JPS611383A - 細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養方法Info
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- JPS611383A JPS611383A JP59120724A JP12072484A JPS611383A JP S611383 A JPS611383 A JP S611383A JP 59120724 A JP59120724 A JP 59120724A JP 12072484 A JP12072484 A JP 12072484A JP S611383 A JPS611383 A JP S611383A
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- culture
- cells
- oxygen
- suspension
- fluorocarbon
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C45/00—Injection moulding, i.e. forcing the required volume of moulding material through a nozzle into a closed mould; Apparatus therefor
- B29C45/14—Injection moulding, i.e. forcing the required volume of moulding material through a nozzle into a closed mould; Apparatus therefor incorporating preformed parts or layers, e.g. injection moulding around inserts or for coating articles
- B29C45/14639—Injection moulding, i.e. forcing the required volume of moulding material through a nozzle into a closed mould; Apparatus therefor incorporating preformed parts or layers, e.g. injection moulding around inserts or for coating articles for obtaining an insulating effect, e.g. for electrical components
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- H—ELECTRICITY
- H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
- H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
- H02K15/00—Methods or apparatus specially adapted for manufacturing, assembling, maintaining or repairing of dynamo-electric machines
- H02K15/12—Impregnating, heating or drying of windings, stators, rotors or machines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
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- Engineering & Computer Science (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- Casting Or Compression Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Injection Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Manufacture Of Motors, Generators (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（ａ） 産業上の利用分野
本発明は細胞を培養増殖させるための培養方法に関する
