JP2005278449A - 細胞の搬送方法および培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 搬送中も細胞の健全性を維持しつつ細胞の成長を促進して培養効率を向上する。
【解決手段】 搬送容器１内に収容した接着性の細胞を含む液体Ａ内に、該細胞が付着可能な、生体親和性を有する基材２を投入するとともに、細胞と容器内壁１ａとを相対的に移動させつつ搬送する細胞の搬送方法を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、細胞の搬送方法および培養方法に関するものである。

間葉系幹細胞等の幹細胞は、様々な組織に分化でき、その組織を再生することができる細胞として知られている。間葉系幹細胞は骨髄液に多く含まれている。しかしながら、骨髄液から採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であり、組織の再生に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには、骨髄液を培養することにより増殖させる必要がある。

間葉系幹細胞は、病院等の医療機関において患者から採取された骨髄液を、所定の搬送容器に封入した状態で培養設備を有する培養機関に搬送し、そこで、所定の培養条件下に配することにより、必要な細胞数まで培養することが考えられる。培養機関においては、搬送されてきた骨髄液は、シャーレのような平坦な培養容器上に播種されて、適当な培地内において培養される。

骨髄液内の間葉系幹細胞は、培養容器の底面に付着して増殖する性質を有している。したがって、培地交換によって造血系の細胞を廃棄することにより、培養容器の底面に付着して増殖した間葉系幹細胞のみを抽出することが可能となる。（例えば、非特許文献１参照。）。
吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３

しかしながら、上述したように、間葉系幹細胞は、培養容器の内壁等に付着しなければ増殖しないため、何物にも付着しない状態にあるとき、例えば、搬送容器内に配置されている場合においては、成長は停止させられていることになる。この場合、搬送容器の内壁に付着させれば、搬送中も細胞の成長を促すことが可能となるが、搬送に際して搬送容器の内壁に細胞を付着させてしまうと、培養機関における培養容器への移し替え作業に手間がかかり、搬送後速やかに培養工程に移行できないという不都合が考えられる。また、搬送容器の内壁から剥離させるために、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いることが必要となるが、トリプシン等を使用すると、間葉系幹細胞の細胞膜を損傷することにもなり好ましくない。

この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、搬送中も細胞の健全性を維持しつつ細胞の成長を促進して培養効率を向上することが可能な細胞の搬送方法および培養方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、搬送容器内に収容した接着性の細胞を含む液体内に、該細胞が付着可能な、生体親和性を有する基材を投入するとともに、細胞と容器内壁とを相対的に移動させつつ搬送する細胞の搬送方法を提供する。

この発明によれば、搬送容器内に収容した接着性の細胞を含む液体内の細胞と容器内壁とが相対的に移動させられるので、細胞が搬送容器の内壁に付着しないように維持されつつ搬送される。この場合に、搬送容器内に収容されている液体内には、細胞が付着可能な基材が投入されているので、液体内に浮遊する細胞は、基材に付着して成長を促される。基材は生体親和性を有する物質により構成されているので、搬送後は、そのまま培養容器に投入して培養することができる。すなわち、細胞は搬送中においても成長を促進されており、培養容器に投入されて培養を開始される際には、既にある程度増殖した状態となっているので、必要な細胞数に達するまでの時間を短縮することができる。また、細胞は搬送容器内壁に付着しないように維持されているので、培養容器への投入も速やかにかつ細胞の健全性を維持しつつ行うことができる。

また、上記発明においては、前記基材を前記液体と同等の比重を有する物質により構成し、細胞とともに液体内に浮遊させることが好ましい。
この発明によれば、液体内に投入された基材は、搬送容器内の液面に浮いたり、底面に沈んだりすることなく、液体内を浮遊させられることになる。付着性の細胞も液体内において浮遊状態に維持されているので、基材とともに浮遊させられる内に、基材に付着するようになる。すなわち、本発明によれば、細胞が基材と接触する機会が増加され、基材への効率的な付着によって迅速に成長を開始することができる。

また、上記発明においては、前記基材が、該基材を貫通させて前記液体を流通可能な形態を有し、前記細胞を含む液体を前記基材を介して流通させることにしてもよい。
この発明によれば、細胞を含む液体を基材を介して流通させることにより、基材に効率的に細胞を付着させることができる。

また、上記発明においては、前記基材が網状部材からなることとしてもよい。
この発明によれば、細胞を容器内壁から浮遊した状態に維持すると、搬送される間に、網状部材の網目を通過するように流動させられる。これにより、細胞が網状部材に付着して成長を促進されることになる。

