JPS60232088A - 細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養方法Info
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- JPS60232088A JPS60232088A JP59088345A JP8834584A JPS60232088A JP S60232088 A JPS60232088 A JP S60232088A JP 59088345 A JP59088345 A JP 59088345A JP 8834584 A JP8834584 A JP 8834584A JP S60232088 A JPS60232088 A JP S60232088A
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- liquid medium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/10—Rotating vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Wood Science & Technology (AREA)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は細胞培養方法によび装置に関するものである。
一般に細胞の培養に?いては、培養対象細胞が浮遊増殖
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖が可能な細胞である場合には、その栄養源である
液体培地中に浮遊させることにより培地と接触させるこ
とが、或いは細胞が接着依存性細胞、すなわち液体培地
中に?ける生育?よび増殖において基質に対する接着が
必須の細胞である場合には、適当な基質の表面に当該細
胞を接Nさせた上で液体培地と接触させることが 。
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖が可能な細胞である場合には、その栄養源である
液体培地中に浮遊させることにより培地と接触させるこ
とが、或いは細胞が接着依存性細胞、すなわち液体培地
中に?ける生育?よび増殖において基質に対する接着が
必須の細胞である場合には、適当な基質の表面に当該細
胞を接Nさせた上で液体培地と接触させることが 。
必要でおる。そして接着依存性細胞を接着させる基質と
しては、大きな接着面積全容易に得ることができること
から、最近に8いては小径の担体粒子が用いられるよう
になってさている。
しては、大きな接着面積全容易に得ることができること
から、最近に8いては小径の担体粒子が用いられるよう
になってさている。
而して目的とする細胞の培養全高い効率で実行するため
罠は、培養対象細胞r常に新しい培地と接触させること
が肝要であゃ、そのためには浮遊増殖性細胞または接着
依存性細胞を接着した担体粒子(以下これら全台せて単
に「細胞」ということがるる。)全液体培地中に高い分
散度で分散せしめることが必要である。
罠は、培養対象細胞r常に新しい培地と接触させること
が肝要であゃ、そのためには浮遊増殖性細胞または接着
依存性細胞を接着した担体粒子(以下これら全台せて単
に「細胞」ということがるる。)全液体培地中に高い分
散度で分散せしめることが必要である。
また接着依存性細胞全基質でめる担体粒子に接着させる
際にも、当該細胞が加えられた液体培地中に?いて担体
粒子金高い分散度で分散せしめることができれば、当該
担体粒子の表面が有効に平均して利用されるようになり
、従って結局は高い接着率で接Nを達成することかでさ
て培養効率を高める上で極めて有利である。
際にも、当該細胞が加えられた液体培地中に?いて担体
粒子金高い分散度で分散せしめることができれば、当該
担体粒子の表面が有効に平均して利用されるようになり
、従って結局は高い接着率で接Nを達成することかでさ
て培養効率を高める上で極めて有利である。
従来に8いて、細胞?常に新しい液体培地に接触させる
ための方法としては、液体培地中に細胞t−mえた系を
回転翼によって攪拌する方法が一般的であるが、この方
法は液体培地と細胞とよ、・シ成る混合系に剪断力?加
える方法であるため、回転翼との衝突により或いは大ぎ
な剪断力の作用により培養中の細胞が損傷されることt
回避することができず、従って培養効率が低く、細胞の
種類によってはこの方法を用いることができない場合も
あるという欠点?有する。またこの方法圧よる大量培養
のための大容量の細胞培養装置の場合には、攪拌のため
に大型の攪拌機が必要となシ、従って必然的に剪断力も
大ぎ(なるために培養効率がさらに低下するようになる
という欠点tも有する。
ための方法としては、液体培地中に細胞t−mえた系を
回転翼によって攪拌する方法が一般的であるが、この方
法は液体培地と細胞とよ、・シ成る混合系に剪断力?加
える方法であるため、回転翼との衝突により或いは大ぎ
な剪断力の作用により培養中の細胞が損傷されることt
回避することができず、従って培養効率が低く、細胞の
種類によってはこの方法を用いることができない場合も
あるという欠点?有する。またこの方法圧よる大量培養
のための大容量の細胞培養装置の場合には、攪拌のため
に大型の攪拌機が必要となシ、従って必然的に剪断力も
