JPS60232088A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞培養方法によび装置に関するものである。

一般に細胞の培養に？いては、培養対象細胞が浮遊増殖
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖が可能な細胞である場合には、その栄養源である
液体培地中に浮遊させることにより培地と接触させるこ
とが、或いは細胞が接着依存性細胞、すなわち液体培地
中に？ける生育？よび増殖において基質に対する接着が
必須の細胞である場合には、適当な基質の表面に当該細
胞を接Ｎさせた上で液体培地と接触させることが　。

必要でおる。そして接着依存性細胞を接着させる基質と
しては、大きな接着面積全容易に得ることができること
から、最近に８いては小径の担体粒子が用いられるよう
になってさている。

而して目的とする細胞の培養全高い効率で実行するため
罠は、培養対象細胞ｒ常に新しい培地と接触させること
が肝要であゃ、そのためには浮遊増殖性細胞または接着
依存性細胞を接着した担体粒子（以下これら全台せて単
に「細胞」ということがるる。）全液体培地中に高い分
散度で分散せしめることが必要である。

また接着依存性細胞全基質でめる担体粒子に接着させる
際にも、当該細胞が加えられた液体培地中に？いて担体
粒子金高い分散度で分散せしめることができれば、当該
担体粒子の表面が有効に平均して利用されるようになり
、従って結局は高い接着率で接Ｎを達成することかでさ
て培養効率を高める上で極めて有利である。

従来に８いて、細胞？常に新しい液体培地に接触させる
ための方法としては、液体培地中に細胞ｔ−ｍえた系を
回転翼によって攪拌する方法が一般的であるが、この方
法は液体培地と細胞とよ、・シ成る混合系に剪断力？加
える方法であるため、回転翼との衝突により或いは大ぎ
な剪断力の作用により培養中の細胞が損傷されることｔ
回避することができず、従って培養効率が低く、細胞の
種類によってはこの方法を用いることができない場合も
あるという欠点？有する。またこの方法圧よる大量培養
のための大容量の細胞培養装置の場合には、攪拌のため
に大型の攪拌機が必要となシ、従って必然的に剪断力も
大ぎ（なるために培養効率がさらに低下するようになる
という欠点ｔも有する。

このような欠点全解消するために種々の万策が研究され
ているが、上記欠点？本質的に解決する細胞培養方法が
見出されていないのが現状である。

本発明は、以上の如き事情に基ぎ鋭意研究を重ねた結果
完成されたものであって、その目的とするところは、ｔ
ｉ体培地と細胞とより成る混合系に本質的に剪断力を与
えることなく、液体培地中に細胞を均一に分散させるこ
とができ、高い効率で細胞の培養紮行なうことのできる
方法８よび装置全提供することにある。

本発明方法の特徴とするところは、液体培地８よび接着
依存性細胞全付着してなる被分散粒子もしくに浮遊増殖
性細胞よシ成る混合基金実質的に充満するように充填し
た培養容器全実質上水平な軸の周９に自転するよう回転
せしめて当該混合系を前記培養容器と共に定常的に回転
せしめ、これにより当該混合系内において前記被分散粒
子もしぐは浮遊増殖性細胞を運動せしめ、以って前記被
分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞盆前記液体培地中に分
散せしめる工程全層する点にある。

本発明装置の特徴とするところは、軸が実質上水子とな
るように保持された培養容器と、この培養容器ｔその軸
の周りに自転するように回転せしめる駆動機構と？有し
て成り、前記駆動機構は、前記培養容器内に実質的に充
満するように充填でれた液体培地および接着依存性細胞
ｔ−＋ｆ着してなる被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞
より成る混合系全培養容器と共に定常的に回転せしめる
機能を有する点にある。

以下本発明について具体的に説明する。

本発明ＫＭいては、第１図および第２図に示すように５
例えば円筒状の密閉された培養容器ｌ内に、細胞２ｔ−
加えた液体培地３ｔ、培養容器ｌの内部空間に実質的に
充満されるよう充填し、培養容器ｌの軸Ｘｖｉｌ−実質
上水平に保ってこの軸Ｘの周りに培養容器１’に一足の
回転速度で自転せしめる。