ものである。さらに詳しくは、細胞をナスペンション状
態で培養する方法において、その培養系中へ酸素を効率
よく供給し且つ細胞の生育を増大せしめる方法に関する
ものである。
ものである。さらに詳しくは、細胞をナスペンション状
態で培養する方法において、その培養系中へ酸素を効率
よく供給し且つ細胞の生育を増大せしめる方法に関する
ものである。
（ｂ） 従来技術
細胞の培養、殊に大量培養は、例えばウィルス。
ワクチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、ある
いはホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブリド
ーマ大量培養によるものであり、その技術の解決は工業
的に重要なテーマである。
いはホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブリド
ーマ大量培養によるものであり、その技術の解決は工業
的に重要なテーマである。
従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。
を用いて実験室的規模で行なわれている。
一方近年細胞の大量培養法及びそのための装置として、
いくつかの提案がなされている。これらの提案は、大き
く分けて付着培養（ａｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ）と浮遊培養、つまりサスペ
ンション培養（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ ＞との２つの方式に分類されるが、これらの方式は
培養される細胞の特性によっていずれかに決められる。
いくつかの提案がなされている。これらの提案は、大き
く分けて付着培養（ａｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ）と浮遊培養、つまりサスペ
ンション培養（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ ＞との２つの方式に分類されるが、これらの方式は
培養される細胞の特性によっていずれかに決められる。
本発明はサスペンション状態で細胞を培養する方式にお
ける改良方法に関する。そのサスペンション状態によっ
て細胞を培養する方法に関し、最近いくつかの提案があ
り、例えばマグネテイツクスターラーもしくは機械的に
駆動されるシャフト１−の羽根中に３ｊ、つ−Ｃ、スビ
犬−フラスコの中に調整された攪拌機能を設（プた培養
方法などが提案され（いる（例えば特開昭５７−６５１
８０号公報参照）。
ける改良方法に関する。そのサスペンション状態によっ
て細胞を培養する方法に関し、最近いくつかの提案があ
り、例えばマグネテイツクスターラーもしくは機械的に
駆動されるシャフト１−の羽根中に３ｊ、つ−Ｃ、スビ
犬−フラスコの中に調整された攪拌機能を設（プた培養
方法などが提案され（いる（例えば特開昭５７−６５１
８０号公報参照）。
−１ｊ細胞のｊｅｔ、 ＷＬにおいては、通常酸素（０
２）の供給を必要どし、そのためサスペンション液の液
面の気相部から酸素含有ガスを溶解させて供給りるｈ−
法、又はサスペンション液中へ酸素含有ガスを吹込／Ｖ
で供給（る方法などによって、サスベンジ１ン液中の酸
素を一定濃度に維持している。
２）の供給を必要どし、そのためサスペンション液の液
面の気相部から酸素含有ガスを溶解させて供給りるｈ−
法、又はサスペンション液中へ酸素含有ガスを吹込／Ｖ
で供給（る方法などによって、サスベンジ１ン液中の酸
素を一定濃度に維持している。
これらの方法による酸素の供給は、小規模に４３いて細
胞を１８養づる場合には、特に問題を引起さない。
胞を１８養づる場合には、特に問題を引起さない。
しかし、細胞培養を工業的規模、集中高密度で実施しよ
うどＪる場合には、上記の酸素供給方法は、いずれも不
適当である。すなわちリスベンジコン液面の自由表面か
ら酸素を供給する場合は、リスベンジ」ン液量が増大す
るとそれと共に液表面の面積を増加させることが出来ず
、工業的規模では、酸素の供給不足を避（〕ることは不
可能に近い。
うどＪる場合には、上記の酸素供給方法は、いずれも不
適当である。すなわちリスベンジコン液面の自由表面か
ら酸素を供給する場合は、リスベンジ」ン液量が増大す
るとそれと共に液表面の面積を増加させることが出来ず
、工業的規模では、酸素の供給不足を避（〕ることは不
可能に近い。
またサスペンション液中へ酸素含有ガスを吹込んで供給
する場合には、発泡によつ−Ｃ液面が上界し、時には操
作を継続することさえ困難となる。