大ぎ(なるために培養効率がさらに低下するようになる
という欠点tも有する。
このような欠点全解消するために種々の万策が研究され
ているが、上記欠点?本質的に解決する細胞培養方法が
見出されていないのが現状である。
ているが、上記欠点?本質的に解決する細胞培養方法が
見出されていないのが現状である。
本発明は、以上の如き事情に基ぎ鋭意研究を重ねた結果
完成されたものであって、その目的とするところは、t
i体培地と細胞とより成る混合系に本質的に剪断力を与
えることなく、液体培地中に細胞を均一に分散させるこ
とができ、高い効率で細胞の培養紮行なうことのできる
方法8よび装置全提供することにある。
完成されたものであって、その目的とするところは、t
i体培地と細胞とより成る混合系に本質的に剪断力を与
えることなく、液体培地中に細胞を均一に分散させるこ
とができ、高い効率で細胞の培養紮行なうことのできる
方法8よび装置全提供することにある。
本発明方法の特徴とするところは、液体培地8よび接着
依存性細胞全付着してなる被分散粒子もしくに浮遊増殖
性細胞よシ成る混合基金実質的に充満するように充填し
た培養容器全実質上水平な軸の周9に自転するよう回転
せしめて当該混合系を前記培養容器と共に定常的に回転
せしめ、これにより当該混合系内において前記被分散粒
子もしぐは浮遊増殖性細胞を運動せしめ、以って前記被
分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞盆前記液体培地中に分
散せしめる工程全層する点にある。
依存性細胞全付着してなる被分散粒子もしくに浮遊増殖
性細胞よシ成る混合基金実質的に充満するように充填し
た培養容器全実質上水平な軸の周9に自転するよう回転
せしめて当該混合系を前記培養容器と共に定常的に回転
せしめ、これにより当該混合系内において前記被分散粒
子もしぐは浮遊増殖性細胞を運動せしめ、以って前記被
分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞盆前記液体培地中に分
散せしめる工程全層する点にある。
本発明装置の特徴とするところは、軸が実質上水子とな
るように保持された培養容器と、この培養容器tその軸
の周りに自転するように回転せしめる駆動機構と?有し
て成り、前記駆動機構は、前記培養容器内に実質的に充
満するように充填でれた液体培地および接着依存性細胞
t−+f着してなる被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞
より成る混合系全培養容器と共に定常的に回転せしめる
機能を有する点にある。
るように保持された培養容器と、この培養容器tその軸
の周りに自転するように回転せしめる駆動機構と?有し
て成り、前記駆動機構は、前記培養容器内に実質的に充
満するように充填でれた液体培地および接着依存性細胞
t−+f着してなる被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞
より成る混合系全培養容器と共に定常的に回転せしめる
機能を有する点にある。
以下本発明について具体的に説明する。
本発明KMいては、第1図および第2図に示すように5
例えば円筒状の密閉された培養容器l内に、細胞2t−
加えた液体培地3t、培養容器lの内部空間に実質的に
充満されるよう充填し、培養容器lの軸Xvil−実質
上水平に保ってこの軸Xの周りに培養容器1’に一足の
回転速度で自転せしめる。
例えば円筒状の密閉された培養容器l内に、細胞2t−
加えた液体培地3t、培養容器lの内部空間に実質的に
充満されるよう充填し、培養容器lの軸Xvil−実質
上水平に保ってこの軸Xの周りに培養容器1’に一足の
回転速度で自転せしめる。
そして培養容器1vI−自転させることによって、自転
開始直後の初期期間娶経過した後は、内部の液体培地3
と細胞2との混合系が液体培地3の粘性により培養容器
lと共にいわば一体的に機械的な流れのない状態で軸X
の周りに定常的に回転するようにする。
開始直後の初期期間娶経過した後は、内部の液体培地3
と細胞2との混合系が液体培地3の粘性により培養容器
lと共にいわば一体的に機械的な流れのない状態で軸X
の周りに定常的に回転するようにする。
このように培養容器lと共に回転する混合系内に3いて
、細胞2は液体培地3の粘性により液体培地3中の相対
的位置全はとんど変えずに培養容器外に対する存在位#
を変えることとなり、従って細胞2は実質上順次異なる
方向から重力が作用する状態とすることが可能でめ9、
これは細胞2 。
、細胞2は液体培地3の粘性により液体培地3中の相対
的位置全はとんど変えずに培養容器外に対する存在位#
を変えることとなり、従って細胞2は実質上順次異なる
方向から重力が作用する状態とすることが可能でめ9、
これは細胞2 。
0比重8よび大きさ、液体培地3の比重8よび粘性、培
養容器lの回転速度など1ifl宜に選定することによ
って実現することができる。
養容器lの回転速度など1ifl宜に選定することによ
って実現することができる。
斯かる状態において、前記混合系内の細胞2につい1見
ると、1個の細胞2は、第3図に模式的に示すように、
液体培地3内に3いて、相対的に矢印Aに示すような円
運動’t−’J″ることとなり、この運動力により細胞
2が液体培地3内において均−忙分散するようになるも
のと推考される。この分散は、条件にもよるが極めて速
やかに生ずるものであり、細胞2Fs:軸X方向にも均
