JP2003310244A - 培養容器とこれを用いた培養細胞シートの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 所望の大きさおよび形状を有する培養細胞シ
ートを、簡易に、非侵襲的に製造する。 【解決手段】 温度に関わらず親水性を呈する親水性領
域３と、所定の境界温度を境にして親水性と疎水性とを
切り替え可能な温度応答性領域４とを底面２に備える培
養容器１を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、培養容器とこれ
を用いた培養細胞シートの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より市販されている培養容器は、そ
の温度に関わらず、全体が弱い疎水性を呈しており、様
々な細胞を培養することができる。すなわち、例えば、
人体から抽出した細胞を適当な培養液とともに培養容器
内で培養すると、細胞が培養容器の底面に付着して成長
していく。そして、このようにして培養された培養細胞
を、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を使用
して、培養容器の底面から剥離させることにより、培養
した細胞のシート（以下、培養細胞シートという。）が
得られる。

【０００３】このようにして得られた培養細胞シート
は、医師が、外傷や火傷等により生じた欠損部を修復す
る際に、当該欠損部の大きさに合わせて適宜切断し、欠
損部に適用されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、培養容
器の底面において増殖した培養細胞からなる培養細胞シ
ートは、細胞どうしが相互に緊密に結びついているの
で、これを切断しようとすると、切れ目に配置されてい
る細胞が損傷してしまう不都合が考えられる。特に、培
養細胞シートを適用しようとする欠損部が小さい症例の
場合には、切断箇所が増えるため、多数の細胞が損傷し
死滅することになる。

【０００５】これを回避するためには、複数の培養容器
に非常に少量ずつの細胞を培養する方法が考えられる
が、培養作業が複雑になるとともに、全ての細胞につい
て同一条件にて培養することが困難である。このため、
例えば、細菌感染検査を全ての培養容器について行わな
ければならない等の不都合が考えられる。

【０００６】この発明は、上述した事情に鑑みてなされ
たものであって、所望の大きさおよび形状を有する培養
細胞シートを、簡易に、かつ、非侵襲的に製造すること
ができる培養容器およびこれを利用した培養細胞シート
の製造方法を提供することを目的としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、この発明は、以下の手段を提供する。請求項１に係
る発明は、温度に関わらず親水性を呈する親水性領域
と、所定の境界温度を境にして親水性と疎水性とを切り
替え可能な温度応答性領域とを内面に備える培養容器を
提供する。

【０００８】培養容器の底面において増殖する間葉系幹
細胞は疎水性を有する領域に付着し、親水性を有する領
域には付着することがない。したがって、この発明によ
れば、例えば、培養容器の温度を所定の境界温度以上に
調節して温度応答性領域を疎水性を呈する状態として間
葉系幹細胞の培養を行うことにより、温度応答性領域の
みにおいて培養細胞シートを製造することが可能とな
る。そして、培養容器の温度を所定の境界温度以下に調
節して温度応答性領域を親水性を呈する状態とすること
により、製造された培養細胞シートを培養容器から非侵
襲的に回収することが可能となる。したがって、温度応
答性領域の形状および大きさを適宜設定しておくことに
より、所望の大きさまたは形状の培養細胞シートを、細
胞に損傷を与えることなく得ることができる。

【０００９】請求項２に係る発明は、請求項１に記載の
培養容器において、前記温度応答性領域の周囲に前記親
水性領域が配置されている培養容器を提供する。この発
明によれば、請求項１に係る発明と同様に、温度応答性
領域のみにおいて培養細胞シートが製造される。この場
合において、培養容器内に疎水性を呈する表面領域が存
在していても、温度応答性領域において製造された培養
細胞シートは、その周囲に配されている親水性領域によ
り、培養容器の内面に付着しないように保持されるの
で、温度を境界温度以下に調節することにより、非侵襲
的に回収されることになる。

【００１０】請求項３に係る発明は、請求項１に記載の
培養容器において、親水性を呈する底面に、部分的に、
温度応答性領域を形成した培養容器を提供する。この発
明によれば、全体的に親水性を呈する底面を備えた培養
容器の底面に、温度応答性領域を部分的に形成すること
により、請求項１に係る発明と同様の作用を備えた培養
容器を簡易に製造することができる。

