JPS60199380A - ガス吹き込み細胞培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は増殖できる、こわれやすい細胞の培養方法に関
し、特に、そのような細胞の培養における最適化したガ
ス交換の方法に関する。本発明の方法により利益を受け
る細胞には、種々のミエローマ細胞のごとき動物細胞株
、初代培養からの自然のまたは人工的に形質転換した細
胞株、ハイブリド−マのごとき融合細胞、悪性腫瘍形質
転換株、および例えばスフェロプラストのごとき細胞壁
を持たない他の細胞が挙げられる。

従来の技術 動物細胞培養に酸素が必須である事、および細胞内への
拡散に利用できる酸素の紙が細胞の生存率および成長に
重要である事はよく知られている。

一般的に、はとんど酸素がないと、細胞は死に、最も良
くてもその成長を制限する。例えば、成長しているバイ
ブリドゝ−マ培養細胞は少くとも約０１２ミリモルの酸
素／リットル／時間／１０細胞を必要とする。もしより
少ない酸素しか利用できない場合は有糸分裂およびタン
パク質合成が制限される。また非常に多量の酸素は、必
須タンパク質の酸化により細胞を殺す酸素毒性を誘発す
る。

酸素吸収の細胞培養による速度は培養細胞の成長に伴い
増加し、培養細胞の密度が増すにつれ、充分な債の酸素
を培養液表面から培養液の内部へ移送する事がより困難
になる。

ｐＨおよび重炭酸塩濃度に影響を与える二酸化炭素もま
た動物細胞成長維持に必要とされる：もし多量の細胞の
成長をめるならその調節は必須である。

普通、実験室規模での哺乳類細胞培養技術では培地中に
懸濁した細胞をハトリ皿へ輩く。酸素および二酸化炭素
は培地の表面を通って細胞内へ拡散する。培養培地の深
さが細胞へ拡散する酸素および二酸化炭素の速度に影響
する。培地の深さが増加すると、培地の容量に対する培
地の表面面積の比が減少する。ある時点で皿上部の空気
中の酸素および二酸化炭素濃度および／または培地中へ
溶解速度が成長中の細胞の要求を満足させる十分よガス
濃度を培地のすべての所に供給するのに不十分なものと
なる。この時点で酸素有効性が成長制限因子となる。従
って、従来の技術はそのような静的培養の培地の深さは
ミリメーター範囲内である事な教えている。一般的に、
そのような培養の細胞密度の上限は、その酸素供給のた
めに上部空間へ空気を用いると約１０　細胞／培養液ミ
リリットルである。

細胞培養技術の規模を大量生産表の哺乳類細胞まで大き
くすると細胞の要求量を満足する充分な酸素量の有効性
を維持するのが困炸となる。

ＧｌａｃｋｅｎらによるＭａｍｍａｌｉａｎ　Ｃａ１１
Ｃｕｌｔｕｒｅ　：Ｅｎｇｉｎｅｓｒｉｎｐ　Ｐｒｊｎ
ｃｉｐｌｓｓ　ａｎｄ　５ｃａｌｓｕｐ　ＴｒａｎａＳ
ｉｎ　１３ｉｏｔ　ＣＪｒｎｄ、ｕｇＹ（哺乳類細胞培
養：工学原理およびバイオテクノロジーにおける規模拡
大傾向）、Ｅｌｓｅｖｉｓｒ　５ｃｉａｎｃｓ　）’ｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　＋　０１６６−９４３０７８３
．１０２に一ジ（１９８３）を参照されたい。この問題
に対する一つの解答は、細胞密度の増加ににつれて、培
地表面上の上部空間の酸素および二酸化炭素の濃度を増
加させる事である。しかしながら、この方法では非常に
多量の酸素が培地の表面に存在し、酸素毒性を起こすた
め、培地中のガスの最適な比を維持する為に、高価な計
量器および酸素センサーで培地中の酸素濃度を連続的に
試験および調整せねばならない。