一に分散するようになるため、極めて高い分散度で細胞
2?液体培地3内に分散せしめることができる。この軸
X方向の分散は、その理由は十分に解明されていないが
、液体培地3内に拡散するよう動く対流が生ずるからで
らるとも推考され、更に、これKは回転開始直後の初期
期間に8ける細胞2の軸X方向に3ける分布状態の熱力
学的不均一さが関与しているとも推−+gれる。
ると、1個の細胞2は、第3図に模式的に示すように、
液体培地3内に3いて、相対的に矢印Aに示すような円
運動’t−’J″ることとなり、この運動力により細胞
2が液体培地3内において均−忙分散するようになるも
のと推考される。この分散は、条件にもよるが極めて速
やかに生ずるものであり、細胞2Fs:軸X方向にも均
一に分散するようになるため、極めて高い分散度で細胞
2?液体培地3内に分散せしめることができる。この軸
X方向の分散は、その理由は十分に解明されていないが
、液体培地3内に拡散するよう動く対流が生ずるからで
らるとも推考され、更に、これKは回転開始直後の初期
期間に8ける細胞2の軸X方向に3ける分布状態の熱力
学的不均一さが関与しているとも推−+gれる。
本発明に?いて、培養容器の自転の軸が実質上水平なも
のであることt必要とする理由は、軸が水平に対して角
度金石すると培養容器内で液体培地中の細胞が均一に分
散しな(なるためである。
のであることt必要とする理由は、軸が水平に対して角
度金石すると培養容器内で液体培地中の細胞が均一に分
散しな(なるためである。
ここに3いて、軸が実質的に水平であるとして許容され
る軸の傾きは、培養容器の形状によって異なる場合がめ
るが、例えば水平に対して5程度までの傾きは実質上水
平であるとして許容することができ、好1しくは水平に
対して3°以内の傾きである。
る軸の傾きは、培養容器の形状によって異なる場合がめ
るが、例えば水平に対して5程度までの傾きは実質上水
平であるとして許容することができ、好1しくは水平に
対して3°以内の傾きである。
何れにせよ、本発明は以上のように、液体培地?相対的
に攪乱させることなく、液体培地の内部に8いて細胞を
運動させて均一に分散させるようにしているため、常に
細胞を新しい液体培地と接触せしめることができて所要
の培養音高い効率で達成することができ、細胞には剪断
力や大きな衝撃全作うような力が作用することがな(、
従って細胞が損傷されるようなことがないので、そのよ
うな損傷全党は易い弱い細胞であってもこれt十分に培
養することができる。
に攪乱させることなく、液体培地の内部に8いて細胞を
運動させて均一に分散させるようにしているため、常に
細胞を新しい液体培地と接触せしめることができて所要
の培養音高い効率で達成することができ、細胞には剪断
力や大きな衝撃全作うような力が作用することがな(、
従って細胞が損傷されるようなことがないので、そのよ
うな損傷全党は易い弱い細胞であってもこれt十分に培
養することができる。
な8本発明において、培養容器に液体培地と細胞とを充
填するためには特殊な方法全必要とするものではなく、
事前に混合された液体培地と細胞を充填すればよい。し
かし接着依存性細胞の場合には、事前に接着依存性細胞
?接着した担体粒子全培養容器に充填するよりも、担体
粒子に接着依存性細胞を接着させる工程についても本発
明に8ける培養容器音用いて同様の操作により、液体培
地中に担体粒子および接着依存性細胞?剪断力を与える
ことなく均一に分散させることによって、担体粒子の表
面に対して細胞を各担体粒子に?いて平均にかつ効率的
に接着させることが望ましく、この場合社この接着工程
に引き続き本発明?実施することができる。
填するためには特殊な方法全必要とするものではなく、
事前に混合された液体培地と細胞を充填すればよい。し
かし接着依存性細胞の場合には、事前に接着依存性細胞
?接着した担体粒子全培養容器に充填するよりも、担体
粒子に接着依存性細胞を接着させる工程についても本発
明に8ける培養容器音用いて同様の操作により、液体培
地中に担体粒子および接着依存性細胞?剪断力を与える
ことなく均一に分散させることによって、担体粒子の表
面に対して細胞を各担体粒子に?いて平均にかつ効率的
に接着させることが望ましく、この場合社この接着工程
に引き続き本発明?実施することができる。
細胞?培養する場合には、液体培地の交換が必要となる
。本発明に8いても長期間にわたる培養に2いては、液
体培地の交換が必要である。液体培地の交換方法として
は1例えば培養容器の回転を止めて液体培地の一部また
は全部會交換する方法、培養容器に液体培地の供給管8
よび排田管金設置し、培養中に連続的に新しい液体培地
3内給すると共に古い液体培地3内田する方法會挙げる
ことができる。このようにして新しい液体培坤葡供給す
ることによつ℃、通常数日以上の時間音必要とする培養
全十分に行なうことができる。新しい液体培地の供給は
、これt上記のように供給管を通じて常時行なうように
すれば、単位時間当りの供給量8よび排出量は僅かでよ
いから、培養容器内の液体に層流、乱流なとの機械的な
流れt実質土庄せしめない状態とすることが可能でアリ
、これによって、細胞の所期の分散に妨げることが防止
される。培養効率?高めるためにも、液体培地の供給會
供給管音道じて常時行うことが好ましい。
。本発明に8いても長期間にわたる培養に2いては、液
体培地の交換が必要である。液体培地の交換方法として