する場合には、発泡によつ−Ｃ液面が上界し、時には操
作を継続することさえ困難となる。
さらにこの方式は、気泡と接触することによって死亡乃
至増殖活性が弱まる細胞には採用し難いし、また気泡に
よって分離現象が起る細胞（例えば成る種の植物細胞）
にも同様に用いることは出来ない。
至増殖活性が弱まる細胞には採用し難いし、また気泡に
よって分離現象が起る細胞（例えば成る種の植物細胞）
にも同様に用いることは出来ない。
前記したいずれの酸素供給方式も、工業的規模で、しか
も高密度による培養を行う場合には、それらの欠点又は
困難性は更に拡大される。
も高密度による培養を行う場合には、それらの欠点又は
困難性は更に拡大される。
そこで本発明者は、上記の如き酸素供給方式の欠点がな
く、種々細胞の生育にも阻害がなく、■−業的規模にお
いてもまた高密度培養においても採用し得、その上酸素
供給操作が簡単でＨつ培養操作のトラブルがない方法に
ついで研究を進めた結果本発明に到達した。
く、種々細胞の生育にも阻害がなく、■−業的規模にお
いてもまた高密度培養においても採用し得、その上酸素
供給操作が簡単でＨつ培養操作のトラブルがない方法に
ついで研究を進めた結果本発明に到達した。
（Ｃ） 発明の構成
づなわら、本発明は細胞をサスペンション状態て゛培養
−するに当り、酸素を溶解しているフルオロカーボンを
該サスペンション中に供給することを特徴と−する細胞
培養方法である。
−するに当り、酸素を溶解しているフルオロカーボンを
該サスペンション中に供給することを特徴と−する細胞
培養方法である。
かかる本弁明方法によれば、酸素を溶解しているフルオ
ロカーボンを細胞が浮遊しているサスペンション液中へ
直接供給することによって、そのフルオロカーボンの表
面からサスペンション液中へ酸素の溶解拡散が起り、該
液中への酸素の供給が行なわれる。
ロカーボンを細胞が浮遊しているサスペンション液中へ
直接供給することによって、そのフルオロカーボンの表
面からサスペンション液中へ酸素の溶解拡散が起り、該
液中への酸素の供給が行なわれる。
本発明者のｆｉｌｌ究によれば、酸素を溶解しているフ
ルオロカーボンを細胞が浮遊しているサスベンジ１ン液
へ直接供給してフルオロカーボンと細胞とが接触しＣも
化学的にもまた物理的にも細胞は安定であり、生育には
何等の悪影響を受けず増殖すること、殊に細胞を高密度
で培養する場合には４ノースペンシヨンの容積当り大量
の酸素を必要とし、ぞのような場合であっても大量に該
フルオロカーボンを供給しても高密度培養が何等の支障
なく達成されることがわかった。
ルオロカーボンを細胞が浮遊しているサスベンジ１ン液
へ直接供給してフルオロカーボンと細胞とが接触しＣも
化学的にもまた物理的にも細胞は安定であり、生育には
何等の悪影響を受けず増殖すること、殊に細胞を高密度
で培養する場合には４ノースペンシヨンの容積当り大量
の酸素を必要とし、ぞのような場合であっても大量に該
フルオロカーボンを供給しても高密度培養が何等の支障
なく達成されることがわかった。
本発明の細胞培養方法はりスペンジョン状（ぶの細胞培
養に適用されるが、サスペンション状態とは、水性媒体
中で細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞が微小担
体くマイクロキャリアー）に担持されて浮遊しながら、
またマイクロカプセル中で細胞が生育されるような種々
の浮遊培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させ
ながら培養する方式に有利に用いられる。
養に適用されるが、サスペンション状態とは、水性媒体
中で細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞が微小担
体くマイクロキャリアー）に担持されて浮遊しながら、
またマイクロカプセル中で細胞が生育されるような種々
の浮遊培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させ
ながら培養する方式に有利に用いられる。
本発明の細胞培養において培養される細胞は、植物細胞
、動物細胞、微生物細胞などであってもよく、また人為
的或いは遺伝子操作により変性された細胞であってもよ
い。また、例えばマウス×マウスハイブリドーマ、マウ
ス×ヒトハイブリドーマ、ヒト×ヒトハイブリドーマな
どの種々ハイブリドーマ、またＢ細胞或いＴ細胞であっ
てもよい。殊に本発明の培養方法は、動物細胞の培養に
適している。
、動物細胞、微生物細胞などであってもよく、また人為
的或いは遺伝子操作により変性された細胞であってもよ