細胞壁を持つ細胞（例えば原核細胞の細胞）の成育にお
いては必要なガス濃度を細胞に供給するため、しばしば
培地に直接ガスを吹き込む。しかしながら細胞膜を持た
ない培養細胞はきわめてこわれやすく、培地中を適当な
ガス濃度にするため充分に高い速度でガスを吹き込むと
物理的損傷を受けるので直接吹き込みは不適当である。

また、すべての動物細胞培養で広く必要とされる培地中
のタンパク質成分が培地表面に泡をｒ「す、それが細胞
を捕捉する。泡に捕捉された細胞は急速に死ぬ。発泡を
おさえるために培地へ添加される消泡剤は培地中の細わ
に非常に毒性がある。

Ｇｌａｃｋｅｎの論文に記載されているごとく、細胞培
養分野での最近の発展においては、高細胞密度にするた
めアルギン酸カルシウムから成るカプセルに細胞を封じ
ている。”生物材料のカプセル化′。

と題した米国特許第４．３５２８８３号は細菌のごとき
有害なものから細胞を保護するカプセル化細胞について
記載している。米国特許第４，４０９，３３１号は半透
性カプセル膜内に細胞を配置したカプセル化細胞培養か
ら動物および他の細胞生成物を採取する事によりそのよ
うな生成物を生産する方法について記載している。

発明が解決しようとする問題点 前記の事から明らかなごとく、哺乳類および他のこわれ
やすい細胞の培養における改良したガス交換法を提供す
る事が望まれている。従って、細胞を損傷させたり、高
価なモニター技術に頼る事なく培地中のガス濃度を最適
化するのが本発明の目的である。他の目的は成育してい
る大量の細胞培養液（例えば２０−３０！Ｊンター培養
）を高細胞密度（例えば１×１０　細胞／　ｍｅ　）に
する過程を提供する事である。他の目的は細胞を損傷す
る事なく細胞のガス必要量を満足させるようにガス吹き
込みを用い、動物細胞またはスフェロプラストのごとき
細胞壁のない細胞を培養する事である。他の目的は多く
の正常組織の細胞密度と比較できるくらいの密度に培養
で動物細胞を成長させる事である。

問題を解決するための手段 本発明はこわれやすい細胞（即ち、細胞壁を持たない細
胞）を高密度まで有効に培養する方法を特徴とする。本
方法は成長させる細胞の種培養細胞を含有する長球カプ
セルを培地中に懸濁する段階を含んでいろ、カプセルは
物理的損傷から細胞を十分に保護し、細胞の成長を保持
するのに必要な必須栄養素（ビタミン、イオン、ガスそ
の他）を通過させるのに十分な透過性のある半透膜から
成っている。細胞により必要とされるガス含有組成物は
細胞成長の間、連続的にまたは間欠的に培地を通し懸濁
したカプセル間に直接吹き込む、吹き込むガスの組成は
培地中の酸素および／または二酸化炭素の濃度を実質的
に一定に保ち、細胞の有糸分裂および代謝を保つのに適
した量の酸素および／または二酸化炭素を供給するのに
十分な濃度を保つのに十分なものである。通常の培地お
よびこのガス吹き込み技術を用いろと、カプセル中の細
胞を５×１０　細胞／細胞を入れたカプセルのｍｅの程
度成長させる事ができる。もし望むなら、細胞により産
生された物質はカプセル内からまたは培地から採取され
ろ。

動物細胞を成長される場合の良好な具体例においては培
地内に望ましい０２／ｃＯ２含量を産み出すのに十分な
ように平衝化した量の二酸化炭素および酸素を吹き込み
ガスは持っている。良好には培地の０２／ＣＯ２含量は
最適な細胞成長を促集する事によりカプセル内の細胞密
度を最大化するのに十分な量である。この事は吹き込み
ガス中に存在する酸素が約０．１５朋Ｈ，９および約４
５０ｍｍＨ！９　の間の水準であり、良好には少くとも
０１５および２００龍Ｈｇ　の間であり、哺乳類細胞に
最適なのは１５０−１７０ｙｎｔｘＨ＆　である事を意
味している。