は1例えば培養容器の回転を止めて液体培地の一部また
は全部會交換する方法、培養容器に液体培地の供給管8
よび排田管金設置し、培養中に連続的に新しい液体培地
3内給すると共に古い液体培地3内田する方法會挙げる
ことができる。このようにして新しい液体培坤葡供給す
ることによつ℃、通常数日以上の時間音必要とする培養
全十分に行なうことができる。新しい液体培地の供給は
、これt上記のように供給管を通じて常時行なうように
すれば、単位時間当りの供給量8よび排出量は僅かでよ
いから、培養容器内の液体に層流、乱流なとの機械的な
流れt実質土庄せしめない状態とすることが可能でアリ
、これによって、細胞の所期の分散に妨げることが防止
される。培養効率?高めるためにも、液体培地の供給會
供給管音道じて常時行うことが好ましい。
また本発明によシ接着依存性細胞を培養する場合に、供
給管を通じて常時培養容器に液体培地?供給し、排出管
音道して常時排出する方法を適用するときに、供給する
液体培地と共に担体粒子8よび接着依存性細胞全培養容
器に供給し、培養容器から排出する液体培地と共に増殖
した接着依存性細胞會そり表面に接着している担体粒子
の一部全抜出す方法音用いれば、液体培地の交換、担体
粒子への接着依存性細胞の接着、培養εよび増殖した接
着依存性細胞の抜出し?連続的に行うことができる。
給管を通じて常時培養容器に液体培地?供給し、排出管
音道して常時排出する方法を適用するときに、供給する
液体培地と共に担体粒子8よび接着依存性細胞全培養容
器に供給し、培養容器から排出する液体培地と共に増殖
した接着依存性細胞會そり表面に接着している担体粒子
の一部全抜出す方法音用いれば、液体培地の交換、担体
粒子への接着依存性細胞の接着、培養εよび増殖した接
着依存性細胞の抜出し?連続的に行うことができる。
本発明の適用に8いては、培養されるべき細胞は何ら制
限されるものではな(、浮遊増殖性細胞としでは、例え
ばリンノぞ球、リンノぞ芽球、パーキットクン・ぐ腫、
急性リンJR芽球性白血病細胞、骨髄腫などのミエロー
マ細胞またはこれらによるハイプリドーマ細胞上、また
接着依存性細胞上しては、ヒト子宮ガン細胞HeLa
、チャイニーズ−ハムスター肺細胞V −79、ヒト胎
児肺細胞MRC−5゜チノパンツー肝繊維芽細胞、ヒト
包皮細胞、ニワトリ、胎児繊維芽細胞、初代サル腎細胞
、マウス転移繊維芽細胞、脳下i体腫瘍細胞、アフリカ
ミドリザル腎細胞■erO2副腎腫瘍細胞など上挙げる
ことができる。
限されるものではな(、浮遊増殖性細胞としでは、例え
ばリンノぞ球、リンノぞ芽球、パーキットクン・ぐ腫、
急性リンJR芽球性白血病細胞、骨髄腫などのミエロー
マ細胞またはこれらによるハイプリドーマ細胞上、また
接着依存性細胞上しては、ヒト子宮ガン細胞HeLa
、チャイニーズ−ハムスター肺細胞V −79、ヒト胎
児肺細胞MRC−5゜チノパンツー肝繊維芽細胞、ヒト
包皮細胞、ニワトリ、胎児繊維芽細胞、初代サル腎細胞
、マウス転移繊維芽細胞、脳下i体腫瘍細胞、アフリカ
ミドリザル腎細胞■erO2副腎腫瘍細胞など上挙げる
ことができる。
また本発明の適用に8ける液体培地も特に限定されるも
のではなく、1〜30%(V/V )の子牛血清または
牛胎児血清?含むミニマルーエッセンシャル培地(mi
nimal essenHal medium :汎用
細胞培養用基礎培地)や1〜30%(V/V)の子牛崩
清または牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地
など會例示することができ、液体培地の比重としてはL
OO〜LO5のものが一般的である。
のではなく、1〜30%(V/V )の子牛血清または
牛胎児血清?含むミニマルーエッセンシャル培地(mi
nimal essenHal medium :汎用
細胞培養用基礎培地)や1〜30%(V/V)の子牛崩
清または牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地
など會例示することができ、液体培地の比重としてはL
OO〜LO5のものが一般的である。
なお液体培地には、酸素によび炭酸ガス會溶存させるこ
とが必要である。なお培養時の液体培地の温度は、通常
30〜40℃であり、好ましくは37℃である。
とが必要である。なお培養時の液体培地の温度は、通常
30〜40℃であり、好ましくは37℃である。
さらに接着依存性細胞全培養する場合に用いる担体粒子
も特に制限があるものではな(、接着依存性細胞の接着
性および増殖性に適しkものであればよく5例えばポリ
スチンンなどの合成高分子、タン白質や多糖類などの天
然高分子により表面が形成された粒子?挙げることがで
きるが、担体粒子は磁性全層するものであることが便利
でろ夕、これによって出石金用いて担体粒子の捕集、移
動、処理、その他の取扱い?簡便に且つ迅速に行なうこ
とが可能となる。磁性全有する担体粒子としては、磁性
体粉全高分子材料によ9M着して成るもの、磁性を有す
るコア全高分子材料により被覆して成るものがアリ、磁
性体の具体例としては、鉄、コバルト、ニッケル、これ
らの合金、低炭素鋼。
も特に制限があるものではな(、接着依存性細胞の接着
性および増殖性に適しkものであればよく5例えばポリ
スチンンなどの合成高分子、タン白質や多糖類などの天
然高分子により表面が形成された粒子?挙げることがで
きるが、担体粒子は磁性全層するものであることが便利