い。また、例えばマウス×マウスハイブリドーマ、マウ
ス×ヒトハイブリドーマ、ヒト×ヒトハイブリドーマな
どの種々ハイブリドーマ、またＢ細胞或いＴ細胞であっ
てもよい。殊に本発明の培養方法は、動物細胞の培養に
適している。
本発明におけるサスペンション状態の細胞培養において
は、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態で
培養される。培養液は実質的に水Ｊ、すなろ水性媒体に
、種々の無機塩、ビタミン類。
は、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態で
培養される。培養液は実質的に水Ｊ、すなろ水性媒体に
、種々の無機塩、ビタミン類。
補酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質などの通常細胞
培養に使用される添加成分が加えられている。また培養
液には血清を加えることもできるし、血清を用いない所
謂無血清培地を培養液として使用することも出来る。
培養に使用される添加成分が加えられている。また培養
液には血清を加えることもできるし、血清を用いない所
謂無血清培地を培養液として使用することも出来る。
本発明方法に４３いて用いられるフルオロカーボンはそ
れ自体酸素を溶解する能力を有していることは云うまで
もないが、培養条件下で水と混和せず水と２液相を形成
するものであり、細胞の生育をμｍ害しないものである
のが一層望ましい。かかるフルオロカーボンとしては、
常温で液体であるのが有利であり、市販されているもの
が広く利用できる。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料と
して使用されているフルオロカーボン、人工血液としで
使用されている種々のフルオロカーボンが使用できる。
れ自体酸素を溶解する能力を有していることは云うまで
もないが、培養条件下で水と混和せず水と２液相を形成
するものであり、細胞の生育をμｍ害しないものである
のが一層望ましい。かかるフルオロカーボンとしては、
常温で液体であるのが有利であり、市販されているもの
が広く利用できる。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料と
して使用されているフルオロカーボン、人工血液としで
使用されている種々のフルオロカーボンが使用できる。
その具体例としては、炭素数８以上のパーフルオロアル
カン カン類（例えば、パーフルオロデカリン、パーフルオロ
メチルデカリン、炭素数３〜５のアルキル置換基を有す
るパーフルオロアルキルシクロヘキサン）、炭素数５〜
７のアルキル置換基を有−するパーフルオロアルチルテ
トラヒドロフラン類，炭素数４〜６のアルキル置換基を
有するパーフルオロアルキルテトラヒドロビラン類，パ
ーフルオロアダマンタン類（例えばパーフルオロアダマ
ンタン、パーフルオロメチルアダマンタン、パーフルオ
ロジメチルアダマンタン、パーフルオロメチルエチルア
ダマンタン、パーフルオロジエチルアダマンタンなど）
が挙げられる。前記フルオロカーボンは、種々の基、例
えば第３級アミン基を自在したものであってもよい。こ
れらは一種でも二種以上の混合物でも使用される。さら
に住友スリーエム■より発売されている種々のフロリナ
ート＠（ ＦＩｕｏｒｉｎｅｒｔ ）であってもよい。
カン カン類（例えば、パーフルオロデカリン、パーフルオロ
メチルデカリン、炭素数３〜５のアルキル置換基を有す
るパーフルオロアルキルシクロヘキサン）、炭素数５〜
７のアルキル置換基を有−するパーフルオロアルチルテ
トラヒドロフラン類，炭素数４〜６のアルキル置換基を
有するパーフルオロアルキルテトラヒドロビラン類，パ
ーフルオロアダマンタン類（例えばパーフルオロアダマ
ンタン、パーフルオロメチルアダマンタン、パーフルオ
ロジメチルアダマンタン、パーフルオロメチルエチルア
ダマンタン、パーフルオロジエチルアダマンタンなど）
が挙げられる。前記フルオロカーボンは、種々の基、例
えば第３級アミン基を自在したものであってもよい。こ
れらは一種でも二種以上の混合物でも使用される。さら
に住友スリーエム■より発売されている種々のフロリナ
ート＠（ ＦＩｕｏｒｉｎｅｒｔ ）であってもよい。
前記したフルオロカーボンは単に例示のために挙げたの
であって本発明方法の実施を防げない限り他のフルオロ
カーボンであっても何等差支えない。
であって本発明方法の実施を防げない限り他のフルオロ
カーボンであっても何等差支えない。
フルオロカーボンはその比重が水に比べて約１、６・〜
約２ ４ｆｌど人きく、そのため本発明方法を実施する
場合には、サスペンション液の上部に酸素を溶解しくい
