が増えた。
・実施例ポリマー1−4:(試験1−2)において、窒素ガスのパージ時間を10分間から5分間に変更した。加水分解よりも重合がより進行してカチオン成分が増えた
・実施例ポリマー1−5:(試験1−2)において、DMAEMAの代わりに、親水性非イオン性モノマーのN,N−ジメチルアクリルアミド(DMAA)をDMAEMAの3質量%配合したものを用いた。
・実施例ポリマー1−6:(試験1−2)において、DMAEMAの代わりに、非イオン性モノマーのN−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)をDMAEMAの5%配合したものを用いた。
・ヒト癌由来細胞株(HepG2):CET社製、HEPG2−500
・心筋細胞:ビーグル犬由来初代細胞
・軟骨細胞:ビーグル犬由来初代細胞
・ラミニン:ニッピ社製
・コラーゲン:新田ゼラチン社製
Claims (10)
- 細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域を複数有し、
前記第一被覆領域の表面ゼータ電位が、0〜50mVであり、
前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であり、
前記各第一被覆領域の面積が、0.1〜30mm 2 であり、
前記第一被覆領域間の距離が、0.1〜10mmである、
ことを特徴とする、細胞培養器。 - 前記第一被覆領域に対する水の接触角が、50〜90°である、請求項1に記載の細胞培養器。
- 前記第一被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の細胞培養器。
- 前記温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が、2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー;N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー;2−N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)及び/又はその誘導体の重合体と、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(トリス)と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される1種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物;からなる群から選択される少なくとも1種の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞培養器。
- 前記アニオン性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも1種の基を有するビニル誘導体からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項4に記載の細胞培養器。
- 前記カチオン性モノマーは、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリルアミド、3−(N,N−ジメチルアミノプロピル)−(メタ)アクリレート、アミノスチレン、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリルアミド、2−(N,N−ジメチルアミノエチル)−(メタ)アクリレートからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項4又は5に記載の細胞培養器。
- 前記第一被覆領域に、細胞接着性物質で更に被覆された第二被覆領域を有し、該第二被覆領域は前記第一被覆領域の内側にある、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞培養器。
- 前記細胞接着性物質は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項7に記載の細胞培養器。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞培養器の前記培養面に細胞を播種し、播種した細胞を培地中で培養し、培地交換を行い、前記培養面に接着した細胞をさらに培養し、細胞構造体を得ることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
- 前記細胞構造体のサイズが50〜1,500μm径である、請求項9に記載の細胞構造体の製造方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015129266 | 2015-06-26 | ||
JP2015129266 | 2015-06-26 | ||
JP2015203835 | 2015-10-15 | ||
JP2015203835 | 2015-10-15 | ||
PCT/JP2016/069565 WO2016208777A1 (ja) | 2015-06-26 | 2016-06-24 | 細胞培養器 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016208777A1 JPWO2016208777A1 (ja) | 2018-04-12 |
JP6796332B2 true JP6796332B2 (ja) | 2020-12-09 |
Family
ID=57585130
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017525483A Active JP6796332B2 (ja) | 2015-06-26 | 2016-06-24 | 細胞培養器、細胞構造体の製造方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180355296A1 (ja) |
EP (1) | EP3315596A4 (ja) |
JP (1) | JP6796332B2 (ja) |
KR (2) | KR20240001270A (ja) |
CN (1) | CN107709539A (ja) |
SG (1) | SG11201800694QA (ja) |
WO (1) | WO2016208777A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020062009A (ja) * | 2018-10-16 | 2020-04-23 | 東ソー株式会社 | 細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、及びスフェロイドの製造方法 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017131241A1 (ja) | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 細胞塊、細胞構造体及び立体組織体 |
CN108699520A (zh) | 2016-01-29 | 2018-10-23 | 国立研究开发法人国立循环器病研究中心 | 细胞块、细胞结构体以及立体组织体 |
JP6900217B2 (ja) * | 2017-03-27 | 2021-07-07 | 一般財団法人電力中央研究所 | 培養細胞供試体の作製方法 |
CN107522825B (zh) * | 2017-07-27 | 2019-12-27 | 西北工业大学 | 基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器及构筑和使用方法 |