【００１１】請求項４に係る発明は、請求項１から請求
項３のいずれかに記載の培養容器において、前記温度応
答性領域が、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピル
アクリルアミド）を共有結合で固定することにより形成
されている培養容器を提供する。この発明によれば、温
度応答性領域を簡易に形成することが可能となる。

【００１２】請求項５に係る発明は、請求項１から請求
項４のいずれかに記載の培養容器において、複数の温度
応答性領域を親水性領域によって区画した培養容器を提
供する。この発明によれば、複数の温度応答性領域が親
水性領域によって区画されているので、温度応答性領域
に応じた大きさの複数の培養細胞シートを同一培養条件
下で簡易に製造することが可能となる。

【００１３】請求項６に係る発明は、請求項５に記載の
培養容器において、前記温度応答性領域が、骨補填材の
表面形状に合わせて形成されている培養容器を提供す
る。この発明によれば、骨補填材の表面形状に合わせた
培養細胞シートを簡易に得ることが可能となる。骨補填
材の表面とは、骨補填材が多面体である場合には、各外
面を言う他、骨補填材に貫通穴等が設けられている場合
には、当該貫通穴内面をも言うものとする。

【００１４】請求項７に係る発明は、請求項１から請求
項６のいずれかに記載の培養容器を用いて、境界温度よ
り高い所定の培養温度で細胞を培養し、前記培養容器を
境界温度より低い剥離温度まで冷却して剥離する培養細
胞シートの製造方法を提供する。この発明によれば、所
望の形状および大きさの培養細胞シートを非侵襲的に回
収することが可能となる。

【００１５】

【発明の実施の形態】この発明の第１の実施形態に係る
培養容器とこれを用いた培養細胞シートの製造方法につ
いて、図面を参照して以下に説明する。本実施形態に係
る培養容器は、図１に示されるように、所定量の培養液
を貯留可能な容積を有する培養容器１であって、その底
面２に、親水性領域３と、温度応答性領域４とを備えて
いる。

【００１６】前記親水性領域３は、例えば、培養容器１
の材質を超親水処理を施したガラスやプラスチックとし
て、培養容器１の表面全体が温度に関わらず親水性を呈
するようにすることにより構成されている。超親水処理
は、例えば、酸化チタン光触媒製の薄膜表面に紫外線を
照射することにより行われる。また前記温度応答性領域
４は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド）を共有結合で固定することにより形成されて
いる。このような温度応答性領域４は、３２℃を境界温
度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程
度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却
することにより高い親水性を呈するようになる領域であ
る。

【００１７】温度応答性領域４は、製造する培養細胞シ
ート５の形状に合わせて形成されている。図１に示す例
は、図２に示すように、立方体状の骨補填材６の各面に
貼り付ける正方形状の培養細胞シート５が必要な場合の
例であり、温度応答性領域４をその正方形と同一形状の
正方形状に形成する。また、立方体状の骨補填材６の全
ての面に貼り付けるため、６枚の培養細胞シート５を製
造するように、６カ所の正方形状の温度応答性領域４が
設けられている。さらに、これら温度応答性領域４は、
相互に間隔をあけて配置されている。

【００１８】このように構成された本実施形態に係る培
養容器１の作用について、以下に説明する。本実施形態
に係る培養容器１を用いて培養細胞シート５を製造する
には、例えば、骨髄細胞を適当な培養液とともに培養容
器１内に入れ、ヒトの体温と同等の温度、例えば、３７
℃に保持して培養を行う。

【００１９】温度３７℃では、境界温度３２℃より高い
ので、温度応答性領域４は、高い疎水性を呈している。
一方、温度応答性領域５以外の親水性領域３では、親水
性を呈している。培養液中の骨髄細胞の内、間葉系幹細
胞は、市販の培養容器の場合には、底面全体が疎水性を
有するために、底面の全体に接着して伸展し、増殖する
が、本実施形態に係る培養容器１では、親水性を呈する
親水性領域３には接着することができない。