でろ夕、これによって出石金用いて担体粒子の捕集、移
動、処理、その他の取扱い?簡便に且つ迅速に行なうこ
とが可能となる。磁性全有する担体粒子としては、磁性
体粉全高分子材料によ9M着して成るもの、磁性を有す
るコア全高分子材料により被覆して成るものがアリ、磁
性体の具体例としては、鉄、コバルト、ニッケル、これ
らの合金、低炭素鋼。
ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フェライト、マグネタイト、そ
の他金挙げることかでさる。担体粒子の比重は、液体培
地の粘性Sよび比重などによっても異なるが、一般的に
LO−15の範囲内のものとされる。また担体粒子の粒
径は40〜500μm程度が好筐しく、形状は球形が望
ましいが、顆粒状、円筒状などであってもよ(、不定形
のものであっても差支えない。
の他金挙げることかでさる。担体粒子の比重は、液体培
地の粘性Sよび比重などによっても異なるが、一般的に
LO−15の範囲内のものとされる。また担体粒子の粒
径は40〜500μm程度が好筐しく、形状は球形が望
ましいが、顆粒状、円筒状などであってもよ(、不定形
のものであっても差支えない。
液体培地1−当りの浮遊増殖性細胞または接着依存性細
胞の播種iは、一般的には1×104〜I X、IO’
個であり、接着依存性細胞を培養するために使用する担
体粒子の数は、通常液体培地1fnlV当JIX104
〜lXl0’個程度である。
胞の播種iは、一般的には1×104〜I X、IO’
個であり、接着依存性細胞を培養するために使用する担
体粒子の数は、通常液体培地1fnlV当JIX104
〜lXl0’個程度である。
な?上記条件などに8いて、細胞は液体培地よりも比重
が小さくてもよく、液体培地より比重が小さい細胞は、
重力によらずに浮力によって、比重が大きい細胞の場合
と同様に液体培地中ににいて運動し均一に分散するよう
になる。
が小さくてもよく、液体培地より比重が小さい細胞は、
重力によらずに浮力によって、比重が大きい細胞の場合
と同様に液体培地中ににいて運動し均一に分散するよう
になる。
本発明に8いて、培養容器内には液体培地と細胞との混
合系が、空間が存在しないように充満状態に充填されて
いることが望ましく、これによって当該混合系全確実に
培養容器と共に回転させることが容易となり、空間が存
在するときにもそれが僅かであればその空間が存在する
ことによる液体培地における撹乱は培養容器内の混合系
の上部部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本発
明による効果音無効とするものではない。しかし培養容
器内の空間の割合が多くなると混合系を撹乱することな
く培養容器と共に回転させることができず、本発明の目
的全達成することができない。
合系が、空間が存在しないように充満状態に充填されて
いることが望ましく、これによって当該混合系全確実に
培養容器と共に回転させることが容易となり、空間が存
在するときにもそれが僅かであればその空間が存在する
ことによる液体培地における撹乱は培養容器内の混合系
の上部部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本発
明による効果音無効とするものではない。しかし培養容
器内の空間の割合が多くなると混合系を撹乱することな
く培養容器と共に回転させることができず、本発明の目
的全達成することができない。
このために本発明に?いては、培養容器内に?ける混合
系の充填割合が80容量%以上の場合全実質的な充満状
態とし、充填割合は、好筐しくは90答量%以上であり
、特に好ましくは98容量%以上である。
系の充填割合が80容量%以上の場合全実質的な充満状
態とし、充填割合は、好筐しくは90答量%以上であり
、特に好ましくは98容量%以上である。
本発明において、培養容器の自転に?ける回転速度は、
細胞の大きさおよび比重、液体培地の粘度、培養容器の
形状8よび大ささなどによって一概に規定することかで
きないが、通常は5〜50r、p、m、、好ましくはl
O〜30 r、p、m、程度となるよりに回転速度全
調整する。
細胞の大きさおよび比重、液体培地の粘度、培養容器の
形状8よび大ささなどによって一概に規定することかで
きないが、通常は5〜50r、p、m、、好ましくはl
O〜30 r、p、m、程度となるよりに回転速度全
調整する。
更に培養容器の形状は、既述の例に:FI5けるようK
、円筒状であることが好lしいが角筒状、或いは球状で
おっても何ら支障がなく、回転方式も、要するに容器の
上下が入れ替わるように実質的に鉛直面内で回転されれ
ばよく、例えば第4図に示すように水平な回転軸100
周りに回転するアーム11の先端に容器12t−保持さ
せて鉛直面内で円運動するようにしてもよ(、更に第5
図に示すように円筒状培養容器20全その半径方向に伸
びる水平な軸Yの周りに自転するよう回転させてもよい
。
、円筒状であることが好lしいが角筒状、或いは球状で
おっても何ら支障がなく、回転方式も、要するに容器の
上下が入れ替わるように実質的に鉛直面内で回転されれ
ばよく、例えば第4図に示すように水平な回転軸100
周りに回転するアーム11の先端に容器12t−保持さ
せて鉛直面内で円運動するようにしてもよ(、更に第5
図に示すように円筒状培養容器20全その半径方向に伸
びる水平な軸Yの周りに自転するよう回転させてもよい
。