CN108102918B (zh) * | 2018-01-03 | 2020-07-07 | 京东方科技集团股份有限公司 | 一种培养皿装置及细胞膜片的培养方法 |
US20210115378A1 (en) * | 2018-05-09 | 2021-04-22 | Yale University | Compositions and systems for ex vivo cell modulation and methods of use thereof |
JP2020025496A (ja) * | 2018-08-10 | 2020-02-20 | 日本電信電話株式会社 | 細胞培養用基板、製造方法、及び予測方法 |
WO2020040247A1 (ja) * | 2018-08-24 | 2020-02-27 | 日産化学株式会社 | 細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び細胞培養容器 |
EP4008770A4 (en) * | 2019-08-02 | 2023-08-16 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | SCAFFOLDING MATERIAL FOR CELL CULTURES AND CELL CULTURE CONTAINERS |
EP4108761A4 (en) * | 2020-02-21 | 2023-07-19 | Nissan Chemical Corporation | PROCESS FOR MAKING A CELL AGGREGATE |
JPWO2021167042A1 (ja) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | ||
JP7470893B2 (ja) | 2020-03-24 | 2024-04-19 | 東ソー株式会社 | 細胞培養基材、およびその製法 |
US20230257686A1 (en) * | 2020-07-03 | 2023-08-17 | National University Corporation Okayama University | Method for producing cartilage tissue |
CN112625906B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-11-18 | 深圳乐土沃森精准医疗有限公司 | 一种心肌细胞和神经细胞专用培养皿 |
CN113061513A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-02 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种培养装置 |
WO2023041735A1 (en) * | 2021-09-17 | 2023-03-23 | Universidad Del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea | Cellular support for culturing methods |
EP4249584A1 (en) * | 2022-03-22 | 2023-09-27 | Catalya | A polymer assembly for growing cells |
EP4342972A1 (en) * | 2022-09-26 | 2024-03-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Immobilized extracellular vesicles suitable for in vitro assays |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0499932A1 (en) * | 1991-02-16 | 1992-08-26 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Cancer cell cluster comprising cancer cells and normal cells and preparation thereof |
EP1264877B1 (en) * | 2000-03-16 | 2013-10-02 | Cellseed Inc. | Cell cultivation-support material, method of cocultivation of cells and cocultivated cell sheet obtained therefrom |
JP2003310244A (ja) * | 2002-04-19 | 2003-11-05 | Olympus Optical Co Ltd | 培養容器とこれを用いた培養細胞シートの製造方法 |
JP2005333938A (ja) * | 2004-05-31 | 2005-12-08 | Fujitsu Ltd | 細胞固定用部材、細胞固定方法、および細胞固定用部材作製装置 |
EP1873205A1 (en) * | 2006-06-12 | 2008-01-02 | Corning Incorporated | Thermo-responsive blends and uses thereof |
WO2008005520A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Organogenesis Inc. | Temperature-responsive microcarrier |
US9598668B2 (en) * | 2008-10-14 | 2017-03-21 | Cellseed Inc. | Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same |
JPWO2010134606A1 (ja) * | 2009-05-22 | 2012-11-12 | 学校法人東京女子医科大学 | 胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法 |
WO2011016423A1 (ja) * | 2009-08-02 | 2011-02-10 | 学校法人 東京女子医科大学 | 膵島細胞シート、製造方法及びその利用方法 |
WO2011027794A1 (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | 株式会社セルシード | 物質分離用前処理カートリッジ及びそれを利用した前処理方法 |
JP5765763B2 (ja) * | 2011-02-15 | 2015-08-19 | 学校法人近畿大学 | 細胞自動分取装置及び細胞自動分取方法 |
JP2013013368A (ja) * | 2011-07-04 | 2013-01-24 | Dainippon Printing Co Ltd | 治療用細胞フラグメント回収用基材およびそれを用いた治療用細胞フラグメントの製造方法、ならびに、継代用細胞フラグメント回収用基材およびそれを用いた継代用細胞フラグメントの製造方法 |
JP6202621B2 (ja) * | 2011-11-20 | 2017-09-27 | 学校法人東京女子医科大学 | 細胞培養用基材及びその製造方法 |
JP6062733B2 (ja) * | 2012-04-24 | 2017-01-18 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 細胞培養用組成物及び細胞培養器 |