さらに、上記発明においては、前記基材が複数の繊維状部材からなることとしてもよい。複数の繊維状部材によっても、網状部材と同様に、細胞が繊維状部材間を流動するように浮遊する間に繊維状部材に付着して成長を開始することになる。
また、前記基材がマイクロキャリアからなることとしても同様である。

また、上記発明においては、搬送容器を略水平な軸線回りに回転させることにより、細胞と容器内壁とを相対的に移動させることとしてもよい。
このようにすることで、搬送容器の容器内壁と細胞とが、同じ場所で接触状態に維持されることがなく、細胞の容器内壁への接着を防止することができる。これにより、搬送後の培養容器への移し替え時に、搬送容器からの細胞の剥離作業を行うことなく、速やかに移し替えることができる。
同様に、前記搬送容器内の液体を攪拌することにより、細胞と容器内壁とを相対的に移動させることとしてもよい。

さらに、本発明は、培養容器内の底面より高い位置に、赤血球より大きな貫通孔を有する多孔性部材を配置し、上記細胞の搬送方法により搬送された細胞を前記多孔性部材上に投入して培養する細胞の培養方法を提供する。
この発明によれば、細胞を含む液体を搬送容器から培養容器に移し替えるときに、細胞を含む液体を多孔性部材上に投入すると、液体内部に含有されている赤血球が多孔性部材の貫通孔を貫通して培養容器の底面側に下降する。一方、細胞は基材に付着して成長しているので、貫通孔を通過しにくく、多孔性部材に付着する。多孔性部材の貫通孔を通して赤血球が底面側に下降しているので、細胞は、赤血球に阻害されることなく多孔性部材の上面に接着して成長する。また、多孔性部材に付着した細胞は、搬送中に既に基材に付着して成長を開始していたので、速やかに成長を継続して効率的に増殖することができる。

本発明によれば、搬送中においても細胞の成長を促進することにより、培養容器に投入されて培養を開始される際には、既にある程度増殖した状態とすることができ、必要な細胞数に達するまでの時間を短縮することができるという効果を奏する。

この発明の一実施形態に係る細胞の搬送方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞の搬送方法は、病院等の医療機関において患者から採取された骨髄液Ａを、培養機関へ搬送するための方法であって、図１に示されるように、採取された骨髄液Ａを収容する搬送容器１内に、基材２を投入するとともに、搬送容器１内において、細胞が容器内壁１ａに付着しないように保持しつつ搬送するものである。

搬送容器１としては、例えば、図１に示す例では、遠沈管状の円筒容器の開口部を蓋体１ｂによって密閉状態に閉鎖したものが挙げられる。
基材２としては、例えば、ポリスチレンや脂質のような材質からなり、粒径１０〜３００μｍ程度のものが好ましい。このような材質からなる基材２は、骨髄液Ａとほぼ同等の比重を有しているため、骨髄液Ａ中に投入すると、液面に浮くことも沈むこともなく、浮遊状態に維持されるようになっている。
また、この基材２は、生体親和性を有しており、培養後に生体内に細胞とともに移植することが可能な材料である。また、この基材２は、細胞を付着させるのに適した表面状態を有している。

骨髄液Ａに含まれる間葉系幹細胞等の付着性の細胞を容器内壁１ａに付着させないように保持する方法として、第１に搬送容器１の容器内壁１ａに親水性処理を施す。親水性処理を施すことにより、容器内壁１ａと細胞との間に水分が進入し、細胞の容器内壁１ａへの接着を阻害するようになっている。親水性処理は、例えば、酸化チタン光触媒製の薄膜を容器内壁１ａに被覆状態に設け、その表面に紫外線を照射することにより行われる。
また、細胞を容器内壁１ａに付着させないように保持する方法として、第２に、図２に示されるように、搬送容器１自体を、その中心軸線Ｂが略水平になるように配置するとともに、その中心軸線Ｂ回りに低速で回転させる方法が挙げられる。図中、符号３は、搬送容器１を載置して同一方向に同期回転させられるローラである。

このようにすることで、細胞は容器内壁１ａに接触状態に維持されることがなく、搬送容器１に収容されている骨髄液Ａ内において浮遊させられることになる。
骨髄液Ａ内には、上述した基材２が同様に浮遊させられているので、細胞は基材２と接触する機会が多く、また、一旦接触すると基材２の表面に付着してその成長を開始することになる。なお、搬送容器１は、搬送時には、図示しない恒温容器内に配置されて、所定の培養条件、例えば、温度３７℃に維持し、搬送容器１内部をＣＯ_２濃度５％に維持されるようになっている。

すなわち、本実施形態に係る細胞の搬送方法によれば、搬送中に、細胞を基材２に付着させて成長を開始させることができるので、培養機関に搬入されて培養容器に移し替えられるときには、細胞を既にある程度成長させた状態とすることができる。したがって、搬送後に行われる培養行程において、必要な細胞数となるまでの培養時間を短縮することができるとともに、ある程度成長された状態から細胞を効率的に成長させることができる。