るフルオロカーボンを供給しフルオロカーボンがり゛ス
ペンジョン液中に懸濁しながら下方へ落下させる方式を
実施するのが有利である。
約２ ４ｆｌど人きく、そのため本発明方法を実施する
場合には、サスペンション液の上部に酸素を溶解しくい
るフルオロカーボンを供給しフルオロカーボンがり゛ス
ペンジョン液中に懸濁しながら下方へ落下させる方式を
実施するのが有利である。
特にり°スペンジョン培養を縦長の培養槽を用いて、そ
の培養槽はその上部に酸素を溶解したフルオロカーボン
を供給し、その下部から酸素溶解量の低下したフルオロ
カーボンを取出すように設計されたものであるのが本発
明方法の実施に特に有利である。
の培養槽はその上部に酸素を溶解したフルオロカーボン
を供給し、その下部から酸素溶解量の低下したフルオロ
カーボンを取出すように設計されたものであるのが本発
明方法の実施に特に有利である。
本発明方法は、フルオロカーボンは、サスペンション液
中に小さな液滴として懸濁するように供給り−るのが望
ましい。
中に小さな液滴として懸濁するように供給り−るのが望
ましい。
本発明方法に実施に当っては、サスペンション液中にお
いて、細胞に栄養分，酸素，その他生前に必要な成分が
充分に接触するために撹拌することができる。また培養
に必要な栄養物，塩類，抗生物質などを含ｌυだ新しい
培養液をサスペンション状態で細胞が存在する培養槽に
供給しながら、細胞が産出した老廃物，代謝産物，その
他生前阻害物質を含んだ古い培養液をサスペンション液
から抜き出し培養槽の外へ適宜排出するのが、細胞を効
率よく増殖させるために望ましく、特に細胞を高密度で
生育させるためには有利である。
いて、細胞に栄養分，酸素，その他生前に必要な成分が
充分に接触するために撹拌することができる。また培養
に必要な栄養物，塩類，抗生物質などを含ｌυだ新しい
培養液をサスペンション状態で細胞が存在する培養槽に
供給しながら、細胞が産出した老廃物，代謝産物，その
他生前阻害物質を含んだ古い培養液をサスペンション液
から抜き出し培養槽の外へ適宜排出するのが、細胞を効
率よく増殖させるために望ましく、特に細胞を高密度で
生育させるためには有利である。
本発明の方法は、前述したようにサスペンション状態で
細胞培養を行っている培養系に酸素をフルオロカーボン
を介して供給するのであるが、他の酸素供給手段を一部
併用しても何等差支えない。
細胞培養を行っている培養系に酸素をフルオロカーボン
を介して供給するのであるが、他の酸素供給手段を一部
併用しても何等差支えない。
例えば、サスペンション液の自由表面に酸素や空気の如
き酸素含有ガスを接触させて、該液面から一部の酸素を
吸収させてもよく、また、酸素含有ガスをサスペンショ
ン液中に吹込んで補足させることもできる。
き酸素含有ガスを接触させて、該液面から一部の酸素を
吸収させてもよく、また、酸素含有ガスをサスペンショ
ン液中に吹込んで補足させることもできる。
かくして本発明によれば、従来の酸素供給手段において
生じる種々の欠点を克服し、安定した操作で細胞を効率
的に増殖出来、また高密度による培養を容易に可能にす
ることができる。
生じる種々の欠点を克服し、安定した操作で細胞を効率
的に増殖出来、また高密度による培養を容易に可能にす
ることができる。
以下実施例を掲げて本発明方法を説明づるが、本発明は
これらに何等限定を受けるものではない。
これらに何等限定を受けるものではない。
実施例１
実験に用いた装置を図１に示づ。槽仔８０ｍｔｒｒφ。
高さ １４０ ｍｍのガラス製の槽１の中に、高さ３５
Ｍ。
Ｍ。
外径６０．ｍφの円筒状回転フィルター（細胞は通さな
いが液性成分は通過しうるフィルター二本実験ではＧ−
５グラスフイルタ）を内蔵した培養槽を７ｔ−１−クレ
ー１滅菌する。しかるのち１０％牛脂児血清含イＪＲＰ
Ｍ Ｉ １６４０培地２２５ｄを培養槽に仕込み、マ
ウス×マウスハイブリドーマ４Ｇ１０Ｂ６株（親株：Ｐ
３１Ｊ１）を１．５ｘ １０５ｃｅｌ Ｉｓ／ ｍｌ！
で播種する。培養槽上部には５％ＣＯ２含有空気を流通
せしめ、回転フィルターを１５Ｏｒ、ｐ、ｍで回転し、
３７℃で培養を行う。
いが液性成分は通過しうるフィルター二本実験ではＧ−
５グラスフイルタ）を内蔵した培養槽を７ｔ−１−クレ
ー１滅菌する。しかるのち１０％牛脂児血清含イＪＲＰ
Ｍ Ｉ １６４０培地２２５ｄを培養槽に仕込み、マ
ウス×マウスハイブリドーマ４Ｇ１０Ｂ６株（親株：Ｐ
３１Ｊ１）を１．５ｘ １０５ｃｅｌ Ｉｓ／ ｍｌ！
で播種する。培養槽上部には５％ＣＯ２含有空気を流通
せしめ、回転フィルターを１５Ｏｒ、ｐ、ｍで回転し、
３７℃で培養を行う。
３日目に細胞密度を測定したところ、生細胞が９．２ｘ