都合よく、本過穆で成長する哺乳類細胞とじて遺伝子工
学による細胞、ミエローマ細胞およびノ・イブリド−マ
および他の融合細胞が挙げられる。

ガス交換に吹き込みを用いる哺乳類細胞培養のための本
技術の主要な利点は、富豊な供給ガスが接近する事によ
り細胞に提供される事である。それ故ガス交換が成長制
限因子にならない水準の酸素および／または二酸化炭素
により密集および大量培養さえもできる。この事は細胞
は膜中に刀ゾセル化され、それ故に吹き込みにより通常
起こされる物理的損傷から保護されているため可能であ
る。吹き込むガスのガス濃度および培地中のガス濃度間
の吹き込み速度閾値で平衝が確立できるので吹き込みは
培地の最適な濃度の酸素および二酸化炭素を提供する有
効な方法である。培地中の酸素および二酸化炭素濃度は
それ故吹き込むガス中のその濃度を調節する事により最
適水準に調整できる。これにより高価なモニター用およ
びガス計測装置の必要性が除去される。

当事者は、図と伴に、特許請求の範囲および以下の詳細
な説明を読むと本発明の他の特徴ある目的および利点が
明らかになろう。

図１は本発明に使用するのに適したマイクロカプセル内
に封じた咄乳類細胞を図式的に例示しており； 図２は本発明の実施に使用するのに適した細胞培養器具
を図式的に例示しており； 図３はガス吹き込みによるおよび吹き込みなしでの種々
のバッチ式に供給した培養液の時間に対する培地ミリリ
ットル当りの総細胞畿のグラフであり； 図４は連続的に供給したガス−吹き込みカプセル化培養
の時間に対する細胞数／細胞を入れたカプセルのｍｅの
グラフであり、本発明の過程を使用して達成できる細胞
密度をｆ＆ｌＪ示しており；および図５は図４と同様の
グラフであり、バッチ式供給培養の成長を示している。

本発明は半透膜でカプセル化した細胞壁のない細胞（例
えば咄乳類細胞）はガス吹き込みにより起こされる物理
的損陽および酸素毒性の問題から実質的に免れ、そのよ
うな細胞に対する酸素および／または二酸化炭素の供給
にガス吹き込みが有効に用いれるという観察に基づいて
いる、本発明の方法を使用すると酸素および二酸化炭素
の濃度を平衝化し、培地中の最適の水準を提供し、大規
模細胞培養容器で細胞が増加する。培地中の０２および
ＣＯ２濃度は、吹き込みガス中のその濃度に比例するの
で、濃度のモニターおよびそれに付随する出費は必要と
しない。

図ＩＫ戻ると、咄乳類細胞１１は長球の、典型的には球
形のカプセル１３内に米国特許第４．３５２８８３（そ
の記載は本明細書で参考文献として現金されている）号
に示された方法によりカプセル化される。現在の良好な
カプセル化技術は本出願と同じ日付で出願された出願中
の出Ｎｆｉ番号（ＤＢＨ−４５２）に記載されている、
この出願の記載もまた本明細書に参考文献として現金さ
れている。典型的なカプセル化過８においては１．　％
　（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム（ＮａＧ−Ｋｅｋｏ
　ＬＶ）巾約１０６細胞／　ｍｅを含有する懸濁液を形
成する。この懸濁液中の細胞密度が種培養細胞が最終的
に産生ずるカプセル当りの細胞数を決定するだろう。懸
濁液を上部空気摂取ノズルおよびストッパーへ摩擦で固
定した伸長中空本体な持つ縦わく架構からなるジェット
−ヘッド器具へ移す。ステッピングポンプを付けたシリ
ンジ（例えば１０ｃｃシリンジ）を針（例えば００１イ
ンチ１．Ｄ、テフロン被覆針）で縦わく架構の上に装着
し、縦わく架構の長さ押し出す。縦わく架構の内部は釧
の先端が空気ナイフとして働く一定の層流を受けるよう
に計画する。