【００２０】したがって、間葉系幹細胞は、疎水性を呈
している温度応答性領域４のみに選択的に接着し、伸展
し、増殖する。温度応答性領域４は、製造されるべき培
養細胞シート５の形状および大きさに合わせて形成され
ているので、製造された培養細胞シート５は、培養容器
から剥離された時点で所望の形状および大きさを有して
いることになる。また、温度応答性領域４は、相互に間
隔をあけて配置され、各温度応答性領域４の間には、親
水性領域３が配置されているので、各温度応答性領域４
に付着して製造された培養細胞シート５どうしが連結す
ることなく、それぞれ独立して構成される。

【００２１】そして、培養細胞シート５が充分に増殖し
た後に培養容器１の温度を３０℃程度まで冷却する。こ
れにより、培養容器１の温度は、境界温度３２℃より低
くなるために、温度応答性領域４の性質が疎水性から親
水性へと変化し、該温度応答性領域４に付着していた培
養細胞シート５が剥がれて回収される。

【００２２】このように、本実施形態に係る培養容器１
によれば、培養後に温度を境界温度以下に下げる冷却行
程を行うだけで、所望の大きさおよび形状の培養細胞シ
ート５を得ることができる。この場合に、トリプシンな
どの蛋白質分解酵素を使用しないので、培養容器１から
剥離する際に細胞が損傷を受けることがないとともに、
培養容器１から剥離した時点で、既に所望の大きさや形
状に形成されているので、骨補填材や骨欠損部の大き
さ、形状に合わせて切断する作業を排除することができ
る。したがって、切断による細胞の損傷をもなくするこ
とができる。

【００２３】さらに、培養容器１の底面２に隔壁などの
物理的な障壁を配置することなく、複数の培養細胞シー
ト５を独立して同時に製造することができる。したがっ
て、培養液を含む培養条件を全く同一にして、複数の培
養細胞シート５を製造することができる。このため、培
養温度や、培養液の組成、あるいは、細菌の感染の有無
等について、一括して検査・管理することができ、培養
作業を簡易なものとすることができるという効果があ
る。

【００２４】また、間葉系幹細胞は、培養の間に、細胞
外マトリックスを合成・分泌・沈着する。細胞外マトリ
ックスは、培養容器１の底面２と間葉系幹細胞の層との
間に配置されており、培養容器を冷却することにより剥
離される単層の培養細胞シート５とともに、培養細胞シ
ート５の表面に配されている細胞外マトリックスも培養
容器１から剥離されて回収される。したがって、該細胞
外マトリックスを接着剤として他の部材に貼り付けるこ
とが可能なシール状の培養細胞シート５を製造すること
ができる。

【００２５】なお、本発明に係る培養容器１は、上記実
施形態に限定されるものではない。すなわち、立方体状
の骨補填材の各面に貼り付ける複数の正方形状の培養細
胞シート５を製造するように形成した温度応答性領域４
の形状および配置に代えて、図３に示されるように、立
方体状の骨補填材６の全面に貼り付けるように、この立
方体を展開した形状の温度応答性領域７を設けておくこ
とにしてもよい。このようにして構成された培養細胞シ
ート８は、図４に示されるように、骨補填材６の全面を
包むように折り曲げられて、骨補填材６の外面を被覆す
ることができる。

【００２６】また、培養骨を構成するための骨補填材６
が比較的大きな場合には、骨補填材６の内部にまで骨芽
細胞が成長するのに時間がかかるので、図５に示される
ように、骨補填材６に貫通穴９を設けておき、その貫通
穴９内面に培養細胞シート１０を貼り付けることができ
るように、培養細胞シート１０の大きさおよび形状を形
成してもよい。

【００２７】また、柱状の骨補填材６に貼り付ける培養
細胞シート１１ａ，１１ｂを製造する培養容器１２とし
ては、図６に示されるように、培養容器１２の底面１２
ａに、柱状の骨補填材６の端面に貼り付ける培養細胞シ
ート１１ａを製造する温度応答性領域１３ａを設け、培
養容器１２の内側面１２ｂに、骨補填材の周囲に巻き付
けるように貼り付ける培養細胞シート１１ｂを製造する
ための温度応答性領域１３ｂを設けることにしてもよ
い。他の領域は親水性領域１４である。このようにして
構成された培養細胞シート１１ａ，１１ｂは、図７に示
されるように、骨補填材６の全面を包むようにして骨補
填材６の外面を被覆することができる。