また、本実施形態に係る細胞の搬送方法によれば、搬送中に細胞が搬送容器１の内壁１ａに接着しないように保持されるので、培養容器への移し替えを速やかに行うことができるとともに、細胞を搬送容器１から剥離させる作業が不要となり、細胞に損傷を与えることなく健全な状態で培養容器へ移動させることができる。

なお、本実施形態に係る搬送方法においては、基材２として、一般的なマイクロキャリアを採用してもよい。マイクロキャリアは、付着性細胞を付着・増殖させるための微小粒子であり、直径約１００〜３００μm、表面積約３０００〜６０００ｃｍ^２／ｇの球状粒子である。材質は、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゼラチン、ポリスチレン等の生体適合性材料である。これらのマイクロキャリアの表面には、細胞が付着しやすいように荷電基や細胞が接触しやすいタンパク等のコーティングが付与されていることが望ましい。また、マイクロキャリアの比重は、約１．０２〜１．０５である。

また、搬送容器１を略水平な軸線Ｂ回りに回転させることにより、容器内壁１ａと内部の細胞とを相対的に移動させることとしたが、これに代えて、図３に示されるように、搬送容器１内部にファン４を配置し、搬送容器１外部に配置したモータ５等によってファン４を回転させることにより、細胞を含む液体Ａを搬送容器１の内部において流動させることにしてもよい。

また、図４に示されるように、搬送容器１の中心軸線とは異なる略水平な軸線Ｃ回りに揺動させることにしてもよい。
この場合に、揺動させることにより、細胞を含む液体Ａを搬送容器１内部において流動させて、細胞が容器内壁１ａに付着するのを防止するとともに、揺動を停止した静止状態に配することにより、内部に投入されている基材２への細胞の付着を促すようにしてもよい。揺動の停止時間は、タイマーによって予め設定してもよいが、搬送容器１内において細胞および基材２が沈降する状態をカメラ等で検出して画像処理することにより、その都度判断してもよい。図中符号６は、搬送容器１を固定状態に載置する載置台、符号７は、揺動アーム、符号８は揺動アームを回転可能に支持するベースを示している。

次に、本発明の第２の実施形態に係る細胞の搬送方法について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る搬送方法の説明において、上述した第１の実施形態に係る搬送方法の説明と共通する構成要素に同一符号を付して説明を簡略化する。
本実施形態に係る搬送方法は、搬送容器１０内に投入する基材１１と、細胞と容器内壁１０ａとを相対的に移動させる方法とにおいて第１の実施形態に係る搬送方法と相違している。

本実施形態における基材１１は、図５に示されるように、搬送容器１０の高さ方向の途中位置に搬送容器１０の横断面全域にわたって掛け渡される網状部材（以下、網状部材１１という。）により構成されている。網状部材１１は、例えば、ポリスチレンのような生体親和性があり、かつ、細胞を付着させやすい材質により構成されている。
また、本実施形態に係る搬送方法に使用される搬送容器１０は、図５に示されるように、伸縮可能な蛇腹状部分１２を備えている。この搬送容器１０内に細胞を含む液体Ａを収容して、搬送容器１０の蛇腹状部分１２を伸縮させることにより、内部の液体と容器内壁１０ａとが相対的に移動させられるようになっている。

このように構成された搬送容器１０を用いて、細胞を含む液体Ａを搬送するには、搬送容器１０の内部に細胞を含む液体Ａを収容し、その液体Ａ内に網状部材１１を浸漬させた状態で、搬送容器１０の蛇腹状部分１２をゆっくりと伸縮させる。これにより、搬送容器１０内部の液体Ａは容器内壁１０ａに対して相対的に移動させられるので、液体Ａ内部に含有されている細胞が容器内壁１０ａに付着することがなく、液体Ａ内において浮遊させられることになる。そして、液体Ａ内には網状部材１１が配置されているので、液体Ａが移動させられる際にこの網状部材１１を通過させられる。

網状部材００は、細胞を付着させやすい材質により構成されているので、細胞が、網状部材１１を通過する際に網状部材１１の表面に接触すると、これに付着する。網状部材１１に付着した細胞は、搬送中においても成長を開始するので、後に培養容器に移し替えられたときに、速やかに成長を再開することができる。すなわち、搬送容器１０内から細胞の付着した網状部材１１を取り出して培養容器に移し替えるだけでよいので、細胞を搬送容器１０から剥離させる必要がなく、移し替え作業が簡単であるとともに、細胞の健全性を害することがないという利点がある。