使用においては、カプセル化する物質を含有する溶液で
シリンジを満たし縦わく架構上に装着し、ステッピング
ポンプを働かせ針先端へ溶液を強制的に降下させる。空
気流で各々の滴を゛°切断し°“、１２チ（Ｗ／Ｖ）塩
化カル／ラム溶液へ約２．５−３．５ｃｍ落下させ、形
成するゲル化した塊な吸引により集める。ゲル化した塊
は補充した３容量の等帰環溶液中でインキュベートし、
総計で約１１分間ゲル膨張させろ。次に等帳場溶液中７
５０■／ｌポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、分子量６５、０００ダルトン
）と接触せしめてゲル化塊のまわりに膜を形成する。１
２分間反応せしめた後、生じるカプセルを１０分間塩水
中０．２　％　（ｗ／ｖ）塩化カルシウムを含有するＣ
ＨＥＳ（２−−／クロヘキシルアミノエタンスルホン酸
）　Ｗ’／１１　液（Ｓｉｇｎａ）ノ１．４９／ｌ溶液
で洗浄する。カプセルを約８分間０３％（ｗ／ｖ）塩化
カルシウム塩水で洗浄し、塩水中ｘｏｓｑ／７のポリビ
ニルアミン（Ｐｏｌｙｅｃｉｅｎｃｅ＋分子量５０．０
０σ−１５００００）と１０分間反応せしめてカプセル
のまわりに第２の膜を形成する。カプセルを再び２容量
の等帳場液液で７分以上洗浄し、７分間、５×１０　チ
（ｗ／））Ｎ（ＺＧ塩溶液中に浸し次の被覆をする。カ
プセルを塩溶液中さらに４分間洗浄し２回５５ｍＭクエ
ン酸塩溶液に浸しカプセル内部りを再液化する（１回目
は２０分間および２回目は６分間）、カプセルを２度塩
溶液で洗浄し、１度培地で４分間洗浄する。カプセル１
３は成育培地１６中でインキュベートする準備ができた
ことになる。

図ＩＫ［＋！Ｉ示し、本カプセル化過程に従って調整し
たカプセルは、高分子量タンパク質、バタテリアおよび
培養する細胞を実質的に透過させない膜を持っている。

図２は本発明に従った細胞培養のための器具を図式的に
例示している。それは３１６Ｌステンレス鋼の電解研磨
した５０リツトル容量の容器１０にヘッドプレート１２
がとり付けられている。モーター１４はかい心棒１６を
動がし培養液２２内に配置されたかい１８および２０を
回転させる。培養液２２は血清を添加したＥａｇ１θ　
改良培地のごとき通常の培地からなる。もしくは以下に
記載されるタイプの約３６０ミリオスモルの浸透圧乞持
つ浸透圧の高い培地であってもよく、非常に詳細には本
出願と同じ日付で出願された出願中の米国出願番号（代
理人処理予定事項第ＤＢＨ−４５７）に記載されており
、その記載は本明細書に参考文献として現金されている
。図１に示したカプセルのような多数のカプセルを培地
に懸濁する。典型的にはカプセルは球形または長球であ
り約２龍以下程度の直径を持っている。平均直径が０８
闘程度のカプセルが５まく働く。

細胞のガス必要性は無菌フィルター２４．空気管２６．
および吹き込みヘラ）＃２８を通して酸素および二酸化
炭素含有ガスを通す事により満足させられる。吹き込み
ヘット９２８は２５ミクロンの微少多孔性の磁器性のフ
ィルターから成っている。