第6図は本発明の一例を示すものであり、この図の例に
?いては、底板30と有底筒状の容器本体31とにより
培養容器が構成されている。即ち、容器本体31は底板
30に固定して設けた押え機構32によって底板30に
O・リング33會介して押圧され、その内部空間が培養
領域とされる。底板30は回転スリーブ35に固定され
、回転スリーブ35はドライベアリング36七介して、
スタンド37によって保持された外套部材38に回転自
在にかつ水平方向に保持されている。底板30は中央に
開口’ff1WL、この開口は、液体は通過するが担体
粒子?通過させないメツシュ40により塞がれてぢ9、
このメツシュ40を貫通する内導管41がメツシュに固
定されている。この内導管41はその先端に開口全層し
、回転スリーブ35内?通って伸び、その後端は連結シ
ール部50に?いて外部よりの供給管51に連通するよ
うにこれに回転自在に連結されている。回転スリーブ3
5の内周には外導管42が内導管41に対して二重管構
造となるよう固定され、その先端は底板30の開口に連
通ずるよう連結されてuf)、その後端は連結シール部
50に8いて回転自在であってしかも外部に伸びる排出
管52と連通されている。60は回転スリーブ35に固
定した被動歯車であり、モータ(図示せず)によって駆
動されろ ・駆動歯車61と噛合している。
?いては、底板30と有底筒状の容器本体31とにより
培養容器が構成されている。即ち、容器本体31は底板
30に固定して設けた押え機構32によって底板30に
O・リング33會介して押圧され、その内部空間が培養
領域とされる。底板30は回転スリーブ35に固定され
、回転スリーブ35はドライベアリング36七介して、
スタンド37によって保持された外套部材38に回転自
在にかつ水平方向に保持されている。底板30は中央に
開口’ff1WL、この開口は、液体は通過するが担体
粒子?通過させないメツシュ40により塞がれてぢ9、
このメツシュ40を貫通する内導管41がメツシュに固
定されている。この内導管41はその先端に開口全層し
、回転スリーブ35内?通って伸び、その後端は連結シ
ール部50に?いて外部よりの供給管51に連通するよ
うにこれに回転自在に連結されている。回転スリーブ3
5の内周には外導管42が内導管41に対して二重管構
造となるよう固定され、その先端は底板30の開口に連
通ずるよう連結されてuf)、その後端は連結シール部
50に8いて回転自在であってしかも外部に伸びる排出
管52と連通されている。60は回転スリーブ35に固
定した被動歯車であり、モータ(図示せず)によって駆
動されろ ・駆動歯車61と噛合している。
以上の如き構成においては、駆動歯車61が駆動される
ことによって回転スリーブ35が回転し。
ことによって回転スリーブ35が回転し。
これによって底板30と容器本体31とにより構」
成される培養容器が水平な軸の周りに回転され、同時に
内導管41%よび外導管42も共に回転する。そして、
液体培地8よび細胞を培養容器内に充填してxくことK
よシ、この培養容器の中で既に述べたところに従って細
胞が均一に分散される。
内導管41%よび外導管42も共に回転する。そして、
液体培地8よび細胞を培養容器内に充填してxくことK
よシ、この培養容器の中で既に述べたところに従って細
胞が均一に分散される。
而してこの装置に8いては供給管51カー内導管41に
連通し、外導管42が排出管52に連通しているので、
これらKより、培養容器上回転させて細胞の分散を図9
ながら、当該培養容器内に新たな液体培地?供給するこ
とおよび対応する量の使用されて栄養分の失われた古い
液体培地r外部に排…することができ、しかもメツシュ
40によって細胞の排出が防止されるので、結局長期間
に亘って細胞培養ヶ行なうことができる。
連通し、外導管42が排出管52に連通しているので、
これらKより、培養容器上回転させて細胞の分散を図9
ながら、当該培養容器内に新たな液体培地?供給するこ
とおよび対応する量の使用されて栄養分の失われた古い
液体培地r外部に排…することができ、しかもメツシュ
40によって細胞の排出が防止されるので、結局長期間
に亘って細胞培養ヶ行なうことができる。
第7図は本発明装置?用いて培養7行なう場合のシステ
ムチャートの一例であって、70は液体培地タンク、7
1は培養容器、72は液体培地排出タンク會示し、モニ
ター機構73によって培養容器71よりの排出直後の液
体培地につ−・て例えばpHセンサー74によりpH7
,並びにDOセンサー75によシ溶存酸素量會検出し、
その結果に従って培養容器71に供給される新たな培地
の量力を指IJ御升76により規制される。77jdよ
び78はそれぞれ液体培地タンク70に設けたpHセン
サー8よびDoセンサーであって、pHセンサー77に
より測定された液体培地のpHに応じてアルカリタンク
80よりアルカリが制御された割合で添加されてpHの
調整が行なわれ、当該液体培地タンク70内に伸びる、
例えば5%の炭酸ガス?含む空気?送気する送気管81
に介挿した制御弁82會介して、DOセンサー78の検
出結果に従った送気量の制御がなされる。
ムチャートの一例であって、70は液体培地タンク、7
1は培養容器、72は液体培地排出タンク會示し、モニ
ター機構73によって培養容器71よりの排出直後の液
体培地につ−・て例えばpHセンサー74によりpH7
,並びにDOセンサー75によシ溶存酸素量會検出し、
その結果に従って培養容器71に供給される新たな培地