そして培養容器１ｖＩ−自転させることによって、自転
開始直後の初期期間娶経過した後は、内部の液体培地３
と細胞２との混合系が液体培地３の粘性により培養容器
ｌと共にいわば一体的に機械的な流れのない状態で軸Ｘ
の周りに定常的に回転するようにする。

このように培養容器ｌと共に回転する混合系内に３いて
、細胞２は液体培地３の粘性により液体培地３中の相対
的位置全はとんど変えずに培養容器外に対する存在位＃
を変えることとなり、従って細胞２は実質上順次異なる
方向から重力が作用する状態とすることが可能でめ９、
これは細胞２　。

０比重８よび大きさ、液体培地３の比重８よび粘性、培
養容器ｌの回転速度など１ｉｆｌ宜に選定することによ
って実現することができる。

斯かる状態において、前記混合系内の細胞２につい１見
ると、１個の細胞２は、第３図に模式的に示すように、
液体培地３内に３いて、相対的に矢印Ａに示すような円
運動’ｔ−’Ｊ″ることとなり、この運動力により細胞
２が液体培地３内において均−忙分散するようになるも
のと推考される。この分散は、条件にもよるが極めて速
やかに生ずるものであり、細胞２Ｆｓ：軸Ｘ方向にも均
一に分散するようになるため、極めて高い分散度で細胞
２？液体培地３内に分散せしめることができる。この軸
Ｘ方向の分散は、その理由は十分に解明されていないが
、液体培地３内に拡散するよう動く対流が生ずるからで
らるとも推考され、更に、これＫは回転開始直後の初期
期間に８ける細胞２の軸Ｘ方向に３ける分布状態の熱力
学的不均一さが関与しているとも推−＋ｇれる。

本発明に？いて、培養容器の自転の軸が実質上水平なも
のであることｔ必要とする理由は、軸が水平に対して角
度金石すると培養容器内で液体培地中の細胞が均一に分
散しな（なるためである。

ここに３いて、軸が実質的に水平であるとして許容され
る軸の傾きは、培養容器の形状によって異なる場合がめ
るが、例えば水平に対して５程度までの傾きは実質上水
平であるとして許容することができ、好１しくは水平に
対して３°以内の傾きである。

何れにせよ、本発明は以上のように、液体培地？相対的
に攪乱させることなく、液体培地の内部に８いて細胞を
運動させて均一に分散させるようにしているため、常に
細胞を新しい液体培地と接触せしめることができて所要
の培養音高い効率で達成することができ、細胞には剪断
力や大きな衝撃全作うような力が作用することがな（、
従って細胞が損傷されるようなことがないので、そのよ
うな損傷全党は易い弱い細胞であってもこれｔ十分に培
養することができる。

な８本発明において、培養容器に液体培地と細胞とを充
填するためには特殊な方法全必要とするものではなく、
事前に混合された液体培地と細胞を充填すればよい。し
かし接着依存性細胞の場合には、事前に接着依存性細胞
？接着した担体粒子全培養容器に充填するよりも、担体
粒子に接着依存性細胞を接着させる工程についても本発
明に８ける培養容器音用いて同様の操作により、液体培
地中に担体粒子および接着依存性細胞？剪断力を与える
ことなく均一に分散させることによって、担体粒子の表
面に対して細胞を各担体粒子に？いて平均にかつ効率的
に接着させることが望ましく、この場合社この接着工程
に引き続き本発明？実施することができる。

細胞？培養する場合には、液体培地の交換が必要となる
。本発明に８いても長期間にわたる培養に２いては、液
体培地の交換が必要である。液体培地の交換方法として
は１例えば培養容器の回転を止めて液体培地の一部また
は全部會交換する方法、培養容器に液体培地の供給管８
よび排田管金設置し、培養中に連続的に新しい液体培地
３内給すると共に古い液体培地３内田する方法會挙げる
ことができる。このようにして新しい液体培坤葡供給す
ることによつ℃、通常数日以上の時間音必要とする培養
全十分に行なうことができる。新しい液体培地の供給は
、これｔ上記のように供給管を通じて常時行なうように
すれば、単位時間当りの供給量８よび排出量は僅かでよ
いから、培養容器内の液体に層流、乱流なとの機械的な
流れｔ実質土庄せしめない状態とすることが可能でアリ
、これによって、細胞の所期の分散に妨げることが防止
される。培養効率？高めるためにも、液体培地の供給會
供給管音道じて常時行うことが好ましい。