動物細胞成長の為にはガスは９５％空気、５φＣＯ□（
容量）から成っている。吹き込みヘッド乞通してガスを
ふくふくと通気し、カプセル間の培地を通して吹き上げ
る。培地中の酸素分圧が実質的にガス中の識素分圧と等
しく保つのに十分な吹き込み速度にするべきである。培
地中の酸素圧は細胞が最適な成長に必要とする水準また
はその少し上の水準にセットされる。培地中の血清成分
のため、吹き込みにより泡が生じ容器１０の上部空間３
０に集まる。しかしながら一時的に池内へ輸送されても
カプセルは細胞を脱水から保護し、また細胞を機械的損
傷からも保護する。それ故、カプセル化培養液中へのガ
ス吹き込みは増加した細胞集団の酸素に対する要求を満
足させる事ができ、それにより非常に高い細胞密度を達
成する事を可能にする。培養液を通過したガスは排気口
３２およびフィルター３４を通って出る。３０リツトル
培養液に対する典型的なガス流量は１時間当り０２標準
平方フイートである。

本発明をバッチ−供給様式で実行する場合、培地を容器
１０内へ種培養細胞を含むマイクロカプセルと伴に単に
計量しながら供給し、培養細胞はガス吹き込みをして最
大密度に成長させる。しかしながら、本発明を実行する
最良の方法は多分連続的または間欠的な培地の流れを入
口３８へ導入する事により培養を通じて培地乞通し、フ
ィルター要素４０を通して培地を排水する。フィルター
要素４０はステンレスで、カプセルの直径より少さい孔
を持つ微少多孔性のメツシュ（ｆｕｌｌえば５０から１
００ミクロン）からなっている。培地はバルブｌＩ２＋
￥通して吸引されろ。培養液の培地の水準は透明な側管
４４で観察される。入口３８に入り、フィルター４０を
通して出る培地の典型的な滝川は１分当り４ｍｌから１
２ｍｅで・ある。

もし鞘堂により産生されるタン・ξり質または他の物質
を採取しようとする場合は、用い乙方法は興味ある物質
の有効な分子の大きさおよびカプセル膜の透過性の関係
に依存するであろう。前に参照した特許に記載されてい
るごとく、カプセル膜の透過性はある制限以内では調節
できる。もし興味あるタンパク質が膜を横切るには太き
すぎる場合はタン・ξり質はマイクロカプセル内で集め
；もしそれが膜を横切るのに十分小さいならば、カプセ
ル外の培地内に採取されるであろう。

使用においては、システムの使用者は培地２２に溶解す
る酸素および／またはニジ化炭素の望ましい量を決定す
る。選択されたガス濃度および比率は培養する細胞の１
重類（で依存するが、現在のまたは計画した細胞密度に
は依存しない。多くの動物細胞に対する望ましい酸素濃
度（分圧）は約１５および２００＋１ｌＩＩＩＨ＆　の
間であるであろう。例えば、細胞の培養に選択された酸
素ａ度は細胞を提供するのに十分なＯ１２ミリモル／リ
ットル／時間／１０細胞（激しい細胞成長の初期の状態
の近似量小必要量）より大きいであろう。

培地中のガスの濃度は実質的に提供される吹き込みガス
中のガスの濃度に比例し、吹き込み速度は細１１５１の
呼吸活性により起こされる０２／ＣＯ２濃度の変化なな
くすのに十分速いものである。限界水準において、吹き
込み速度はガスおよび容器１０の液体相間の平衝を維持
するのに十分なものである。／ステム使用者は従って望
まれるガスの混合物を吹き込みヘノ）’２８に供給する
吹き込み速度をセットする事ができる。吹き込みヘッド
２８は培地中の酸素濃度を実質的に一定に維持する速度
で培養液２２ヘガスを供給する。３０リツトル培養容ｋ
（における一つのそのような速度は０２律準立方フィー
ト／時間である。カプセル１３は培地内の細胞１１を機
械的横部から保護している。カプセルはまた容器の上部
空間の泡の中へ輸送された却１胞を酸素傷害または脱水
から保護している。

培地２２に溶解するガスの濃度およびそれを通じて吹き
込むガスの前もって選択された濃度間に平価が確立され
るので培地中の酸素濃度はモニターする必要がない。

吹き込みを続け、カプセル１３内の細胞１１を有糸分裂
させる。ついに細胞培養が望んだ細胞密度に達した時抗
体のごとき細胞により産生される物質がカルセル内また
はカプセル外の培地から採取される。