の量力を指IJ御升76により規制される。77jdよ
び78はそれぞれ液体培地タンク70に設けたpHセン
サー8よびDoセンサーであって、pHセンサー77に
より測定された液体培地のpHに応じてアルカリタンク
80よりアルカリが制御された割合で添加されてpHの
調整が行なわれ、当該液体培地タンク70内に伸びる、
例えば5%の炭酸ガス?含む空気?送気する送気管81
に介挿した制御弁82會介して、DOセンサー78の検
出結果に従った送気量の制御がなされる。
このようなシステムによれば、常に培養条件を良好に維
持することができ、細胞が液体培地中に高い分散度で均
一に分散させることができることと相俟って工業的規模
に2いて高い効率で所期の培養全行なうことができる。
持することができ、細胞が液体培地中に高い分散度で均
一に分散させることができることと相俟って工業的規模
に2いて高い効率で所期の培養全行なうことができる。
第8図8J−び第9図は本発明の他の例會示し、この例
に’Mいては、断熱材層全層する外匣、11.0:l内
に水平方向に伸びる回転軸102が設けられ、その一端
は外匣101の外部に配置したモータ103に動力伝達
機構104 Vi−介し℃連結され℃いる。
に’Mいては、断熱材層全層する外匣、11.0:l内
に水平方向に伸びる回転軸102が設けられ、その一端
は外匣101の外部に配置したモータ103に動力伝達
機構104 Vi−介し℃連結され℃いる。
回転軸102には、放射状に突出する複数(図示の例で
は4本)のアーム105が固定され、各アーム105め
先端には円筒状の培養容器106七着脱自在に保持する
保持具107が設けられている。七し℃外匣10.1内
にはヒーター(図示せず)が設けられている。
は4本)のアーム105が固定され、各アーム105め
先端には円筒状の培養容器106七着脱自在に保持する
保持具107が設けられている。七し℃外匣10.1内
にはヒーター(図示せず)が設けられている。
このような構成の装置によれば、ia数の培養容器1−
06内に液体培地どよび細胞倉充満させて?くこと・に
よル、回転軸102’i回転させることによって既述と
同様に培養容器106内KMいて液体培地中に細胞hI
E遥に均−忙分散させることができる。
06内に液体培地どよび細胞倉充満させて?くこと・に
よル、回転軸102’i回転させることによって既述と
同様に培養容器106内KMいて液体培地中に細胞hI
E遥に均−忙分散させることができる。
次忙本発明の実施例について説明する。
実施例1
培養細胞:チャイニニズハムスター肺繊維芽細胞由来の
rV−79J 液体培地:酸素8よび炭酸ガスを溶存する10%牛脂児
血清を含む[Eagle−MEMJ(粘度: 0.01
poise 、比重:LOl)担体粒子: 「Cyt
odex III J (Pharmacia社)(粒
径:lsoμfi、比重: LO3)容量300−の筒
状培養容器中に乾燥重量で750〜(約3XlO’個)
の担体粒子を入れて液体培地t″瀾し二これに2X10
’個の培養細胞全播種し、空気が入らないように密閉し
た後、温度37℃の環境下、4時間に亘り、回転数15
r、p、m。
rV−79J 液体培地:酸素8よび炭酸ガスを溶存する10%牛脂児
血清を含む[Eagle−MEMJ(粘度: 0.01
poise 、比重:LOl)担体粒子: 「Cyt
odex III J (Pharmacia社)(粒
径:lsoμfi、比重: LO3)容量300−の筒
状培養容器中に乾燥重量で750〜(約3XlO’個)
の担体粒子を入れて液体培地t″瀾し二これに2X10
’個の培養細胞全播種し、空気が入らないように密閉し
た後、温度37℃の環境下、4時間に亘り、回転数15
r、p、m。
で培養容器上回転させた。
そのM果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約5
%でろシ、細胞接着のろった担体粒子における細胞数は
2〜4個で平均3.2個でろり、全担体粒子上の細胞数
はL6X107個であった。上記とは別に、上記と同様
九培養細胞?播種した培養容器金72時間KMシ回転さ
せた。この間に8いて24時間毎に培養容器の回転上止
めて液体培地全全量交換した。この結果、全担体粒子上
の細胞は3 X 108個に増殖していた。
%でろシ、細胞接着のろった担体粒子における細胞数は
2〜4個で平均3.2個でろり、全担体粒子上の細胞数
はL6X107個であった。上記とは別に、上記と同様
九培養細胞?播種した培養容器金72時間KMシ回転さ
せた。この間に8いて24時間毎に培養容器の回転上止
めて液体培地全全量交換した。この結果、全担体粒子上
の細胞は3 X 108個に増殖していた。
実施例2
第6図に示した構成の内容積が12の培養容器を有する
培養装置を用い、実施例IKgけると同 i様の培養細
胞、液体培地および担体粒子上用い℃細胞の培養7行な
った。即ち液体培地12に対して乾燥重量で3.9(約
L2X10’個)の担体粒子を用い、液体培地1m/!
半り1x104個の培養細胞全播種し、培養容器内に空
気が入らないようにこの混合系金元填し、温度37℃の
環境下に8いて、144時間に亘り、培養容器を回転数
12r、p、m。
培養装置を用い、実施例IKgけると同 i様の培養細
胞、液体培地および担体粒子上用い℃細胞の培養7行な
った。即ち液体培地12に対して乾燥重量で3.9(約
L2X10’個)の担体粒子を用い、液体培地1m/!