また本発明によシ接着依存性細胞を培養する場合に、供
給管を通じて常時培養容器に液体培地？供給し、排出管
音道して常時排出する方法を適用するときに、供給する
液体培地と共に担体粒子８よび接着依存性細胞全培養容
器に供給し、培養容器から排出する液体培地と共に増殖
した接着依存性細胞會そり表面に接着している担体粒子
の一部全抜出す方法音用いれば、液体培地の交換、担体
粒子への接着依存性細胞の接着、培養εよび増殖した接
着依存性細胞の抜出し？連続的に行うことができる。

本発明の適用に８いては、培養されるべき細胞は何ら制
限されるものではな（、浮遊増殖性細胞としでは、例え
ばリンノぞ球、リンノぞ芽球、パーキットクン・ぐ腫、
急性リンＪＲ芽球性白血病細胞、骨髄腫などのミエロー
マ細胞またはこれらによるハイプリドーマ細胞上、また
接着依存性細胞上しては、ヒト子宮ガン細胞ＨｅＬａ　
、チャイニーズ−ハムスター肺細胞Ｖ　−７９、ヒト胎
児肺細胞ＭＲＣ−５゜チノパンツー肝繊維芽細胞、ヒト
包皮細胞、ニワトリ、胎児繊維芽細胞、初代サル腎細胞
、マウス転移繊維芽細胞、脳下ｉ体腫瘍細胞、アフリカ
ミドリザル腎細胞■ｅｒＯ２副腎腫瘍細胞など上挙げる
ことができる。

また本発明の適用に８ける液体培地も特に限定されるも
のではなく、１〜３０％（Ｖ／Ｖ　）の子牛血清または
牛胎児血清？含むミニマルーエッセンシャル培地（ｍｉ
ｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎＨａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　：汎用
細胞培養用基礎培地）や１〜３０％（Ｖ／Ｖ）の子牛崩
清または牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地
など會例示することができ、液体培地の比重としてはＬ
ＯＯ〜ＬＯ５のものが一般的である。

なお液体培地には、酸素によび炭酸ガス會溶存させるこ
とが必要である。なお培養時の液体培地の温度は、通常
３０〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。

さらに接着依存性細胞全培養する場合に用いる担体粒子
も特に制限があるものではな（、接着依存性細胞の接着
性および増殖性に適しｋものであればよく５例えばポリ
スチンンなどの合成高分子、タン白質や多糖類などの天
然高分子により表面が形成された粒子？挙げることがで
きるが、担体粒子は磁性全層するものであることが便利
でろ夕、これによって出石金用いて担体粒子の捕集、移
動、処理、その他の取扱い？簡便に且つ迅速に行なうこ
とが可能となる。磁性全有する担体粒子としては、磁性
体粉全高分子材料によ９Ｍ着して成るもの、磁性を有す
るコア全高分子材料により被覆して成るものがアリ、磁
性体の具体例としては、鉄、コバルト、ニッケル、これ
らの合金、低炭素鋼。

ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フェライト、マグネタイト、そ
の他金挙げることかでさる。担体粒子の比重は、液体培
地の粘性Ｓよび比重などによっても異なるが、一般的に
ＬＯ−１５の範囲内のものとされる。また担体粒子の粒
径は４０〜５００μｍ程度が好筐しく、形状は球形が望
ましいが、顆粒状、円筒状などであってもよ（、不定形
のものであっても差支えない。

液体培地１−当りの浮遊増殖性細胞または接着依存性細
胞の播種ｉは、一般的には１×１０４〜Ｉ　Ｘ、ＩＯ’
個であり、接着依存性細胞を培養するために使用する担
体粒子の数は、通常液体培地１ｆｎｌＶ当ＪＩＸ１０４
〜ｌＸｌ０’個程度である。

な？上記条件などに８いて、細胞は液体培地よりも比重
が小さくてもよく、液体培地より比重が小さい細胞は、
重力によらずに浮力によって、比重が大きい細胞の場合
と同様に液体培地中ににいて運動し均一に分散するよう
になる。

本発明に８いて、培養容器内には液体培地と細胞との混
合系が、空間が存在しないように充満状態に充填されて
いることが望ましく、これによって当該混合系全確実に
培養容器と共に回転させることが容易となり、空間が存
在するときにもそれが僅かであればその空間が存在する
ことによる液体培地における撹乱は培養容器内の混合系
の上部部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本発
明による効果音無効とするものではない。しかし培養容
器内の空間の割合が多くなると混合系を撹乱することな
く培養容器と共に回転させることができず、本発明の目
的全達成することができない。

このために本発明に？いては、培養容器内に？ける混合
系の充填割合が８０容量％以上の場合全実質的な充満状
態とし、充填割合は、好筐しくは９０答量％以上であり
、特に好ましくは９８容量％以上である。

本発明において、培養容器の自転に？ける回転速度は、
細胞の大きさおよび比重、液体培地の粘度、培養容器の
形状８よび大ささなどによって一概に規定することかで
きないが、通常は５〜５０ｒ、ｐ、ｍ、、好ましくはｌ
　Ｏ〜３０　ｒ、ｐ、ｍ、程度となるよりに回転速度全
調整する。

更に培養容器の形状は、既述の例に：ＦＩ５けるようＫ
、円筒状であることが好ｌしいが角筒状、或いは球状で
おっても何ら支障がなく、回転方式も、要するに容器の
上下が入れ替わるように実質的に鉛直面内で回転されれ
ばよく、例えば第４図に示すように水平な回転軸１００
周りに回転するアーム１１の先端に容器１２ｔ−保持さ
せて鉛直面内で円運動するようにしてもよ（、更に第５
図に示すように円筒状培養容器２０全その半径方向に伸
びる水平な軸Ｙの周りに自転するよう回転させてもよい
。

第６図は本発明の一例を示すものであり、この図の例に
？いては、底板３０と有底筒状の容器本体３１とにより
培養容器が構成されている。即ち、容器本体３１は底板
３０に固定して設けた押え機構３２によって底板３０に
Ｏ・リング３３會介して押圧され、その内部空間が培養
領域とされる。底板３０は回転スリーブ３５に固定され
、回転スリーブ３５はドライベアリング３６七介して、
スタンド３７によって保持された外套部材３８に回転自
在にかつ水平方向に保持されている。底板３０は中央に
開口’ｆｆ１ＷＬ、この開口は、液体は通過するが担体
粒子？通過させないメツシュ４０により塞がれてぢ９、
このメツシュ４０を貫通する内導管４１がメツシュに固
定されている。この内導管４１はその先端に開口全層し
、回転スリーブ３５内？通って伸び、その後端は連結シ
ール部５０に？いて外部よりの供給管５１に連通するよ
うにこれに回転自在に連結されている。回転スリーブ３
５の内周には外導管４２が内導管４１に対して二重管構
造となるよう固定され、その先端は底板３０の開口に連
通ずるよう連結されてｕｆ）、その後端は連結シール部
５０に８いて回転自在であってしかも外部に伸びる排出
管５２と連通されている。６０は回転スリーブ３５に固
定した被動歯車であり、モータ（図示せず）によって駆
動されろ　・駆動歯車６１と噛合している。

以上の如き構成においては、駆動歯車６１が駆動される
ことによって回転スリーブ３５が回転し。

これによって底板３０と容器本体３１とにより構」 成される培養容器が水平な軸の周りに回転され、同時に
内導管４１％よび外導管４２も共に回転する。そして、
液体培地８よび細胞を培養容器内に充填してｘくことＫ
よシ、この培養容器の中で既に述べたところに従って細
胞が均一に分散される。

而してこの装置に８いては供給管５１カー内導管４１に
連通し、外導管４２が排出管５２に連通しているので、
これらＫより、培養容器上回転させて細胞の分散を図９
ながら、当該培養容器内に新たな液体培地？供給するこ
とおよび対応する量の使用されて栄養分の失われた古い
液体培地ｒ外部に排…することができ、しかもメツシュ
４０によって細胞の排出が防止されるので、結局長期間
に亘って細胞培養ヶ行なうことができる。

第７図は本発明装置？用いて培養７行なう場合のシステ
ムチャートの一例であって、７０は液体培地タンク、７
１は培養容器、７２は液体培地排出タンク會示し、モニ
ター機構７３によって培養容器７１よりの排出直後の液
体培地につ−・て例えばｐＨセンサー７４によりｐＨ７
，並びにＤＯセンサー７５によシ溶存酸素量會検出し、
その結果に従って培養容器７１に供給される新たな培地
の量力を指ＩＪ御升７６により規制される。７７ｊｄよ
び７８はそれぞれ液体培地タンク７０に設けたｐＨセン
サー８よびＤｏセンサーであって、ｐＨセンサー７７に
より測定された液体培地のｐＨに応じてアルカリタンク
８０よりアルカリが制御された割合で添加されてｐＨの
調整が行なわれ、当該液体培地タンク７０内に伸びる、
例えば５％の炭酸ガス？含む空気？送気する送気管８１
に介挿した制御弁８２會介して、ＤＯセンサー７８の検
出結果に従った送気量の制御がなされる。

このようなシステムによれば、常に培養条件を良好に維
持することができ、細胞が液体培地中に高い分散度で均
一に分散させることができることと相俟って工業的規模
に２いて高い効率で所期の培養全行なうことができる。

第８図８Ｊ−び第９図は本発明の他の例會示し、この例
に’Ｍいては、断熱材層全層する外匣、１１．０：ｌ内
に水平方向に伸びる回転軸１０２が設けられ、その一端
は外匣１０１の外部に配置したモータ１０３に動力伝達
機構１０４　Ｖｉ−介し℃連結され℃いる。

回転軸１０２には、放射状に突出する複数（図示の例で
は４本）のアーム１０５が固定され、各アーム１０５め
先端には円筒状の培養容器１０６七着脱自在に保持する
保持具１０７が設けられている。七し℃外匣１０．１内
にはヒーター（図示せず）が設けられている。

このような構成の装置によれば、ｉａ数の培養容器１−
０６内に液体培地どよび細胞倉充満させて？くこと・に
よル、回転軸１０２’ｉ回転させることによって既述と
同様に培養容器１０６内ＫＭいて液体培地中に細胞ｈＩ
Ｅ遥に均−忙分散させることができる。

次忙本発明の実施例について説明する。

実施例１ 培養細胞：チャイニニズハムスター肺繊維芽細胞由来の
ｒＶ−７９Ｊ 液体培地：酸素８よび炭酸ガスを溶存する１０％牛脂児
血清を含む［Ｅａｇｌｅ−ＭＥＭＪ（粘度：　０．０１
　ｐｏｉｓｅ　、比重：ＬＯｌ）担体粒子：　「Ｃｙｔ
ｏｄｅｘ　ＩＩＩ　Ｊ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）（粒
径：ｌｓｏμｆｉ、比重：　ＬＯ３）容量３００−の筒
状培養容器中に乾燥重量で７５０〜（約３ＸｌＯ’個）
の担体粒子を入れて液体培地ｔ″瀾し二これに２Ｘ１０
’個の培養細胞全播種し、空気が入らないように密閉し
た後、温度３７℃の環境下、４時間に亘り、回転数１５
　ｒ、ｐ、ｍ。

で培養容器上回転させた。

そのＭ果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約５
％でろシ、細胞接着のろった担体粒子における細胞数は
２〜４個で平均３．２個でろり、全担体粒子上の細胞数
はＬ６Ｘ１０７個であった。上記とは別に、上記と同様
九培養細胞？播種した培養容器金７２時間ＫＭシ回転さ
せた。この間に８いて２４時間毎に培養容器の回転上止
めて液体培地全全量交換した。この結果、全担体粒子上
の細胞は３　Ｘ　１０８個に増殖していた。

実施例２ 第６図に示した構成の内容積が１２の培養容器を有する
培養装置を用い、実施例ＩＫｇけると同　ｉ様の培養細
胞、液体培地および担体粒子上用い℃細胞の培養７行な
った。即ち液体培地１２に対して乾燥重量で３．９（約
Ｌ２Ｘ１０’個）の担体粒子を用い、液体培地１ｍ／！
半り１ｘ１０４個の培養細胞全播種し、培養容器内に空
気が入らないようにこの混合系金元填し、温度３７℃の
環境下に８いて、１４４時間に亘り、培養容器を回転数
１２ｒ、ｐ、ｍ。

で回転せしめながら液体培地ｔ−ｓ　ｏ　ｍｅ／ｂｒの
割合で供給し、また同量の液体培地全排出δゼた。その
結果、担体粒子上の細胞数は液体培地１　ｍｌ当り平均
３．７　Ｘ　１０’個であった。

比較例１ 内容Ｍ２１のスピンナービン？用い、実施例１にどける
と同様の培養細胞、液体培地によび担体粒子を用いて細
胞の培養上行なった。即ちスピンナーピンに液体培地ｌ
−ｅに対して乾燥重量で３Ｉの担体粒子を加え、次いで
ｌ　Ｘ　ｌ　Ｏ’個の培養細胞全播種し、温度３７℃の
環境下ＩＬＪ６いて、回転子の回転ＥＸ　Ｙｒ　３０　
ｒ、ｐｏｍ、で回転せしめ１４４時間に亘ｐ培養を行っ
た。このとぎに５％の炭酸ガス會含む空気全スピンナー
ビンの上部に供給し続け、液体培地が常に該空気に接触
するようにした。その結果、担体粒子上の細胞数は、液
体培地ｌ−当９平均５．ｌＸ１０’個であった。

【図面の簡単な説明】

第１図によび第２図は本発明の一例についての説明用斜
視図によび断面図、第３図は液体培地中に３ける粒子の
運動についての説明図、第４図および第５図はそれぞれ
本発明の他の例を示す説明用断面図どよび斜視図、第６
図は本発明装置の一例會示す断面図、第７図は本発明装
置が組み込まれた培養システムを示すシステムチャート
の一例、第８図および第９図は本発明装置の他の例全示
す説明用縦断側面図および正面図である。 １．１２．２０・・・培養容器　２・・・細胞３・・・
液体培地　３０・・・底板 ３１・・・容器本体　３２・・・押え機構３５・・回転
スリーブ　３６・・・Ｐライベアリング３７・・・スタ
ンド　３８・・・外套部材４０・・・メツシュ　４１・
・・内導管４２・・・外導管　５０・・・連箱シール部
５１・・・供給管　５２°°”排出管 ６０・・・被動歯車　６１・・・駆動歯車７０・・・液
体培地タンク　７１・・・培養容器７２・・・排出タン
ク　７３・・・モニター機構７４．７７・・・ｐＨセン
サー　７５．７８・・・ＤＯ七ンサー８０・・・アルカ
リタンク　８１・・送気管１０１・・・外匣　１０２・
・・回転軸１０３・・・モーター　１０４・・・動力伝
達機構１０５・・・アーム　１０７・・・保持具代理人
　弁理士　大　井　、正　彦　−第１図 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １〕液体培地Ｓよび接着依存性細胞會付着してなる被分
   散粒子もしくは浮遊増殖性細胞より成る混合系全実質的
   に充満するように充填した培養容器全実質上水平な軸の
   周りに自転するよう回転せしめて当該混合系を前記培養
   容器と共に定常的に回転せしめ、これによシ当該混合系
   内において前記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞全運
   動せしめ、以って前記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細
   胞全前記液体培地中に分散せしめる工程會有すること全
   特徴とする細胞培養方法。 ２）軸が実質上水平となるように保持された培養容器と
   、この培養容器をその軸の周シに自転するように回転せ
   しめる駆動機構とｔ有して成り、前記駆動機構は、前記
   培養容器内に実質的に充満するように充填された液体培
   地？よび接着依存性細胞を付層してなる被分散粒子もし
   くは浮遊増殖性細胞よシ成る混合系？培養容器と共に定
   常的に回転せしめる機能金石するものであること全特徴
   とする細胞培養装置。