上に記載したごときマイクロカプセル化細胞培養系の吹
き込みにより、細胞を入れたカプセルでは約５×１０　
細胞／ミリリノ］・ルまたは培地では約１×１０　細胞
／　ｒｔｔｌの細胞密度を持っている事か観察された。

これは通常の培養技術に対し約２桁程度の改良である。

細胞密度の増加による細胞産生物収率の改良のほか、本
発明によるガス吹き込みは細胞培養技術を商業生産水準
まで規模拡火する事を可能にする。

それ故マイクロカプセル化哺乳類細胞に対し、改良され
た有効なガス交換を吹き込みが提供する事がわかった。

実施例 本発明は以下の限定されない実施例からさらに理解され
るであろう。

実施例１ ミリリットル当り約ｌＯマウスーマウスハイブリ）パ−
マ細胞を含有する約８００ｍ１の細胞含有カプセルを２
３リツトル容量のカプセル化種培養細胞を作るのに十分
な培地に均等に分散する。同時に２３リツトル容看の培
地単位容量当り同じ細胞を同じような数含有する培地を
調製する。培地は５チウ／胎児血清を供給した標準Ｅａ
ｇ１ａ培地である。

４つの種培養細胞は緩かに撹拌し１０日の間培地を供給
しない。１つのカプセル化培養および１つの非カプセル
化培養では１時間当り０３標準立方フイートの速度で５
日間、その後１時間当り１．０標準立方フイートで吹き
込む。残りの２つの種培養細胞には吹き込みをしない。

吹き込むガスは５φＣＯ２および９５チ空気（容量）の
組成である。

各々の培養の、ｌ′ｌｌ＋胞密度をモニターし、そのデ
ータをプロットした。結果は図３に示しである。

デー、夕から明らかなように、６日後非吹き込みカプセ
ル化培養は約８×１０　細胞／ｍｅ＠養液の細１泡密度
まで成長し、非吹き込み通常の細胞培養ででは約３×１
０　細胞／　１ｎｅの密度まで成長した。吹き込みを行
った非カプセル化およびカプセル化培養では各々約１．
５Ｘ］Ｏ細胞／　ｍｌおよび］、、３Ｘ１０６細胞／　
ｍｌの密度まで成長した。その後、非吹き込みおよび吹
き込み懸濁培養両方の細胞密度は急速に１０日まで落ち
、両方の培養液の密度は２×１０５細胞／ｍｅ未満であ
った。この事は吹き込み非カプセル化培養は上部空間か
ら培地に溶解する酸化を利用する同じ培養と比較して何
の著しい有益な効果を持たない事を示している。非吹き
込みカプセル化培養は中程度により成功したにすぎない
。その細胞密度は約７×ｌＯ細胞／　ｍｅであり９日目
に減少した。反応にカプセル化吹き込み培養では２日目
から９日目にかけて定常的な細胞密度の増加を示し、そ
の後細胞密度は約３×１０　に維持された。この実施例
はもし感受性の高い動物細胞をガス吹き込みカプセル化
培養で成長させると、その細胞における細胞生存率およ
び細胞成長が促進され、この結果を達成するＫはカプセ
ル化および吹き込み段階の両方が必要な事を示している
。

実施例２ ２つのカプセル化ハイブリド−マ培養液を調製し、５チ
ウン胎児血清、正常濃度の１００倍の鉄イオ／および正
常濃埠の２倍のアミノ酸を供給したＥａｇｌθ培地中に
懸濁する。培地は約３６０ミリオスモルの浸透圧を持つ
。培養番号１は最初５×１０５細胞／・′培養液Ｉｎｅ
の細胞密奪ヲ持ち、１３日間６ｍｅ１分でＡ１鮮な培地
ケ循環させ、その後５日間ＩＬｍｌ１分で培地ケ供給す
る。培養番号２（初期細胞密度Ｉ　Ｘ　ｌ　（ｌ　細胞
／　ｍｅ　）は９日間連続的に４ｍｅ／分で培明を供給
し、９−２０の各々の日において１１当り１０リツトル
の培地で置換する事によりバッチ式で供給する。両方の
培養ともその成長ザイクルを通して１時間当り０２標準
立方フィードで空気２吹き込む。各々の培養における細
胞密度をモニターする。結果を図４および５に示した。