次に、本発明の一実施形態に係る細胞の培養方法について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、上記各実施形態に係る搬送方法により搬送されてきた骨髄液と所定の培地との混合液Ｄを、以下の培養容器２０に投入して所定の培養条件下に配するものである。図６は、例えば、第１の実施形態において説明した搬送容器１から移し替える場合について示している。

培養容器２０は、図６に示されるように、シャーレ状の容器本体２１内に、底面より高い位置に配置された網状部材（多孔性部材）２２を備えている。網状部材２２は、赤血球を通過可能にするために、赤血球より大きな網目（貫通孔：図示略）を多数有している。また、網状部材２２は、細胞を付着させやすい材質、例えば、ポリスチレンにより構成されている。

また、培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）またはＭＥＭ(Minimal Essential
Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものである。また、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。

本実施形態に係る培養方法によれば、網状部材２２の上から骨髄液と培地との混合液Ｄを培養容器２０内に投入することにより、混合液Ｄ内に含有されている赤血球が、網状部材２２の網目を通して容器本体２１の底面側に沈降する（矢印Ｘ）一方、基材２に付着して、ある程度成長している細胞Ｅは、網状部材２２の網目を通過することなく、網状部材２２に付着する。細胞Ｅは搬送中に基材２を核としてある程度の大きさの塊となっているので、比較的大きな網目（例えば、直径１０〜２５０μｍ程度）としても網目からこぼれることなく網状部材２２に捕獲されることになる。

すなわち、骨髄液と培地との混合液Ｄ中に含まれていた、赤血球より比重の軽い間葉系幹細胞Ｅは、網状部材２２の網目を通して赤血球から分離されることにより、赤血球によって阻害されることなく網状部材２２に付着することができ、速やかに成長を再開することができる。
その結果、細胞Ｅの増殖スピードを向上して、必要細胞数まで増殖させるのに要する時間を短縮することができるという効果がある。

なお、多孔性部材として網状部材２２を例に挙げて説明したが、これに代えて、相互に絡み合った複数の繊維状部材により構成してもよく、また、複数の孔を有する薄膜により構成してもよい。さらに、図７に示すように、培養容器２１を、底面に複数の凹部２３を有する形態に構成してもよい。この凹部２３の口径を赤血球より大きな寸法に設定しておくことにより、凹部２３内に赤血球を沈降させて（矢印Ｘ）、細胞Ｅから分離させることができる。

また、本発明に係る細胞の搬送方法および培養方法は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された接着性の細胞や、樹立された細胞ラインの搬送および培養に適用することにしてもよい。

この発明の一実施形態に係る細胞の搬送方法に適用する搬送容器を説明する図である。 図１の搬送容器を用いた搬送方法を説明する図である。 図２の搬送方法の変形例を示す図である。 図２の搬送方法の他の変形例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞の搬送方法に適用する搬送容器を説明する図である。 本発明の一実施形態に係る細胞の培養方法を説明する図である。 図６の変形例を示す図である。

符号の説明

Ａ 骨髄液（液体）
Ｂ，Ｃ 軸線
Ｅ 細胞
１，１０ 搬送容器
１ａ，１０ａ 容器内壁
２ 基材
１１ 網状部材（基材）
２１ 培養容器
２２ 網状部材（多孔性部材）

Claims (9)

1. 搬送容器内に収容した接着性の細胞を含む液体内に、該細胞が付着可能な、生体親和性を有する基材を投入するとともに、細胞と容器内壁とを相対的に移動させつつ搬送する細胞の搬送方法。
2. 前記基材を前記液体と同等の比重を有する物質により構成し、細胞とともに液体内に浮遊させる請求項１に記載の細胞の搬送方法。
3. 前記基材が、該基材を貫通させて前記液体を流通可能な形態を有し、前記細胞を含む液体を前記基材を介して流通させる請求項１または請求項２に記載の細胞の搬送方法。
4. 前記基材が網状部材からなる請求項３に記載の細胞の搬送方法。
5. 前記基材が複数の繊維状部材からなる請求項３に記載の細胞の搬送方法。
6. 前記基材がマイクロキャリアからなる請求項１または請求項２に記載の細胞の搬送方法。
7. 搬送容器を略水平な軸線回りに回転させることにより、細胞と容器内壁とを相対的に移動させる請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞の搬送方法。
8. 前記搬送容器内の液体を攪拌することにより、細胞と容器内壁とを相対的に移動させる請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞の搬送方法。
9. 培養容器内の底面より高い位置に、赤血球より大きな貫通孔を有する多孔性部材を配置し、請求項１から請求項８のいずれかに記載の細胞の搬送方法により搬送された細胞を前記多孔性部材上に投入して培養する細胞の培養方法。

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