１０″ｅｅｌ Ｉｓ／ ｔｒｄｌであり、死細胞は認
められなかった１、３日目から図１に示すライン１より
上記組成の新培地を４５０ｒＩｔＩ！、／ ｄａｙの速
度で連続供給を開始し、同時に培養槽内の培養容積が２
２５ｄに一定になるようにライン４の先に取付（プたポ
ンプでフィルター３経由ライン４を通じて培養液を連続
的に細胞と分離して系外へ取り出す。４目目に培養槽内
の溶存酸素濃度が３１１ｐ以下になつＩこので５％ＣＯ
２含有空気の供給を止め、ライン５からあらかじめ酸素
を溶解せしめである、３Ｍ社製フロリノーート ＦＣ，
−４０を培養槽内の溶存酸素最が３ ｐｐｍとなるよう
に、培養槽の上部から滴下して供給する。ＦＣ−４０は
培養槽底部に滞留するが培養液との界面が一定になるよ
うに培養槽からライン６を通して系外へ取出す。６日目
以降は、ライン１より供給する新培地の供給速度を６７
５−／ ｄａｙに変更した。
１０″ｅｅｌ Ｉｓ／ ｔｒｄｌであり、死細胞は認
められなかった１、３日目から図１に示すライン１より
上記組成の新培地を４５０ｒＩｔＩ！、／ ｄａｙの速
度で連続供給を開始し、同時に培養槽内の培養容積が２
２５ｄに一定になるようにライン４の先に取付（プたポ
ンプでフィルター３経由ライン４を通じて培養液を連続
的に細胞と分離して系外へ取り出す。４目目に培養槽内
の溶存酸素濃度が３１１ｐ以下になつＩこので５％ＣＯ
２含有空気の供給を止め、ライン５からあらかじめ酸素
を溶解せしめである、３Ｍ社製フロリノーート ＦＣ，
−４０を培養槽内の溶存酸素最が３ ｐｐｍとなるよう
に、培養槽の上部から滴下して供給する。ＦＣ−４０は
培養槽底部に滞留するが培養液との界面が一定になるよ
うに培養槽からライン６を通して系外へ取出す。６日目
以降は、ライン１より供給する新培地の供給速度を６７
５−／ ｄａｙに変更した。
以上のパーヒユージョン方式による高密度連続培養は操
作性良好であった。細胞密度の測定結果を次に示す。
作性良好であった。細胞密度の測定結果を次に示す。
〈以を余白）
比較例１
実験に用いた装置を図２に示す。実施例１で用いたと同
じ寸法の培養槽にガス吹込み管く先端にＧ−３グラフフ
イルターを取付けたガラス管）を取付はオートクレーブ
滅菌する。しかるのち１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ Ｉ
１６４０培地２２５Ｉｄを培養槽に仕込み、マウス×
マウスハイブリドーマ４Ｃ１０Ｂ６株（親株：Ｐ３Ｕ１
）を１，５ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｄで播種する。培養
槽上部には５％ＣＯ２含有空気を流通せしめ、回転フィ
ルターを１ｓｏｒ、ｐ、ｍで回転し３７℃で培養を行う
。３日目に細胞密度を測定したところ１．ｌｘ １０’
ｃｅｌ Ｉｓ／−であり、死細胞は認められなかっ
た。３日目から図２に示すライン１より上記組成の新培
地を４５０ｄ ／ ｄａｙの速度で連続供給を開始し、
同時に培養槽内の培養容積が２２５７に一定になるよう
にライン４の先に取付けちポンプでフィルター３経由ラ
イン４を通して培養液を連続的に細胞と分離して系外へ
取出す。
じ寸法の培養槽にガス吹込み管く先端にＧ−３グラフフ
イルターを取付けたガラス管）を取付はオートクレーブ
滅菌する。しかるのち１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ Ｉ
１６４０培地２２５Ｉｄを培養槽に仕込み、マウス×
マウスハイブリドーマ４Ｃ１０Ｂ６株（親株：Ｐ３Ｕ１
）を１，５ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｄで播種する。培養
槽上部には５％ＣＯ２含有空気を流通せしめ、回転フィ
ルターを１ｓｏｒ、ｐ、ｍで回転し３７℃で培養を行う
。３日目に細胞密度を測定したところ１．ｌｘ １０’
ｃｅｌ Ｉｓ／−であり、死細胞は認められなかっ
た。３日目から図２に示すライン１より上記組成の新培
地を４５０ｄ ／ ｄａｙの速度で連続供給を開始し、
同時に培養槽内の培養容積が２２５７に一定になるよう
にライン４の先に取付けちポンプでフィルター３経由ラ
イン４を通して培養液を連続的に細胞と分離して系外へ
取出す。
４日目に培養槽の溶存酸素′ｍ度が３ ｐｐｍ以下にな
ったので、ガス吹込みライン５から５％ＣＯ２含イ１空
気を培養槽中に溶存酸素濃度が３ ｐｐｍとなるように
吹込んだ。空気吹込み開始と同時に培養液−１一部に約
１０ｍの泡沫層を形成した。細胞密度を測定したところ
生細胞１，７ｘ １０６（ｅｌｌｓ／ｄ、死細胞３．Ｏ
ｘ １０’ Ｃｅｌ Ｉｓ／ Ｉｎｌ１であった。５