【００２８】また、この発明は、上記各実施形態におけ
るようなシャーレ状の培養容器１，１２のみならず、図
８に示されるようなフラスコ状の培養容器１５にも適用
することができる。図中、符号１６は温度応答性領域、
符号１７は親水性領域を示している。さらに、表面全体
が親水性を呈する培養容器の内面に温度応答性領域を部
分的に形成する場合の他、内面全体を温度応答性領域と
した後に、部分的に親水性領域を形成することにしても
よい。なお、温度応答性領域の面積を充分に小さく設定
しておいて、多数の細かい培養細胞シートを製造し、骨
補填材と混ぜ合わせて培養することにより、培養骨を製
造することにしてもよい。

【００２９】また、表面全体を親水性とする代わりに、
表面全体を疎水性を呈する培養容器（例えば、ガラスや
プラスチック製）を使用してもよい。この場合は、通常
のガラスやプラスチック製の容器の一部に、温度応答性
領域およびその周囲の親水性領域を設けるだけなので容
器を安価に構成することができる。

【００３０】

【発明の効果】以上説明したように、この発明に係る培
養容器とこれを用いた培養細胞シートの製造方法によれ
ば、温度応答性領域の形状および大きさの設定により、
所望の大きさまたは形状の培養細胞シートを得ることが
できるので、骨欠損部の形状に合わせて切断する必要が
なく、健全な間葉系幹細胞を骨欠損部に適用することが
できるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 この発明の一実施形態に係る培養容器を示
す斜視図である。

【図２】 図１の培養容器で製造された培養細胞シー
トの骨補填材表面への適用を説明する斜視図である。

【図３】 この発明の他の実施形態に係る培養容器を
示す斜視図である。

【図４】 図３の培養容器で製造された培養細胞シー
トの骨補填材表面への適用を説明する斜視図である。

【図５】 製造された培養細胞シートの骨補填材内面
への適用を説明する斜視図である。

【図６】 この発明の他の実施形態に係る培養容器を
示す斜視図である。

【図７】 図６の培養容器で製造された培養細胞シー
トの骨補填材表面への適用を説明する斜視図である。

【図８】 この発明の他の実施形態に係る培養容器を
示す縦断面図である。

【符号の説明】

１，１２，１５ 培養容器 ２ 底面 ３、１４，１７ 親水性領域 ４，７，１３ａ，１３ｂ，１６ 温度応答性領域 ５，８，１１ａ，１１ｂ 培養細胞シート ６ 骨補填材

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B029 AA08 AA21 BB11 CC02 CC08 GA01 GA08 GB05 GB09 GB10 4B065 AA90X BC03 BC41 BD50 CA43 CA44 4C081 AA12 AB04 BA12 BA13 CD34 DC03 EA11 EA12

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 温度に関わらず親水性を呈する親水性
   領域と、所定の境界温度を境にして親水性と疎水性とを
   切り替え可能な温度応答性領域とを内面に備える培養容
   器。
2. 【請求項２】 前記温度応答性領域の周囲に前記親水
   性領域が配置されている請求項１に記載の培養容器。
3. 【請求項３】 親水性を呈する内面に、部分的に、温
   度応答性領域を形成した請求項１に記載の培養容器。
4. 【請求項４】 前記温度応答性領域が、温度応答性高
   分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結
   合で固定することにより形成されている請求項１から請
   求項３のいずれかに記載の培養容器。
5. 【請求項５】 複数の温度応答性領域を親水性領域に
   よって区画した請求項１から請求項４のいずれかに記載
   の培養容器。
6. 【請求項６】 前記温度応答性領域が、骨補填材の表
   面形状に合わせて形成されている請求項５に記載の培養
   容器。
7. 【請求項７】 請求項１から請求項６のいずれかに記
   載の培養容器を用いて、境界温度より高い所定の培養温
   度で細胞を培養し、 前記培養容器を境界温度より低い剥離温度まで冷却して
   剥離する培養細胞シートの製造方法。