JP2014027918A (ja) * | 2012-04-24 | 2014-02-13 | National Cerebral & Cardiovascular Center | 細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体 |
JP2014027917A (ja) * | 2012-04-24 | 2014-02-13 | National Cerebral & Cardiovascular Center | 細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体 |
JP5746240B2 (ja) * | 2013-02-26 | 2015-07-08 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の製造方法、及び細胞培養器 |
JP2015058298A (ja) * | 2013-09-20 | 2015-03-30 | 独立行政法人国立循環器病研究センター | 移植材料の製造方法、及び該方法により製造された移植材料 |
-
2016
- 2016-06-24 JP JP2017525483A patent/JP6796332B2/ja active Active
- 2016-06-24 SG SG11201800694QA patent/SG11201800694QA/en unknown
- 2016-06-24 US US15/739,832 patent/US20180355296A1/en active Pending
- 2016-06-24 KR KR1020237043731A patent/KR20240001270A/ko active Search and Examination
- 2016-06-24 CN CN201680037645.XA patent/CN107709539A/zh active Pending
- 2016-06-24 EP EP16814544.9A patent/EP3315596A4/en active Pending
- 2016-06-24 WO PCT/JP2016/069565 patent/WO2016208777A1/ja active Application Filing
- 2016-06-24 KR KR1020177037876A patent/KR20180021003A/ko active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020062009A (ja) * | 2018-10-16 | 2020-04-23 | 東ソー株式会社 | 細胞培養基材、細胞培養基材の製造方法、及びスフェロイドの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20240001270A (ko) | 2024-01-03 |
CN107709539A (zh) | 2018-02-16 |
JPWO2016208777A1 (ja) | 2018-04-12 |
EP3315596A4 (en) | 2019-02-13 |
US20180355296A1 (en) | 2018-12-13 |
WO2016208777A1 (ja) | 2016-12-29 |
KR20180021003A (ko) | 2018-02-28 |
EP3315596A1 (en) | 2018-05-02 |
SG11201800694QA (en) | 2018-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6796332B2 (ja) | 細胞培養器、細胞構造体の製造方法 | |
JP5746240B2 (ja) | 温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の製造方法、及び細胞培養器 | |
US20100184182A1 (en) | Method for preparing biological tissue | |
US9469839B2 (en) | Cell culture support and associated method for cell growth and release | |
JP6375358B2 (ja) | 細胞培養用組成物及び細胞培養器 | |
JP6704197B2 (ja) | 細胞構造体の製造方法 | |
JP2010161953A (ja) | 生体組織の作製方法 | |
JP2021503958A (ja) | 細胞拡大のための生体活性3d封入培養系 | |
US20190040359A1 (en) | Cell mass, cell structure, and three-dimensional tissue body | |
JP6800436B2 (ja) | 細胞構造体の製造方法、細胞構造体、細胞培養器 | |
WO2017131241A1 (ja) | 細胞塊、細胞構造体及び立体組織体 | |
JP2017079714A (ja) | 細胞培養器及び細胞培養器の製造方法 | |
WO2021149661A1 (ja) | 立体的細胞構造体の製造方法 | |
JP2014027918A (ja) | 細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体 | |
JP2017014324A (ja) | 温度応答性ポリマーの製造方法、温度応答性ポリマー、細胞培養器の製造方法、細胞培養器 | |
JP2017012019A (ja) | 細胞構造体の製造方法、細胞構造体 | |
JP2017163912A (ja) | 細胞構造体の製造方法 | |
JP2017104089A (ja) | 細胞構造体の製造方法 | |
JP2017131198A (ja) | 軟骨細胞塊及び移植材料の製造方法、軟骨細胞塊及び移植材料並びに複合材 | |
JP2017055744A (ja) | カプセル化細胞構造体の製造方法、及びカプセル化細胞構造体 | |
JP6780816B2 (ja) | 上皮系細胞の培養方法、細胞構造体の製造方法、及び上皮系細胞用細胞培養器 | |
JP2017169552A (ja) | 立体組織体の作製装置、及び立体組織体の作製方法 | |
JP6755010B2 (ja) | 細胞培養器の製造方法 | |
JP2017055743A (ja) | 管状細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造される管状細胞構造体 | |
JP2017163911A (ja) | 細胞構造体の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171222 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190508 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200526 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200708 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201020 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201109 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6796332 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |