JPH0416153B2 - - Google Patents
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Description
(a) 産業上の利用分野
本発明は細胞を培養増殖させるための装置およ
び方法に関するものである。更に詳しくは細胞を
サスペンジヨン状態で培養するための装置および
方法に関するものである。 細胞培養技術は、例えばウイルス、ワクチン、
インターフエロンの如き抗ウイルス剤或いはホル
モンの如き生物薬品の製造にとつて重要である。
更に近年特定タンパク質などを標的とするモノク
ローナル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマ
によるハイブリドーマの培養によるものであり、
その技術の解決は工業的に重要なテーマである。 (b) 従来技術 従来、細胞培養は一般にシヤーレ試験管、培養
びんなどを用いて実験室的規模で行なわれてい
る。 一方近年細胞の培養法及びそのための装置とし
て、いくつかの提案がなされている。これらの提
案は、大きく分けて付着培養（anchorage
dependent culture）と浮遊培養、つまりサスペ
ンジヨン培養（suspension culture）との２つの
方式に分類されるが、これらの方式は培養される
細胞の特性によつていずれかに決められる。 このうちサスペンジヨン培養に関して下記の提
案がなされている。例えばマグネテイツクスター
ラーもしくは機械的に駆動されるシヤフト上の羽
根車によつて、スピナーフラスコの中に調整され
た撹拌機能を設けた培養方法が提案されている
（米国特許第2958517号および同第3649465号明細
書参照）。 特開昭57−65180号公報には、回転可能なシヤ
フト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面
積の屈撓性シートを撹拌機とし、該撹拌機を回転
させて該シートを波立たせ、それによつてヒトの
２倍体細胞のような或る種の虚弱細胞に対し所望
の隠かな撹拌を作り出すサスペンジヨン培養装置
が提案されている。 しかし、上記装置による培養方法においては、
細胞が一定量の栄養分の中で培養されるため細胞
の生長増殖は比較的低い密度で停止する。 細胞のサスペンジヨン培養において、細胞の生
長増殖が比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細
胞を大量に且つ高密度で培養するために、一般に
新しい培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物
質を含んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら
培養する方式すなわち通称パーヒユージヨン方式
と言われる方式が提案されている（Annual
Reports or Fiamentation Processes、vol.6参
照）。この方式を用いて培養するに当つて重要な
ことの１つは、サスペンジヨン液中の生細胞と前
記古い培養液とを効率よく分離し、古い培養液を
培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の成育環境
を最適条件下に維持することである。サスペンジ
ヨン液から生細胞と古い培養液とを分離するため
に種々のフイルターやまた種々の形式が提案され
ているが、フイルターの目塞りや、装置の構造の
煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいずれ
も満足すべきもはのとは言い難い。 特開昭59−82083号公報および特開昭60−9482
号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培
養上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該
導管から培地を添加し同時に上記排出管から培養
上清を排出しつつ培養を行うようにした浮遊細胞
の高濃度培養装置が提案されている。 一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし
数10ミクロンと小さくしかもその比重は培地の比
重と大きな差がないため、浮遊細胞と培地とを重
力によつて分離する上記の如き装置では、細胞沈
降を有利に達成するために沈降面積を大きくする
必要があるが上記２件の特開昭に開示された装置
では沈降面積をあまり大きくとることはできな
い。 (c) 発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペン
ジヨン培養液から生細胞と培養液とを分離するこ
とが可能な装置および方法を提供することにあ
る。 本発明の他の目的は、フイルターなどを使用し
なくとも生細胞と古い培養液とを分離することが
可能な装置および方法、従つてフイルターの目塞
りなどによる問題の発生を解消した装置および方
法を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に
達成するための沈降面積を非常に大きくとること
のできる工業的に有利なサスペンジヨン培養のた
めの装置および方法を提供することにある。 本発明の更に他の目的は、サスペンジヨン培養
においてしばしば問題となる死細胞およびその破
壊片を培養槽外へ容易に除去可能な装置および方
法を提供することにある。 本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ高密
度の培養に適したパーヒユージヨン方式による工
業的装置および方法を提供することにある。 更に他の目的および利点は、以下の説明から明
らかとなるであろう。 (d) 発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した
本発明の目的および利点は、第１に細胞培養槽
が、細胞のサスペンジヨン培養ゾーン、細胞のセ
トリングゾーン、該セトリングゾーンからの培養
液排出口および該サスペンジヨン培養ゾーンへの
培養液供給口とを有し該サスペンジヨン培養ゾー
ンと該サスペンジヨンゾーンとは該細胞培養槽内
で該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡す
るように仕切りによつて仕切られており、そして
該セトリングゾーンは該細胞培養槽の槽側壁と該
仕切りの間に形成されていることを特徴とするサ
スペンジヨン培養のための細胞培養槽から構成さ
れる潅流培養のための細胞培養装置によつて達成
される。 かかる本発明によれば、培養槽中に設置された
セトリングゾーンにおいて、生細胞は重力方向の
下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片などはセ
トリングゾーンの上部へ分離されることになるの
で、セトリングゾーンの上部に設けられた培養液
の排出口から生細胞を実質的に含まない培養液を
排出することができる。従つて本発明は、目塞り
の原因となるフイルターを使用することなく、簡
単な方式によつて生細胞と培養液を効率よく分離
することを可能とするので、細胞の大量且つ高密
度培養に適用することができる。 本発明の培養装置は、細胞をサスペンドさせて
実質的な細胞培養を実施する区域と規定できる細
胞のサスペンジヨン培養ゾーンおよび細胞を重力
によつて培養液から分離する区域と規定できる細
胞のセトリングゾーンを有している。細胞のサス
ペンジヨン培養ゾーンと細胞のセトリングゾーン
とは、細胞培養槽内において該セトリングゾーン
の下方部位を通じて連絡するように仕切りによつ
て仕切られている。このような構造を有するた
め、細胞のセトリングゾーンにおいて、沈降しそ
して培養液から分離された細胞は該セトリングゾ
ーンの下方部位を通じて細胞のサスペンジヨン培
養ゾーンに再び導入され、その区域で再び培養さ
れる。 本発明の装置において、培養槽内の該セトリン
グゾーンは、該培養槽の槽側壁と上記仕切りの間
に形成されている。このような構造によつて、培
養槽内でセトリングゾーンの有効なセトリング面
積を非常に大きくとることのできる利点がある。 本発明の装置は、セトリングゾーンにおいて細
胞と分離された古い培養液を排出するための培養
液排出口および培養ゾーンへ新しい培養液を供給
するための培養液供給口を上記培養槽に有してい
る。 本発明の装置の培養槽において、該セトリング
ゾーンは、好ましくは、該サスペンジヨン培養ゾ
ーンの周囲に該サスペンジヨン培養ゾーンを取囲
むように槽側壁と該仕切りとの間に形成されてい
る。この好ましい態様において、例えば該サスペ
ンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンは円筒
状仕切りによつて仕切られている。この場合、さ
らに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する槽側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒
状仕切りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に
位置している。 また、本発明の装置は、セトリングゾーンにお
ける細胞のセトリングを助長するため、セトリン
グゾーン内に細胞のセトリングを助長する手段を
有することができる。その様な手段は、細胞が沈
降する重力方向の距離を短くするような手段であ
り、例えば重力方向を遮ぎる方向にセトリングゾ
ーン内に設けられた沈降板であることができる
（図７参照）。 さらに、セトリングゾーン中には、細胞のサス
ペンジヨン培養ゾーン中に形成される培養液の流
動の影響を可及的に小さくする目的で、重力方向
に伸びてセトリングゾーンを仕切るじやま板を設
けることもできる。重力方向に角度を有してセト
リングゾーン内に設けられたじやま板は沈降板と
しての機能を発揮することは容易に理解されよ
う。 本発明の装置の培養槽は、細胞のサスペンジヨ
ン培養ゾーン中の培養液を強制的に流動させるた
めの手段を備えることができる。そのような手段
は、例えば培養液中に細胞を強制的にサスペンド
させるための機械的撹拌手段であることができ
る。また、培養槽に、酸素含有ガス導入口、また
は酸素含有ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を設
け、該導入口から導入された酸素含有ガスが上昇
する際の撹拌効果により培養液中に細胞を強制的
にサスペンドさせることもできる。 本発明の細胞培養装置はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或い
は細胞を微小担体（マイクロキヤリアー）に担持
して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細
胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊
に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培養する
方式に有利に用いられる。 本発明の細胞培養装置において培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞例えばハイブリドーマであつてもよ
い。殊に本発明の培養装置は、動物細胞の培養に
適している。 本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養槽
中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的に
水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン
類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質など
の通常細胞培養に使用される添加成分が加えられ
ている。また培養液には血清を加えることもでき
るし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することも出来る。 本発明の培養装置を用いて細胞を潅流培養する
本発明方法は、セトリングゾーンから細胞を実質
的に含まない培養液を抜出しそしてサスペンジヨ
ン培養ゾーンへ新しい培養液を導入することによ
つて有利に実施される。 その際、セトリングゾーンによつて規定される
細胞の有効セトリング面積〔Ｓ（cm2）〕と、サスペ
ンジヨン培養ゾーン内の培養液の体積〔Ｖ（cm3）〕
との比Ｖ／Ｓが好ましくは0.1〜500cm、特に好ま
しくは１〜100cmの範囲にある。 以下本発明の装置および方法について更に詳細
に説明する。 先ず添付した図１および図２により本発明を説
明すると、図１および図２は、それぞれ本発明の
装置の概略図の一例を示したものである。 図１において培養槽本体１にはその内壁の内側
に隔壁２によつて仕切られたセトリングゾーン６
が設けられている。培養槽１には新しい培養液の
供給導管３を通じて培養液の供給口が備えられ、
導管５を通じて酸素または酸素含有ガスが供給さ
れるようになつており、また排ガスの排出導管９
が設けられている。さらにセトリングゾーン６の
上部には古い培養液の排出口が設けられ、導管４
を通じて培養槽外へ培養液を排出するようになつ
ている。 図１は培養槽１中に撹拌装置７が設置され、そ
れを回転させることによつて、細胞がサスペンジ
ヨン状態に維持されている。 一方図２において、１〜６は図１と同じ機能を
持つた手段および装置を意味する。図１と異なる
のは、培養槽１の中に案内筒８が設けられ、その
案内筒８の下部に酸素または酸素含有ガスを導管
５を介して供給するようになつている点である。
この案内筒８の下部に酸素または酸素含有ガスを
供給することによつてサスペンジヨン液は案内筒
８の内部を下部から上部へ上昇し、案内筒８の外
側では逆に上部から下部へとサスペンジヨン液の
移動が起り、全体としてサスペンジヨン液の撹拌
が行なわれる。 上記図１および図２において、いずれも培養槽
の内壁の内側に隔壁２によつて仕切られたセトリ
ングゾーン６が設けられていて、そのセトリング
ゾーンにはサスペンジヨン液の撹拌効果は実質的
に及ばないようになつている。セトリングゾーン
６の内部では、細胞が重力方向へ沈降し、細胞を
実質的に含まない生育阻害物質を含む古い培養液
が上部に存在するように設計されている。 図１および図２に示すように槽の高さをＨ、槽
の直径をＤとしたとき、Ｈ／Ｄが0.5〜10、好ま
しくは１〜５の範囲となるような槽が、本発明の
培養槽として好ましく使用される。また槽の全体
の形状としては一般に細胞のサンペンジヨン型培
養に使用されるものであれば種々のものが用いら
れる。 セトリングゾーンは、その中における培養液の
線速度が、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽
内のサスペンジヨン液の撹拌が及ばない領域が確
保されていればよく、その形状および構造に限定
を受けない。 図１および図２の装置は、セトリングゾーン６
とサスペンジヨン培養ゾーンとが円筒状隔壁２に
よつて仕切られており、該円筒状隔壁２と対向す
る槽側壁の実質的部分が円筒状であり、そして上
記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁とが実質的に同
心に位置しているものである。 この装置において、Ｖ／Ｓ（ここで、Ｖはサス
ペンジヨン培養ゾーン内の培養液の体積であり、
Ｓは細胞の有効なセトリング面積である）を算出
する基礎となるＳは下記式で表わされる。 Ｓ＝π／４（D2−d2） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄ
は円筒状隔壁２の直径である。また、Ｖは培養槽
の容積から、培養液の存在しない空間部の体積と
セトリングゾーンの容積とを差し引いた体積と理
解されるべきである。 図３および図４には、本発明の装置の平断面の
概略図が図示されている。図３および図４におい
て、１０はセトリングゾーン６に設けられたじや
ま板を示している。じやま板１０は、区画された
セトリングゾーンが図３のように格子状になるよ
うに設けることができ、図４のように扇形を形成
するように設けることもできる。図５および図６
には、それぞれ図３および図４に示した装置の縦
断面の概略図である。 図７には、セトリングゾーンに沈降板１１を有
する本発明の他の装置の縦断面の概略図が示され
ている。 図８には本発明の装置のさらに他の態様の縦断
面の概略図が示されている。図８の装置におい
て、セトリングゾーン６は培養槽の高さ方向の中
途までしか伸びておらず、あたかもサスペンジヨ
ン培養ゾーンが２段に形成されているように構成
されている。上段のサスペンジヨン培養ゾーンに
も撹拌翼が設けられている。 さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養
素の濃度、PHの値を測定し、それらを或る範囲に
維持する装置が一般に設置されているが、本発明
の細胞培養槽にもこれらの装置が備えられてもよ
いことは言うまでもない。しかし添付図面にはこ
れらの付属装置は省略されている。 本発明の方法を実施するに当つて、新しい培養
液は、この中にブドウ糖、蛋白質の如き栄養源、
種々のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培
養に必要な成分を水溶液として含むものが使用さ
るが、さらに血清を含んでいてもよく、また含ん
でいなくてもよい。 かかる新しい培養液は、サスペンジヨン培養ゾ
ーンへの培養液供給口から、例えば図１および図
２に示すように培養槽の上部に設けられた培養液
供給口から供給される。またサスペンジヨン液中
へ直接導管を通じて供給してもよい。 また本発明の方法を実施するに当つて、新しい
培養液の供給と、古い培養液の排出とは、培養槽
中の液面の水準がほぼ一定となるように維持する
ことが望ましいが、必ずしもその必要はない。新
しい培養液の供給と古い培養液の排出とは、それ
ぞれ独立して、連続的に行なうこともできまた間
歇的に行なうこともできる。 本発明の培養方法において、サスペンジヨン液
中の酸素濃度を一定に維持するために、酸素を供
給する方法としては、前述の如く、サスペンジヨ
ン液中の酸素または酸素含有ガスを直接供給して
もよく、また他の供給手段によつてもよい。他の
供給手段としては、例えば酸素キヤリアーを用い
る方法である。酸素キヤリアーとしては、水と実
質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合
物が使用され、その例としては、人工血液の素材
として使用されるような種々のフルオロカーボン
が挙げられる。かようなフルオロカーボンを酸素
供給手段として使用する場合には、酸素を溶解さ
せたフルオロカーボンをサスペンジヨン液中の上
部から液滴状または薄膜状で添加すればよい。 図９には、培養槽にフルオロカーボンに溶解さ
せて酸素を導入する装置の縦断面の概略図が示さ
れている。図９の装置は、サスペンジヨン培養ゾ
ーンが図１の装置等に較べると、さらに下方へ伸
びたような形態をなしている。フルオロカーボン
導入口１２から酸素を溶解されたフルオロカーボ
ンが導入され、下方へ落下する間に培養液と接触
して培養液に酸素を供給し、その後培養槽の下方
に貯まり、フルオロカーボン排出口１３から排出
される。本発明の培養槽を用いて培養を効率的に
行なうためには、新しい培養液および酸素などを
サスペンジヨン液中へ均一に供給し、一方古い培
養液を槽外へ排出する必要があり、そのためサス
ペンジヨン液は良く撹拌されていることが望まし
い。撹拌方法としては、図１の示した撹拌翼の回
転による如き機械的撹拌方法、また図２に示した
案内筒を用いたドラフト効果による方法、この他
前記した如き酸素を溶解した酸素キヤリアーを用
いることによる酸素供給と撹拌を同時に行なう方
法などが挙げられる。もちろんこれら撹拌手段を
２つ以上併用することもできる。 また培養は、培養槽の有効培養容積（Ｖ）に対
して新しい培養液を供給する割合（新しい培養液
の供給量／Ｖ）は１日当り0.2〜10、好ましくは
0.5〜５の範囲とするのが適当である。 かくして本発明によれば、細胞のサスペンジヨ
ン培養において、生細胞を含まない古い培養液を
簡単に分離することができ、また細胞破壊片も古
い培養液と共にサスペンジヨン液から除去でき
る。また本発明の装置は構造が簡単であり、その
操作が煩雑でなく工業的装置として適している。
殊に細胞の大量培養、高密度培養に有利である。 以下実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例 １ (1) 培養液の形状 添付図１に示したような構造をした内容積が
約200mlのガラス容器を培養槽として使用した。
培養槽の高さ（Ｈ）と直径（Ｄ）の比（Ｈ／
Ｄ）は２：１であつた。この培養槽には図１に
示したように撹拌効果の実質的に及ばないセト
リングゾーンが設けられている。このゾーンに
おけるＶ／Ｓは5.3〔cm〕であり、ｈは８cmであ
つた。 (2) 新しい培養液の組成 基礎培地として、RPMI1640培地とハムＦ−
12培地とダルベツコ変法イーグル培地を２：
１：１で混合したものを用い、増殖因子として
次のものを加えた。 インシユリン 9μｇ／ml トランスフエリン 10μｇ／ml エタノールアミン 10μｇ／ml 亜セレン酸 ２×10-8mole／ (3) 培養方法 前記培養槽に液容積が150mlとなるように新
しい培養液を入れ、これにマウスミエローマ細
胞P3U1を親株とするマウスーマウスハイブリ
ドーマ4C10B6細胞株を8.0×105個／mlとなる
ように加えた。この細胞は免疫グロブリン
（IgG）産生型の株である。 培養槽においては、炭酸ガス５％含有空気お
よび炭酸ガス５％含有酸素のそれぞれがサスペ
ンジヨン液中へ供給され、それらの供給はそれ
ぞれ系内のPH6.5〜7.0、溶存酸素量が３〜
4ppmの範囲で一定となるように制御された。 培養槽中のサスペンジヨン液は37.0℃に保持
され、またマリン型撹拌子は60rpmの速度で回
転させた。 新しい培養液の供給と古い培養液の排出は、
培養開始直後から行ない、１日における新しい
培養液の培養槽への供給量は150mlであつた。
培養開始５日経過後は、この新しい培養液の供
給を１日あたり300mlまで増加させた。 (4) 培養結果 かくして７日間培養を行なつた結果は下記の
表１の通りであつた。
び方法に関するものである。更に詳しくは細胞を
サスペンジヨン状態で培養するための装置および
方法に関するものである。 細胞培養技術は、例えばウイルス、ワクチン、
インターフエロンの如き抗ウイルス剤或いはホル
モンの如き生物薬品の製造にとつて重要である。
更に近年特定タンパク質などを標的とするモノク
ローナル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマ
によるハイブリドーマの培養によるものであり、
その技術の解決は工業的に重要なテーマである。 (b) 従来技術 従来、細胞培養は一般にシヤーレ試験管、培養
びんなどを用いて実験室的規模で行なわれてい
る。 一方近年細胞の培養法及びそのための装置とし
て、いくつかの提案がなされている。これらの提
案は、大きく分けて付着培養（anchorage
dependent culture）と浮遊培養、つまりサスペ
ンジヨン培養（suspension culture）との２つの
方式に分類されるが、これらの方式は培養される
細胞の特性によつていずれかに決められる。 このうちサスペンジヨン培養に関して下記の提
案がなされている。例えばマグネテイツクスター
ラーもしくは機械的に駆動されるシヤフト上の羽
根車によつて、スピナーフラスコの中に調整され
た撹拌機能を設けた培養方法が提案されている
（米国特許第2958517号および同第3649465号明細
書参照）。 特開昭57−65180号公報には、回転可能なシヤ
フト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面
積の屈撓性シートを撹拌機とし、該撹拌機を回転
させて該シートを波立たせ、それによつてヒトの
２倍体細胞のような或る種の虚弱細胞に対し所望
の隠かな撹拌を作り出すサスペンジヨン培養装置
が提案されている。 しかし、上記装置による培養方法においては、
細胞が一定量の栄養分の中で培養されるため細胞
の生長増殖は比較的低い密度で停止する。 細胞のサスペンジヨン培養において、細胞の生
長増殖が比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細
胞を大量に且つ高密度で培養するために、一般に
新しい培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物
質を含んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら
培養する方式すなわち通称パーヒユージヨン方式
と言われる方式が提案されている（Annual
Reports or Fiamentation Processes、vol.6参
照）。この方式を用いて培養するに当つて重要な
ことの１つは、サスペンジヨン液中の生細胞と前
記古い培養液とを効率よく分離し、古い培養液を
培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の成育環境
を最適条件下に維持することである。サスペンジ
ヨン液から生細胞と古い培養液とを分離するため
に種々のフイルターやまた種々の形式が提案され
ているが、フイルターの目塞りや、装置の構造の
煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいずれ
も満足すべきもはのとは言い難い。 特開昭59−82083号公報および特開昭60−9482
号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培
養上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該
導管から培地を添加し同時に上記排出管から培養
上清を排出しつつ培養を行うようにした浮遊細胞
の高濃度培養装置が提案されている。 一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし
数10ミクロンと小さくしかもその比重は培地の比
重と大きな差がないため、浮遊細胞と培地とを重
力によつて分離する上記の如き装置では、細胞沈
降を有利に達成するために沈降面積を大きくする
必要があるが上記２件の特開昭に開示された装置
では沈降面積をあまり大きくとることはできな
い。 (c) 発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペン
ジヨン培養液から生細胞と培養液とを分離するこ
とが可能な装置および方法を提供することにあ
る。 本発明の他の目的は、フイルターなどを使用し
なくとも生細胞と古い培養液とを分離することが
可能な装置および方法、従つてフイルターの目塞
りなどによる問題の発生を解消した装置および方
法を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に
達成するための沈降面積を非常に大きくとること
のできる工業的に有利なサスペンジヨン培養のた
めの装置および方法を提供することにある。 本発明の更に他の目的は、サスペンジヨン培養
においてしばしば問題となる死細胞およびその破
壊片を培養槽外へ容易に除去可能な装置および方
法を提供することにある。 本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ高密
度の培養に適したパーヒユージヨン方式による工
業的装置および方法を提供することにある。 更に他の目的および利点は、以下の説明から明
らかとなるであろう。 (d) 発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した
本発明の目的および利点は、第１に細胞培養槽
が、細胞のサスペンジヨン培養ゾーン、細胞のセ
トリングゾーン、該セトリングゾーンからの培養
液排出口および該サスペンジヨン培養ゾーンへの
培養液供給口とを有し該サスペンジヨン培養ゾー
ンと該サスペンジヨンゾーンとは該細胞培養槽内
で該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡す
るように仕切りによつて仕切られており、そして
該セトリングゾーンは該細胞培養槽の槽側壁と該
仕切りの間に形成されていることを特徴とするサ
スペンジヨン培養のための細胞培養槽から構成さ
れる潅流培養のための細胞培養装置によつて達成
される。 かかる本発明によれば、培養槽中に設置された
セトリングゾーンにおいて、生細胞は重力方向の
下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片などはセ
トリングゾーンの上部へ分離されることになるの
で、セトリングゾーンの上部に設けられた培養液
の排出口から生細胞を実質的に含まない培養液を
排出することができる。従つて本発明は、目塞り
の原因となるフイルターを使用することなく、簡
単な方式によつて生細胞と培養液を効率よく分離
することを可能とするので、細胞の大量且つ高密
度培養に適用することができる。 本発明の培養装置は、細胞をサスペンドさせて
実質的な細胞培養を実施する区域と規定できる細
胞のサスペンジヨン培養ゾーンおよび細胞を重力
によつて培養液から分離する区域と規定できる細
胞のセトリングゾーンを有している。細胞のサス
ペンジヨン培養ゾーンと細胞のセトリングゾーン
とは、細胞培養槽内において該セトリングゾーン
の下方部位を通じて連絡するように仕切りによつ
て仕切られている。このような構造を有するた
め、細胞のセトリングゾーンにおいて、沈降しそ
して培養液から分離された細胞は該セトリングゾ
ーンの下方部位を通じて細胞のサスペンジヨン培
養ゾーンに再び導入され、その区域で再び培養さ
れる。 本発明の装置において、培養槽内の該セトリン
グゾーンは、該培養槽の槽側壁と上記仕切りの間
に形成されている。このような構造によつて、培
養槽内でセトリングゾーンの有効なセトリング面
積を非常に大きくとることのできる利点がある。 本発明の装置は、セトリングゾーンにおいて細
胞と分離された古い培養液を排出するための培養
液排出口および培養ゾーンへ新しい培養液を供給
するための培養液供給口を上記培養槽に有してい
る。 本発明の装置の培養槽において、該セトリング
ゾーンは、好ましくは、該サスペンジヨン培養ゾ
ーンの周囲に該サスペンジヨン培養ゾーンを取囲
むように槽側壁と該仕切りとの間に形成されてい
る。この好ましい態様において、例えば該サスペ
ンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンは円筒
状仕切りによつて仕切られている。この場合、さ
らに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する槽側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒
状仕切りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に
位置している。 また、本発明の装置は、セトリングゾーンにお
ける細胞のセトリングを助長するため、セトリン
グゾーン内に細胞のセトリングを助長する手段を
有することができる。その様な手段は、細胞が沈
降する重力方向の距離を短くするような手段であ
り、例えば重力方向を遮ぎる方向にセトリングゾ
ーン内に設けられた沈降板であることができる
（図７参照）。 さらに、セトリングゾーン中には、細胞のサス
ペンジヨン培養ゾーン中に形成される培養液の流
動の影響を可及的に小さくする目的で、重力方向
に伸びてセトリングゾーンを仕切るじやま板を設
けることもできる。重力方向に角度を有してセト
リングゾーン内に設けられたじやま板は沈降板と
しての機能を発揮することは容易に理解されよ
う。 本発明の装置の培養槽は、細胞のサスペンジヨ
ン培養ゾーン中の培養液を強制的に流動させるた
めの手段を備えることができる。そのような手段
は、例えば培養液中に細胞を強制的にサスペンド
させるための機械的撹拌手段であることができ
る。また、培養槽に、酸素含有ガス導入口、また
は酸素含有ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を設
け、該導入口から導入された酸素含有ガスが上昇
する際の撹拌効果により培養液中に細胞を強制的
にサスペンドさせることもできる。 本発明の細胞培養装置はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或い
は細胞を微小担体（マイクロキヤリアー）に担持
して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細
胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊
に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培養する
方式に有利に用いられる。 本発明の細胞培養装置において培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞例えばハイブリドーマであつてもよ
い。殊に本発明の培養装置は、動物細胞の培養に
適している。 本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養槽
中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的に
水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン
類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質など
の通常細胞培養に使用される添加成分が加えられ
ている。また培養液には血清を加えることもでき
るし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することも出来る。 本発明の培養装置を用いて細胞を潅流培養する
本発明方法は、セトリングゾーンから細胞を実質
的に含まない培養液を抜出しそしてサスペンジヨ
ン培養ゾーンへ新しい培養液を導入することによ
つて有利に実施される。 その際、セトリングゾーンによつて規定される
細胞の有効セトリング面積〔Ｓ（cm2）〕と、サスペ
ンジヨン培養ゾーン内の培養液の体積〔Ｖ（cm3）〕
との比Ｖ／Ｓが好ましくは0.1〜500cm、特に好ま
しくは１〜100cmの範囲にある。 以下本発明の装置および方法について更に詳細
に説明する。 先ず添付した図１および図２により本発明を説
明すると、図１および図２は、それぞれ本発明の
装置の概略図の一例を示したものである。 図１において培養槽本体１にはその内壁の内側
に隔壁２によつて仕切られたセトリングゾーン６
が設けられている。培養槽１には新しい培養液の
供給導管３を通じて培養液の供給口が備えられ、
導管５を通じて酸素または酸素含有ガスが供給さ
れるようになつており、また排ガスの排出導管９
が設けられている。さらにセトリングゾーン６の
上部には古い培養液の排出口が設けられ、導管４
を通じて培養槽外へ培養液を排出するようになつ
ている。 図１は培養槽１中に撹拌装置７が設置され、そ
れを回転させることによつて、細胞がサスペンジ
ヨン状態に維持されている。 一方図２において、１〜６は図１と同じ機能を
持つた手段および装置を意味する。図１と異なる
のは、培養槽１の中に案内筒８が設けられ、その
案内筒８の下部に酸素または酸素含有ガスを導管
５を介して供給するようになつている点である。
この案内筒８の下部に酸素または酸素含有ガスを
供給することによつてサスペンジヨン液は案内筒
８の内部を下部から上部へ上昇し、案内筒８の外
側では逆に上部から下部へとサスペンジヨン液の
移動が起り、全体としてサスペンジヨン液の撹拌
が行なわれる。 上記図１および図２において、いずれも培養槽
の内壁の内側に隔壁２によつて仕切られたセトリ
ングゾーン６が設けられていて、そのセトリング
ゾーンにはサスペンジヨン液の撹拌効果は実質的
に及ばないようになつている。セトリングゾーン
６の内部では、細胞が重力方向へ沈降し、細胞を
実質的に含まない生育阻害物質を含む古い培養液
が上部に存在するように設計されている。 図１および図２に示すように槽の高さをＨ、槽
の直径をＤとしたとき、Ｈ／Ｄが0.5〜10、好ま
しくは１〜５の範囲となるような槽が、本発明の
培養槽として好ましく使用される。また槽の全体
の形状としては一般に細胞のサンペンジヨン型培
養に使用されるものであれば種々のものが用いら
れる。 セトリングゾーンは、その中における培養液の
線速度が、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽
内のサスペンジヨン液の撹拌が及ばない領域が確
保されていればよく、その形状および構造に限定
を受けない。 図１および図２の装置は、セトリングゾーン６
とサスペンジヨン培養ゾーンとが円筒状隔壁２に
よつて仕切られており、該円筒状隔壁２と対向す
る槽側壁の実質的部分が円筒状であり、そして上
記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁とが実質的に同
心に位置しているものである。 この装置において、Ｖ／Ｓ（ここで、Ｖはサス
ペンジヨン培養ゾーン内の培養液の体積であり、
Ｓは細胞の有効なセトリング面積である）を算出
する基礎となるＳは下記式で表わされる。 Ｓ＝π／４（D2−d2） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄ
は円筒状隔壁２の直径である。また、Ｖは培養槽
の容積から、培養液の存在しない空間部の体積と
セトリングゾーンの容積とを差し引いた体積と理
解されるべきである。 図３および図４には、本発明の装置の平断面の
概略図が図示されている。図３および図４におい
て、１０はセトリングゾーン６に設けられたじや
ま板を示している。じやま板１０は、区画された
セトリングゾーンが図３のように格子状になるよ
うに設けることができ、図４のように扇形を形成
するように設けることもできる。図５および図６
には、それぞれ図３および図４に示した装置の縦
断面の概略図である。 図７には、セトリングゾーンに沈降板１１を有
する本発明の他の装置の縦断面の概略図が示され
ている。 図８には本発明の装置のさらに他の態様の縦断
面の概略図が示されている。図８の装置におい
て、セトリングゾーン６は培養槽の高さ方向の中
途までしか伸びておらず、あたかもサスペンジヨ
ン培養ゾーンが２段に形成されているように構成
されている。上段のサスペンジヨン培養ゾーンに
も撹拌翼が設けられている。 さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養
素の濃度、PHの値を測定し、それらを或る範囲に
維持する装置が一般に設置されているが、本発明
の細胞培養槽にもこれらの装置が備えられてもよ
いことは言うまでもない。しかし添付図面にはこ
れらの付属装置は省略されている。 本発明の方法を実施するに当つて、新しい培養
液は、この中にブドウ糖、蛋白質の如き栄養源、
種々のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培
養に必要な成分を水溶液として含むものが使用さ
るが、さらに血清を含んでいてもよく、また含ん
でいなくてもよい。 かかる新しい培養液は、サスペンジヨン培養ゾ
ーンへの培養液供給口から、例えば図１および図
２に示すように培養槽の上部に設けられた培養液
供給口から供給される。またサスペンジヨン液中
へ直接導管を通じて供給してもよい。 また本発明の方法を実施するに当つて、新しい
培養液の供給と、古い培養液の排出とは、培養槽
中の液面の水準がほぼ一定となるように維持する
ことが望ましいが、必ずしもその必要はない。新
しい培養液の供給と古い培養液の排出とは、それ
ぞれ独立して、連続的に行なうこともできまた間
歇的に行なうこともできる。 本発明の培養方法において、サスペンジヨン液
中の酸素濃度を一定に維持するために、酸素を供
給する方法としては、前述の如く、サスペンジヨ
ン液中の酸素または酸素含有ガスを直接供給して
もよく、また他の供給手段によつてもよい。他の
供給手段としては、例えば酸素キヤリアーを用い
る方法である。酸素キヤリアーとしては、水と実
質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合
物が使用され、その例としては、人工血液の素材
として使用されるような種々のフルオロカーボン
が挙げられる。かようなフルオロカーボンを酸素
供給手段として使用する場合には、酸素を溶解さ
せたフルオロカーボンをサスペンジヨン液中の上
部から液滴状または薄膜状で添加すればよい。 図９には、培養槽にフルオロカーボンに溶解さ
せて酸素を導入する装置の縦断面の概略図が示さ
れている。図９の装置は、サスペンジヨン培養ゾ
ーンが図１の装置等に較べると、さらに下方へ伸
びたような形態をなしている。フルオロカーボン
導入口１２から酸素を溶解されたフルオロカーボ
ンが導入され、下方へ落下する間に培養液と接触
して培養液に酸素を供給し、その後培養槽の下方
に貯まり、フルオロカーボン排出口１３から排出
される。本発明の培養槽を用いて培養を効率的に
行なうためには、新しい培養液および酸素などを
サスペンジヨン液中へ均一に供給し、一方古い培
養液を槽外へ排出する必要があり、そのためサス
ペンジヨン液は良く撹拌されていることが望まし
い。撹拌方法としては、図１の示した撹拌翼の回
転による如き機械的撹拌方法、また図２に示した
案内筒を用いたドラフト効果による方法、この他
前記した如き酸素を溶解した酸素キヤリアーを用
いることによる酸素供給と撹拌を同時に行なう方
法などが挙げられる。もちろんこれら撹拌手段を
２つ以上併用することもできる。 また培養は、培養槽の有効培養容積（Ｖ）に対
して新しい培養液を供給する割合（新しい培養液
の供給量／Ｖ）は１日当り0.2〜10、好ましくは
0.5〜５の範囲とするのが適当である。 かくして本発明によれば、細胞のサスペンジヨ
ン培養において、生細胞を含まない古い培養液を
簡単に分離することができ、また細胞破壊片も古
い培養液と共にサスペンジヨン液から除去でき
る。また本発明の装置は構造が簡単であり、その
操作が煩雑でなく工業的装置として適している。
殊に細胞の大量培養、高密度培養に有利である。 以下実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例 １ (1) 培養液の形状 添付図１に示したような構造をした内容積が
約200mlのガラス容器を培養槽として使用した。
培養槽の高さ（Ｈ）と直径（Ｄ）の比（Ｈ／
Ｄ）は２：１であつた。この培養槽には図１に
示したように撹拌効果の実質的に及ばないセト
リングゾーンが設けられている。このゾーンに
おけるＶ／Ｓは5.3〔cm〕であり、ｈは８cmであ
つた。 (2) 新しい培養液の組成 基礎培地として、RPMI1640培地とハムＦ−
12培地とダルベツコ変法イーグル培地を２：
１：１で混合したものを用い、増殖因子として
次のものを加えた。 インシユリン 9μｇ／ml トランスフエリン 10μｇ／ml エタノールアミン 10μｇ／ml 亜セレン酸 ２×10-8mole／ (3) 培養方法 前記培養槽に液容積が150mlとなるように新
しい培養液を入れ、これにマウスミエローマ細
胞P3U1を親株とするマウスーマウスハイブリ
ドーマ4C10B6細胞株を8.0×105個／mlとなる
ように加えた。この細胞は免疫グロブリン
（IgG）産生型の株である。 培養槽においては、炭酸ガス５％含有空気お
よび炭酸ガス５％含有酸素のそれぞれがサスペ
ンジヨン液中へ供給され、それらの供給はそれ
ぞれ系内のPH6.5〜7.0、溶存酸素量が３〜
4ppmの範囲で一定となるように制御された。 培養槽中のサスペンジヨン液は37.0℃に保持
され、またマリン型撹拌子は60rpmの速度で回
転させた。 新しい培養液の供給と古い培養液の排出は、
培養開始直後から行ない、１日における新しい
培養液の培養槽への供給量は150mlであつた。
培養開始５日経過後は、この新しい培養液の供
給を１日あたり300mlまで増加させた。 (4) 培養結果 かくして７日間培養を行なつた結果は下記の
表１の通りであつた。
【表】
比較例 １
培養槽および新しい培養液は実施例１と全く同
じものを使用した。 この培養槽に液容積が150mlとなるように新し
い培養液を入れ、これに4C10B6細胞株を8.0×
105個／mlとなるように加えた。 新しい培養液を供給せず、古い培養液を排出し
ないほかは実施例１と全く同じ条件で培養を行な
つた。５日間培養を行なつた結果は下記の表２の
通りであつた。
じものを使用した。 この培養槽に液容積が150mlとなるように新し
い培養液を入れ、これに4C10B6細胞株を8.0×
105個／mlとなるように加えた。 新しい培養液を供給せず、古い培養液を排出し
ないほかは実施例１と全く同じ条件で培養を行な
つた。５日間培養を行なつた結果は下記の表２の
通りであつた。
【表】
比較例 ２
(1) 培養方法
柴田ハリオ硝子(株)製100mlスピンナーフラス
コを培養槽として使用した。 該フラスコに液容積が100mlとなるように新
しい培養液を入れた。新しい培養液には、実施
例１と同じものを用いた。 培養槽にマウスミエローマ細胞P3U1を親株
とするマウスーマウスハイブリドーマ4C10B6
細胞株を8.0×105個／mlとなるように加えた。
培養の条件は実施例１と全く同じになるように
した。 培養開始後、新しい培養液の供給と古い培養
液の排出を該フラスコに装着された導管を通じ
て行なつた。１日における新しい培地の供給量
は100mlであつた。 (2) 培養結果 かくして培養を８日間行なつた結果は下記の
表３の通りであつた。
コを培養槽として使用した。 該フラスコに液容積が100mlとなるように新
しい培養液を入れた。新しい培養液には、実施
例１と同じものを用いた。 培養槽にマウスミエローマ細胞P3U1を親株
とするマウスーマウスハイブリドーマ4C10B6
細胞株を8.0×105個／mlとなるように加えた。
培養の条件は実施例１と全く同じになるように
した。 培養開始後、新しい培養液の供給と古い培養
液の排出を該フラスコに装着された導管を通じ
て行なつた。１日における新しい培地の供給量
は100mlであつた。 (2) 培養結果 かくして培養を８日間行なつた結果は下記の
表３の通りであつた。
【表】
【表】
実施例 ２
(1) 培養装置
添付図１０に示す培養システムを使用した。
培養槽は図１０に示されるように外壁の内側に
設けられた隔壁２によつて仕切られたセトリン
グゾーン６が設けられ、その上部には培養液の
排出のための導管４を有しており、撹拌装置７
が設置されていて正味培養容積は約200mlであ
り、Ｖ、Ｄ、ｄ、Ｈはそれぞれ120ml、6.5cm、
4.5cm、14cm、Ｖ／Ｓは7.0であつた。 (2) 培養液 RPMI1640培地、ハム・F12培地およびダル
ベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合し
たものにさらにアミノ酸、グルコース等を添加
したもの（以下eRDFと称する）を基本培地と
して用いた。これに増殖因子としてインスリ
ン、トランスフエリン、エタノールアミン、亜
セレン酸を添加したものを培養に用いた。これ
らの増殖因子の添加量は、インスリン9μｇ／
ml、トランスフエリン10μｇ／ml、エタノール
アミン10μM、亜セレン酸２×10-8Mであつた。 (3) 培養方法 細胞はマウスミエローマ細胞P3U1株を親株
とするマウス×ヒトハイブリドーマH1株を用
いた。この細胞はIgG産生株である。 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養
槽に培地を入れ、これに細胞を2.5×105cells／
mlとなるように播種した。培養槽では炭酸ガス
５％を含む酸素ガス、溶存酸素3ppmとなるよ
うに吹込みノズル５を通して自動的にコントロ
ールされて送入された。培養液と接触したのち
ガスはノズル９から糸外へ取出された。培養槽
中の培養液は37℃に保持された。培養槽中には
マリン型撹拌翼が取付けられており、撹拌速度
は35rpmであつた。 播種後１日間は回分培養を行い、この後パー
ヒユージヨンを開始した。すなわち、新培地を
ノズル３から送入し、培養槽１の液面が一定に
なるように細胞を分離された培養液を導管４を
経由して系外へ取出した。 パーヒユージヨンのＲ度として正味培養容積
の１日当りの置換率を実験結果に併記する。 (4) 培養結果 かくして13日間培養を行つた結果を表４に示
す。 実施例 ３ (1) 培養装置 V.D.d.Hそれぞれ1200ml、13cm、8.5cm、26.5
cm、とし、Ｖ／Ｓを約15とした以外は実施例１
で用いたものと同じものを用いた。 (2) 培養液 基本培地eRDFインスリン、トランスフエリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸および0.5
％（Ｗ／Ｖ）のBSA（ウシ血清アルブミン）を
添加したものを用いた。 (3) 培養方法 実施例１と同様に行つた。 (4) 培養結果 表５に示す。 実施例 ４ 培地に実施例３と同様のものを用いた以外は実
施例２と同様にして培養実験を行なつた。 実験結果を表６に示す。 実施例 ５ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：基本培地eRDFに10％（Ｗ／Ｖ）のFCS
（牛胎児血清）を添加したもの。 実験結果を表７に示す。 実施例 ６ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：培養８日目からPluronic F68を0.02％
（Ｗ／Ｖ）を添加した。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマH2株 実験結果を表８に示す。 実施例 ７ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ、 細胞：実施例６に同じ、 実験結果を表９に示す。 実施例 ８ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：ITES−eRDFにHSA（ヒト血清アルブミ
ン）を0.5％（Ｗ／Ｖ）添加したもの。 細胞：実施例６に同じ 実験結果を表10に示す。 実施例 ９ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例５に同じ 細胞：実施例６に同じ 実験結果を表11に示す。 実施例 10 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマH3株 実験結果を表12に示す。 実施例 11 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV1株 実験結果を表13に示す。 実施例 12 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ。培養19日目からPluronic
F68を0.02％（Ｗ／Ｖ）添加した。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV2株 実験結果を表14に示す。 実施例 13 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV6株 実験結果を表15に示す。
培養槽は図１０に示されるように外壁の内側に
設けられた隔壁２によつて仕切られたセトリン
グゾーン６が設けられ、その上部には培養液の
排出のための導管４を有しており、撹拌装置７
が設置されていて正味培養容積は約200mlであ
り、Ｖ、Ｄ、ｄ、Ｈはそれぞれ120ml、6.5cm、
4.5cm、14cm、Ｖ／Ｓは7.0であつた。 (2) 培養液 RPMI1640培地、ハム・F12培地およびダル
ベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合し
たものにさらにアミノ酸、グルコース等を添加
したもの（以下eRDFと称する）を基本培地と
して用いた。これに増殖因子としてインスリ
ン、トランスフエリン、エタノールアミン、亜
セレン酸を添加したものを培養に用いた。これ
らの増殖因子の添加量は、インスリン9μｇ／
ml、トランスフエリン10μｇ／ml、エタノール
アミン10μM、亜セレン酸２×10-8Mであつた。 (3) 培養方法 細胞はマウスミエローマ細胞P3U1株を親株
とするマウス×ヒトハイブリドーマH1株を用
いた。この細胞はIgG産生株である。 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養
槽に培地を入れ、これに細胞を2.5×105cells／
mlとなるように播種した。培養槽では炭酸ガス
５％を含む酸素ガス、溶存酸素3ppmとなるよ
うに吹込みノズル５を通して自動的にコントロ
ールされて送入された。培養液と接触したのち
ガスはノズル９から糸外へ取出された。培養槽
中の培養液は37℃に保持された。培養槽中には
マリン型撹拌翼が取付けられており、撹拌速度
は35rpmであつた。 播種後１日間は回分培養を行い、この後パー
ヒユージヨンを開始した。すなわち、新培地を
ノズル３から送入し、培養槽１の液面が一定に
なるように細胞を分離された培養液を導管４を
経由して系外へ取出した。 パーヒユージヨンのＲ度として正味培養容積
の１日当りの置換率を実験結果に併記する。 (4) 培養結果 かくして13日間培養を行つた結果を表４に示
す。 実施例 ３ (1) 培養装置 V.D.d.Hそれぞれ1200ml、13cm、8.5cm、26.5
cm、とし、Ｖ／Ｓを約15とした以外は実施例１
で用いたものと同じものを用いた。 (2) 培養液 基本培地eRDFインスリン、トランスフエリ
ン、エタノールアミン、亜セレン酸および0.5
％（Ｗ／Ｖ）のBSA（ウシ血清アルブミン）を
添加したものを用いた。 (3) 培養方法 実施例１と同様に行つた。 (4) 培養結果 表５に示す。 実施例 ４ 培地に実施例３と同様のものを用いた以外は実
施例２と同様にして培養実験を行なつた。 実験結果を表６に示す。 実施例 ５ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：基本培地eRDFに10％（Ｗ／Ｖ）のFCS
（牛胎児血清）を添加したもの。 実験結果を表７に示す。 実施例 ６ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：培養８日目からPluronic F68を0.02％
（Ｗ／Ｖ）を添加した。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマH2株 実験結果を表８に示す。 実施例 ７ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ、 細胞：実施例６に同じ、 実験結果を表９に示す。 実施例 ８ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：ITES−eRDFにHSA（ヒト血清アルブミ
ン）を0.5％（Ｗ／Ｖ）添加したもの。 細胞：実施例６に同じ 実験結果を表10に示す。 実施例 ９ 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例５に同じ 細胞：実施例６に同じ 実験結果を表11に示す。 実施例 10 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマH3株 実験結果を表12に示す。 実施例 11 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV1株 実験結果を表13に示す。 実施例 12 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ。培養19日目からPluronic
F68を0.02％（Ｗ／Ｖ）添加した。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV2株 実験結果を表14に示す。 実施例 13 次に記す事項以外は実施例２と同様にして培養
実験を行なつた。 培地：実施例３に同じ。 細胞：マウスミエローマP3U1を親株とするIgG
産生マウス×ヒトハイブリドーマV6株 実験結果を表15に示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
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【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
図１〜１０は、それぞれ本発明の培養装置の概
略図を示したものである。
略図を示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞培養槽が、細胞のサスペンジヨン培養ゾ
ーン、細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾ
ーンからの培養液排出口および該サスペンジヨン
培養ゾーンへの培養液供給口とを有し、該サスペ
ンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンとは該
細胞培養槽内で該セトリングゾーンの下方部位を
通じて連絡するように仕切りによつて仕切られて
おり、そして該セトリングゾーンは該細胞培養槽
の槽側壁と該仕切り間に形成されていることを特
徴とするサスペンジヨン培養のための細胞培養槽
から構成される潅流培養のための細胞培養装置。 ２ 該セトリングゾーンが該サスペンジヨン培養
ゾーンの周囲に該サスペンジヨン培養ゾーンを取
囲むように槽側壁と該仕切りとの間に形成されて
いる第１項記載の装置。 ３ 該セトリングゾーンが細胞のセトリングを助
長するための手段を有する第１項記載の装置。 ４ 該サスペンジヨン培養ゾーンと該セトリング
ゾーンが円筒状仕切りによつて、仕切られている
第１項記載の装置。 ５ 該サスペンジヨン培養ゾーンと該セトリング
ゾーンが円筒状仕切りによつて仕切られており、
該円筒状仕切りと対向する槽側壁の実質的部分が
円筒状であり、そして上記円筒状仕切りと上記円
筒状槽側壁とが実質的に同心に位置している第１
項記載の装置。 ６ 装置が培養液中に細胞を強制的にサスペンド
させるための機械的撹拌手段を有する第１項記載
の装置。 ７ 装置が酸素含有ガス導入口および酸素含有ガ
ス案内筒を有し、該案内筒内を酸素含有ガスが上
昇する際の撹拌効果により培養液中に細胞を強制
的にサスペンドさせる第１項記載の装置。 ８ 細胞培養槽が、細胞のサスペンジヨン培養ゾ
ーン、細胞のセトリングゾーン、該セトリングゾ
ーンからの培養液排出口および該サスペンジヨン
培養ゾーンへの培養液供給口とを有し、該サスペ
ンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンとは該
細胞培養槽内で該セトリングゾーンの下方部位を
通じて連絡するように仕切りによつて仕切られて
おり、そして該セトリングゾーンは該細胞培養槽
の槽側壁と該仕切りの間に形成されていることを
特徴とするサスペンジヨン培養のための細胞培養
槽から構成される潅流培養のための細胞培養装置
によつて細胞を潅流培養する方法であつて、セト
リングゾーンから細胞を実質的に含まない培養液
を抜出し、そしてサスペンジヨン培養ゾーンへ新
しい培養液を導入することを特徴とする方法。 ９ セトリングゾーンによつて規定される細胞の
有効セトリング面積［Ｓ（cm2）］とサスペンジヨン
培養ゾーン内の培養液の体積［Ｖ（cm3）］との比、
Ｖ／Ｓが0.1〜500cmの範囲にある第８項記載の方
法。 １０ 細胞が動物細胞である第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-19238 | 1985-02-05 | ||
| JP1923885 | 1985-02-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62265A JPS62265A (ja) | 1987-01-06 |
| JPH0416153B2 true JPH0416153B2 (ja) | 1992-03-23 |
Family
ID=11993810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61008839A Granted JPS62265A (ja) | 1985-02-05 | 1986-01-21 | 細胞培養装置および方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0191356B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62265A (ja) |
| DE (1) | DE3681805D1 (ja) |
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| EP0224962A1 (en) * | 1985-11-25 | 1987-06-10 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Apparatus for the continuous cultivation of microorganisms in a culture liquid |
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| US5019512A (en) * | 1989-03-17 | 1991-05-28 | Baxter International Inc. | Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system |
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| US5320963A (en) * | 1992-11-25 | 1994-06-14 | National Research Council Of Canada | Bioreactor for the perfusion culture of cells |
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Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US2451156A (en) * | 1944-06-19 | 1948-10-12 | Mattos Annibal Ramos De | Process and apparatus for producing alcohol by fermentation |
| US2975553A (en) * | 1957-08-23 | 1961-03-21 | Nat Res Dev | Apparatus for culture of biological cells and tissues |
| AT247823B (de) * | 1964-05-08 | 1966-06-27 | Vogelbusch Gmbh | Vorrichtung zur Begasung von Flüssigkeiten in einem Behälter |
| DE2847443A1 (de) * | 1978-11-02 | 1980-05-22 | Blenke Heinz | Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung (bio-)chemischer reaktionen und verfahrenstechnischer grundoperationen in fluiden systemen |
-
1986
- 1986-01-21 JP JP61008839A patent/JPS62265A/ja active Granted
- 1986-01-28 EP EP86101104A patent/EP0191356B1/en not_active Expired
- 1986-01-28 DE DE8686101104T patent/DE3681805D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
| DE3681805D1 (de) | 1991-11-14 |
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| EP0191356A1 (en) | 1986-08-20 |
| JPS62265A (ja) | 1987-01-06 |
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