日目には泡沫層の＾さが約３０ ｍｍとなり細胞密度は
生細胞３．８ｘ１０６ｃｅ１１ｓ／ｍ１．死細胞１．２
ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／Ｉｎｌであった。６日目には泡沫
層が高くなり排気ライン６へ泡沫層が流出し連続操作不
可能となったので実験を打切った。この時点での細胞密
度は生細胞５．１ｘｌＯＧｃｅｌｌｓ／＃！ｉ！、死細
胞２．１ｘ１０６ｃｅｌｌＳ／ｄであった。
ったので、ガス吹込みライン５から５％ＣＯ２含イ１空
気を培養槽中に溶存酸素濃度が３ ｐｐｍとなるように
吹込んだ。空気吹込み開始と同時に培養液−１一部に約
１０ｍの泡沫層を形成した。細胞密度を測定したところ
生細胞１，７ｘ １０６（ｅｌｌｓ／ｄ、死細胞３．Ｏ
ｘ １０’ Ｃｅｌ Ｉｓ／ Ｉｎｌ１であった。５
日目には泡沫層の＾さが約３０ ｍｍとなり細胞密度は
生細胞３．８ｘ１０６ｃｅ１１ｓ／ｍ１．死細胞１．２
ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／Ｉｎｌであった。６日目には泡沫
層が高くなり排気ライン６へ泡沫層が流出し連続操作不
可能となったので実験を打切った。この時点での細胞密
度は生細胞５．１ｘｌＯＧｃｅｌｌｓ／＃！ｉ！、死細
胞２．１ｘ１０６ｃｅｌｌＳ／ｄであった。
実施例２
柴田バリオ社製４す培養用スピンナーフラスコに１０％
牛脂児血清添加ＲＰＭ Ｉ １６４０ 、培地４塁を
仕込み、ヒト丁セルラインＭＬＴ２．２株を１×１０５
ｃｅｌ Ｉｓ／ ｍａｌで播種し回転数６Ｏｒ、ｐ、ｍ
、 ３７℃で培養を開始した。培養槽上部には５％含
有空気を流通せしめた。培養開始２日目から、培養槽内
の溶存酸素濃度が３ ｐｐｍとなるようあらかじめ酸素
を飽和したフルオロカーボンＦＣ−４０を滴下して培養
を継続した。２日目の生細胞密度は３．２×１０５Ｃｅ
ｌｌＳ／ｍｅであり、５日目は９．８ｘ １０５ｃｅｌ
ｌＳ／ｄであった。
牛脂児血清添加ＲＰＭ Ｉ １６４０ 、培地４塁を
仕込み、ヒト丁セルラインＭＬＴ２．２株を１×１０５
ｃｅｌ Ｉｓ／ ｍａｌで播種し回転数６Ｏｒ、ｐ、ｍ
、 ３７℃で培養を開始した。培養槽上部には５％含
有空気を流通せしめた。培養開始２日目から、培養槽内
の溶存酸素濃度が３ ｐｐｍとなるようあらかじめ酸素
を飽和したフルオロカーボンＦＣ−４０を滴下して培養
を継続した。２日目の生細胞密度は３．２×１０５Ｃｅ
ｌｌＳ／ｍｅであり、５日目は９．８ｘ １０５ｃｅｌ
ｌＳ／ｄであった。
比較例２
実施例２と全く同じ条件で培養を開始した。但し、フル
オロカーボンの培養系への供給は行わなかった。この培
養実験における２日目の生細胞密度は２ｘ１０５ｃｅｌ
ｌｓ／ｓ＋ｅであり、５日目は１．８×１０５Ｃｅｌｌ
Ｓ／ｄで死細胞が多数認められＩｃ。
オロカーボンの培養系への供給は行わなかった。この培
養実験における２日目の生細胞密度は２ｘ１０５ｃｅｌ
ｌｓ／ｓ＋ｅであり、５日目は１．８×１０５Ｃｅｌｌ
Ｓ／ｄで死細胞が多数認められＩｃ。
実施例３〜７．比較例３，４
柴田バイオ社製１００ｄ 、培養用スピンナーフラスコ
２に図３に示ず。ライン１及びライン３を取付けたもの
を培養槽として用いる。
２に図３に示ず。ライン１及びライン３を取付けたもの
を培養槽として用いる。
培養槽に１００＃１１！の第１表に示す培地を送入する
。
。
次いでマウスＸマウスハイブリドーマ４ ＣＩＯＢ ６
株を５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／＃Ｉｅの密度で播種し６０
ｒ、ｐ、ｍ
株を５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／＃Ｉｅの密度で播種し６０
ｒ、ｐ、ｍ
図１は本発明の実施例１において用いられた培養槽の概
略図を示し、図２は比較例において用いられｌこ培養槽
の概略図を示し、また図３は実施例３３〜７にａ３い（
用いられた培養槽の概略図を示したものである。 第１図 第２図 第３図
略図を示し、図２は比較例において用いられｌこ培養槽
の概略図を示し、また図３は実施例３３〜７にａ３い（
用いられた培養槽の概略図を示したものである。 第１図 第２図 第３図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞をサスペンション状態で培養するに当り、酸素
を溶解しているフルオロカーボンを該サスペンション中
に供給することを特徴とする細胞培養方法。 ２、該フルオロカーボンの少なくとも一部は液滴状で該
サスペンション中に存在する第１項記載の細胞培養方法