半り1x104個の培養細胞全播種し、培養容器内に空
気が入らないようにこの混合系金元填し、温度37℃の
環境下に8いて、144時間に亘り、培養容器を回転数
12r、p、m。
で回転せしめながら液体培地t−s o me/brの
割合で供給し、また同量の液体培地全排出δゼた。その
結果、担体粒子上の細胞数は液体培地1 ml当り平均
3.7 X 10’個であった。
割合で供給し、また同量の液体培地全排出δゼた。その
結果、担体粒子上の細胞数は液体培地1 ml当り平均
3.7 X 10’個であった。
比較例1
内容M21のスピンナービン?用い、実施例1にどける
と同様の培養細胞、液体培地によび担体粒子を用いて細
胞の培養上行なった。即ちスピンナーピンに液体培地l
−eに対して乾燥重量で3Iの担体粒子を加え、次いで
l X l O’個の培養細胞全播種し、温度37℃の
環境下ILJ6いて、回転子の回転EX Yr 30
r、pom、で回転せしめ144時間に亘p培養を行っ
た。このとぎに5%の炭酸ガス會含む空気全スピンナー
ビンの上部に供給し続け、液体培地が常に該空気に接触
するようにした。その結果、担体粒子上の細胞数は、液
体培地l−当9平均5.lX10’個であった。
と同様の培養細胞、液体培地によび担体粒子を用いて細
胞の培養上行なった。即ちスピンナーピンに液体培地l
−eに対して乾燥重量で3Iの担体粒子を加え、次いで
l X l O’個の培養細胞全播種し、温度37℃の
環境下ILJ6いて、回転子の回転EX Yr 30
r、pom、で回転せしめ144時間に亘p培養を行っ
た。このとぎに5%の炭酸ガス會含む空気全スピンナー
ビンの上部に供給し続け、液体培地が常に該空気に接触
するようにした。その結果、担体粒子上の細胞数は、液
体培地l−当9平均5.lX10’個であった。
第1図によび第2図は本発明の一例についての説明用斜
視図によび断面図、第3図は液体培地中に3ける粒子の
運動についての説明図、第4図および第5図はそれぞれ
本発明の他の例を示す説明用断面図どよび斜視図、第6
図は本発明装置の一例會示す断面図、第7図は本発明装
置が組み込まれた培養システムを示すシステムチャート
の一例、第8図および第9図は本発明装置の他の例全示
す説明用縦断側面図および正面図である。 1.12.20・・・培養容器 2・・・細胞3・・・
液体培地 30・・・底板 31・・・容器本体 32・・・押え機構35・・回転
スリーブ 36・・・Pライベアリング37・・・スタ
ンド 38・・・外套部材40・・・メツシュ 41・
・・内導管42・・・外導管 50・・・連箱シール部
51・・・供給管 52°°”排出管 60・・・被動歯車 61・・・駆動歯車70・・・液
体培地タンク 71・・・培養容器72・・・排出タン
ク 73・・・モニター機構74.77・・・pHセン
サー 75.78・・・DO七ンサー80・・・アルカ
リタンク 81・・送気管101・・・外匣 102・
・・回転軸103・・・モーター 104・・・動力伝
達機構105・・・アーム 107・・・保持具代理人
弁理士 大 井 、正 彦 −第1図 第2図 第3図
視図によび断面図、第3図は液体培地中に3ける粒子の
運動についての説明図、第4図および第5図はそれぞれ
本発明の他の例を示す説明用断面図どよび斜視図、第6
図は本発明装置の一例會示す断面図、第7図は本発明装
置が組み込まれた培養システムを示すシステムチャート
の一例、第8図および第9図は本発明装置の他の例全示
す説明用縦断側面図および正面図である。 1.12.20・・・培養容器 2・・・細胞3・・・
液体培地 30・・・底板 31・・・容器本体 32・・・押え機構35・・回転
スリーブ 36・・・Pライベアリング37・・・スタ
ンド 38・・・外套部材40・・・メツシュ 41・
・・内導管42・・・外導管 50・・・連箱シール部
51・・・供給管 52°°”排出管 60・・・被動歯車 61・・・駆動歯車70・・・液
体培地タンク 71・・・培養容器72・・・排出タン
ク 73・・・モニター機構74.77・・・pHセン
サー 75.78・・・DO七ンサー80・・・アルカ
リタンク 81・・送気管101・・・外匣 102・
・・回転軸103・・・モーター 104・・・動力伝
達機構105・・・アーム 107・・・保持具代理人
弁理士 大 井 、正 彦 −第1図 第2図 第3図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1〕液体培地Sよび接着依存性細胞會付着してなる被分
散粒子もしくは浮遊増殖性細胞より成る混合系全実質的
に充満するように充填した培養容器全実質上水平な軸の
周りに自転するよう回転せしめて当該混合系を前記培養
容器と共に定常的に回転せしめ、これによシ当該混合系
内において前記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞全運
動せしめ、以って前記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細
胞全前記液体培地中に分散せしめる工程會有すること全
特徴とする細胞培養方法。 2)軸が実質上水平となるように保持された培養容器と
、この培養容器をその軸の周シに自転するように回転せ
しめる駆動機構とt有して成り、前記駆動機構は、前記
培養容器内に実質的に充満するように充填された液体培
地?よび接着依存性細胞を付層してなる被分散粒子もし
くは浮遊増殖性細胞よシ成る混合系?培養容器と共に定
常的に回転せしめる機能金石するものであること全特徴
とする細胞培養装置。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59088345A JPS60232088A (ja) | 1984-05-04 | 1984-05-04 | 細胞培養方法 |
CA000480675A CA1260418A (en) | 1984-05-04 | 1985-05-03 | Rotating culture chamber for uniform dispersal and culturing of cells or plant tissues |
EP85303236A EP0164888B1 (en) | 1984-05-04 | 1985-05-07 | Cell and tissue culture process and apparatus |
DE8585303236T DE3568798D1 (en) | 1984-05-04 | 1985-05-07 | Cell and tissue culture process and apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59088345A JPS60232088A (ja) | 1984-05-04 | 1984-05-04 | 細胞培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60232088A true JPS60232088A (ja) | 1985-11-18 |
JPH0461636B2 JPH0461636B2 (ja) | 1992-10-01 |
Family
ID=13940252
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59088345A Granted JPS60232088A (ja) | 1984-05-04 | 1984-05-04 | 細胞培養方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0164888B1 (ja) |
JP (1) | JPS60232088A (ja) |
CA (1) | CA1260418A (ja) |
DE (1) | DE3568798D1 (ja) |
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JP2005278449A (ja) * | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Olympus Corp | 細胞の搬送方法および培養方法 |
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- 1985-05-07 DE DE8585303236T patent/DE3568798D1/de not_active Expired
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Also Published As
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DE3568798D1 (en) | 1989-04-20 |
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