図示したごとく、連続的供給培養（図４）ては１７日目
およびそれ以後において１×１０　細胞／′細胞含有カ
プセルｍｅおよび５×１０　細胞／細胞含イ１カプセル
ｍｅの間細胞密度が達成された。培地の容量はカプセル
の容置の約５倍であるので、培養液ｗＬｌ！当りの細胞
密度は約５×１０　およびｌＸＩＯ３細胞／　ｍｅの間
である事を意味している。

図５に示したごとく、バッチ式供給培養もまた１×１０
　細胞／細胞含有カプセルｍ１以上の密度を達成した。

当事者は本明細書に記載した方法および生成物の他の改
良や変法を決定できるであろう。そのような他の改良や
変法は′１４許請求の範囲に含有される。

【図面の簡単な説明】

図１二本発明に使用するのに適したマイクロカプセル内
に封じられた咄乳類細胞。 図２：本発明の実′ＭＩｌＫ使用するのに適した細胞培
養器具、 図３＝ガス吹き込みを行ったおよび行っていない種々の
バッチ式供給培養における時間に対する培地ミリリット
ル当りの総細胞数のグラフ ・カプセル培養、吹き込み ０懸濁培養、吹き込み Δ懸濁培養、非吹き込み ■カプセル培養、非吹き込み 図４：連続的培地供給、ガス吹吹き込みカプセル化培養
における時間に対する細胞含有カプセル化培養りの細胞
数のグラフ 培地供給連続的 日１−１３：６ｍｌ／分 日１４−１８　：　１４ｍｌ／分 空気吹き込み　＠　０．２３ＣＦ”Ｈ 図５二図４と同様のグラフでバッチ式培地供給培養での
成長 培地供給： 日１−４　：４ｍｌ！／分　連続的 日４−２０　：ノぐノチ式供給 １０リソトル二日 空気吹き込み　＠　０．２５ＣＦＨ （外５名） Ｆ／Ｇｉ ｔ＠表日′４′Ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　以下に記載するＡ、Ｂの工程を特徴とする細胞壁を
   持たない細胞を高密度まで培養する方法：Ａ、成育培地
   中に直接ガスを吹き込み、前記培地に前記細胞の生存能
   力を紐持し、および有糸分裂を助けるのに十分な実質的
   に一定なガス濃度を供給し、前記細胞は前記培地中＆Ｃ
   Ｍ！濁した長球カプセル内に配置されており、前記カプ
   セルは前記細胞を物理的損傷から保護するのに十分で、
   しかも前記細胞の生存能力を維持し、有糸分裂を助ける
   のに必要な成分が横切るのを可能にするのに十分な透過
   性のある半透膜を持ち；およびＩ３．Ｔｈｌ記細胞を成
   長させる。 ２　前記細胞により産生される物質を前記カプセル内ま
   たは前記培地から採取する工程を加えた特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３　前記細胞が動物細胞であり、前記ガスが酸素含有ガ
   スである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　前記ガスがさらに二酸化炭素を含有する特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ５、前記細胞が哺乳類細胞からなる特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ６　前記酸素含有ガスが前記培地中、前記細胞の代謝を
   維持し、有糸分裂を促進する最適で実質的に一定の酸素
   および二酸化炭素濃度にするのに十分な平衝化された量
   の酸素および二酸化炭素を含有する特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ７　前記培地中の酸素分圧が１１５−２００ｉｉＨの範
   囲内である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ８、前記動物細胞が融合細胞からなる特許請求の範囲第
   ３項記載の方法。 ９、前記動物細胞が遺伝子操作された細胞からなる特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 １０、前記動物細胞がミエローマ細胞からなる特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 １１、前記動物細胞を少くとも約５×１０　細胞７／培
   養液−の密度まで成長させる特許請求の範囲第３項記載
   の方法。