。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59120784A JPS60264212A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | モ−ルドコイルの製造方法 |
| JP59120724A JPS611383A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 細胞培養方法 |
| DE8585201026T DE3584317D1 (de) | 1984-06-14 | 1985-06-12 | Verfahren zur zuechtung tierischer oder pflanzlicher zellen. |
| EP19850201026 EP0164813B1 (en) | 1984-06-14 | 1985-06-12 | Method of cultivating animal or plant cells |
| DK268585A DK268585A (da) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | Fremgangsmaade til dyrkning af dyre- eller planteceller |
| US07/668,473 US5180676A (en) | 1984-06-14 | 1991-03-13 | Method of cultivating animal or plant cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59120724A JPS611383A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 細胞培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611383A true JPS611383A (ja) | 1986-01-07 |
Family
ID=14793429
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59120784A Pending JPS60264212A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | モ−ルドコイルの製造方法 |
| JP59120724A Pending JPS611383A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 細胞培養方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59120784A Pending JPS60264212A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | モ−ルドコイルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS60264212A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01218340A (ja) * | 1988-02-25 | 1989-08-31 | Makita Electric Works Ltd | 整流子電動機のターミナルベース製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50908A (ja) * | 1973-03-16 | 1975-01-08 | ||
| JPS50125082A (ja) * | 1974-03-22 | 1975-10-01 |
-
1984
- 1984-06-14 JP JP59120784A patent/JPS60264212A/ja active Pending
- 1984-06-14 JP JP59120724A patent/JPS611383A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50908A (ja) * | 1973-03-16 | 1975-01-08 | ||
| JPS50125082A (ja) * | 1974-03-22 | 1975-10-01 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60264212A (ja) | 1985-12-27 |
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